專利名稱：鑒別牦牛奶制品中是否摻雜普通牛奶的方法及其專用引物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種鑒別牦牛奶制品中是否摻雜普通牛奶的方法及其專用引物。
背景技術：
牦牛是家養(yǎng)動物中地理分布范圍極其有限的珍奇家畜之，牦牛奶及其奶制品相對于普通牛奶，以其稀有和高的營養(yǎng)價值而稱著。因此就出現(xiàn)了一些不法商販，在牦牛奶中摻入普通牛奶從中謀取更高的利潤，使消費者的利益受到了極大的損害。
牦牛主要生活在海拔2000-4500m的高原、高山、亞高山的寒冷半濕潤地區(qū)。中國牦牛占世界牦牛的90％以上，主要分布在青藏高原中心地帶及其東部邊緣地區(qū)。牦牛的分布極其有限，作為珍奇的家畜品種，牦?？梢詾槿藗兲峁┤椤⑷?、脂肪、毛、絨、皮等產(chǎn)品。這些產(chǎn)品中特別是乳的加工、利用形式種類多樣。由于牦牛乳制品的營養(yǎng)價值高，產(chǎn)量稀少，因此其市場價格要比普通牛乳制品高的多。
牦牛的產(chǎn)乳季節(jié)在每年5月產(chǎn)犢后至11月，泌乳高峰期在7、8月份，產(chǎn)乳期約為150天。牦牛的產(chǎn)乳量比較低，150天擠乳期內的產(chǎn)乳量為350kg左右，平均每日擠乳量1.0-2.5kg左右。在牦牛各地方品種中以新疆巴州牦牛最高，2.5kg/天。而在國內普通奶牛泌乳期分為305天，平均產(chǎn)奶量為4000kg，平均每天擠乳量為13.5kg。從營養(yǎng)成分上比較，牦牛奶的營養(yǎng)成分含量要比普通牛奶高的多，圖1比較了普通牛乳、初乳與牦牛乳液、初乳之間的營養(yǎng)成分含量上的差異。從數(shù)據(jù)中可以看出，牦牛奶的兩個主要特點營養(yǎng)價值高，而且稀有。
哺乳動物線粒體DNA(mtDNA)的長度為16kb左右，人類的mtDNA的長度為16569bp；mtDNA呈閉合環(huán)狀結構，位于線粒體基質內，每個細胞中有上千拷貝線粒體(依細胞類型不同而異)。線粒體DNA呈雙鏈，一條富含鳥嘌呤的重鏈(H)，一條富含胞嘧啶的輕鏈(L)。重鏈編碼12個多肽鏈，14個tRNA和所有的rRNA；輕鏈編碼一個多肽鏈，8個tRNA。線粒體編碼的基因內部沒有內含子，基因內所有編碼序列緊密相連。
線粒體DNA中僅有的非編碼區(qū)是D-loop區(qū)(Displacement loop)，在人類線粒體DNA中該區(qū)域長1121bp，該區(qū)域包含有重鏈復制起始位點(OH)和輕鏈，重鏈的轉錄啟動子區(qū)。線粒體DNA的復制起始于兩個區(qū)域，復制最初在RNA引物的作用下發(fā)生在重鏈復制起始位點OH，當重鏈的合成到整個線粒體DNA的三分之二時，置換出來的部分親本重鏈到達輕鏈復制起始位點(OL)，該位點位于五個tRNA基因簇中；當輕鏈復制起始位點被置換出來后，OL折疊成發(fā)卡結構，DNA聚合酶以置換出的重鏈為模板起始新輕鏈的合成；隨后線粒體DNA進行非同步雙向合成。
線粒體DNA呈母系遺傳，單個卵母細胞中線粒體DNA可以達到100,000個拷貝，然而在精子中線粒體DNA僅含100～1500個拷貝。在受精過程精子中的線粒體進入卵母細胞，但是在胚胎發(fā)生的二細胞期和四細胞期逐漸消失。通過人工受精和單精注射的方法發(fā)育形成的個體中，來自父系的線粒體DNA也檢測不到。
線粒體自身缺乏有效的DNA修復系統(tǒng)，同時也沒有象組蛋白那樣的有保護功能的蛋白質；而且線粒體DNA還暴露在由OXPHOS過程中產(chǎn)生的強誘變劑——氧自由基。另外線粒體中異常的代謝可能也會積累突變的線粒體DNA。這些比較獨特的性質導致了線粒體DNA多態(tài)的積累速度要比核DNA快10～17倍。與編碼區(qū)相比線粒體DNA的非編碼區(qū)的突變率要高5-10倍。
線粒體DNA非編碼區(qū)也就是D-loop區(qū)的高突變特性，以及單細胞中線粒體DNA的高拷貝的特性，使得其在樣本鑒別中與核DNA相比存在著巨大的優(yōu)勢(1)對高度降解的樣本有相對高的檢測靈敏度，(2)可以檢測痕跡量的樣本，(3)高突變率使得它有比核DNA有更高的物種間或物種內的特異性。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是提供一種鑒別牦牛奶制品中是否摻雜普通牛奶的方法。
本發(fā)明所提供的鑒別牦牛奶制品中是否摻雜普通牛奶的方法，包括以下步驟1)以從待測牦牛奶制品中提取的DNA為模板，利用核苷酸序列分別是序列表中的序列1和序列2的一對引物進行PCR反應；2)檢測PCR擴增產(chǎn)物中是否有DNA條帶，如PCR擴增產(chǎn)物中有DNA條帶，則待測牦牛奶制品中摻雜有普通牛奶。
所述DNA條帶的大小可為445bp(對所有的普通牛品種或個體，該DNA條帶大小都是445bp)。
所述牦牛可為所有牦牛(Bos grunniens)品種。雖然不同牦牛品種或個體之間的D-loop區(qū)都會有個別堿基的差異，但是對本發(fā)明的PCR擴增沒有影響，用上述序列表中的序列1和序列2的一對引物進行PCR擴增，均得不到DNA條帶。
所述普通?？蔀樗蠦os taurus種屬的牛品種。雖然不同普通牛品種或個體之間的D-loop區(qū)都會有個別堿基的差異，但是對本發(fā)明的PCR擴增沒有影響，用上述序列表中的序列1和序列2的一對引物進行PCR擴增，均得到445bp的DNA條帶。
上述方法中還包括對待測牦牛奶制品進行預處理的步驟；所述預處理的方法為將待測牦牛奶制品進行截留分子量為8000-12000Da的透析，然后向透析后的牦牛奶制品中加入Tris-Cl，EDTA，NaCl和蛋白酶K，使Tris-Cl的終濃度為10mmol/L、EDTA的終濃度為5mmol/L、NaCl的終濃度為50mmol/L、蛋白酶K的終濃度為200ug/ml，50℃反應2小時。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種用于鑒別牦牛奶制品中是否摻雜普通牛奶的一對引物。
本發(fā)明所提供的用于鑒別牦牛奶制品中是否摻雜普通牛奶的一對引物，其核苷酸序列分別是序列表中的序列1和序列2。
本發(fā)明的又一個目的是提供一種用于鑒別牦牛奶制品中是否摻雜普通牛奶的試劑盒。
本發(fā)明所提供的用于鑒別牦牛奶制品中是否摻雜普通牛奶的試劑盒，其含有核苷酸序列分別是序列表中的序列1和序列2的一對引物。
所述試劑盒還包括PCR反應試劑。
本發(fā)明根據(jù)乳液在擠出過程中會隨之帶出一些體細胞(平均3.9×104個/毫升)，從奶制品中提取微量的DNA，而線粒體DNA的D-Loop區(qū)在牦牛和普通牛之間存在較大的差異，根據(jù)他們之間的差異設計普通奶牛特異的引物，通過PCR方法對摻假牦牛奶制品進行鑒定。
本發(fā)明的鑒別牦牛奶制品中是否摻雜普通牛奶的方法快速(只需6小時)、準確、靈敏。


圖1為中國牦牛乳及初乳營養(yǎng)成分平均含量與普通奶牛之間的差異。
圖2為普通牛D-loop(NC_006853)和牦牛D-loop(NC_006380)之間所存在的差異。
圖3為引物Milk-id-F和Milk-id-R的牦牛和普通牛混合乳液的擴增結果。
圖4為引物Milk-id-F和Milk-id-R的牦牛和普通牛混合奶粉的擴增結果。
具體實施例方式
本發(fā)明分析了牦牛線粒體DNA D-loop區(qū)序列(NC_006380，序列表中序列4)和普通牛線粒體DNA D-loop區(qū)序列(NC_006853，序列表中序列3)之間的差異。結果如圖2所示，序列中Yak為牦牛線粒體DNA D-loop區(qū)的序列，Cattle為普通奶牛線粒體DNA D-loop區(qū)的序列，Majority為它們之間的保守序列。方框表示正反向引物所在位置。圖2中的普通牛是指荷斯坦牛，牦牛是指青海牦牛。雖然不同牦牛品種或個體之間D-loop區(qū)都會有個別堿基的差異，但是對本發(fā)明的PCR擴增來說沒有影響，用上述序列表中的序列1和序列2的一對引物進行PCR擴增，均得不到DNA條帶；雖然不同普通牛品種或個體之間D-loop區(qū)都會有個別堿基的差異，但是對本發(fā)明的PCR擴增來說沒有影響，用上述序列表中的序列1和序列2的一對引物進行PCR擴增，均得到445bp的DNA條帶。
根據(jù)牦牛和普通牛線粒體DNA D-loop區(qū)之間的差異，設計了普通牛特異引物Milk-id-F5’-GCCCATACACAGACCAC-3’(序列1)Milk-id-R5’-GTGAGCATGGGCTGATT-3’(序列2)。
下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
實施例1、鑒別牦牛奶制品中是否摻雜普通牛奶的方法實驗乳品市場購得的荷斯坦牛普通牛奶及奶粉，市場購得的青海牦牛牛奶及奶粉。
牦牛奶和普通牛奶分別按1∶1、3∶1、6∶1、10∶1、20∶1的體積比混合，鑒定牦牛奶中的普通牛奶成分。
牦牛奶粉和普通牛奶粉分別按1∶1、3∶1、6∶1、10∶1、20∶1的質量比混合，鑒定牦牛奶粉中的普通牛奶粉成分。
1、牛奶中DNA的提取(1)取牛奶500μl，放入截留分子量為8000-12000Da(道爾頓)的透析袋中。
(2)將透析袋放入準備好的500ml雙蒸水中，透析1小時。
(3)將透析袋中的奶樣移入1ml的EP管中。
(4)加入Tris-Cl，EDTA，NaCl和蛋白酶K，使Tris-Cl的終濃度為10mmol/L、EDTA的終濃度為5mmol/L、NaCl的終濃度為50mmol/L、蛋白酶K的終濃度為200ug/ml，50℃反應3小時。
(5)加入等體積的Tris-飽和酚，抽提10min，11000g離心10min。
(6)取上清重復步驟(5)。
(7)取上清加入等體積的1∶1(體積比)的苯酚氯仿抽提10min，11000g離心10min。
(8)取上清加入兩倍體積的無水乙醇，11000g離心10min。
(9)棄上清，70％(體積百分含量)的乙醇漂洗兩次。37℃烘干后，溶入5ul的雙蒸水中。
相同的方法提取10份相同樣本，將提取的DNA融入一個體系中。
2、奶粉中DNA的提取(1)取奶粉100μg，溶入600μl雙蒸水中，移入截留分子量為8000-12000Da(道爾頓)的透析袋中。
(2)將透析袋放入準備好的500ml雙蒸水中，透析2小時。
(3)更換500ml雙蒸水，繼續(xù)透析3小時。
(4)將透析袋中的奶樣移入1ml的EP管中，每管500ul奶樣。
(5)加入Tris-Cl，EDTA，NaCl和蛋白酶K，使Tris-Cl的終濃度為10mmol/L、EDTA的終濃度為5mmol/L、NaCl的終濃度為50mmol/L、蛋白酶K的終濃度為200ug/ml，50℃反應3小時。
(6)加入等體積的Tris-飽和酚，抽提10min，11000g離心10min。
(7)取上清重復步驟(6)。
(8)取上清加入等體積的1∶1(體積比)的苯酚氯仿抽提10min，11000g離心10min。
(9)取上清加入兩倍體積的無水乙醇，11000g離心10min。
(10)棄上清，70％(體積百分含量)的乙醇漂洗兩次。37℃烘干后，溶入5ul的雙蒸水中。
相同的方法提取10份相同樣本，將提取的DNA融入一個體系中。
3、PCR反應及檢測分別以步驟1和步驟2提取的DNA為模板，利用Milk-id-F5’-GCCCATACACAGACCAC-3’(序列1)和Milk-id-R5’-GTGAGCATGGGCTGATT-3’(序列2)進行PCR反應。其中，PCR反應體系如下10倍的擴增緩沖液 2.5ul4種dNTP混合物，(各42.5mmol/L)2ulMilk-id-F和Milk-id-R(各10pmol/ul)1ul模板DNA 5ulTaq DNA聚合酶(3u/ul) 1ulddH2O 13.5ul總體積 25ul反應條件94℃預變性5分鐘；循環(huán)條件(94℃變性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸30秒)，35個循環(huán)；72℃延伸7分鐘；4℃保存。反應產(chǎn)物用2％的瓊脂糖凝膠檢測，并對擴增產(chǎn)物進行測序。
牦牛奶的檢測結果如圖3所示，作為對照的牦牛奶中未得到DNA條帶，牦牛奶和普通牛奶分別按1∶1、3∶1、6∶1、10∶1、20∶1的體積比混合的樣品中均得到445bp的DNA條帶。而未混入普通奶的樣品沒有擴增條帶產(chǎn)生，該結果表明引物Milk-id-F和Milk-id-R特異于普通牛，可用于鑒別牦牛奶制品中是否摻雜普通牛奶。圖3中，M為100bp分子量標記，CON是PCR模板為牦牛奶的對照，1-5分別為牦牛奶和普通牛奶分別按20∶1，10∶1，5∶1，3∶1和1∶1的體積比的混合奶樣PCR結果。
牦牛奶粉的檢測結果如圖4所示，作為對照的牦牛奶粉中未得到DNA條帶，牦牛奶粉和普通牛奶粉分別按1∶1、3∶1、6∶1、10∶1、20∶1的質量比混合的樣品中均得到445bp的DNA條帶。而未混入普通奶粉的樣品沒有擴增條帶，說明引物Milk-id-F和Milk-id-R特異于普通牛，可用于鑒別牦牛奶制品中是否摻雜普通牛奶。圖4中，M為pBR322分子量標記，CON是PCR模板為牦牛奶粉的對照，1-5分別為牦牛奶粉和普通牛奶粉分別按20∶1，10∶1，5∶1，3∶1和1∶1的質量比的混合奶樣PCR結果。
序列表<160>4<210>1<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1gcccatacac agaccac 17<210>2<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2gtgagcatgg gctgatt 17<210>3<211>910<212>DNA<213>牛(Bos taurus)<400>3aacactatta atatagttcc ataaatacaa agagccttat cagtattaaa tttatcaaaa 60atcccaataa ctcaacacag aatttgcacc ctaaccaaat attacaaaca ccactagcta120acataacacg cccatacaca gaccacagaa tgaattacct acgcaagggg taatgtacat180aacattaatg taataaagac ataatatgta tatagtacat taaattatat gccccatgca240tataagcaag cacatgacct ctatagcagt acataataca tataattatt gactgtacat300
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1.一種鑒別牦牛奶制品中是否摻雜普通牛奶的方法，包括以下步驟1)以從待測牦牛奶制品中提取的DNA為模板，利用核苷酸序列分別是序列表中的序列1和序列2的一對引物進行PCR反應；2)檢測PCR擴增產(chǎn)物中是否有DNA條帶，如PCR擴增產(chǎn)物中有DNA條帶，則待測牦牛奶制品中摻雜有普通牛奶。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述DNA條帶的大小為445bp。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述牦牛為Bos grunniens種屬所有牦牛品種。
4.根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述普通牛為Bos taurus種屬所有牛品種。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述牦牛為青海牦牛，所述普通牛為荷斯坦牛。
6.根據(jù)權利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于所述方法中還包括對待測牦牛奶制品進行預處理的步驟；所述預處理的方法為將待測牦牛奶制品進行截留分子量為8000-12000Da的透析，然后向透析后的牦牛奶制品中加入Tris-Cl，EDTA，NaCl和蛋白酶K，使Tris-Cl的終濃度為10mmol/L、EDTA的終濃度為5mmol/L、NaCl的終濃度為50m mol/L、蛋白酶K的終濃度為200ug/ml，50℃反應2小時。
7.用于鑒別牦牛奶制品中是否摻雜普通牛奶的一對引物，其核苷酸序列分別是序列表中的序列1和序列2。
8.用于鑒別牦牛奶制品中是否摻雜普通牛奶的試劑盒，其含有核苷酸序列分別是序列表中的序列1和序列2的一對引物。
9.根據(jù)權利要求8所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括PCR反應試劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鑒別牦牛奶制品中是否摻雜普通牛奶的方法及其專用引物。本發(fā)明所提供的鑒別牦牛奶制品中是否摻雜普通牛奶的方法，包括以下步驟1)以從待測牦牛奶制品中提取的DNA為模板，利用核苷酸序列分別是序列表中的序列1和序列2的一對引物進行PCR反應；2)檢測PCR擴增產(chǎn)物中是否有DNA條帶，如PCR擴增產(chǎn)物中有DNA條帶，則待測牦牛奶制品中摻雜有普通牛奶。本發(fā)明的鑒別牦牛奶制品中是否摻雜普通牛奶的方法快速、準確、靈敏。
文檔編號A23C7/00GK1965664SQ200610114329
公開日2007年5月23日 申請日期2006年11月6日 優(yōu)先權日2006年11月6日
發(fā)明者趙興波, 劉玉方 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學