專利名稱：代謝活性微生物及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及代謝活性細(xì)菌的制備物、包含此制備物的組合物例如益生素補(bǔ)充物或動(dòng)物飼料及其用途，例如在治療疾病中的用途。本發(fā)明還涉及微生物的生長基質(zhì)，該生長基質(zhì)包含復(fù)合和簡單糖的混合物，和利用此生長基質(zhì)制造有代謝活性微生物制備物的方法。
背景技術(shù)：
通常使用微生物有機(jī)體作為食品補(bǔ)充物。一個(gè)實(shí)例是已知對(duì)腸道微生物群落具有有益影響的益生菌，其可增加對(duì)傳染性疾病比如腹瀉的抵抗力。益生素還顯示出涉及血液化學(xué)修飾和免疫調(diào)節(jié)(見參考文獻(xiàn)部分中列在潛在健康益處之下的參考文獻(xiàn))。
益生菌可在乳制品比如酸奶中發(fā)現(xiàn)并且已知有益健康的菌種包括那些來自腸球菌屬和乳桿菌屬的菌種。然而，益生素乳制品的保存期很短。消費(fèi)者也能買到粉末或片劑形式的益生素。益生素另外的應(yīng)用涉及在動(dòng)物飼料中的使用。
目前保存細(xì)菌培養(yǎng)物的方法通常使用凍干法，也被稱作冷凍干燥法。在此方法中，通過升華作用從生物體除去水并且在加入水后生物體可以復(fù)活。然而，凍干的細(xì)菌沒有代謝活性并且眾所周知的是凍干的產(chǎn)物在室溫下保存幾周后通常喪失了它們大部分的復(fù)原能力(Fonseca et al andMurga et al)。
此外，許多商業(yè)益生素似乎并不包含標(biāo)簽上所提及的所有菌種，并且存在的細(xì)菌中活細(xì)菌量經(jīng)常是非常低的(J.Hamilton-Miller)。
現(xiàn)在本發(fā)明人已經(jīng)確認(rèn)，活的、有代謝活性細(xì)菌的穩(wěn)定制備物可使用特定的生長基質(zhì)來制備，該生長基質(zhì)包含平衡量的復(fù)合和簡單碳水化合物。與現(xiàn)有技術(shù)中的益生素相比，根據(jù)本發(fā)明提供的制備物包含大量可在長期儲(chǔ)存期間保持穩(wěn)定和活性的細(xì)菌。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一方面提供了包含活的、有代謝活性的細(xì)菌的制備物以及包含復(fù)合和簡單碳水化合物的混合物的生長基質(zhì)，其中細(xì)菌表現(xiàn)出平衡的生長狀態(tài)，該狀態(tài)的特征在于當(dāng)在約4℃和控制pH條件下保存至少5個(gè)月時(shí)，細(xì)菌群保持穩(wěn)定的水平。
本發(fā)明的一個(gè)基本特征是，在此制備物中細(xì)菌培養(yǎng)物可以在4℃、控制pH條件下至少5個(gè)月期間維持平衡狀態(tài)。在此狀態(tài)中，維持細(xì)菌的增殖率接近其死亡率。在優(yōu)選實(shí)施方案中，接近平衡狀態(tài)的有代謝活性細(xì)菌群維持在108-109個(gè)活細(xì)胞/ml制備物。
所述生長基質(zhì)包含復(fù)合和簡單碳水化合物(糖)的混合物。在本文中使用的術(shù)語“復(fù)合碳水化合物”或“復(fù)合糖”包括寡糖和多糖，而術(shù)語“簡單碳水化合物”或“簡單糖”包括單糖和二糖。
優(yōu)選的是，生長基質(zhì)中糖的總量為20mg/ml-40mg/ml，還原糖的總量為5mg/ml-20mg/ml。在優(yōu)選實(shí)施方案中，總的糖濃度為約30mg/ml，還原糖的濃度為約10mg/ml。
所述生長基質(zhì)優(yōu)選還包含蛋白質(zhì)和肽成分。典型的是，基質(zhì)中存在的蛋白質(zhì)和肽的總量為1mg/ml-2mg/ml，高分子量肽(分子量大于5000道爾頓)的總量為100μg/ml-300μg/ml。在特定的實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)和肽的濃度可以是約2mg/ml，高分子量肽的濃度可以是約250μg/ml。
所述生長基質(zhì)可以包含另外的成分，例如纖維素、淀粉、β-葡聚糖、戊聚糖、多酚、核糖核酸、脂質(zhì)、磷酸鹽、類黃酮(flavenoids)、氨基酸、維生素(B1、B2、C和E)、硅酸鹽和微量元素。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，生長基質(zhì)來源于發(fā)芽的谷物。最優(yōu)選的是，用下文描述的方法制備生長基質(zhì)。
本發(fā)明比目前的益生素制備物具有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)橛写x活性細(xì)菌可以保存許多個(gè)月而沒有退化或喪失活性。目前使用的凍干細(xì)菌制備物通常即便有也只含很少的有代謝活性細(xì)菌。此外，凍干的細(xì)菌制備物一旦再水化，將喪失它們的一些特性和活性。同樣，再活化細(xì)菌的貯藏壽命很短并且只能保存很短的時(shí)間。在用于宿主動(dòng)物之前，凍干的細(xì)菌通常不被再水化。如果它們被再水化，那么它們必須在當(dāng)天使用，否則活力將迅速喪失并且會(huì)因?yàn)槲廴旧锒瘮 ?br>
現(xiàn)有技術(shù)的凍干制備物的另一個(gè)問題是吸濕(從空氣中吸收水分)并且因此包裝物必須在開封后的幾天內(nèi)使用，否則部分的水化作用將引起活力的快速喪失。
根據(jù)本發(fā)明的制備物避免了上面列舉的有關(guān)使用凍干的細(xì)菌培養(yǎng)物的問題。此外，發(fā)明人也顯示了根據(jù)本發(fā)明制備的細(xì)菌培養(yǎng)物比通過現(xiàn)有技術(shù)中的已知方法制備的細(xì)菌明顯更加強(qiáng)壯，其能夠使細(xì)菌在宿主動(dòng)物體內(nèi)更快地定居并且能容忍哺乳動(dòng)物消化道的苛刻環(huán)境(在實(shí)施例5中舉例說明)。
發(fā)明人已經(jīng)克服了常規(guī)上使用的制備物的問題，通過使用具有平衡營養(yǎng)供給的，復(fù)合和簡單糖、蛋白質(zhì)和肽形式的生長基質(zhì)，并結(jié)合控制pH和冷藏條件。在這些條件下，制備物中的細(xì)菌持續(xù)緩慢地生長。溫度、pH、階段生長和基質(zhì)的組合強(qiáng)制形成了接近平衡的生長狀態(tài)，從而活的、有代謝活性細(xì)菌的高濃度可以維持至少5個(gè)月。
在一個(gè)實(shí)施方案中，保存時(shí)維持制備物的pH為3.8-4.5。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，保存期間制備物的pH維持在約4.0。可通過加入合適的緩沖劑或緩沖試劑的組合來方便地控制制備物的pH。優(yōu)選的緩沖劑包括，例如，檸檬酸三鈉或磷酸緩沖劑。本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法描述了緩沖劑，比如檸檬酸三鈉或磷酸緩沖劑的使用。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，制備物中的細(xì)菌是乳酸菌。在本文中使用的術(shù)語“乳酸菌(LAB)”描述的是一組革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性、非運(yùn)動(dòng)性厭氧細(xì)菌，它們將碳水化合物發(fā)酵成乳酸。這個(gè)組包括乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、片球菌屬(Pediococcus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)和腸球菌屬(Enterococcus)。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述細(xì)菌屬于乳桿菌屬或腸球菌屬。在最優(yōu)選實(shí)施方案中，乳酸菌屬于以下菌種中的至少一種屎腸球菌(Enterococcus faecium)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)和嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用屎腸球菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌的組合。
所述制備物還可以包含抗真菌劑，例如滅菌的山梨酸鉀和/或抗氧化劑，比如維生素C。
在本發(fā)明第二方面中還提供了包含碳水化合物復(fù)合混合物的微生物(特別是細(xì)菌)的生長基質(zhì)。所述生長基質(zhì)包括包含糖的單體、二聚體、低聚體和多聚體的復(fù)合和簡單糖的混合物。
在上面有關(guān)本發(fā)明第一方面的描述中基本上給出了生長基質(zhì)的優(yōu)選特征。因此，生長基質(zhì)中存在的碳水化合物(簡單糖加上復(fù)合糖)總量優(yōu)選為20mg/ml-40mg/ml，更優(yōu)選25mg/ml-35mg/ml和最優(yōu)選約30mg/ml。在這個(gè)總碳水化合物(糖)含量中，還原糖(單糖)的總量優(yōu)選為5mg/ml-20mg/ml，更優(yōu)選5mg/ml-15mg/ml和最優(yōu)選約10mg/ml。
盡管簡單和復(fù)合碳水化合物是生長基質(zhì)的關(guān)鍵成分，應(yīng)該理解的是生長基質(zhì)還可以包含另外的成分，比如提供細(xì)菌生長氮源的蛋白質(zhì)。由此生長基質(zhì)優(yōu)選包含的蛋白質(zhì)和肽的總量為1mg/ml-2mg/ml，優(yōu)選約2mg/ml。在這個(gè)總的蛋白質(zhì)/肽含量中，高分子量肽(分子量大于5000道爾頓)的總量可以是100μg/ml-300μg/ml，典型的為約250μg/ml。生長基質(zhì)中蛋白質(zhì)和肽成分的準(zhǔn)確特征(例如氨基酸序列)通常不是本發(fā)明的內(nèi)容。
所述生長基質(zhì)可包含另外的成分，例如纖維素、淀粉、β-葡聚糖、戊聚糖、多酚、核糖核酸、脂質(zhì)、磷酸鹽、類黃酮(flavenoids)、氨基酸、維生素(B1、B2、C和E)、硅酸鹽和微量元素。基質(zhì)中這些額外成分的準(zhǔn)確特征和相對(duì)量沒有特定的限制。如果優(yōu)選的話，生長基質(zhì)是源自天然植物來源，例如發(fā)芽的谷物，這些另外的成分通常是天然存在的生物分子。
所述生長基質(zhì)可包含各種添加物比如緩沖劑和其它用來改善基質(zhì)性能和/或延長保存期的物質(zhì)。這樣的添加物可以包括，例如，抗真菌劑、抗氧化劑等。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述生長基質(zhì)可以包含顆粒物質(zhì)，例如直徑不超過1mm的顆粒。
可從發(fā)芽的谷物開始使用下文描述的制造方法制備生長基質(zhì)。然而，本發(fā)明不限于根據(jù)此方法制備的基質(zhì)?？梢杂煤铣傻姆绞街苽滹@示基本相似特性的生長基質(zhì)，例如將必需的復(fù)合和簡單碳水化合物與上面列舉的任何另外成分一起進(jìn)行混合。
本發(fā)明的另一方面提供了制備微生物的生長基質(zhì)的方法，所述方法包括將發(fā)芽的谷物糖化，其中混合發(fā)芽的谷物與水成液并置于限制復(fù)合碳水化合物向簡單碳水化合物轉(zhuǎn)化程度的時(shí)間和溫度條件下，從而獲得復(fù)合和簡單碳水化合物、蛋白質(zhì)和肽的混合物，和從經(jīng)過處理的發(fā)芽谷物中分離復(fù)合和簡單碳水化合物、蛋白質(zhì)和肽的混合物，從而獲得生長基質(zhì)。
本文中使用的術(shù)語“發(fā)芽的谷物”或“麥芽”表示用麥芽制造方法處理谷物的產(chǎn)物。在釀造領(lǐng)域中麥芽制造是眾所周知的方法。
在典型的麥芽制造方法中，使谷物發(fā)芽以誘導(dǎo)貯存營養(yǎng)物的活動(dòng)化(mobilisation)。發(fā)芽的種子產(chǎn)生大量酶以動(dòng)員(mobilize)貯存的蛋白質(zhì)和碳水化合物，包括將淀粉水解成麥芽糖的α-淀粉酶。優(yōu)選的實(shí)施方案涉及大麥的使用，但是在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以使用其它谷物，比如稻、小麥、玉米和燕麥或甚至它們的混合物。發(fā)芽的方法通常是眾所周知的。
應(yīng)該理解的是可以通過提供發(fā)芽的谷物或包含碳水化合物、蛋白質(zhì)和酶混合物的合成基質(zhì)來實(shí)施本方法。
優(yōu)選的是，在進(jìn)一步的處理之前碾壓發(fā)芽谷粒。通過碾壓使谷物破裂促進(jìn)了糖化步驟中水的進(jìn)入和營養(yǎng)物的提取，同時(shí)避免谷物粉碎以參與隨后從經(jīng)過處理的發(fā)芽的谷物中分離生長基質(zhì)。
制備的麥芽經(jīng)過糖化步驟，該步驟類似于釀造方法中所用的糖化步驟(例如見Kunze，W.Technology Brewing and Malting(1996))。術(shù)語“糖化”在釀造領(lǐng)域中是眾所周知的，并且涉及將發(fā)芽的谷物在加熱到確定溫度的水中攪動(dòng)來制備麥芽汁的過程。在糖化步驟中，發(fā)芽谷物中的復(fù)合碳水化合物被降解成麥芽糖。
本發(fā)明的方法也涉及糖化(mash)步驟，其中發(fā)芽的谷物與水成液(通常是水)混合并且將混合物加熱至各種規(guī)定的溫度。然而，這個(gè)糖化步驟與典型啤酒釀造的糖化方法不一致。啤酒釀造的目的在于盡可能多地將碳水化合物轉(zhuǎn)化成簡單糖，隨后發(fā)酵成酒精。與此相比，本發(fā)明的方法中特別地選擇糖化步驟的條件從而限制轉(zhuǎn)化成簡單(還原)糖的程度，剩余相當(dāng)數(shù)量更復(fù)雜的低聚體和多聚體形式的碳水化合物。
在非限制性實(shí)施方案中，可以限制碳水化合物的轉(zhuǎn)化程度，使得得到的生長基質(zhì)中存在的以總碳水化合物含量百分比(w/w)形式表示的簡單(還原)糖的量為10％(w/w)-50％(w/w)。
期望的復(fù)合糖向簡單糖有限轉(zhuǎn)化可通過在短時(shí)間內(nèi)增加糖化步驟中的溫度來實(shí)現(xiàn)，典型地為30分鐘，并且不讓發(fā)芽谷物/水的混合物在中間溫度靜置。傳統(tǒng)釀造方法包括在60-65℃和70-74℃靜置，因?yàn)檫@使得酶產(chǎn)生高濃度的簡單糖(主要是麥芽糖)。由此，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，糖化步驟不包括在60℃-65℃和/或70℃-74℃的溫度下靜置。
在特定的實(shí)施方案中，糖化步驟包括將發(fā)芽的谷物與水在30℃-45℃的溫度下混合，靜置混合物1-2個(gè)小時(shí)，在20-40分鐘內(nèi)使溫度升至75℃-85℃，優(yōu)選30分鐘，隨后使混合物在75℃-85℃靜置60-90分鐘。在較高的溫度下，混合物中存在的任何酶都將失活并且可以提取營養(yǎng)物。通常優(yōu)選76℃-80℃，尤其是78℃的較高溫度。在此步驟中，溫度需要在足夠長的時(shí)間內(nèi)足夠的高，從而使制備物中存在的所有酶失活。應(yīng)該理解的是，所用的溫度和時(shí)間可以根據(jù)所用谷物的類型稍微改變。
本文描述的方法尤其限制復(fù)合糖向簡單糖轉(zhuǎn)化的量。此外，在30℃-45℃下最初的靜置提供的另外益處在于，它使氨基酸和肽的釋放最大化。通常優(yōu)選所述范圍內(nèi)較高一端的溫度，即40℃-45℃或特別是約45℃。此步驟的目的是將谷物中存在的貯存蛋白質(zhì)水解成可用的氨基酸和肽。實(shí)現(xiàn)期望的水解所需的時(shí)間和溫度的最佳組合可以根據(jù)所用谷物的類型稍微改變。
在用來支持微生物的生長的生長基質(zhì)中期望存在高濃度的蛋白質(zhì)、肽和氨基酸，因?yàn)樗峁┝擞杏玫牡?。在傳統(tǒng)釀造中所用的典型糖化方法通常不包括在此溫度范圍內(nèi)的靜置，因?yàn)槠【浦圃焱ǔ２粚で笤诖蛩阌脕戆l(fā)酵產(chǎn)生酒精的麥芽汁中獲得高的蛋白質(zhì)或氨基酸含量。
當(dāng)糖化步驟完成時(shí)，例如已經(jīng)從現(xiàn)有的“經(jīng)過處理的”發(fā)芽谷物中提取了所有期望的營養(yǎng)物，使用任何合適的手段可以從麥糟中分離產(chǎn)生的包含復(fù)合和簡單碳水化合物、蛋白質(zhì)和肽的混合物從而獲得生長基質(zhì)。典型地這包括粗過濾，例如使用1mm過濾材料比如楔形-鐵絲籃，產(chǎn)生包含粗顆粒的溶液。本發(fā)明方法的特征是所述生長基質(zhì)未被澄清化，正如通常標(biāo)準(zhǔn)釀造中制備麥芽汁的情形。在傳統(tǒng)釀造中，通常將麥芽汁澄清化以去除所有粗的顆粒，由此產(chǎn)生清澈的液體。
在根據(jù)本發(fā)明方法所制備的生長基質(zhì)中存在一些顆粒物對(duì)隨后用于支持細(xì)菌生長是有益處的，因?yàn)樗纯梢跃徛尫艩I養(yǎng)物又提供了附著細(xì)菌培養(yǎng)物的顆粒表面。
如果是必需的話，根據(jù)本發(fā)明制備的生長基質(zhì)可以在進(jìn)一步應(yīng)用前進(jìn)行滅菌。應(yīng)該理解的是，這能通過煮沸約一小時(shí)來實(shí)施或者通過在120℃高壓滅菌約20分鐘來實(shí)施。
如果需要的話可以向生長基質(zhì)加入緩沖劑或幾種緩沖成分，例如，如果生長基質(zhì)隨后將用于制造根據(jù)本發(fā)明第一方面的細(xì)菌制備物。優(yōu)選的緩沖劑與在有關(guān)本發(fā)明第一方面中所列舉的緩沖劑一樣。如果生長基質(zhì)要進(jìn)行滅菌，緩沖劑可以根據(jù)需要在滅菌之前、期間或之后加入。
在本發(fā)明另一方面中還涉及生產(chǎn)活的、有代謝活性和穩(wěn)定的微生物的方法，包括使微生物在包含復(fù)合和簡單糖、蛋白質(zhì)和肽的混合物的生長基質(zhì)中生長，從而獲得微生物制備物，和將得到的制備物冷卻至約4℃，其中微生物處于接近平衡的生長狀態(tài)，所述狀態(tài)的特征在于當(dāng)在約4℃和控制pH條件下保存至少5個(gè)月時(shí)，制備物中的細(xì)胞群可以維持穩(wěn)定的水平，和任選地在約4℃保存制備物。
在此方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述微生物是細(xì)菌。
在特定的實(shí)施方案中，細(xì)菌在生長基質(zhì)中生長，直到它們的濃度達(dá)到2×108-1×109集落形成單位/ml。在這時(shí)，培養(yǎng)物(或發(fā)酵物)被冷卻至約4℃并且溫度、pH、生長階段和剩余基質(zhì)組成的組合提供了允許在長期保存期間維持接近平衡生長狀態(tài)的平衡條件。在這個(gè)可以維持至少5個(gè)月的接近平衡狀態(tài)中，有代謝活性的細(xì)菌群被維持在108-109個(gè)活細(xì)胞/ml的基本穩(wěn)定的水平上。然而，應(yīng)該理解的是，在接近平衡狀態(tài)的活細(xì)胞的精確量可以根據(jù)所用細(xì)菌的菌種稍微改變。
根據(jù)本發(fā)明這個(gè)方面的方法包括“生長步驟”，其中微生物(例如細(xì)菌)在生長基質(zhì)中生長，直到它們達(dá)到能夠在隨后保存期間實(shí)現(xiàn)接近平衡條件的濃度。該方法的重要特征是所用的生長基質(zhì)提供均衡的營養(yǎng)供應(yīng)，該營養(yǎng)供應(yīng)包含復(fù)合和簡單糖的混合物，其中碳水化合物含量的很大比例是可用作微生物的能源的復(fù)合糖形式。這種混合物幫助在生長步驟期間限制立即可用的能量。生長基質(zhì)的組成和優(yōu)選特征優(yōu)選地如上面有關(guān)本發(fā)明第一和第二方面中描述的。優(yōu)選使用本文中描述的制造方法從發(fā)芽的谷物制備生長基質(zhì)。然而，應(yīng)該理解的是，不必嚴(yán)格地使用根據(jù)此方法制備的生長基質(zhì)。使用通過混合所需比例的復(fù)合和簡單碳水化合物、蛋白質(zhì)和肽而合成制備的生長基質(zhì)可以獲得相似的結(jié)果。
在進(jìn)行生長步驟時(shí)，必須注意不能使微生物生長時(shí)間過長，以避免產(chǎn)生酸性條件，否則酸性條件將抑制進(jìn)一步的生長以及限制所得制備物的保存期。另一方面，如果過早地終止生長步驟，這將限制生物量生產(chǎn)。在微生物生長期間，制備物的pH可用作接近平衡狀態(tài)的指示器。在典型的實(shí)施方案中，乳酸菌培養(yǎng)物可以生長至pH達(dá)到4.5+/-0.3個(gè)單位。
應(yīng)該理解的是生長基質(zhì)的pH可以根據(jù)所用微生物(例如細(xì)菌)的最佳pH范圍稍微改變。在典型的實(shí)施方案中(適用于乳酸菌)，在保存期間pH應(yīng)該維持在3.8-4.5。優(yōu)選的是，將緩沖劑，比如檸檬酸三鈉或磷酸鹽加入生長基質(zhì)從而控制微生物生長期間和隨后保存期間的pH。
應(yīng)該理解的是，微生物(例如細(xì)菌)生長至接近平衡狀態(tài)的步驟的準(zhǔn)確時(shí)機(jī)取決于所用菌種。微生物生長可以在任何合適的培養(yǎng)裝置中進(jìn)行。在特定實(shí)施方案中，生長步驟可以在發(fā)酵容器中通過發(fā)酵的方式進(jìn)行。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，所用微生物是乳酸菌。優(yōu)選菌種屬于腸球菌屬和乳桿菌屬。如果使用主要由簡單糖組成的“常規(guī)”生長培養(yǎng)基培養(yǎng)這樣的菌種，過度的能量供應(yīng)將使乳酸菌產(chǎn)生過量的酸，這將限制生物量的產(chǎn)生和所得培養(yǎng)物的保存期。相比之下，本發(fā)明方法所用的生長基質(zhì)中存在的糖的復(fù)合混合物提供用在初始生長步驟中的能源，還用于產(chǎn)物保存期間的維持。
根據(jù)本發(fā)明，可以使用細(xì)菌的單一菌種(或其它微生物)實(shí)施生長步驟。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，兩種或多種不同的細(xì)菌(微生物)菌種可以在分開的生長培養(yǎng)基中獨(dú)立生長并且隨后在冷卻步驟之前或之后混合在一起。用于獨(dú)立培養(yǎng)兩種或多種不同細(xì)菌菌種的生長培養(yǎng)基可以是相同或不同的組成。因此，可以最佳化培養(yǎng)單一細(xì)菌菌種的生長條件并且隨后將培養(yǎng)物組合在一起，用于在允許維持培養(yǎng)物中各個(gè)單一菌種平衡生長的條件下的保存。
在此方法的其它實(shí)施方案中，如果它們的生長率是相當(dāng)?shù)?，使得一個(gè)菌種不能支配整個(gè)菌群，那么兩種或多種不同的細(xì)菌菌種(或其它微生物)就可以在相同生長基質(zhì)中的同一培養(yǎng)物中一起培養(yǎng)。生長步驟之后，可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法分析制備物以確定微生物純度并計(jì)數(shù)微生物。也可以在分開的生長基質(zhì)中一起培養(yǎng)兩種或多種不同的微生物(例如細(xì)菌)組合，隨后將培養(yǎng)物一起組合在終產(chǎn)物中。組合培養(yǎng)物可以同樣地與單一細(xì)菌菌種培養(yǎng)物混合。
用于本方法生長步驟的起始培養(yǎng)物包括，例如，凍干的細(xì)菌或液體培養(yǎng)物。
應(yīng)該理解的是，使用本發(fā)明方法制備的微生物制備物可以在冷卻步驟后立即使用，但是更典型的是在使用之前保存制備物。為了在培養(yǎng)物中維持接近平衡的生長狀態(tài)，保存的最佳溫度為約4℃，但是技術(shù)人員應(yīng)該理解的是保存溫度可以稍微改變。方便起見，可以在長期保存之前將由此方法產(chǎn)生的接近平衡的培養(yǎng)物的等分樣分裝成合適的滅菌包裝。
本發(fā)明方法的一個(gè)關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)在于，當(dāng)在延長的時(shí)間內(nèi)保存時(shí)，典型地是至少5個(gè)月，產(chǎn)生的接近平衡的培養(yǎng)物保持存活性和完整性。然而，應(yīng)該理解的是，在使用之前培養(yǎng)物必須實(shí)際保存至少5個(gè)月對(duì)于本方法而言并不是必需的。
為避免真菌或酵母的生長，在保存之前，可以加入抗真菌劑，比如滅菌的山梨酸鉀?？拐婢鷦┲饕菫榱朔乐棺罱K用戶使用期間，一旦產(chǎn)品容器被打開時(shí)由酵母或真菌引起的腐敗。此外，可以加入有助于防止保存期間產(chǎn)品腐敗的抗氧化劑，例如，維生素C。應(yīng)該理解的是，還可以使用本領(lǐng)域熟知的其它試劑作為抗真菌劑或抗氧化劑。
在本發(fā)明的另一方面中還涉及產(chǎn)生活的、有代謝活性的和穩(wěn)定的微生物制備物的可選擇方法，其不需要活躍的生長步驟。這種方法包括以下步驟將微生物加入包含復(fù)合和簡單糖、蛋白質(zhì)和肽的混合物的生長基質(zhì)以形成微生物制備物，其中微生物以提供接近平衡生長狀態(tài)的濃度加到生長基質(zhì)中，所述接近平衡生長狀態(tài)的特征在于當(dāng)在約4℃和控制pH條件下保存至少5個(gè)月時(shí)，制備物中的微生物群可以維持穩(wěn)定水平，和任選地在約4℃保存制備物。
在此方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述微生物是細(xì)菌。優(yōu)選的細(xì)菌菌種與上面有關(guān)需要活躍生長步驟的方法中列舉的一樣。
此方法在施加接近平衡生長的條件之前，微生物(例如細(xì)菌)不需要在生長基質(zhì)中生長。更確切的是，將微生物(例如細(xì)菌)起始培養(yǎng)物以一定的濃度接種至生長基質(zhì)，所述濃度允許所得制備物在4℃和受控pH條件下保存至少5個(gè)月時(shí)維持平衡狀態(tài)。所述方法的起始培養(yǎng)物包括，例如，凍干的細(xì)菌或液體培養(yǎng)物?？梢杂贸^一種的細(xì)菌菌種接種生長基質(zhì)。優(yōu)選的是，起始培養(yǎng)物中活細(xì)胞的濃度超過108個(gè)活細(xì)胞/ml。
通過生長基質(zhì)中的營養(yǎng)物、溫度、pH和階段生長的組合再次達(dá)到接近平衡的狀態(tài)。在能夠維持至少5個(gè)月的接近平衡的狀態(tài)中，優(yōu)選將有代謝活性的細(xì)菌群維持在108-109個(gè)活細(xì)胞/ml的穩(wěn)定水平。還應(yīng)該理解的是，接近平衡狀態(tài)的活細(xì)胞的準(zhǔn)確量可根據(jù)所用細(xì)菌的菌種稍微改變。還應(yīng)該理解的是，起始培養(yǎng)物的濃度和生長基質(zhì)的pH可以根據(jù)所用細(xì)菌的種類稍微改變。
將在有關(guān)應(yīng)用需要生長步驟的方法中所產(chǎn)生的接近平衡的培養(yǎng)物中描述的優(yōu)選特征加以必要的變更應(yīng)用于使用這種方法獲得的接近平衡的培養(yǎng)物。因此，在優(yōu)選實(shí)施方案中，保存期間接近平衡的培養(yǎng)物的pH維持在3.8-4.5。優(yōu)選的是，在保存期間使用緩沖劑，比如檸檬酸三鈉或磷酸鹽來控制pH。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，所用微生物是乳酸菌。優(yōu)選的菌種屬于腸球菌屬和乳桿菌屬。
在此方法中所用的生長基質(zhì)的優(yōu)選特征與上面有關(guān)本發(fā)明第二方面中所描述的一樣。另一方面，使用本文中描述的方法從發(fā)芽的谷物制備所述生長基質(zhì)是優(yōu)選的但不是必需的。
有代謝活性細(xì)菌的制備物的用途有益健康的益生素是眾所周知的(見，例如，Marteau，P.andRambaud，J-C，(1996)‘Therapeutic applications of probiotics inhumans’in Leeds，A.R.and Rowland，I.R.(eds.)Gut flora andhealth-past，present and future，Royal Society of Medicine Press Limited，London；Stark，B.A.and Wilkinson，(eds.)(1989)Probiotics.Theoryand Applications)。益生素已經(jīng)顯示出對(duì)治療腹瀉和便秘、腸易激綜合征、癌的治療和預(yù)防與其它影響腸內(nèi)微生物群落的疾病是有用的。
因此，發(fā)現(xiàn)了由本發(fā)明提供的細(xì)菌制備物在治療或預(yù)防影響微生物腸內(nèi)群落的疾病中的特定效用，和在幫助維持健康微生物群落中更普遍的效用。
由此，本發(fā)明的另一方面提供治療和預(yù)防影響人或動(dòng)物患者腸內(nèi)微生物平衡的病癥的方法，包括向需要的患者施用有效量的根據(jù)本發(fā)明的有代謝活性和穩(wěn)定的細(xì)菌制備物。
具體而言，本發(fā)明涉及治療或預(yù)防慢性炎性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎或克羅恩病。此外，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)菌培養(yǎng)物可以給人或動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物或鳥)施用以全面維持健康的微生物群落，而不是用于治療特定的疾病。
在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的有代謝活性和穩(wěn)定的細(xì)菌制備物在制備治療影響微生物腸內(nèi)群落的疾病的藥物中的用途。
細(xì)菌制備物可以以本來形式使用，例如作為益生素補(bǔ)充物使用，或者在施用給人或動(dòng)物對(duì)象之前它們可以與另外的成分混合，或者甚至不混合的與另外的成分一起施用。對(duì)于獸醫(yī)使用，可以很方便地將細(xì)菌制備物加到正常動(dòng)物飼料中。在獸醫(yī)領(lǐng)域中發(fā)現(xiàn)所述制備物在治療鳥類，尤其是市售家禽(如在所附實(shí)施例中列舉的)，以及治療哺乳動(dòng)物種類，例如牛、羊、馬、貓、狗等中的特定效用。
對(duì)于人的應(yīng)用，所述細(xì)菌制備物可以以本來形式施用，或者在施用于人對(duì)象之前與另外的成分再次混合或配置后再施用。因此本發(fā)明包括含有根據(jù)本發(fā)明的細(xì)菌制備物加上一種或多種另外成分的組合物。通過實(shí)例的方式，可以加入另外的成分以改善人消費(fèi)的組合物的可口性。如果為了便利，可以將根據(jù)本發(fā)明的制備物并入人消費(fèi)用的食品或飲料中，只要這不影響細(xì)菌在制備物中的存活性。
對(duì)于人和/或獸醫(yī)的使用，可以將根據(jù)本發(fā)明的制備物方便地配制成單位劑量形式，單獨(dú)的或者是與一種或多種藥學(xué)上可接受的稀釋劑、賦形劑或載體組合在一起。同樣，這種制劑不應(yīng)該對(duì)細(xì)菌在制備物中的存活性有不利的影響。
結(jié)合附圖參考以下非限制性試驗(yàn)實(shí)施例將更進(jìn)一步理解本發(fā)明，其中圖1a-1d顯示根據(jù)本發(fā)明描述的方法制備的植物乳桿菌液體培養(yǎng)物(“濕性”)與凍干的細(xì)菌制備物(“干性”)強(qiáng)壯性的比較。最先的兩個(gè)生長曲線(圖1a和1b)表明在非有害環(huán)境(non-hostile)中，根據(jù)本發(fā)明制備的細(xì)菌比凍干的制備物生長更快。圖1c中的生長曲線顯示通過本文描述的方法制備的植物乳桿菌(“濕性”)與凍干的細(xì)菌制備物(“干性”)在補(bǔ)充膽汁鹽的培養(yǎng)基中生長的比較。圖1d顯示通過本文描述的方法制備的植物乳桿菌(“濕性”)與凍干的細(xì)菌制備物(“干性”)在模擬哺乳動(dòng)物消化道環(huán)境的低pH和存在膽汁鹽的條件下生長的比較。結(jié)果顯示根據(jù)本發(fā)明方法制備的細(xì)菌對(duì)有害環(huán)境有更強(qiáng)的抵抗性。
圖2a和2b顯示根據(jù)本發(fā)明制備的細(xì)菌的保存期增加。
圖3顯示細(xì)菌在小雞小腸中的建群。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1使用基于大麥的培養(yǎng)基生產(chǎn)生長基質(zhì)(A)發(fā)芽(麥芽制造)第一天根據(jù)谷物的批次，將大麥在水中浸泡2-24小時(shí)。水中可含有0.1％(w/v)的次氯酸鈉(漂白劑)以抑制發(fā)芽階段污染物的生長。4小時(shí)之后，從谷物中排出水并且將谷物置于10-30℃的室溫下約1天時(shí)間。
第二天將谷物在干凈水中另外浸泡4小時(shí)。這次和隨后的浸透的水中可以加入過氧化氫(0.1％w/v)。過氧化氫給發(fā)芽的谷物提供氧，并且作為消毒劑。作為選擇，可以使用次氯酸鈉。4小時(shí)后，從谷物中排出水并且將谷物放置約1天。對(duì)谷物偶爾的(例如每隔4小時(shí))攪拌可以通過增加氣體交換、提供氧和去除二氧化碳來改善發(fā)芽。
第三天起繼續(xù)浸泡、排水和放置循環(huán)，直到發(fā)芽谷物上出現(xiàn)的小根達(dá)到2-4mm長。此生長狀態(tài)表明谷物已經(jīng)產(chǎn)生動(dòng)員貯存營養(yǎng)物的酶。這些酶對(duì)‘糖化’期間隨后的產(chǎn)生生長培養(yǎng)基是非常重要的。可以對(duì)谷物進(jìn)行更廣泛的改進(jìn)，讓發(fā)芽階段直到小根達(dá)到幾毫米長為止。然而，太長的生長僅僅將營養(yǎng)物轉(zhuǎn)化成為植物的根和芽，其并不能用在發(fā)酵中。
(B)碾壓當(dāng)谷物已經(jīng)充分發(fā)芽時(shí)，接著用滾筒碾磨機(jī)對(duì)它們進(jìn)行碾壓。調(diào)整碾磨機(jī)以使谷物破裂開口但并不粉碎或完全變平。破裂谷物允許在糖化期間水的進(jìn)入和營養(yǎng)的提取，同時(shí)避免谷物的粉碎從而有利于過濾步驟。
(C)生長基質(zhì)的制備在45℃將發(fā)芽的、碾壓的谷物與足夠覆蓋它們的水混合，并且將混合物在45℃保持1小時(shí)。
在45℃保持1小時(shí)之后，在30分鐘的期間將溫度升高至78℃。
將混合物放置在78℃條件下1小時(shí)。在78℃的放置后，通過過濾將經(jīng)過處理的谷物分出。使用相對(duì)粗的過濾器(例如1mm縫隙楔形-鐵絲籃)產(chǎn)生含有相當(dāng)大量懸浮固體的溶液。拋棄經(jīng)過處理的谷物并且接下來加熱處理液體從而對(duì)其進(jìn)行巴氏滅菌或消毒。在此特定的試驗(yàn)中，液體被煮沸45分鐘。隨后加入緩沖劑(0.5％(w/v)檸檬酸三鈉)并且混合物被進(jìn)一步煮沸15分鐘從而產(chǎn)生最終的生長基質(zhì)。
實(shí)施例2生長基質(zhì)的分析(a)碳水化合物分析使用苯酚-硫酸分析法測(cè)定總碳水化合物含量，用葡萄糖作為參考標(biāo)準(zhǔn)。(Dubois，M.，Gilles，K.A.，Hamilton，J.K.，Rebers，P.A.and Smith，F(xiàn).(1956)Analytical Chemistry，vol.28.，p.350)。
使用Nelson-Somogyi方法測(cè)定還原糖，同樣用葡萄糖作為參考標(biāo)準(zhǔn)。(Somogyi，M.(1952)Journal of Biological Chemistry.，vol.195.，p.19)。
結(jié)果基質(zhì)中的總糖為20-40mg/ml(毫克每毫升)，還原糖為5-20mg/ml。
(b)蛋白質(zhì)和肽分析使用兩種分析法測(cè)定總蛋白質(zhì)，用牛血清白蛋白作為參考標(biāo)準(zhǔn)(i)雙縮脲試劑法(Itzhaki，R.F & Gill，D.M.(1964)AnalyticalBiochemistry，Vol.9.，p.401-410)。
(ii)由Ohnishi和Barr.改進(jìn)的Lowry方法(Ohnishi，S.T.& Barr，J.K.(1978)Journal of Biological Chemistry，Vol.193，p.265)。
使用Bradford試劑測(cè)定分子量超過5000道爾頓的肽(Bradford，M.M.(1976)Analytical Biochemistry，Vol.72，p.248-254)。
結(jié)果總蛋白質(zhì)和肽為1-2mg/ml。
高分子量的肽(大于5000道爾頓)為100-300μg/ml。
實(shí)施例3產(chǎn)生有代謝活性的細(xì)菌培養(yǎng)物(A)發(fā)酵將根據(jù)實(shí)施例1制備的生長基質(zhì)冷卻至37℃并加入細(xì)菌培養(yǎng)物。合適接種物的實(shí)例是凍干的細(xì)菌或液體起始培養(yǎng)物(典型地是營養(yǎng)培養(yǎng)液中1％(v/v)的過夜培養(yǎng)物)。
在此實(shí)施例中，以下細(xì)菌在兩個(gè)容器中生長(i)屎腸球菌、植物乳桿菌(ii)干酪乳桿菌發(fā)酵進(jìn)行16-20小時(shí)，直到pH達(dá)到4.5+/-0.3單位。隨后將發(fā)酵混合物冷卻至4℃并用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)評(píng)估質(zhì)量(確定微生物的純度和計(jì)數(shù)細(xì)菌)。
在此，可以向發(fā)酵的培養(yǎng)液中加入消毒的山梨酸鉀(0.005％w/v終濃度)。這起到抑制任何真菌或酵母生長的作用，真菌或酵母可以由于最終用戶使用期間的污染而出現(xiàn)。
還可以加入作為抗氧化劑的維生素C(0.01％w/v終濃度)。
質(zhì)量保證檢驗(yàn)之后，如果需要的話，可以將不同的批次物混合從而獲得含有細(xì)菌菌種的復(fù)雜混合物的產(chǎn)物。
在此列舉的實(shí)施例中，混合兩批次的細(xì)菌產(chǎn)生含有屎腸球菌、植物乳桿菌和干酪乳桿菌的終產(chǎn)物。
實(shí)施例4有代謝活性細(xì)菌培養(yǎng)物的保存期為評(píng)估有代謝活性細(xì)菌培養(yǎng)物的保存期，將實(shí)施例2中獲得的包含屎腸球菌、植物乳桿菌和干酪乳桿菌的細(xì)菌培養(yǎng)物批次在4℃(+/-1℃)保存。一周一次進(jìn)行采樣，以0.1％(w/v)蛋白胨水連續(xù)稀釋的100μl等分試樣被涂布在瓊脂平板上。在約37℃培養(yǎng)平板約48小時(shí)，并計(jì)數(shù)細(xì)菌集落。
結(jié)果下面的結(jié)果以每周每毫升集落形成單位的數(shù)量來說明由本發(fā)明方法制備的細(xì)菌的保存期(同樣見圖2)。已經(jīng)根據(jù)本文中描述的同樣方法制備A和B批物，但它們是在不同的天數(shù)上制備的。
E.f＝屎腸球菌L.p＝植物乳桿菌L.c＝干酪乳桿菌LAB＝乳酸菌cfu/ml＝每毫升集落形成單位表1A批(8059)
表2B批(8060)
實(shí)施例5評(píng)估有代謝活性培養(yǎng)物和凍干細(xì)菌的強(qiáng)壯性在這個(gè)系列試驗(yàn)中，使用單菌株植物乳桿菌接種生長培養(yǎng)基。隨后通過監(jiān)測(cè)在600nm的吸光度來測(cè)量在約37℃的生長(同樣可以通過檢查稀釋物在瓊脂平板上的生長來實(shí)施)。
‘濕性’表示細(xì)菌的液體培養(yǎng)物(由在此專利申請(qǐng)中描述的方法產(chǎn)生)?！尚浴硎炯?xì)菌的凍干制備物，其僅在特定培養(yǎng)基培育之前被懸浮于MRS培養(yǎng)液(De Man，Rogosa and Sharpe Broth)。在每個(gè)配對(duì)培育中使用等量活的‘濕性’和‘干性’細(xì)菌。
(1)在富集和‘友好’培養(yǎng)基中的生長將細(xì)菌接種到MRS培養(yǎng)液中，并監(jiān)測(cè)它們的生長(×1＝接種物的終濃度為1×107cfu/ml；×2＝2×107cfu/ml)。結(jié)果顯示在圖1a中。此第一生長曲線表明在非有害環(huán)境中，液體培養(yǎng)物比凍干制備物的生長快很多。推測(cè)起來凍干制備物中的休眠細(xì)菌需要時(shí)間來再水化并起動(dòng)和運(yùn)行它們的新陳代謝。
(2)酸性沖擊的影響將1％(v/v)的液體培養(yǎng)物、或1％(v/v)凍干細(xì)菌的懸浮液加入MRS培養(yǎng)液中，該培養(yǎng)液已經(jīng)用HCl調(diào)節(jié)到不同的pH值。細(xì)菌在酸性培養(yǎng)液中培育1小時(shí)，隨后在MRS瓊脂平板上對(duì)樣品進(jìn)行計(jì)數(shù)。
cfu＝每毫升集落形成單位此結(jié)果表明‘濕性’細(xì)菌比‘干性’細(xì)菌能更好的在酸性環(huán)境中存活。因?yàn)槲傅膒H水平可以低至2，這明顯與細(xì)菌在胃轉(zhuǎn)運(yùn)期間和其后期間的存活和適合度相關(guān)。
(3)pH和膽汁鹽的聯(lián)合影響采用進(jìn)一步的沖擊水平，在以下條件中比較‘濕性’和‘干性’細(xì)菌制備物的生長(a)只有MRS培養(yǎng)液(圖1b)(b)補(bǔ)充有0.5％(w/v)膽汁鹽(Oxoid L55)的MRS培養(yǎng)液(圖1c)(c)在pH3.0的MRS中培養(yǎng)1小時(shí)，接著在含有膽汁鹽的MRS-培養(yǎng)液中生長(圖1d)。
來自試驗(yàn)的聯(lián)合結(jié)果表明以下要點(diǎn)●‘濕性’細(xì)菌比‘干性’細(xì)菌生長的更快。
●酸性沖擊對(duì)‘干性’細(xì)菌比對(duì)‘濕性’細(xì)菌帶來更有害的影響。
●膽汁鹽抑制此兩種類型細(xì)菌，但是與‘濕性’細(xì)菌相比，可能給‘干性’細(xì)菌帶來更不利的影響。
●酸性沖擊之后暴露于膽汁鹽的聯(lián)合的連續(xù)作用明顯地減慢‘濕性’細(xì)菌的生長，但是殺死了‘干性’細(xì)菌(通過瓊脂平板上缺少集落來判斷)。
然而，雖然pH和膽汁耐受是非常重要的因素，但是有其它大量的益生細(xì)菌必須面對(duì)的挑戰(zhàn)，即有化學(xué)方面的又有微生物方面的。因此簡單地通過每克或每ml中集落形成單位的數(shù)量來判定細(xì)菌的存活力和總量是表明制備物作為功能性益生菌適合度的唯一指示。如果當(dāng)細(xì)菌進(jìn)入宿主時(shí)不是在活動(dòng)狀態(tài)，它們非常有可能被殺死，或者在它們有機(jī)會(huì)建群之前，需要經(jīng)過很長的消化道。因此，如果當(dāng)益生素進(jìn)入宿主時(shí)是處于代謝活性狀態(tài)，那么對(duì)它們?cè)谒拗鲀?nèi)的應(yīng)用是有益處的。根據(jù)本發(fā)明，細(xì)菌是活的和有代謝活性的形式，因此它們能夠抵擋GI道的有害環(huán)境。設(shè)計(jì)所述產(chǎn)物有代謝活性的特性來增加在宿主內(nèi)存活和建群的機(jī)會(huì)。
實(shí)施例6對(duì)家禽小雞胃腸微生物群落的影響介紹和方法根據(jù)本文中描述的方法制備含有乳酸菌屎腸球菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌和嗜酸乳桿菌的益生素。檢驗(yàn)益生素改變市售家禽(肉雞)單位的家禽小雞胃腸微生物群落的能力。
小雞的處理從第一天(日齡(day old))到第三天給家禽小雞施用抗生素林可霉素(Lincospectin)。在第四天這些禽類不接受處理。在第五天，一半肉雞舍的雞以每5000只小雞1升的比率接受所述制備物。余下的雞舍的雞作為對(duì)照。在第六天，從每組中隨機(jī)選擇6只小雞處死，并且檢查腸的微生物群落。(集合來自每組中成對(duì)小雞的組織樣品，于是從每組得到3個(gè)樣品)。
微生物學(xué)分析選擇用于分析的消化系統(tǒng)區(qū)域是上腸道，采自從小腸的起始部位向下到卵黃囊附著位點(diǎn)的部分。
來自成對(duì)小雞的胃腸組織和內(nèi)容物在滅菌的蛋白胨水中被浸軟、稀釋，并且將樣品涂布在多種半選擇性瓊脂上。培養(yǎng)所述平板之后，與細(xì)菌的顯微鏡分析一起記錄集落的特征和數(shù)量。通過檢查集落特征、細(xì)胞形態(tài)和碳水化合物發(fā)酵特征(后者使用BioMerieux的‘a(chǎn)pi50CH’檢測(cè)試劑盒進(jìn)行)實(shí)施乳酸菌菌種的鑒定。
結(jié)果結(jié)果顯示在圖3中。
L1-L3＝經(jīng)益生素處理的小雞(1-3對(duì))C1-C3＝對(duì)照小雞(1-3對(duì))SI＝小腸cfu＝集落形成單位正如所預(yù)期的，許多不同的微生物即存在于對(duì)照的又存在于益生素處理的小雞的胃腸道中。總的來說，在兩組小雞中存在相似量和類型的細(xì)菌，但是在特定菌種的分布和量上有明顯的差異。
乳酸菌乳酸菌(LAB)的含量在制備物處理的小雞和對(duì)照小雞之間有非常顯著的差異。同時(shí)兩組有相當(dāng)總量的LAB，對(duì)照小雞的微生物群落的優(yōu)勢(shì)種是單一菌種，然而益生素處理的小雞存在有更廣范圍的菌種混合。
實(shí)施例7益生素制備物對(duì)鴕鳥幼雛的影響實(shí)施一個(gè)試驗(yàn)來評(píng)估根據(jù)本發(fā)明的制備物對(duì)鴕鳥幼雛的影響。該試驗(yàn)進(jìn)行4周時(shí)間，其中幼雛從第4天起患有腹瀉。一組用根據(jù)本發(fā)明的制備物處理，第二組使用廣譜抗生素和第三組使用維生素氨基酸補(bǔ)充物。試驗(yàn)結(jié)果顯示用根據(jù)本發(fā)明制備物處理組的死亡率與抗生素處理組相比降低67％并且施用制備物可以緩解便秘、腹瀉、腸淤滯、異常行為和下垂。此外，與對(duì)照組相比，在益生素制備物處理組中觀察到體重增加27％。
在第二試驗(yàn)中，其中給種雞施用100ml根據(jù)本發(fā)明的制備物，與對(duì)照組相比，可以觀察到施用所述制備物導(dǎo)致繁殖力增加。
因此，這些結(jié)果顯示施用根據(jù)本發(fā)明的益生素制備物影響了生長率、發(fā)病率和死亡率。
實(shí)施例8益生素制備物對(duì)哺乳動(dòng)物的有益影響在小規(guī)模獨(dú)立試驗(yàn)中，評(píng)估根據(jù)本發(fā)明的制備物對(duì)患有慢性腸炎的貓和狗的影響并且發(fā)現(xiàn)了它在恢復(fù)正常的腸微生物群落中的用處。
在對(duì)人的試驗(yàn)中，從自愿者中已經(jīng)觀察到制備物在治療急性腹瀉中的有益影響并且可以醫(yī)治慢性腸不規(guī)則(chronic bowel irregularity)。
這種益處模式表明基于在此報(bào)導(dǎo)方法的產(chǎn)物具有控制人的急性和慢性胃腸功能紊亂(包括腸易激綜合征和炎性腸病、食物中毒、傳染性腹瀉和便秘)的顯著好處?，F(xiàn)在正在實(shí)施一個(gè)完整的臨床試驗(yàn)以支持迄今已獲得的結(jié)果。
參考文獻(xiàn)F.Fonseca，C.Béal，and G.Corrieu.J.Dairy Res.67(1)83-90，2000.
M.L.F.Murga，A.P.D.Holgado，and G.F.de Valdez.Cryobiology 36(4)315-319，1998.
J.Hamilton-Miller.Lancet 355(9201)413-414，2000.Kunze，W.Technology Brewing and Malting(1996)潛在健康益處
Collins，J.K.，O′Sullivan，G.and Shanahan，F(xiàn).(1996)Gutflora and health-past，present and future，Royal Societyof Medicine Press Limited，London.
D.Haller，C.Bode，and W.P.Hammes.Microbiol.Immunol，43(10)925-935，1999．C.Hessle，L. .Hanson，and A.E.Wold.Clin.Exp.Immunol.116(2)276-282，1999．E.Isolauri，Y.Sütas，P.Kankaanp，H.Arvilommi，and S·Salminen．Am.J.Clin.Nutr.73(2)444S-450S，2001.
M.Miettinen，S.Matikainen，J.Vuopio-Varkila，J.Pirhonen，K.Varkila，M.Kurimoto，and I.Julkunen.Infect.Immun.66(12)6058-6062，1998.
A.E.Wold and I.Adlerberth.Adv.Exp.Med.Biol.47877-93，2000.
血液化學(xué)J.W.Anderson and S.E.Gilliland.J.Am.Coll.Nutr.18(1)43-50，1999.
H.Bukowska，J.Pieczul-Mróz，M.Jastrzebska，K.Chelstowski，and M.Naruszewicz.Atherosclarosis 137(2)437-438，1998.
I.De Smet，P.De Boever，and W.Verstraete.Br.J.Nutr.79(2)185-194，1998.
T.Endo，M.Nakano，S.Shimizu，M.Fukushima，and S.Miyoshi.Biosci.Biotechnol.Biochem.63(9)1569-1575，1999.
H.Kikuchi-Hayakawa，N.Onodera，S.Matsubara，E.Yasuda，Y.Shimakawa，and F.Ishikawa.Br.J.Nutr.79(1)97-105，1998.
H.Kikuchi-Hayakawa，H.Shibahara-Sone，K.Osada，N.Onodera-Masuoka，F(xiàn).Ishikawa，and M.Watanuki.
Biosci.Biotechnol.Biochem.64(3)466-475，2000.
F.A.M.Klaver and R.van der Meer.The AssumedAppl.Environ.Microbiol.59(4)1120-1124，1993.
B.K.Mital and S.K.Garg.Crit.Rev.Microbiol.21(3)175-214，1995.
G.R.J.Taylor and C.M.Williams.Br.J.Nutr.80(4)S225-S230，1998.
癌的治療和預(yù)防Y.Aso，H.Akaza，T.Kotake，T.Tsukamoto，K.Imai，and S.Naito.Eur.Urol.27104-109，1995.
R.Balansky，B.Gyosheva，G.Ganchev，Z.Mircheva，S.Minkova，and G.Georgiev.Cancer Lett. 147(1-2)125-137，1999.
L.J.Brady，D.D.Gallaher，and F.F.Busta.J.Nutr.130(2)410S-414S，2000.
D.D.Gallaher and J.Khil.J.Nutr.129(7)1483S-1487S，1999.
B.R.Goldin.Br.J.Nutr.80(4)S203-S207，1998.
S.L.Gorbach.Am.J.Gastroenterol.95(1)S2-S4，2000.
K.Hirayama and J.Rafter.Antonie Van Leeuwenhoek-International Journal of Microbiology76(1)391-394，1999.
K.Hirayama and J.Rafter.Microbe.Infect.2(6)681-686，2000.
W.H.Ling.Nutr.Res.15(3)439-454，1995.
G.H.McIntosh，P.J.Royle，and M.J.Playne.Nutr.Cancer.35(2)153-159，1999.
J.J.Rafter.Scand.J.Ga stroenterol.30497-502，1995.
B.S.Reddy.Br.J.Nutr.80(4)S219-S223，1998.
Rowland，I.R.(1996)`Gut microflora and cancer′in Leeds，A.R.and Rowland，I.R.(eds.)Gut flora and health-past，present and future，Royal Society of Medicine Press Limited，London.
M.D.Winters，T.L.Schlinke，W.A.Joyce，S.R.Glore，andM.M.Huycke. Am.J.Gastroenterol.93(12)2491-2500，1998.
腹瀉和便秘T.Arvola，K.Laiho，S.Torkkeli，H.Mykknen，S.Salminen，L.Maunula，and E.Isolauri.Pediatrics 104(5)L1-L4，1999.
R.Bennet，S.L.Gorbach，B.R.Goldin，T.W.Chang，B.E.
Laughon，W.B.Greenough，and J.G.Bartlett.NutritionToday31(6)35S-38S，1996.
A.Bomba，R.Nemcová，S.Gancarcíková，R.Herich，and R.Kastel.Adv.Exp.Med.Biol.473185-190，1999.
N.M.De Roos and M.B.Katan.Am.J.Clin.Nutr.71(2)405-411，2000.
H.L.DuPont.J.Pediatr.134(1)1-2，1999.
S.L.Gorbach.Am.J.Gastroenterol.95(1)S2-S4，2000.
M.Heyman.J.Am.Coll.Nutr.19(2)137S-146S，2000.
E.Isolauri，M.Kaila，H.Mykkanan，W.H.Ling，and S.Salminen.Dig.Dis.Sci.39(12)2595-2600，1994.
R.A.Oberhelman，E.H.Gilman，P.Sheen，D.N.Taylor，R.
E.Black，L.Cabrera，A.G.Lescano，R.Meza，and G.Madico.
J.Pediatr.134(1)15-20，1999.
R.D.Rolfe.J.Nutr.130(2)396S-402S，2000.
J.Saavedra.Am.J.Gastroenterol.95(1)S16-S18，2000.
C.Scarpignato_and P.Rampal.Chemotherapy41((suppl1))48-81，1995.
A.V.Shornikova，I.A.Casas，H.Mykknen，E.Salo，and T.Vesikari.Pediatr.Infect.Dis.J.16(12)1103-1107，1997.
J.A.Vanderhoof，D.B.Whitney，D.L.Antonson，T.L.Hanner，J.V.Lupo，and R.J.Young.J.Pediatr.135(5)564-568，1999.
腸易激綜合征P.Brigidi，B.Vitali，E.Swennen，G.Bazzocchi，and D.Matteuzzi.Res.Microbiol.152(8)735-741，2001.
K.Niedzielin，H.Kordecki，and B.Birkenfeld.
Eur.J.Gastroenterol.Hepatol.13(10)1143-1147，2001.
S.Nobaek，M.L.Johansson，G.Molin，S.Ahrne，and B.
Jeppsson.Am.J.Gastroenterol.95(5)1231-1238，2000.
綜述
Marteau，P.and Rambaud，J-C，(1996)`Therapeuticapplications of probiotics in humans′in Leeds，A.R.andRowland，I.R.(eds.)Gut flora and health-past，presentand future，Royal Society of Medicine Press Limited，London.Stark，B.A.and Wilkinson，(eds.)(1989) Probiotics.Theoryand Applications，Chalcombe Publications，Bucks，UK.2權(quán)利要求
1.一種包含活的、有代謝活性的細(xì)菌以及含有復(fù)合和簡單糖、蛋白質(zhì)和肽的混合物的生長基質(zhì)的制備物，其中制備物中的細(xì)菌表現(xiàn)出接近平衡的生長狀態(tài)，所述狀態(tài)的特征在于當(dāng)在約4℃和控制pH條件下保存至少5個(gè)月時(shí)細(xì)菌群保持在穩(wěn)定的水平。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的制備物，其中當(dāng)在約4℃和控制pH條件下保存至少5個(gè)月時(shí)細(xì)菌群保持108-109個(gè)活細(xì)胞/ml制備物的水平。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的制備物，其中糖的總量為20mg/ml-40mg/ml，并且其中還原糖的總量為5mg/ml-20mg/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的制備物，其中糖的總量為30mg/ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或權(quán)利要求4的制備物，其中還原糖的總量為10mg/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的制備物，其中蛋白質(zhì)和肽的總量為1mg/ml-2mg/ml，并且其中高分子量肽的總量為100μg/ml-300μg/ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的制備物，其中蛋白質(zhì)和肽的總量為2mg/ml。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或權(quán)利要求7的制備物，其中高分子量肽的總量為250μg/ml。
9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的制備物，其中pH維持在3.8-4.5。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的制備物，其中pH維持在約4.0。
11.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的制備物，其中通過緩沖劑控制pH。
12.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的制備物，其中所述細(xì)菌是乳酸菌。
13.權(quán)利要求12的制備物，其中所述細(xì)菌屬于乳桿菌屬(Lactobacillus)。
14.權(quán)利要求12的制備物，其中所述細(xì)菌屬于腸球菌屬(Enterococcus)。
15.權(quán)利要求12的制備物，其包含屎腸球菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌或嗜酸乳桿菌中的至少一種。
16.權(quán)利要求15的制備物，其包含屎腸球菌、植物乳桿菌和干酪乳桿菌。
17.權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的制備物，其另外包含抗真菌劑。
18.權(quán)利要求17的制備物，其中所述抗真菌劑是滅菌的山梨酸鉀。
19.權(quán)利要求1-13中任何一項(xiàng)的制備物，其另外包含抗氧化劑。
20.權(quán)利要求14的制備物，其中所述抗氧化劑是維生素C。
21.一種用于微生物的包含復(fù)合和簡單糖混合物的生長基質(zhì)，其中糖的總量為20mg/ml-40mg/ml，并且還原糖的總量為5mg/ml-20mg/ml。
22.權(quán)利要求21的生長基質(zhì)，其中糖的總量為25mg/ml-35mg/ml。
23.權(quán)利要求22的生長基質(zhì)，其中糖的總量為約30mg/ml。
24.權(quán)利要求21-23中任一項(xiàng)的生長基質(zhì)，其中還原糖的總量為5mg/ml-15mg/ml。
25.權(quán)利要求24的生長基質(zhì)，其中還原糖的總量為約10mg/ml。
26.權(quán)利要求21-25中任一項(xiàng)的生長基質(zhì)，其另外包含蛋白質(zhì)和肽，其中蛋白質(zhì)和肽的總量為1mg/ml-2mg/ml，并且高分子量肽的總量為100μg/ml-300μg/ml。
27.權(quán)利要求26的生長基質(zhì)，其中蛋白質(zhì)和肽的總量為約2mg/ml。
28.權(quán)利要求26或權(quán)利要求27的生長基質(zhì)，其中高分子量肽的總量為約250μg/ml。
29.一種制備用于微生物的生長基質(zhì)的方法，所述方法包括以下步驟將發(fā)芽的谷物糖化，其中混合發(fā)芽的谷物與水成液并置于限制復(fù)合碳水化合物向簡單碳水化合物轉(zhuǎn)化程度的時(shí)間和溫度條件下，從而獲得復(fù)合和簡單碳水化合物、蛋白質(zhì)和肽的混合物，和從經(jīng)過處理的發(fā)芽谷物中分離復(fù)合和簡單碳水化合物、蛋白質(zhì)和肽的混合物，從而獲得生長基質(zhì)。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述糖化步驟不包括60℃-65℃和/或70℃-74℃溫度下的靜置。
31.根據(jù)權(quán)利要求29或權(quán)利要求30的方法，其中所述糖化步驟包括將發(fā)芽的谷物與水在30℃-45℃的溫度下混合，靜置混合物1-2個(gè)小時(shí)，在20-40分鐘內(nèi)使溫度升至75℃-85℃，和隨后使混合物在75℃-85℃靜置60-90分鐘。
32.根據(jù)權(quán)利要求29-31中任一項(xiàng)的方法，其中通過粗過濾從經(jīng)過處理的發(fā)芽谷物中分離復(fù)合和簡單碳水化合物、蛋白質(zhì)和肽的混合物。
33.根據(jù)權(quán)利要求29-32中任一項(xiàng)的方法，其中所述生長基質(zhì)未被澄清化。
34.根據(jù)權(quán)利要求29-33中任一項(xiàng)的方法，其中所述谷物是大麥、小麥、稻、燕麥或玉米。
35.根據(jù)權(quán)利要求29-34中任一項(xiàng)的方法，其中所述生長基質(zhì)是經(jīng)過滅菌的。
36.根據(jù)權(quán)利要求29-35中任一項(xiàng)的方法，其中向生長基質(zhì)中加入緩沖劑。
37.一種可通過權(quán)利要求29-36中任一項(xiàng)的方法獲得的生長基質(zhì)。
38.一種制備有代謝活性和穩(wěn)定的微生物制備物的方法，其包括以下步驟使微生物在包含復(fù)合和簡單糖、蛋白質(zhì)和肽的混合物的生長基質(zhì)中生長，從而獲得微生物制備物，和將得到的制備物冷卻至約4℃，其中微生物處于接近平衡的生長狀態(tài)，所述狀態(tài)的特征在于當(dāng)在約4℃和控制pH條件下保存至少5個(gè)月時(shí)，制備物中的微生物群可以維持穩(wěn)定的水平，和任選地在約4℃保存制備物。
39.權(quán)利要求38的方法，其中兩種微生物生長在一種生長基質(zhì)中。
40.權(quán)利要求38或權(quán)利要求39的方法，其中兩種或多種微生物生長在分開的生長基質(zhì)中并且在于約4℃保存之前將它們混合在一起。
41.一種制備有代謝活性和穩(wěn)定的微生物制備物的方法，其包括以下步驟將微生物加入包含復(fù)合和簡單糖、蛋白質(zhì)和肽的混合物的生長基質(zhì)中以形成微生物制備物，其中所述微生物以提供接近平衡生長狀態(tài)的濃度加到生長基質(zhì)中，所述接近平衡生長狀態(tài)的特征在于當(dāng)在約4℃和控制pH條件下保存至少5個(gè)月時(shí)，制備物中的微生物群可以維持穩(wěn)定水平，和任選地在約4℃保存制備物。
42.權(quán)利要求38-41中任一項(xiàng)的方法，其中微生物是細(xì)菌。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述細(xì)菌是乳酸菌。
44.權(quán)利要求43的方法，其中所述細(xì)菌屬于乳桿菌屬。
45.權(quán)利要求43的方法，其中所述細(xì)菌屬于腸球菌屬。
46.權(quán)利要求43-45中任一項(xiàng)的方法，其中制備物中細(xì)菌的濃度為108-109個(gè)活細(xì)胞/ml。
47.權(quán)利要求38-46中任一項(xiàng)的方法，其中所述生長基質(zhì)是權(quán)利要求21-28或37中任一項(xiàng)定義的生長基質(zhì)。
48.根據(jù)權(quán)利要求38-47中任一項(xiàng)的方法，其中根據(jù)權(quán)利要求29-36中任一項(xiàng)的方法制備所述生長基質(zhì)。
49.權(quán)利要求38-48中任一項(xiàng)的方法，其中在保存制備物之前加入抗真菌劑。
50.權(quán)利要求49的方法，其中所述抗真菌劑是滅菌的山梨酸鉀。
51.權(quán)利要求38-50中任一項(xiàng)的方法，其中在保存制備物之前加入抗氧化劑。
52.權(quán)利要求51的方法，其中所述抗氧化劑是維生素C。
53.權(quán)利要求38-52中任一項(xiàng)的方法，其中所述制備物的pH維持在3.8-4.5。
54.權(quán)利要求53的方法，其中通過緩沖劑控制pH。
55.一種通過權(quán)利要求42-54中任一項(xiàng)的方法可獲得的有代謝活性和穩(wěn)定的細(xì)菌制備物。
56.一種包含根據(jù)權(quán)利要求1-20或55中任一項(xiàng)的有代謝活性和穩(wěn)定的細(xì)菌制備物的動(dòng)物飼料。
57.一種適合人消費(fèi)的食品或飲料，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-20或55中任一項(xiàng)的有代謝活性和穩(wěn)定的細(xì)菌制備物。
58.一種藥物組合物，其包含與一種或多種藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或賦形劑混合的根據(jù)權(quán)利要求1-20或55中任一項(xiàng)的有代謝活性和穩(wěn)定的細(xì)菌制備物。
59.一種用作藥物的根據(jù)權(quán)利要求1-20或55中任一項(xiàng)的有代謝活性和穩(wěn)定的細(xì)菌制備物。
60.根據(jù)權(quán)利要求1-20或55中任一項(xiàng)的有代謝活性和穩(wěn)定的細(xì)菌制備物在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療影響哺乳動(dòng)物對(duì)象的腸微生物平衡的病癥。
61.根據(jù)權(quán)利要求60的用途，其中所述影響腸微生物平衡的病癥是慢性炎性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎或克羅恩病。
62.根據(jù)權(quán)利要求1-20或55中任一項(xiàng)的有代謝活性和穩(wěn)定的細(xì)菌制備物在制備維持哺乳動(dòng)物對(duì)象的腸微生物平衡的藥物中的用途。
63.一種治療或預(yù)防影響人或動(dòng)物患者腸微生物平衡的病癥的方法，其包括對(duì)有此需要的患者施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-20或55中任一項(xiàng)的有代謝活性和穩(wěn)定的細(xì)菌制備物或根據(jù)權(quán)利要求58的藥物組合物。
64.根據(jù)權(quán)利要求63的方法，其中影響腸微生物平衡的病癥是慢性炎性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎或克羅恩病。
全文摘要
本發(fā)明涉及有代謝活性細(xì)菌的制備物、包含這種制備物的組合物例如益生素補(bǔ)充物或動(dòng)物飼料及其用途，例如治療影響腸道微生物平衡的疾病。同時(shí)也描述了微生物的生長基質(zhì)，所述基質(zhì)包含復(fù)合和簡單糖的混合物，和利用這種生長基質(zhì)制造有代謝活性微生物制備物的方法。
文檔編號(hào)A23L1/30GK101027387SQ200580032485
公開日2007年8月29日 申請(qǐng)日期2005年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月27日
發(fā)明者蒂莫西·圖伯 申請(qǐng)人:馬蒂吉姆英國企業(yè)有限公司