專利名稱：一種分離純化嗜鐵鉤端螺旋菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物培養(yǎng)方法，特別是一種嗜鐵鉤端螺旋菌
"e/ to矽/ri77f/巡/em》/^7/咖)純培養(yǎng)物的分離方法。
背景技術(shù)：
嗜鐵鉤端螺旋菌(Zep"sp/ri77w邁/em'pA/"咖)是一類專性化能自養(yǎng) 鐵氧化細(xì)菌，革蘭氏陰性，最適生長pH 2.5,最適生長溫度4(TC，能夠直接 氧化硫化礦物，在微生物浸礦過程中具有重要作用。該菌種不易于純培養(yǎng)， 在普通瓊脂固體培養(yǎng)基平板上很難形成菌落，目前它的分離純化主要是采用 瓊脂糖雙層平板培養(yǎng)基方法，[).B. Johnson及劉纓，劉相梅，田克立在《微生 物學(xué)通報》，2003， 30 (6)，"氧化亞鐵鉤端螺旋菌在固體平板上的培養(yǎng)及形 態(tài)觀察"中所記載的方法.他們利用瓊脂糖作固化劑，在底層平板中加入嗜酸 性異養(yǎng)細(xì)菌(〃wero^ro/7力^2W/M^/〃邁SJH)消耗上層無磷培養(yǎng)基中瓊脂
糖的一些寡糖類物質(zhì)而促進(jìn)嗜鐵鉤端螺旋菌菌落的形成。該方法顯示，菌落 形成時間較短，得率較高，但是，該方法使用雙層平板，步驟較單層平板要 復(fù)雜，使用瓊脂糖作凝膠劑其價格比瓊脂高出約10倍，另外需要嗜酸性異養(yǎng) 細(xì)菌(〃"e/""ro/ 力^^///7/^7/咖SJH)作為輔助細(xì)菌，增加了分離工作的 額外工作量以及引進(jìn)了新的影響因素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了--'種用單層平板分離方法得到純的嗜鐵鉤端螺旋菌的方 法，采用改良的固體培養(yǎng)基成分以及優(yōu)化的培養(yǎng)條件實(shí)現(xiàn)分離，它較雙層平 板分離方法簡便很多，用普通瓊脂作凝膠劑降低費(fèi)用，且不需要添加任何其 它細(xì)菌輔助分離，能大大地減少工作量，并且菌落形成率較高，形成菌落時 間在兩周左右。
本發(fā)明將采集的酸性礦坑水樣品用9K無機(jī)鹽液培養(yǎng)基富集培養(yǎng)一代，然 后將其傳代用--種新的選擇性液體培養(yǎng)基A-M培養(yǎng)，選擇性液體培養(yǎng)基A-M
成分為(NH4)2S04 3 g/L， KC1 0. 1 g/L， K2HP04 0. 5 g/L, MgS04 7H20 0. 5 g/L, Ca(N03) 0.01 g/L， MnS04 l.() g/L， A12(S04)3 18H20 2.1 g/L， FeS04 7H20 44. 5-60. 0 g/L.設(shè)定培養(yǎng)基pH值為1.5-1.7，并設(shè)定其培養(yǎng)溫度為38-42°C ， 傳代培養(yǎng)3 4次且每次稀釋5-10倍傳代，最后將處于對數(shù)生長期培養(yǎng)物取 適量稀釋20-IOO倍，取其中IOO"L在改良的單層固體培養(yǎng)基上均勻涂布。 改良的單層固體培養(yǎng)基配方由A， B和C三部分組成A成分同于上述選擇性 液體培養(yǎng)基A-M成分3 g/L， KC1 0.1 g/L, K2HP04 0.5 g/L， MgS04 7H20 0. 5 g/L, Ca(N03) 0. 01 g/L, MnS04 1. 0 g/L， A12(S04)3 18H20 2. 1 g/L，溶于400 mL蒸餾水；B:普通瓊脂10-15g溶于300 mL蒸餾水；C: FeS04 7H20 44, 5-60. 0 g/L， KSCN 15. 5-25. 0 g/L溶于300 mL蒸餾水。將A 和B部分分開高壓蒸汽滅菌116-121°C， 20-30 mins，最后將A， B和C三部 分混合，調(diào)pH值2.0-3.5，倒平板，在平板上均勻涂布菌液。涂有菌液的固 體培養(yǎng)基平板先正置5 10分鐘，待菌液吸收后倒置于36-45-C恒溫培養(yǎng)箱培 養(yǎng)。固體培養(yǎng)基顏色為紅褐色，兩周左右長出十多個大小不一的黃色光滑菌 落，大的菌落直徑可達(dá)3mm左右。
本發(fā)明只要用單層平板就能分離得到純的嗜鐵鉤端螺旋菌，采用普通瓊 脂作凝膠劑，不需要添加任何其它細(xì)菌輔助分離，菌落形成率較高，較雙層 平板方法更簡單易行。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1:分離嗜鐵鉤端螺旋菌Dl菌株"e/7^Sp/ri'〃咖/^77"http://^77/咖
strain Dl， GenBank登錄號為DQ665909)，將采集的酸性礦坑水樣品Dl用 9K無機(jī)鹽液培養(yǎng)基在3(TC條件下富集培養(yǎng)一代，然后將其傳代用一種新的選 擇性液體培養(yǎng)基A-M培養(yǎng)，選擇性液體培養(yǎng)基A-M成分為(NH4)2S04 3 g/L, KC1 0. 1 g/L， K2HP04 0. 5 g/L， MgS04 7H20 0. 5 g/L， Ca(N03) 0. 01 g/L， MnS04 1. 0 g/L， A12(S04)3 18H20 2. 1 g/L， FeS04 7H20 55 . 0 g/L.設(shè)定培養(yǎng)基pH值為 1.65，并設(shè)定其培養(yǎng)溫度為4(TC,傳代培養(yǎng)3 4次且每次稀釋6倍傳代，最 后將處于對數(shù)生長期培養(yǎng)物取適量稀釋20倍，取其中IOO"L在改良的單層 固體培養(yǎng)基上均勻涂布。改良的單層固體培養(yǎng)基配方由A， B和C三部分組成 A成分同于上述選擇性液體培養(yǎng)基A-M配方:(NH4)2S04 3 g/L， KC1 0.1 g/L， K2HP04 0.5 g/L， MgS(WH'() 0.5 g/L， Ca(N03) 0.01 g/L， MnS04 1.0 g/L，A12(S04)3 跳0 2. 1 g/L，溶于400 mL蒸餾水；B:普通瓊脂12g溶于300 mL 蒸餾水；C: FeS(V 7H20 55.0 g/L， KSCN 20.0 g/L溶于300 raL蒸餾水。將 A和B部分分開高壓蒸汽滅菌121°C， 20mins，最后將A， B和C三部分混合， 調(diào)pH值2. 8左右，倒平板，在平板上均勻涂布菌液。涂有菌液的固體培養(yǎng) 基平板先正置5 10分鐘，待菌液吸收后倒置于38. 5'C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。固 體培養(yǎng)基顏色為紅褐色，兩周左右長出十多個大小不一的黃色光滑菌落，大 的菌落直徑可達(dá)3mm左右。
實(shí)施例2:同樣分離嗜鐵鉤端螺旋菌Dl菌株，從富集培養(yǎng)一用選擇性液 體培養(yǎng)基A-M稀釋傳代培養(yǎng)，步驟同例1， FeS04 7H20為45. 0 g/L，培養(yǎng)基 pH值為1. 58，其培養(yǎng)溫度為38°C ，傳代培養(yǎng)3 4次且每次稀釋8倍傳代， 最后將處于對數(shù)生長期培養(yǎng)物取適量稀釋60倍，同實(shí)施例1步驟進(jìn)行固體培 養(yǎng)基平板分離其中FeS04 7H20濃度為為45. 0 g/L， KSCN為16. 5 g/L,瓊脂 為10g，調(diào)pH值2.5，培養(yǎng)溫度設(shè)為37.0°C，將A和B部分分開高壓蒸汽滅 菌116°C， 25 mins。結(jié)果兩周左右長出十個左右嗜鐵鉤端螺旋菌單菌落，菌 落與例1中相比稍小些，最大為l 2mm。
實(shí)施例3:分離嗜鐵鉤端嫘旋菌D1菌株，從富集培養(yǎng)一用選擇性液體培 養(yǎng)基A-M稀釋傳代培養(yǎng)，步驟同實(shí)施例l， FeS04 7H20濃度為60. 0 g/L，將 培養(yǎng)基pH值設(shè)為1.70，培養(yǎng)溫度為4rC,傳代培養(yǎng)3 4次且每次稀釋6倍 傳代，最后將處于對數(shù)生長期培養(yǎng)物取適量稀釋100倍，同實(shí)施例1方式進(jìn) 行固體培養(yǎng)基平板分離，F(xiàn)eSO' 7H20濃度為60. 0 g/L， KSCN濃度為23. 5 g/L, 瓊脂增加為15g，調(diào)pH值3. 0，培養(yǎng)溫度設(shè)為40°C ，將A和B部分分開高壓 蒸汽滅菌120。C， 30mins。結(jié)果獲得嗜鐵鉤端螺旋菌單菌落數(shù)量較多20 30 個，但是個頭都較小0.5 lmm左右。
權(quán)利要求
1.一種分離純化嗜鐵鉤端螺旋菌的方法，其特征在于包含以下步驟(1)將采集的酸性礦坑水樣品用無機(jī)鹽液培養(yǎng)基富集培養(yǎng)一代，然后將其傳代用一種新的選擇性液體培養(yǎng)基A-M培養(yǎng)，選擇性液體培養(yǎng)基A-M成分為(NH4)2SO4 3g/L，KCl 0.1g/L，K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，Ca(NO3)0.01g/L，MnSO4 1.0g/L，Al2(SO4)3·18H2O 2.1g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 44.5-60.0g/L，培養(yǎng)基pH值為1.5-1.7，培養(yǎng)溫度為38-42℃；(2)制作單層固體培養(yǎng)基平板 其配方由A，B和C三部分組成A成分同于上述選擇性液體培養(yǎng)基A-M成分(NH4)2SO4 3g/L，KCl 0.1g/L，K2HPO40.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，Ca(NO3)0.01g/L，MnSO4 1.0g/L，Al2(SO4)3·18H2O 2.1g/L，溶于400mL蒸餾水；B普通瓊脂10-15g溶于300mL蒸餾水；CFeSO4·7H2O 44.5-60.0g/L，KSCN 15.5-25.0g/L溶于300mL蒸餾水；將A和B部分別在115-121℃蒸汽滅菌，時間20-30mins，最后將A，B和C三部分混合，調(diào)pH值至2.0-3.5，倒于平板上；(3)將步驟(1)所得培養(yǎng)物傳代培養(yǎng)3～4次且每次稀釋后傳代，最后將處于對數(shù)生長期培養(yǎng)物取適量稀釋20-100倍；取菌液均勻涂布在單層固體培養(yǎng)基上，涂有菌液的固體培養(yǎng)基平板先正置5～10分鐘，待菌液吸收后倒置于36-45℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，得到菌落。
全文摘要
一種分離純化嗜鐵鉤端螺旋菌的方法，本發(fā)明從酸性礦坑水中分離嗜鐵鉤端螺旋菌，將采集的酸性礦坑水樣品用無機(jī)鹽液培養(yǎng)基在30℃條件下富集培養(yǎng)一代，然后將其傳代用一種新的選擇性液體培養(yǎng)基A-M培養(yǎng)，并在培養(yǎng)基A-M中添加MnSO₄ 1.0g/L，Al₂(SO₄)₃·18H₂O 2.1g/L，培養(yǎng)基pH值設(shè)為1.5-1.7，培養(yǎng)溫度設(shè)為38-42℃；稀釋傳代培養(yǎng)后，在改良的單層固體培養(yǎng)基上均勻涂布。本發(fā)明只要用單層平板就能分離得到純的嗜鐵鉤端螺旋菌，采用普通瓊脂作凝膠劑，不需要添加任何其它細(xì)菌輔助分離，菌落形成率較高，較雙層平板方法更簡單易行。
文檔編號C12N1/20GK101191121SQ200610136739
公開日2008年6月4日 申請日期2006年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月24日
發(fā)明者柳建設(shè), 王秀美, 田卓力, 肖升木, 謝學(xué)輝 申請人:中南大學(xué)