專利名稱：：病毒病原高通量快速排查檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種病毒病原的排査檢測方法，具體涉及一種豬疫病病毒的高通量快速排查檢測方法。技術(shù)背景寡核苷酸芯片(OligonucleotideMcro呵s)，是將事先設(shè)計(jì)并合艦的十幾至幾十個(gè)鵬的寡核苷酸探ftM:點(diǎn)樣儀有規(guī)律地排列固定于支持物上，然后與熒光fgi己的耙序列按i^酉ax寸原理在一定條件下雜交，經(jīng)洗滌后iM:激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)對芯片進(jìn)行掃描，ffil計(jì)穀/!M行繊比較和分析，一次i微就可對多種基因進(jìn)行'鵬、準(zhǔn)確、豬細(xì)小病謝PV)、豬圓環(huán)病斷CV)、豬瘟病寧CSFV)是引發(fā)豬患病的常見病原，且常呈混合感染出現(xiàn)。豬流感病毒、口蹄疫病毒、豬偽狂犬病毒、豬藍(lán)耳病毒是危害豬呼吸系統(tǒng)、神會L系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)常見的四類高發(fā)性病毒性病疫原。目前，現(xiàn)有技術(shù)中對這幾種鄉(xiāng)病毒的分析檢測多采用病原分離和常規(guī)的免ML清學(xué)檢測以及聚^l^i反應(yīng)(PCR)法。病原分離不僅費(fèi)時(shí)、操作復(fù)雜。免麵清^t測法，雖然操作較為簡單，但主要是敏感tt&特異性相對較低?，F(xiàn)有PCR分析檢觀啲方法先根據(jù)待檢測病毒設(shè)計(jì)引物，xf待測樣本進(jìn)行擴(kuò)增，然后進(jìn)行檢測。由于是采用電泳的方法直驗(yàn)行檢測，因此每次只能檢測一種病原，多種病原需要進(jìn)行多次檢測，費(fèi)時(shí)、操作鋭，特異性相對較低，假附性率較高?，F(xiàn)有技術(shù)中樣本處麟用直接標(biāo)己的方法，標(biāo)己效割氏，導(dǎo)致檢測靈鵬低。步驟是(1)弓嫩的設(shè)計(jì)合成先設(shè)計(jì)引物，然后合成引物，同日射示記上熒光物質(zhì)，形淑示記有熒光物質(zhì)的引物。(2)生成單鏈DNA產(chǎn)物擴(kuò)增產(chǎn)物，形成帶有熒光物質(zhì)單鏈DNA產(chǎn)物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于掛共一種病原高通量^I排査檢測方法，其解決了
背景技術(shù)：
中豬疫病病毒檢測方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，敏感'隨特異性較低，檢測結(jié)果不準(zhǔn)確的技術(shù)問題。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種病毒病原高通量i^I排查檢測方法，M^L處在于，該方法的實(shí)現(xiàn)步驟包括:(1)制備芯片探針設(shè)計(jì)，芯片點(diǎn)制，得寡核苷酸芯片；(2)待測樣本處理(2.1)引物的設(shè)計(jì)合成得到與待檢測病原對應(yīng)的引物；(2.2)生鵬鏈DNA產(chǎn)物用與待檢測病原對應(yīng)的引物對待觀蹄本進(jìn)行同步不對稱PCR擴(kuò)增，生成與寡核苷酸探針特異性互補(bǔ)的單鏈DNA產(chǎn)物；(2.3)標(biāo)記熒光物質(zhì)在單鏈DNA產(chǎn)物上標(biāo)己熒光物質(zhì)，形^fi己上熒光物質(zhì)的單鏈DNA產(chǎn)物；(3)雜交將標(biāo)己上熒光物質(zhì)的單鏈DNA產(chǎn)物與寡核苷酸芯片雜交，清洗芯片；(4)檢測分析用熒光掃描儀掃描，得到病毒檢測分析結(jié)果。上述制備芯片的步驟可包括(1)探針的設(shè)計(jì)根據(jù)病毒基因組保守序列設(shè)計(jì)牛寺異性強(qiáng)的寡核苷酸探針；(2)芯片點(diǎn)制先進(jìn)行片基表面斷布處理，然后^按照設(shè)計(jì)的陣列固定在片基上，制備成寡核苷酸芯片，進(jìn)行芯片點(diǎn)樣后處理，得寡核苷酸芯片。上述標(biāo)記熒光物質(zhì)的步驟可以是(1)單鏈樣本的間接熒光^H己iiai不Xd^PCRj參入的氨基烯丙基和熒光^Tcy3或cy5上的琥珀酰亞胺基團(tuán)進(jìn)^i接，使不X^妳CR單鏈產(chǎn)物連接上熒光iH己^;(2)fei己產(chǎn)物的純化將熒光t射己產(chǎn)物用AmershamG"25柱進(jìn)fi^化，除去^^H己的游離熒光分子，得純化后的熒光標(biāo)記的樣本，置于-2crc避光保存，備雜交用。上述熒光掃描儀以采用GenePix4000B掃描儀為宜。上述弓嫩設(shè)計(jì)合成中弓嫩的選出方案可以是弓嫩長度15—30個(gè)，引tJMS組鵬隨機(jī)分布，0+€含量在45-55%，弓卿自身不形成二級結(jié)構(gòu)，引物之間班補(bǔ)序列，引物序列是被檢病毒降異的，引物3'端^tt與樹B)NA酉B寸，引物3'彩I堿基以選T、C或者G。上述探針設(shè)計(jì)方案可以是Tm值為85。C土5。C，GC含量為50X-60%，重復(fù)的單一哲,i^續(xù)《6個(gè)，探針M的二級結(jié)構(gòu)酉W訴jtt長度《6bp，合^的引物和寡核苷針用滅菌7條解，弓嫩終濃度為20pmol/ul，徽終濃度為25pmol/pl;或合鵬的寡核苷酸探針用無菌水溶解至濃度為50iiM/L，同2Xspottingbuffer1:i混合使其點(diǎn)樣終濃度調(diào)整為25"M/L。戰(zhàn)單鏈樣本的間接熒光標(biāo)己的步驟可以是:取分裝千燥的cy染料，力口5ul的DMSO室溫避光孵育l小時(shí)；用30ul0.1MPH9.3Na2C03充分溶解純化后的不X^敘CRss-DNA，然后立即轉(zhuǎn)移至孵育好的cy熒光染料中，吹吸混勻，室溫避光反應(yīng)l小時(shí)，每隔10分,襯顯和震蕩1^H中；加入10ul4Mf剄安，使P勁安終濃度為1M，室溫靜置15併中。上述將標(biāo)己上熒光物質(zhì)的單,節(jié)NA產(chǎn)物與寡核苷酸芯片雜交的步驟可以是將熒光標(biāo)記的樣本與1X以1:9的體積比混合，95'C變性3^^中，使二級莖環(huán)結(jié)構(gòu)解f連；取混合樣品至芯片表面，置于雜交盒內(nèi)6(TC雜交；所述的雜交液為50%甲翻安、5XSSC、0.1%SDS以及l(fā)X鮭魚精DNA。上述制備芯片包括片基處理，步驟可以是用APTES溶^樹Gokisea魅烷化玻片進(jìn)行處理，離心甩干，經(jīng)掃描后，選取背景均一且背景值較低的氨基化片基，室溫千燥，保存以備用。上述芯片清洗的步驟可以是取出芯片，立即^A清洗液I中清洗2次，每次10y刀H中再轉(zhuǎn)入4'C保存的清洗液II中清洗10^H中，最后常溫下將芯片離心甩干。清洗液I可采用6XSSC以及Triton-X102，清洗液II可采用0.1XSSC以及Triton-X102。本發(fā)明具有以下tt:點(diǎn)1.本發(fā)明應(yīng)用寡核苷酸(Oligo)芯片，可對多種豬疫病病毒進(jìn)行并行化的高通量、快速排査檢測。2.操作簡便，省時(shí)3.敏感性及特異性高，檢測結(jié)果穩(wěn)定，準(zhǔn)確性好。4.由于可對多種基因進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、高效的檢測，實(shí)用性強(qiáng)。圖1為本發(fā)明實(shí)施例芯片設(shè)計(jì)示意圖。圖2為本發(fā)明實(shí)施例芯片陣列設(shè)計(jì)示意圖。圖3為本發(fā)明引物特異性驗(yàn)證結(jié)果圖。圖4為本發(fā)明不對稱PCR反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物的PAGE膠驗(yàn)證結(jié)果圖。圖5為本發(fā)明引物特異性跑膠驗(yàn)i正結(jié)果圖。圖6為本發(fā)明芯片掃描結(jié)果圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明采用的病毒病原高通量快速排査檢測方法，實(shí)現(xiàn)步驟如下l.制備芯片.本發(fā)明制備芯片中的探針設(shè)計(jì)及芯片點(diǎn)帝購可采用公知技術(shù)。(1.1)探針的設(shè)計(jì)根據(jù)病毒基因組保守序列設(shè)m寺異性強(qiáng)的60bp寡核苷酸探針。(1.2)芯片點(diǎn)制先進(jìn)行片基表制斷布處理，然后^^B十按照設(shè)計(jì)的陣列固定在片基上，制備成寡核苷酸芯片，進(jìn)行芯片點(diǎn)樣后處理，即得寡核苷酸芯片。2.待測樣本處理本發(fā)明樣本處理釆用間接^H己的方法，*斜己效率高，使檢測靈提高，而且成本低。(2.1)引物的設(shè)計(jì)合成得到與待檢測病原對應(yīng)的引物。(2.2)生鵬鏈DNA產(chǎn)物用與待檢測病原對應(yīng)的引物對待觀財(cái)羊本進(jìn)行同步不對稱PCR擴(kuò)增，生成大量可與寡核苷酸探針特異性互補(bǔ)的單鏈DNA產(chǎn)物。(2.3)禾fi己熒光物質(zhì)在單鏈DNA產(chǎn)物上牛斜己熒光物質(zhì)，形j^^H己上熒光物質(zhì)的單鏈DNA產(chǎn)物。(2.3.1)單鏈樣本的間接熒光標(biāo)己iW不對禾敘CR^參入的ES化脫氧尿嘧啶核苷酸(aa-dUTP)和熒光物質(zhì)cy3^cy5上的琥珀酉tt胺基團(tuán)進(jìn)fi^接，使不對禾敘CR單鏈產(chǎn)物連接上熒光標(biāo)記分子。具體方法取分裝^P燥的cy染料，力Q5ul的DMSO室顯避光孵育l小時(shí)；用25"10.lMNa2C03(PH9.3)充分溶解純化后的不對稱PCRss-DNA，然后立即轉(zhuǎn)移至孵育好的cy熒光染料中，吹吸混勻，室溫避光反應(yīng)l小時(shí)，每隔10分鍬顯和震蕩l分鐘；加入10ul4MP勁安，使羥胺終濃度為1M，室溫靜置15^H中。(2.3.2)t射己產(chǎn)物的純化將Jl^熒光^i己產(chǎn)物用Amei3ham025柱進(jìn)fi^屯化，除去未標(biāo)己的游離熒光分子，得純化后的熒光iH己的樣本，置于-2(TC避光保存，備雜娜。將牛莉己上熒光物質(zhì)的單鏈DNA產(chǎn)物與寡核苷酸芯片進(jìn)行雜交，清洗芯片。具體方法如下(3.1)雜交將熒光豐射己的樣本與lX以l:9的體積比混合，95。C變性3min，使可能存在的二級莖環(huán)結(jié)構(gòu)解鏈。取混合樣品至芯片表面，置于雜交盒內(nèi)6(TC雜交。雜交液可采用50%甲,安、5XSSC、0.1Q/oSDS以及l(fā)。/Q鮭魚fSDNA。(3.2)芯片清洗取出芯片，立即臥清洗激中清^2次，每次10粥中；再轉(zhuǎn)入4t:保存的清洗^n中清洗io力H中，最后常溫下將芯片離心甩干。清洗鄉(xiāng)可采用6xssc以及Triton-X102，清洗銜I可采用O.1XSSC以及Triton-X102。用lnePix4000B熒光掃描儀掃描，分析芯片熒光信號，貝U得到豬病毒檢測結(jié)果。目前，Genepix4000B熒光掃描儀帶有Genepixpro3.0微陣列分析軟件，芯片掃描完成，3.雜交:即可得到芯片熒光信號檢測分析結(jié)果。實(shí)施例實(shí)現(xiàn)歩驟如下(1)引物的設(shè)計(jì)方案弓胸長度一般以15—30個(gè)堿基為宜。正向、反向兩條引物鏈之間的距離/頓中。因?yàn)槠瑪噙^短會影響結(jié)果判定，過長則擴(kuò)增特異性陶氐。引物石組成應(yīng)隨機(jī)分布，G+C含量在45-55%為宜。引物自身不形成二級結(jié)構(gòu)，弓胸之間沒有互補(bǔ)序列。引物序列必須是被檢病毒待異的。引物3'織ja與模feDNA要酉瀏，引物3'末端堿基以選T、C或者G為宜，一般不i^A。(2)探針的設(shè)計(jì)方案Tm值在85。C左右，上下波動范圍為5。C。GC含量為50。/o-6(F。。重復(fù)的單一石鵬連續(xù)不超過6個(gè)。探針^H^慰急定的二級結(jié)構(gòu)酉瀏石鵬長度少刊bp。豬細(xì)小病毒(PPV)、豬圓環(huán)病毒(PCV)、豬瘟病毒(CSFV)探針，合成后的引物和探針用滅菌水溶解，弓l物終濃度為20pmol/"l，探針終濃度為25pmol/ul。豬流感病毒、口蹄疫病毒、豬偽狂犬病毒、豬繁殖和呼吸綜合癥這四種病毒的探針，均未經(jīng)ttf可1it布，質(zhì)，級為PAGE級。合成好的寡核苷酸探針用無菌水溶解至濃度為50"M/L，同2Xspottingbufferl:l混合使其點(diǎn)樣終濃度調(diào)整為25uM/L。豬流感病毒、口蹄疫病毒、豬偽狂犬病毒、豬繁殖和呼吸綜合癥這四種病毒的弓l物序列位置、序列及特點(diǎn)如下表所述PorcinevirusesgeneGenebankIDPrimerPositionPCRproduct5'(ACGGAGGACGAGCTGGGGCT-3'431FPRVgDAF08670264服217bpPi.:5'"GTCCACGCCCCGCTrGAAGCKTPk5'-AAGTGCAAAGCCAGAAGA-3'1392FSIVnpAF397198141bpP卜:5'-TACTCCTCTGCATTGTCTCC-3'1513RP!:5'《ACCACCTCACCCAGACT墨3'I96FPRRSVnpAY035959128bpPk5'(GGCAGCATAAACTCAAC-3'324RPh:5'"CCTTACCTGGGTCCCGAATG-3'273FFMDVVP1X00871263bpP卜:5'《CCGAGTGGCTTTGATGO-3'535R表l<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表2豬流感病毒、口蹄疫病毒、豬偽狂犬病毒、豬繁殖和呼吸纟^^癥寡核苷酸^l十編號、序列組其特點(diǎn)如下表所述<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表3<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表4(3)制備芯片片基處理用APTES溶，稱寸Goldseal碌烷化玻片進(jìn)行處理，離心甩干，經(jīng)掃描后，選取背景均一且背景值較低的氨基化片基室溫千燥，保存以備用。具體可參照ESJ七芯片片基制備的標(biāo)準(zhǔn)化操作方案。豬細(xì)小病毒(PPV)、豬圓環(huán)病毒(PCV)、豬瘟病毒(CSFV)芯片設(shè)計(jì)為6X4的陣列，見圖l，每個(gè)探針橫向重復(fù)打印2個(gè)點(diǎn)。陣列中的PC位點(diǎn)為熒光標(biāo)己探針，起禾標(biāo)位置的作用，B位點(diǎn)為空白對照點(diǎn)樣緩沖液，SCl和SC2為病毒檢測的陽t鈔卜對照，起監(jiān)視體系的作用，其中SCl為DNA病毒的附ft^卜對照探針，SC2為RNA病毒的陽性外對照探針，V1-V3分別代表所檢觀啲病毒基因，其中深色位點(diǎn)表示正鏈的寡核苷針，淺色位點(diǎn)標(biāo)負(fù)鏈的寡核苷酸探針，正、負(fù)鏈探針可互為陰性、陽性對照。豬流感病毒、口蹄疫病毒、豬偽狂犬病毒、豬繁殖和呼吸綜合癥這四種病毒共設(shè)計(jì)8^60mer01igo陽性和附性檢測探針以及陽性質(zhì)控、陰性指控探針各l條，另外加上空白對照，將芯片設(shè)計(jì)成6X6的陣列。陣列設(shè)計(jì)方案見圖2。(4)單鏈DNA片段的制備普ffiPCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為25tU，含有5"110XPCRbuffer,2ul2.5腿ol/LdNTP，2ul模板，20umol/L的上、下游引物別.625lU，0.5y1TaqDNA聚合酶(3M/ul)，力口dd恥至終體積25ul。PCR反應(yīng)^(牛95°C5力H中；95°C30秒，51°C30秒，72°C30秒，30個(gè)循環(huán)；72°C5^H中。收數(shù)CR產(chǎn)物經(jīng)l.5%的瓊月識凝膠電泳觀察結(jié)果。經(jīng)普MPCR實(shí)驗(yàn)5li正，所設(shè)計(jì)引物的特異性良好，引物特異性驗(yàn)i正結(jié)果見圖3。其中，M泳道表示DNAMarkerDL2000，1、2泳道^PPV的NS基因片段，3、4泳道表示PPV的W基因片段。從電泳結(jié)果可知擴(kuò)增產(chǎn)物大小正確，無非特異性條帶，所用的種特異性引物間沒有交叉擴(kuò)增的現(xiàn)象，證實(shí)了這些弓l物的特異性良好。(5)驗(yàn)證不對稱PCR單鏈產(chǎn)物經(jīng)艦上述引物特異性驗(yàn)證后，通過不對稱PCR前珠制備ss-DNA，在不X^爾PCR體系中摻入aa-dUTP，以備下一頻行間接熒光l射己。25u1不X^爾PCR反應(yīng)體系為:Virus模板2ti1、10Xreactionbuffer2.5u1、MgC12solution2.5u1、dNTP每種、濃度為2.5mM(dATP0.5ii1、dGTP0.5u1、dCTP0.5u1、dTTP0.3u1、aa-dUTP0.2Ul，其中，dTTP和aa-dUTP的比例固定為3:2)、Primer:P卜/P卜.(20uM)0.625ul、P卜/P卜(0.2yM)0.625ul比例為100:1、TagDNApolymerse(3M/L)0.5ul、無菌水補(bǔ)至25wl。不對稱PCR反應(yīng)條件同每種病毒各自擴(kuò)增割牛，不同的是循環(huán)數(shù)增加至40個(gè)循環(huán)。圖4為不X訴爾PCR擴(kuò)增結(jié)果。其中，M泳道表示DNAMarkerDL2000;l泳道表示上下游引物摩爾比為IOO:1的不X^爾PCR產(chǎn)物；2泳道表示上下游弓嫩摩爾比為50:1的不對-^PCR產(chǎn)物；3泳道表示普31PCR產(chǎn)物。經(jīng)12%聚丙烯凝膠電泳分離后，不對稱PCR產(chǎn)物中出現(xiàn)2條分子量較接近的條帶，雙llDNA產(chǎn)物與同時(shí)電泳的普iiPCR產(chǎn)物^量大小一致，略有滯后的條帶是單鏈擴(kuò)增產(chǎn)物，即單IIDNA產(chǎn)物。圖5為引物特異性跑膠^i正結(jié)果圖。其中，M泳道表示DNAMarkerDL2000，1、2泳道表示PPVNS1基因片斷，3、4泳道表示PPVVP2基因片斷。圖6為樣品與芯片雜交后用Genepix4000B掃描儀掃描的結(jié)果圖。從雜交結(jié)果可看出所有病毒基因的陽性寡核苷酸探針都離寺異性地與相應(yīng)樣品雜交，能檢領(lǐng)倒較強(qiáng)的熒光信號，而空白對照和陰性對照基本不能檢測到熒光信號。權(quán)利要求1.一種病毒病原高通量快速排查檢測方法，其特征在于，該方法的實(shí)現(xiàn)步驟包括(1)制備芯片探針設(shè)計(jì)，芯片點(diǎn)制，得寡核苷酸芯片；(2)待測樣本處理(2.1)引物的設(shè)計(jì)合成得到與待檢測病原對應(yīng)的引物；(2.2)生成單鏈DNA產(chǎn)物用與待檢測病原對應(yīng)的引物對待測樣本進(jìn)行同步不對稱PCR擴(kuò)增，生成與寡核苷酸探針特異性互補(bǔ)的單鏈DNA產(chǎn)物；(2.3)標(biāo)記熒光物質(zhì)在單鏈DNA產(chǎn)物上標(biāo)記熒光物質(zhì)，形成標(biāo)記上熒光物質(zhì)的單鏈DNA產(chǎn)物；(3)雜交將標(biāo)記上熒光物質(zhì)的單鏈DNA產(chǎn)物與寡核苷酸芯片雜交，清洗芯片；(4)檢測分析用熒光掃描儀掃描，得到病毒檢測分析結(jié)果。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的病毒病原高通量決速排査檢測方法，其特征在于，所述制備芯片的步驟包括(1)探針的設(shè)計(jì)根據(jù)病毒基因組保守序列設(shè)i討寺異性強(qiáng)的寡核苷^^針；(2)芯片點(diǎn)制先進(jìn)行片基表畫針布處理，然后纟十按照設(shè)計(jì)的陣列固定在片基上，制備成寡核苷酸芯片，進(jìn)行芯片點(diǎn)樣后處理，得寡核苷酸芯片。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2戶腿的病毒病原高通量決速排査檢測方法，其特征在于，所述標(biāo)記熒光物質(zhì)的步驟是(1)單鏈樣本的間接熒光標(biāo)己通過不X訴^PCRJf入的MS烯丙基和熒光分子cy3或cy5上的琥珀M胺基團(tuán)進(jìn)fi^接，使不對稱PCR單鏈產(chǎn)物連接上熒光^H己分子；(2)fH己產(chǎn)物的純化將熒光^H己產(chǎn)物用AmershamG"25柱進(jìn)行純化，除去未liH己的游離熒光分子，得純化后的熒光標(biāo)記的樣本，置于-2(TC避光保存，備雜交用。4.根據(jù)權(quán)利要求3戶;M的病毒病原高通量決速排査檢測方法，其特征在于，戶;M的熒光掃描儀為GenePix4000B掃描儀。5.根據(jù)權(quán)利要求4戶腿的病毒病原高通量決速排查檢測方法，期寺征在于，戶脫的引物設(shè)計(jì)合成中弓嫩的選出方案是引物長度15—30個(gè)，引物鵬鄉(xiāng)M^隨機(jī)分布，G+C含量在45-55%,引物自身不形成二級結(jié)構(gòu)，引物之間無互補(bǔ)序列，引物序列是被檢病毒特異的，引物3'端IK與模feDNAE^，引物3'^石Jtt以選T、C或者G。6.根據(jù)權(quán)利要求5戶腿的病毒病原高通量快速排查檢測方法，^#征在于，戶脫的探針設(shè)計(jì)方案是Tm值為85。C土5。C，00含量為50%~60%，重復(fù)的單一^S連續(xù)《6個(gè)，探針力^的二級結(jié)構(gòu)酉樹M長度《6bp，合^jg的弓i物和寡核苷^^針用滅菌7jC溶解，弓l物終農(nóng)度為20pmol/ul，探針終濃度為25pmol/iil;或合成后的寡核苷酸^lf用無菌水溶解至濃度為50uM/L，同2Xspottingbuffer1:l混合使其點(diǎn)樣終濃度調(diào)整為25uM/L。7.根據(jù)權(quán)利要求6戶;M的病毒病原高通量決速排查檢測方法，期寺征在于，戶皿單鏈樣本的間接熒光豐射己的步驟是取6嘴千燥的cy染料，力口5ul的DMSO室溫避光孵育l小時(shí)；用30tU0.1MPH9.3Na2CO3充分溶解純化后的不對禾敘CRss-DNA，然后立即轉(zhuǎn)移至孵育好的cy熒光染料中，吹吸混勻，室溫避光反應(yīng)l小時(shí)，每隔105>^溫和震蕩1分沐加入10iil4M羥胺，使夢勁安終濃度為1M，室溫靜置15分鐘。8.根據(jù)權(quán)利要求6戶，的病毒病原高通量^I排査檢測方法，^#征在于，戶，的將桐H己上熒光物質(zhì)的單IIDNA產(chǎn)物與寡核苷酸芯片雜交的步驟是將熒光標(biāo)己的樣本與lX以l:9的體積比混合，95。C變性3分鐘，使二級莖環(huán)結(jié)構(gòu)解能取混合樣品至芯片表面，置于雜交盒內(nèi)60。C雜交；戶誠的雜交液為50%甲醐安、5XSSC、0.1XSDS以及1X旁旌撤NA。9.根據(jù)權(quán)利要求8戶;M的病毒病原高通量f^l排查檢測方法，其特征在于，所述的制備芯片包括片基處理，步驟是用APTES溶^X寸Goldseal硅烷化玻片進(jìn)行處理，離心甩十，經(jīng)掃描后，選取背景均一且背景值較低的氨基化片基室溫千燥，保存以備用。10.根據(jù)權(quán)利要求9戶，的病毒病原高通量快速排査檢測方法，—欺寺征在于，戶;M芯片清洗的步驟是取出芯片，立g卩mA清洗激中清洗2次，每次10併中；再轉(zhuǎn)入4。C保存的清洗M中清洗1(K刀H中，最后常溫下將芯片離心甩干。清洗激可采用6XSSC以及Triton-X102，清洗柯如可采用0.1XSSC以及Triton-X102。全文摘要一種病毒病原高通量快速排查檢測方法，其步驟是(1)探針設(shè)計(jì)、芯片點(diǎn)制得寡核苷酸芯片；(2)引物設(shè)計(jì)合成，得到與待檢測病原對應(yīng)的引物；(3)生成單鏈DNA產(chǎn)物用與待檢測病原對應(yīng)的引物對待測樣本進(jìn)行同步不對稱PCR擴(kuò)增，生成與寡核苷酸探針特異性互補(bǔ)的單鏈DNA產(chǎn)物；(4)在單鏈DNA產(chǎn)物上標(biāo)記熒光物質(zhì)，形成標(biāo)記上熒光物質(zhì)的單鏈DNA產(chǎn)物；(5)將標(biāo)記上熒光物質(zhì)的單鏈DNA產(chǎn)物與寡核苷酸芯片雜交，清洗芯片；(6)用熒光掃描儀掃描，得病毒檢測分析結(jié)果。本發(fā)明解決了
背景技術(shù)：
中豬疫病病毒檢測方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，敏感性及特異性較低，檢測結(jié)果不準(zhǔn)確的技術(shù)問題。本發(fā)明可對多種基因進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、高效的檢測。文檔編號C12Q1/70GK101210270SQ20061010539公開日2008年7月2日申請日期2006年12月31日優(yōu)先權(quán)日2006年12月31日發(fā)明者錚李,王小強(qiáng),祁會彩,超陳,高金拽,鶴黃申請人:陜西北美基因股份有限公司