專利名稱：一種山桐子的組織培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到一種植物的組織培養(yǎng)方法，具體地說(shuō)，是涉及山桐子(Idesia polycarpaMaxim.)的組織培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
在現(xiàn)有技術(shù)中，沒(méi)有有關(guān)山桐子組織培養(yǎng)方法的報(bào)道，山桐子現(xiàn)有繁殖方法是用種子繁殖，由于種子發(fā)芽率低，苗木質(zhì)量參差不齊，無(wú)法達(dá)到良種壯苗的要求；同時(shí)該樹(shù)種為雌雄異株，雌株的果實(shí)多觀賞價(jià)值更高，而播種育苗雌雄混雜，分不清雌雄，通過(guò)組培的方法，可選擇雌株進(jìn)行大量繁殖。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種山桐子組織培養(yǎng)的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下。
一種山桐子的組織培養(yǎng)方法，它基本上由下列步驟組成步驟1將培養(yǎng)基注入玻璃瓶中，經(jīng)高溫高壓消毒(120-125℃，1.1KG/CM2)20分鐘待用，步驟2采用經(jīng)選育的國(guó)內(nèi)外優(yōu)良的種源優(yōu)良單株(生長(zhǎng)速度快、果實(shí)多觀賞價(jià)值高、抗逆性強(qiáng))的腋芽莖段為外植體，經(jīng)70％酒精消毒(30-45)秒，再用0.12％的升汞溶液消毒，(一般8-10分鐘)，用無(wú)菌水沖洗4-5次，步驟3在超凈的工作臺(tái)上，無(wú)菌條件下，將消毒的外植體接種在步驟1的含有接種、啟動(dòng)培養(yǎng)基的玻璃瓶中，將其置于日光為光源、光照強(qiáng)度為1500-2000lx下，每日照光12小時(shí)，溫度20-28℃、濕度為60％，培養(yǎng)35天，分化長(zhǎng)成芽苗，步驟4將從步驟3中長(zhǎng)成的芽苗，剪切，按步驟3接種于按步驟1的方法消毒的含有增殖培養(yǎng)基的玻璃瓶中，進(jìn)行增殖培養(yǎng)，不斷增殖，視繁殖生產(chǎn)需要100-2000瓶時(shí)進(jìn)入下一步，步驟5將步驟4中培養(yǎng)的試管芽苗，剪切，按步驟3接種于按步驟1的方法消毒的含有壯苗培養(yǎng)基的玻璃瓶中，進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，30-35天后進(jìn)入下一步，
步驟6將步驟5中的試管壯苗，去掉基部愈傷組織和部分葉片，留3-5片葉片，按步驟3接種子按步驟1的方法消毒含有生根培養(yǎng)基的玻璃瓶中，進(jìn)行生根培養(yǎng)10-15天，生根率達(dá)92％以上。
步驟7將步驟6中生長(zhǎng)的帶有完整根的小苗，取出清洗，移栽到含有礱糠灰∶黃心土＝1∶1(體積比)的基質(zhì)中，澆透水，保持溫度25-28℃，相對(duì)濕度80％以上，遮光(前10天)70％，后逐漸見(jiàn)光，20天后生根成活，生根率達(dá)85％以上，35-45天，全光照。
上述的接種、啟動(dòng)培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基添加噻苯隆(TDZ)至0.02-0.05毫克/升、添加6-芐基嘌呤(BA)至1.0-1.2毫克/升和添加α-萘乙酸(NAA)至0.05-0.2毫克/升，上述的增殖培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基添加TDZ至0.02-0.08毫克/升添加BA至1.5-2.5毫克/升和添加NAA至0.1-0.5毫克/升，上述的壯苗培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基添加TDZ至0.02-0.03毫克/升添加BA至0.8-1.2毫克/升和添加NAA至0.1-0.5毫克/升，上述的生根培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基添加NAA至0.3-0.5毫克/升和添加吲哚丁酸(IBA)至0.5-0.8毫克/升，上述的每升基本培養(yǎng)基中含有如下物質(zhì)種類和質(zhì)量硝酸鉀(KNO3)600-800毫克，硝酸銨(NH4NO3)500-650毫克，二水氯化鈣(CaCl2·2H2O)220-330毫克，七水硫酸鎂(MgSO4·7H2O)200-370毫克，磷酸二氫鉀(KH2PO4)75-90毫克，乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)49.8毫克，硫酸亞鐵(FeSO4)37.1毫克，四水硫酸錳(MnSO4·4H2O)12毫克，七水硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)4.5毫克，硼酸(H3BO3)6.2毫克，碘化鉀(KI)0.42毫克，二水鉬酸鈉(Na2MO4·2H2O)0.25毫克，五水硫酸銅(CuSO4·5H2O)0.025毫克，六水氯化鈷(CoCl2·6H2O)0.025毫克，鹽酸硫胺素0.18毫克，煙酸1.0毫克，鹽酸吡哆醇0.5毫克，肌醇80毫克，甘氨酸2毫克，蔗糖20毫克，卡拉膠6.5克。
本發(fā)明的特點(diǎn)在于；采用低鹽濃度的培養(yǎng)液，在各培養(yǎng)階段添加不同種類、濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，分別組成接種、啟動(dòng)培養(yǎng)基，增殖培養(yǎng)基，壯苗培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)基等。整個(gè)培養(yǎng)周期35-40天，培養(yǎng)倍數(shù)大于4.5天，高度大于3.85cm，試管內(nèi)生根率大于92％，試管苗煉苗移栽的成活率大于85％，可實(shí)現(xiàn)山桐子的大規(guī)模工廠化生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1.山桐子的組織培養(yǎng)所用的基本培養(yǎng)基如下(每升中所含物質(zhì)種類和質(zhì)量)硝酸鉀600毫升，硝酸銨500毫克，二水氯化鈣220毫升，七水硫酸鎂200毫克，磷酸二氫鉀75毫克，乙二胺四乙酸二鈉49.8毫克，硫酸亞鐵37.1毫克，四水硫酸錳12毫克，七水硫酸鋅4.5毫克，硼酸6.2毫克，碘化鉀0.42毫克，二水鉬酸鈉0.25毫克，五水硫酸銅0.025毫克，六水氯化鈷0.025毫克，鹽酸硫胺素0.18毫克，煙酸1.0毫克，鹽酸吡哆醇0.5毫克，肌醇80毫克，甘氨酸2毫克，蔗糖20毫克，卡拉膠6.5克，并最終調(diào)pH為5.8-6.0.
接種、啟動(dòng)培養(yǎng)基為上述基本培養(yǎng)基添加TDZ 0.02+BA 1.0+NAA 0.05(毫克/升)增殖培養(yǎng)基為上述基本培養(yǎng)基添加TDZ 0.02+BA 1.5+NAA 0.1(毫克/升)壯苗培養(yǎng)基為上述基本培養(yǎng)基添加TDZ 0.02+BA 0.8+NAA 0.1(毫克/升)生根培養(yǎng)基為上述基本培養(yǎng)基添加NAA 0.3+IBA 0.8(毫克/升)山桐子的組織培養(yǎng)方法由以下步驟組成步驟1將上述接種、啟動(dòng)培養(yǎng)基注入玻璃瓶中，經(jīng)高溫高壓消毒(120-125℃，1.1KG/CM2)20分鐘，待用。
步驟2采用經(jīng)選育的國(guó)內(nèi)外引進(jìn)的優(yōu)良種源優(yōu)良單株(生長(zhǎng)速度快、果實(shí)多觀賞價(jià)值高、抗逆性強(qiáng))的腋芽莖段為外植體，經(jīng)70％酒精消毒(30-45)秒，再用0.12％的升汞溶液消毒，(一般8-10分鐘)，用無(wú)菌水沖洗4-5次。
步驟3在超凈的工作臺(tái)上，無(wú)菌條件下，將消毒的外植體接種在步驟1的含有培養(yǎng)基的玻璃瓶，將其置于以日光為光源，光照強(qiáng)度為1500-2000lx，每日照光12小時(shí)，溫度20-28℃、濕度為60％的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)40天，分化長(zhǎng)成芽苗。
步驟4將從步驟3中長(zhǎng)成的芽苗，剪切，按步驟3接種于按步驟1的方法消毒的含有增殖培養(yǎng)基的玻璃瓶中，進(jìn)行增殖培養(yǎng)增殖倍數(shù)為4.8，不斷增殖。視繁殖生產(chǎn)需要達(dá)100-2000瓶時(shí)，進(jìn)入下一步。
步驟5將步驟4中培養(yǎng)的試管芽苗，剪切，按步驟3接種于按步驟1的方法消毒的含有壯苗培養(yǎng)基的玻璃瓶中，進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，40天高度為4.4CM，進(jìn)入下一步。
步驟6將步驟5中的試管壯苗，去掉基部愈傷組織和部分葉片，留3-5片葉片，按步驟3接種于按步驟1的方法消毒的含有生根培養(yǎng)基的玻璃瓶中，進(jìn)行生根培養(yǎng)15天，生根率達(dá)94％。
步驟7將步驟6中生長(zhǎng)的帶有完整根的小苗，取出清洗，移栽到含有礱糠灰∶黃心土＝1∶1(體積比)的基質(zhì)中，澆透水，保持溫度25-28℃，相對(duì)濕度80％以上，遮光(前10天)70％，后逐漸見(jiàn)光，20天后生根成活，生根率達(dá)88％以上，35-45天后，全光照。
實(shí)施例2.山桐子的組織培養(yǎng)所用的基本培養(yǎng)基如下(每升中所含物質(zhì)種類和質(zhì)量)硝酸鉀800毫升，硝酸銨650毫克，二水氯化鈣330毫升，七水硫酸鎂370毫克，磷酸二氫鉀90毫克，乙二胺四乙酸二鈉49.8毫克，硫酸亞鐵37.1毫克，四水硫酸錳12毫克，七水硫酸鋅4.5毫克，硼酸6.2毫克，碘化鉀0.42毫克，二水鉬酸鈉0.25毫克，五水硫酸銅0.025毫克，六水氯化鈷0.025毫克，鹽酸硫胺素0.18毫克，煙酸1.0毫克，鹽酸吡哆醇0.5毫克，肌醇80毫克，甘氨酸2毫克，蔗糖20毫克，卡拉膠6.5克，并最終調(diào)pH為5.8-6.0.
接種、啟動(dòng)培養(yǎng)基為上述基本培養(yǎng)基添加TDZ 0.05+BA 1.2+NAA 0.2(毫克/升)，增殖培養(yǎng)基為上述基本培養(yǎng)基添加TDZ 0.08+BA 2.5+NAA 0.5(毫克/升)，壯苗培養(yǎng)基為上述基本培養(yǎng)基添加TDZ 0.03+BA 1.2+NAA 0.5(毫克/升)，生根培養(yǎng)基為上述基本培養(yǎng)基添加NAA 0.5+IBA 0.5(毫克/升)，山桐子的組織培養(yǎng)方法由以下步驟組成步驟1將上述接種、啟動(dòng)培養(yǎng)基注入玻璃瓶中，經(jīng)高溫高壓消毒(120-125℃，1.1KG/CM2)20分鐘，待用。
步驟2采用經(jīng)選育的國(guó)內(nèi)外引進(jìn)的優(yōu)良種源優(yōu)良單株(生長(zhǎng)速度快、果實(shí)多觀賞價(jià)值高、抗逆性強(qiáng))的腋芽莖段為外植體，經(jīng)70％酒精消毒(30-45)秒，再用0.12％的升汞溶液消毒，(一般8-10分鐘)，用無(wú)菌水沖洗4-5次。
步驟3在超凈的工作臺(tái)上，無(wú)菌條件下，將消毒的外植體接種在步驟1的含有培養(yǎng)基的玻璃瓶，將其置于以日光為光源，光照強(qiáng)度為1500-2000lx，每日照光12小時(shí)，溫度20-28℃，濕度為60％的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)35天，分化長(zhǎng)成芽苗。
步驟4將從步驟3中長(zhǎng)成的芽苗，剪切，按步驟3接種于按步驟1的方法消毒的含有增殖培養(yǎng)基的玻璃瓶中，進(jìn)行增殖培養(yǎng)，增殖倍數(shù)為5.3，不斷增殖，視繁殖生產(chǎn)需要100-2000瓶，進(jìn)入下一步。
步驟5將步驟4中培養(yǎng)的試管芽苗，剪切，按步驟3接種于按步驟1的方法消毒的含有壯苗培養(yǎng)基的玻璃瓶中，進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，35天生長(zhǎng)高度為4.2CM，后進(jìn)入下一步，步驟6將步驟5中的試管壯苗，去掉基部愈傷組織和部分葉片，留3-5片葉片，按步驟3接種于接步驟1的方法消毒的含有生根培養(yǎng)基的玻璃瓶中，進(jìn)行生根培養(yǎng)12天，生根率達(dá)96.5％。
步驟7將步驟6中生長(zhǎng)的帶有完整根的小苗，取出清洗，移栽到含有礱糠灰∶黃心土＝1∶1(體積比)的基質(zhì)中，澆透水，保持溫度25-28℃，相對(duì)濕度80％以上，遮光(前10天)70％，后逐漸見(jiàn)光，20天后生根成活，生根率達(dá)92％以上，35-45天后，全光照。
權(quán)利要求
1.一種山桐子的組織培養(yǎng)方法，其特征是它基本上由下列步驟組成步驟1將培養(yǎng)基注入玻璃瓶中，經(jīng)高溫高壓消毒待用，步驟2采用經(jīng)選育的優(yōu)良種源的優(yōu)良單株的腋芽莖段為外植體，經(jīng)酒精和升汞溶液消毒，用無(wú)菌水沖洗4-5次，步驟3無(wú)菌條件下，將消毒的外植體接種在步驟1的含有接種、啟動(dòng)培養(yǎng)基的玻璃瓶中，將其置于日光為光源、光照強(qiáng)度為1500-20001x下，每日照光12小時(shí)，溫度20-28℃、濕度為60％，培養(yǎng)35天，分化長(zhǎng)成芽苗，步驟4將從步驟3中長(zhǎng)成的芽苗，剪切，按步驟3的方法接種于按步驟1的方法消毒的注入增殖培養(yǎng)基的玻璃瓶中，進(jìn)行增殖培養(yǎng)，不斷增殖，視繁殖生產(chǎn)需要100-1000瓶時(shí)，進(jìn)入下一步，步驟5將步驟4中培養(yǎng)的試管芽苗，剪切，按步驟3的方法接種于按步驟1的方法消毒的注入壯苗培養(yǎng)基的玻璃瓶中，進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，30-35天后進(jìn)入下一步，步驟6將步驟5中的試管壯苗，去掉基部愈傷組織和部分葉片，留3-5片葉片，接種于按步驟1的方法消毒的注入生根培養(yǎng)基的玻璃瓶中，進(jìn)行生根培養(yǎng)10-15天，步驟7將步驟6中生長(zhǎng)的帶有完整根的小苗，取出清洗，移栽到含有體積比為礱糠灰∶黃心土＝1∶1的基質(zhì)中，澆透水，保持溫度25-28℃，相對(duì)濕度80％以上，前10天遮光70％，后逐漸見(jiàn)光，20天后生根成活，35-45天后，全光照。上述的接種、啟動(dòng)培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基添加噻苯隆至0.02-0.05毫克/升、添加6-芐基嘌呤至1.0-1.2毫克/升和添加α-萘乙酸至0.05-0.2毫克/升，上述的增殖培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基添加噻苯隆至0.02-0.08毫克/升、添加6-芐基嘌呤至1.5-2.5毫克/升和添加α-萘乙酸至0.1-0.5毫克/升，上述的壯苗培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基添加噻苯隆至0.02-0.03毫克/升、添加6-芐基嘌呤至0.8-1.2毫克/升和添加α-萘乙酸至0.1-0.5毫克/升，上述的生根培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基添加α-萘乙酸至0.3-0.5毫克/升和添加吲哚丁酸至0.5-0.8毫克/升，上述的每升基本培養(yǎng)基中含有如下物質(zhì)種類和質(zhì)量硝酸鉀600-800毫克，硝酸銨500-650毫克，二水氯化鈣220-330毫克，七水硫酸鎂200-370毫克，磷酸二氫鉀75-90毫克，乙二胺四乙酸二鈉49.8毫克，硫酸亞鐵37.1毫克，四水硫酸錳12毫克，七水硫酸鋅4.5毫克，硼酸6.2毫克，碘化鉀0.42毫克，二水鉬酸鈉0.25毫克，五水硫酸銅0.025毫克，六水氯化鈷0.025毫克，鹽酸硫胺素0.18毫克，煙酸1.0毫克，鹽酸吡哆醇0.5毫克，肌醇80毫克，甘氨酸2毫克，蔗糖20毫克，卡拉膠6.5克。
全文摘要
一種山桐子的組織培養(yǎng)方法，它基本上由下列步驟組成1.將培養(yǎng)基高溫高壓消毒待用，2.采用優(yōu)良種源優(yōu)良單株的腋芽莖段為外植體，經(jīng)酒精和升汞溶液消毒，用無(wú)菌水沖洗，3.將消毒的外植體接種培養(yǎng)基中，置于人工提供的日光燈下，分化長(zhǎng)成芽苗，4.將芽苗剪切，接種于增殖培養(yǎng)基中，進(jìn)行增殖培養(yǎng)，5.將試管芽苗，剪切，接種于壯苗培養(yǎng)基中，進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，6.將試管壯苗去掉基部愈傷組織和部分葉片，留3－5葉片，接種于生根培養(yǎng)基中，進(jìn)行生根培養(yǎng)，7.將帶有完整根的小苗，取出清洗，移栽到含有礱糠灰+黃心土的基質(zhì)中，澆透水，前10天遮光70％，后逐漸見(jiàn)光，20天后生根成活，生根率達(dá)85％以上，35－45天后，全光照。本發(fā)明方法可實(shí)現(xiàn)山桐子的大規(guī)模工廠化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N5/04GK1802903SQ20061003780
公開(kāi)日2006年7月19日 申請(qǐng)日期2006年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月16日
發(fā)明者蔣澤平, 梁珍海, 吳綱, 季永華, 劉根林, 朱學(xué)雷, 李玉巧, 李勁, 李淑琴, 楊勇, 仇曙光, 袁芳 申請(qǐng)人:江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院