專(zhuān)利名稱(chēng)：生產(chǎn)l－氨基酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用微生物通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸的方法。具體地，本發(fā)明涉及生產(chǎn)芳香族氨基酸例如L-色氨酸，L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的方法。
背景技術(shù)：
戊糖磷酸途徑(PPP)是大部分生物體的中樞代謝(central metabolism)的重要部分。在PPP的氧化分支中發(fā)生NADPH的合成，而PPP非氧化分支中的磷酸化的糖類(lèi)是核苷酸生物合成(核糖-5-磷酸)，芳香族氨基酸和維生素(赤蘚糖-5-磷酸)的前體。赤蘚糖-4-磷酸(E4p)是芳香族L-氨基酸的常規(guī)生物合成的必需前體。因此，優(yōu)化磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和E4p生物合成的具體途徑可以提高芳香族L-氨基酸的產(chǎn)量。
PPP的氧化分支包括3個(gè)反應(yīng)。第一和第三個(gè)反應(yīng)由熟知的6-磷酸葡萄糖脫氫酶(EC 1.1.1.49)和6-磷酸葡糖酸脫氫酶(EC.1.1.1.44)所催化，這兩個(gè)酶分別由zwf和gnd基因所編碼。第二個(gè)反應(yīng)是6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯水解成6-磷酸葡糖酸(Escherichia coli and Salmonella，Second Edition，F(xiàn).C.Neihardt主編，ASM Press，Washington D.C.1996)。已經(jīng)在若干種生物中發(fā)現(xiàn)了催化此反應(yīng)的酶，這些生物包括，例如，人(Collard等，F(xiàn)EBS Lett.，4592，223-6(1999))，布氏錐蟲(chóng)(Trypanosoma brucei)(Duffieux F.等，J.Biol.Chem.，27536，27559-65(2000))，貝氏瘧原蟲(chóng)(Plasmodium berghei)(Clarke，J.L.等，Eur.J.Biochem.，2687，2013-9(2001))，銅綠假單孢菌(Pseudomonasaeroginosa)(Hager P.W.等，J.Bacteriol.，18214，3934-41(2000))，惡臭假單孢菌(Pseudomonas putida)(Petruschka，L.等，F(xiàn)EMS Microbiol.Lett.，2151，89-95(2002))，但是還已知該反應(yīng)可以自發(fā)進(jìn)行。
δ-6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯是由6-磷酸葡萄糖脫氫酶催化的反應(yīng)的產(chǎn)物之一，其可以在分子間重排的過(guò)程中異構(gòu)為γ-6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯。只有δ-6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯可以自發(fā)地水解為6-磷酸葡糖酸，而此反應(yīng)正是被已知的6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶(EC.3.1.1.31)所催化的(Miclet E.等，J Biol Chem.，27637，34840-46(2001))。來(lái)自大腸桿菌(E.coli)的pgl基因可能編碼6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶，其被定位于大腸桿菌染色體上att-λ和chlD基因(在最新的數(shù)據(jù)庫(kù)中-modC基因)之間。大腸桿菌突變體(pgl-)顯示“麥芽糖藍(lán)色”(“maltose-blue”)表型(Kupor，S.R.和Fraenkel，D.G.，J.Bacteriol.，1003，1926-1301(1969))這是積累麥芽糖糊精的菌株所特有的特征(Adhya S.和Schwartz M.，J.Bacteriol.，1082，621-626(1971))。
但是目前，pgl基因的序列和它在大腸桿菌染色體上的確切位置都還是未知的。來(lái)自大腸桿菌的具有6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶活性的酶尚未得到分離，也沒(méi)有將產(chǎn)L-氨基酸細(xì)菌的細(xì)胞中6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶活性的增強(qiáng)和L-氨基酸產(chǎn)量增加聯(lián)系起來(lái)的報(bào)道。
本發(fā)明的公開(kāi)本發(fā)明的一個(gè)目的是提供來(lái)自大腸桿菌的6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶，提高產(chǎn)L-氨基酸菌株的生產(chǎn)能力，并提供使用該菌株生產(chǎn)L-氨基酸的方法。
通過(guò)確認(rèn)下列事實(shí)達(dá)到了上述目的大腸桿菌K-12株的ybhE開(kāi)放閱讀框(ORF)編碼6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶，且ybhE ORF(pgl基因)的表達(dá)的增強(qiáng)可以提高各種產(chǎn)L-氨基酸菌株的L-氨基酸生產(chǎn)。因此，本發(fā)明得以完成。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種產(chǎn)L-氨基酸細(xì)菌，其中該細(xì)菌已經(jīng)受到修飾以增強(qiáng)6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶的活性。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供如上所述的細(xì)菌，其中該細(xì)菌屬于腸桿菌(Enterobacteriaceae)科，且該細(xì)菌選自埃希氏菌屬(Escherichia)、歐文氏菌屬(Erwinia)、普羅威登斯菌屬(Providencia)和沙雷氏菌屬(Serratia)。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供如上所述的細(xì)菌，其中通過(guò)修飾細(xì)菌染色體上6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶基因的表達(dá)調(diào)控序列以增強(qiáng)該基因的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶的活性。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供如上所述的細(xì)菌，其中所述基因的天然啟動(dòng)子被更強(qiáng)(potent)的啟動(dòng)子所取代。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供如上所述的細(xì)菌，其中所述6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶基因源自屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供如上所述的細(xì)菌，其中所述6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶基因選自(a)包括SEQ ID NO1的核苷酸1至993的核苷酸序列的DNA；和
(b)可以與SEQ ID NO1的核苷酸1至993的核苷酸序列或者與可從上述序列制備得到的探針在嚴(yán)緊條件下雜交，并且編碼具有6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供如上所述的細(xì)菌，其中所述嚴(yán)緊條件包括在60℃、對(duì)應(yīng)于1xSSC和0.1％SDS的鹽濃度下，洗滌15分鐘。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供如上所述的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌受到進(jìn)一步修飾以具有增強(qiáng)的ybhE開(kāi)放閱讀框的表達(dá)。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供如上所述的細(xì)菌，其中L-氨基酸是芳香族L-氨基酸，其選自L-色氨酸、L-苯丙氨酸和L-酪氨酸。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供生產(chǎn)芳香族L-氨基酸的方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)如上所述的細(xì)菌并從培養(yǎng)基中收集所述L-氨基酸。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供如上所述的方法，其中L-氨基酸是芳香族氨基酸，其選自L-色氨酸、L-苯丙氨酸和L-酪氨酸。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供如上所述的方法，其中所述細(xì)菌具有增強(qiáng)的芳香族氨基酸生物合成基因的表達(dá)。
所述生產(chǎn)L-氨基酸的方法包括使用產(chǎn)L-色氨酸細(xì)菌生產(chǎn)L-色氨酸，該細(xì)菌中本發(fā)明的蛋白的活性被增強(qiáng)。所述生產(chǎn)L-氨基酸的方法還包括使用產(chǎn)L-苯丙氨酸細(xì)菌生產(chǎn)L-苯丙氨酸，該細(xì)菌中本發(fā)明的蛋白的活性被增強(qiáng)。所述生產(chǎn)L-氨基酸的方法還包括使用產(chǎn)L-酪氨酸細(xì)菌生產(chǎn)L-酪氨酸，該細(xì)菌中本發(fā)明的蛋白的活性被增強(qiáng)。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示ybhE ORF周?chē)?xì)菌天然DNA區(qū)域的結(jié)構(gòu)。
圖2顯示ybhE ORF缺失的細(xì)菌DNA區(qū)域的結(jié)構(gòu)。
圖3顯示ybhA ORF缺失的細(xì)菌DNA區(qū)域的結(jié)構(gòu)。
圖4顯示ybhD ORF缺失的細(xì)菌DNA區(qū)域的結(jié)構(gòu)。
圖5顯示pgi基因缺失的細(xì)菌DNA區(qū)域的結(jié)構(gòu)。
圖6顯示zwf-edd-eda操縱子缺失的細(xì)菌DNA區(qū)域的結(jié)構(gòu)。
圖7顯示在pgl基因(ybhE ORF)上游具有人工啟動(dòng)子區(qū)域(Ptac*)的細(xì)菌DNA區(qū)域的結(jié)構(gòu)。
圖8顯示(His)6-YbhE蛋白的凝膠分離和純化(照片)。A.BL21(DE3)[pET-HTybhE]菌株的粗提取物。第1，2，9列-蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記；第3，4列-不使用和使用IPTG誘導(dǎo)的菌株的總細(xì)胞蛋白；第5，6列-不使用和使用IPTG誘導(dǎo)的菌株可溶級(jí)分；第7，8列-不使用和使用IPTG誘導(dǎo)的菌株不可溶級(jí)分。B.第1列-BL21(DE3)[pET-HTybhE]的總細(xì)胞蛋白；第2，3，4，6列-遞增濃度的純化后(His)6-YbhE；第5列蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記。
優(yōu)選的實(shí)施方案描述根據(jù)本發(fā)明，描述了產(chǎn)L-氨基酸的細(xì)菌，其中該細(xì)菌已受到修飾以增強(qiáng)6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶的活性。術(shù)語(yǔ)“6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶的活性”指催化6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯水解成為6-磷酸葡糖酸的反應(yīng)的活性。通過(guò)由，例如Kupor，S.R.和Fraenkel，D.G.(J.Bacteriol.，1003，1296-1301(1969))所描述的方法來(lái)測(cè)量6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶的活性。編碼6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶的基因可以是大腸桿菌的ybhE基因或其同源物。
作為編碼大腸桿菌的6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶(EC號(hào)3.1.1.31)的基因，已公開(kāi)了包括ybhE ORF的pgl基因(GenBank登記號(hào)NC_000913，gi16128735的序列中核苷酸號(hào)797809至798804)。ybhE ORF位于大腸桿菌菌株K12染色體上的ybhA ORF和ybhD ORF之間。因此pgl基因可以使用基于該基因的核苷酸序列制備的引物通過(guò)PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，參考White，T.J.等，Trends Genet.，5，185(1989))來(lái)獲得。
來(lái)自大腸桿菌的pgl基因可以以包括下列DNA(a)或(b)的DNA為例(a)包括SEQ ID NO1的核苷酸1至993的核苷酸序列的DNA；和(b)可以與SEQ ID NO1的核苷酸1至993的核苷酸序列或者與可從上述序列制備得到的探針在嚴(yán)緊條件下雜交，并且編碼具有6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。
編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的DNA包括編碼這樣的蛋白質(zhì)的DNA，該蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)(A)的一個(gè)或幾個(gè)位置上包含了一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的缺失、取代、插入或添加，只要它們不失去該蛋白質(zhì)的活性。盡管“幾個(gè)”氨基酸的數(shù)目根據(jù)在該蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)中的位置及氨基酸殘基的類(lèi)型而不同，對(duì)于蛋白(A)其可以是2至30，優(yōu)選2至20，更優(yōu)選2至10。
具有上述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的缺失、取代、插入或添加的本發(fā)明的蛋白質(zhì)與SEQ ID NO2的蛋白質(zhì)至少70％同源。蛋白質(zhì)的百分比同源性是通過(guò)將變體序列與SED ID2中的序列進(jìn)行全序列長(zhǎng)度的比較并確定相似殘基的數(shù)目來(lái)測(cè)定的。本發(fā)明的蛋白質(zhì)與SEQ ID NO2的蛋白質(zhì)至少70％同源，優(yōu)選至少80％同源，還更優(yōu)選至少90％同源，并最優(yōu)選與SEQ ID NO2的蛋白質(zhì)至少95％同源。蛋白質(zhì)或DNA的百分比同源性還可以用已知的計(jì)算方法來(lái)評(píng)價(jià)，例如BLAST搜索，F(xiàn)ASTA搜索和CrustalW。BLAST(基本局部比對(duì)搜索工具)是blastp，blastn，blastx，megablast，tblastn和tblastx等程序所使用的啟發(fā)式搜索算法。這些程序把重要性歸因于它們使用Karlin，Samuel和Stephen F.Altschul的統(tǒng)計(jì)方法的發(fā)現(xiàn)(“Method forassessing the statistical significance of molecular sequence features by usinggeneral scoring schemes”.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1990，872264-68；“Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecularsequences”.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1993，905873-7)。W.R.Pearson描述了FASTA搜索方法(“Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTPand FASTA”，Methods in Enzymology，199018363-98)。Thompson J.D.，Higgins D.G.和Gibson T.J.描述了ClustalW方法(“CLUSTAL Wimprovingthe sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequenceweighting，position-specific gap penalties and weight matrix choice”，NucleicAcids Res.1994，224673-4680)。
(A)中定義的蛋白質(zhì)的改變，如上所述通常是保守性的改變，以維持該蛋白的活性。取代改變包括除去氨基酸序列中至少一個(gè)殘基并在其位置上插入另一個(gè)不同的殘基?？稍谏鲜龅鞍踪|(zhì)中取代原始氨基酸并且被認(rèn)為是保守取代的氨基酸的實(shí)例包括，例如，用ser或thr取代ala；用gln、his或lys取代arg；用glu、gln、lys、his、asp取代asn；用asn、glu或gln取代asp；用ser或ala取代cys；用asn、glu、lys、his、asp或arg取代gln；用asn、gln、lys或asp取代glu；用pro取代gly；用asn、lys、gln、arg、tyr取代his；用leu、met、val、phe取代ile；用ile、met、val、phe取代leu；用asn、glu、gln、his、arg取代lys；用ile、leu、val、phe取代met；用trp、tyr、met、ile或leu取代phe；用thr、ala取代ser；用ser或ala取代thr；用phe、tyr所取代trp；用his、phe或trp取代tyr；以及用met、ile、leu取代val。
編碼與(A)中定義的蛋白質(zhì)基本上相同的蛋白質(zhì)的DNA可以通過(guò)例如如下方法獲得使用定點(diǎn)誘變來(lái)修飾編碼(A)中定義的蛋白質(zhì)的核苷酸序列，以缺失、取代、插入或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。所述修飾的DNA可以通過(guò)常規(guī)的方法，使用產(chǎn)生突變的試劑和條件進(jìn)行處理而得到。這些處理包括用羥胺處理編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的DNA，或用紫外輻射或諸如N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍或亞硝酸的試劑處理含有該DNA的細(xì)菌。
由于天然多樣性，編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA還包括變體，這些變體可能存在于屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌的不同菌株和變體中。通過(guò)分離在嚴(yán)緊條件下與pgl基因或該基因的部分雜交，且編碼具有6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶活性的蛋白質(zhì)的DNA，可以得到編碼上述的變體的DNA。術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)緊條件”在本文中指這樣的條件，在該條件下形成所謂的特異性雜合體，而不形成非特異性雜合體。例如，嚴(yán)緊條件包括這樣的條件，在該條件下具有高同源性的DNA，例如相互之間具有不少于70％，優(yōu)選不少于80％，更優(yōu)選不少于90％，最優(yōu)選不少于95％的同源性的DNAs，發(fā)生雜交。或者，嚴(yán)緊條件通過(guò)這樣的條件舉例說(shuō)明，該條件包括Southern雜交中常規(guī)的洗滌條件，例如60℃，大約1xSSC，0.1％SDS，優(yōu)選0.1xSSC，0.1％SDS。洗滌的持續(xù)時(shí)間取決于印跡所用的膜的種類(lèi)，通常由生產(chǎn)商推薦。例如，HybondTMN+尼龍膜(Amersham)在嚴(yán)緊條件下推薦的洗滌持續(xù)時(shí)間為15分鐘。優(yōu)選地，洗滌可進(jìn)行2到3次。
SEQ ID NO1的核苷酸序列的部分序列也可以用作編碼變體并與pgl基因雜交的DNA的探針。這種探針可以使用基于SEQ ID NO1的核苷酸序列的寡核苷酸作為引物，含有SEQ ID NO1的核苷酸序列的DNA片段作為模板，通過(guò)PCR來(lái)制備。當(dāng)使用長(zhǎng)度大約300bp的DNA片段作為探針時(shí)，雜交的洗滌條件由例如50℃，2xSSC，和0.1％SDS組成。
用編碼蛋白質(zhì)的DNA轉(zhuǎn)化細(xì)菌的意思是將該DNA例如通過(guò)常規(guī)手段導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞，以增加編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)并增強(qiáng)該蛋白質(zhì)在該細(xì)菌細(xì)胞中的活性。
本發(fā)明的細(xì)菌是屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的產(chǎn)L-氨基酸細(xì)菌，其具有蛋白質(zhì)的增強(qiáng)的活性，增強(qiáng)了目標(biāo)L-氨基酸的生產(chǎn)能力。優(yōu)選地，本發(fā)明的細(xì)菌是產(chǎn)芳香族L-氨基酸的細(xì)菌，具體地，其屬于埃希氏菌屬，并具有增強(qiáng)的本發(fā)明的蛋白質(zhì)的活性。更優(yōu)選地，本發(fā)明的細(xì)菌是產(chǎn)芳香族L-氨基酸的細(xì)菌，例如產(chǎn)L-色氨酸細(xì)菌，具體地屬于埃希氏菌屬，其中該細(xì)菌已受到修飾以增強(qiáng)6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶的活性。更優(yōu)選地，本發(fā)明的細(xì)菌在其染色體上含有DNA，所述DNA包含帶有修飾的表達(dá)調(diào)控序列的pgl基因(ybhE ORF)，并具有增強(qiáng)的產(chǎn)L-色氨酸的能力。
“產(chǎn)L-氨基酸的細(xì)菌”指這樣的細(xì)菌，當(dāng)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的細(xì)菌時(shí)，其具有引起L-氨基酸在培養(yǎng)基中積累的能力?？梢酝ㄟ^(guò)培養(yǎng)來(lái)賦予或增強(qiáng)產(chǎn)L-氨基酸的能力。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“產(chǎn)L-氨基酸的細(xì)菌”還指這樣的細(xì)菌，其能夠以比野生型或親代菌株更大的量產(chǎn)生并在培養(yǎng)基中積累L-氨基酸，優(yōu)選地，指該微生物能夠產(chǎn)生并導(dǎo)致在培養(yǎng)基中積累不少于0.5g/L，更優(yōu)選不少于1.0g/L的量的目標(biāo)L-氨基酸。L-氨基酸包括L-丙氨酸，L-精氨酸，L-天冬酰胺，L-天冬氨酸，L-半胱氨酸，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，L-甘氨酸，L-組氨酸，L-異亮氨酸，L-亮氨酸，L-賴(lài)氨酸，L-甲硫氨酸，L-苯丙氨酸，L-脯氨酸，L-絲氨酸，L-蘇氨酸，L-色氨酸，L-酪氨酸，和L-纈氨酸，優(yōu)選地包括芳香族L-氨基酸，例如L-色氨酸，L-苯丙氨酸和L-酪氨酸。
腸桿菌科細(xì)菌包括屬于下列屬的細(xì)菌埃希氏菌屬，腸桿菌屬(Enterobacter)，歐文氏菌屬，克雷伯氏菌屬(Klebsiella)，泛菌屬(Pantoea)，普羅威登斯菌屬，沙門(mén)氏菌屬(Salmonella)，沙雷氏菌屬(Serratia)，志賀氏菌屬(Shigella)，摩根氏菌屬(Morganella)。腸桿菌屬，歐文氏菌屬，埃希氏菌屬，克雷伯氏菌屬，普羅威登斯菌屬，沙門(mén)氏菌屬，沙雷氏菌屬，志賀氏菌屬等。具體地，可以使用那些根據(jù)NCBI(國(guó)家生物技術(shù)信息中心)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbinpost/Taxomomy/wgetorg？mode＝Tree&id＝1236&lvl＝3&keep＝1&srchmode＝1&unlock))所用的分類(lèi)法歸類(lèi)于腸桿菌科的細(xì)菌。優(yōu)選埃希氏菌屬。
短語(yǔ)“屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌”意思是該細(xì)菌根據(jù)微生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的分類(lèi)而被分類(lèi)于埃希氏菌屬。本發(fā)明中使用的屬于埃希氏菌屬的微生物的例子包括，但不限于大腸桿菌(E.coli)。
可用于本發(fā)明的屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌無(wú)具體的限制，但是例如，由Neidhardt，F(xiàn).C.等(Escherichia coli and Salmonella typhimurium，AmericanSociety for Microbiology，Washington D.C.，1208，表1)描述的細(xì)菌為本發(fā)明所涵蓋。野生型的大腸桿菌菌株包括但不限于，K12菌株及其衍生菌株，大腸桿菌MG1655菌株(ATCC No.47076)，及W3110菌株(ATCC No.27325)。這些菌株都可從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，地址12301Parklawn Drive，Rockville Maryland 20852，美國(guó))得到。
術(shù)語(yǔ)“屬于泛菌屬的細(xì)菌”的意思是該細(xì)菌根據(jù)微生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的分類(lèi)而被歸類(lèi)于泛菌屬。根據(jù)16S rRNA等的核苷酸序列分析，最近已將成團(tuán)腸桿菌(Enterobacter agglomerans)的某些種重新歸類(lèi)于成團(tuán)泛菌(Pantoea agglomerans)，Pantoea ananatis，斯氏泛菌(Pantoea stewartii)等等。
術(shù)語(yǔ)“經(jīng)過(guò)修飾以增強(qiáng)6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶的活性”指每個(gè)細(xì)胞的活性已高于非修飾的菌株，例如野生型菌株。6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶活性可以用Collard’s方法測(cè)量(FEBS Letters 459(1999)223-226)。例如，當(dāng)每個(gè)細(xì)胞的6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶分子數(shù)增加時(shí)，每個(gè)6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶分子的比活性增加，等等。另外，作為比較的對(duì)象的野生型菌株包括，例如，大腸桿菌K-12。作為6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶的細(xì)胞內(nèi)活性增強(qiáng)的結(jié)果，L-氨基酸例如在培養(yǎng)基中積累的L-色氨酸的量的增加。
細(xì)菌細(xì)胞中6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶活性的增強(qiáng)是通過(guò)增加編碼6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶的基因(pgl基因)的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶基因包括來(lái)自于腸桿菌科中的細(xì)菌的基因。可通過(guò)，例如，使用遺傳重組技術(shù)增加細(xì)胞中pgl基因的拷貝數(shù)來(lái)增強(qiáng)pgl基因的表達(dá)。例如，可以通過(guò)如下方法得到重組DNA將含有pgl基因的基因片段連接到載體，優(yōu)選多拷貝載體中，該載體在宿主微生物的細(xì)胞中是可操作的；并將所得載體導(dǎo)入宿主微生物的細(xì)胞中。
當(dāng)使用大腸桿菌的pgl基因時(shí)，可以使用基于SEQ ID NO1的核苷酸序列設(shè)計(jì)的引物，并用大腸桿菌的染色體DNA作為模板，通過(guò)例如PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，參考White，T.J.等，Trends Genet.，5，185(1989))來(lái)獲得該pgl基因(ybhE)。也可以使用來(lái)自其他微生物的pgl基因，并可以從這些微生物的染色體DNA或者染色體DNA文庫(kù)中得到，使用以這些微生物的pgl基因，或其pgl基因的同源序列，或來(lái)自不同微生物的6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶蛋白質(zhì)的序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，通過(guò)PCR獲得；或使用基于所述序列信息制備的寡核苷酸探針，通過(guò)雜交獲得?？梢詮淖鳛镈NA供體的微生物中通過(guò)，例如Saito和Miura的方法(參考H.Saito和K.Miura，Biochem.Biophys.Acta，72，619，(1963)，Text for Bioengineering Experiments，由Society for Bioscience and Bioengineering，Japan編輯，pp.97-98，Baifukan，1992)來(lái)制備染色體DNA。
然后，將pgl基因連接到在宿主微生物的細(xì)胞中可操作的載體DNA中以制備重組DNA。優(yōu)選地，使用可以在宿主微生物的細(xì)胞中自主復(fù)制的載體。
可以在大腸桿菌中自主復(fù)制的載體的例子包括pUC19，pUC18，pHSG299，pHSG399，pHSG398，pACYC184，(pHSG和pACYC可以從Takara Bio獲得)，RSF1010，pBR322，pMW219(pMW可以從Nippon Gene獲得)，等等。
為了通過(guò)連接pgl基因和上述任一個(gè)載體來(lái)制備重組DNA，用限制性酶消化該載體和含有pgl基因的片段，并通常通過(guò)使用連接酶如T4DNA連接酶來(lái)相互連接。
為了將如上述制備的重組DNA導(dǎo)入微生物，可以使用目前報(bào)道過(guò)的任何已知的轉(zhuǎn)化方法。例如，一種用氯化鈣處理受體細(xì)胞以增加DNA的通透性的方法，其已被報(bào)道用于大腸桿菌(Mandel M.和Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))，和一種使用由生長(zhǎng)的細(xì)胞制備的感受態(tài)細(xì)胞來(lái)導(dǎo)入DNA的方法，其已被報(bào)道用于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)(Duncan，C.H.，Wilson，G.A.和Young，F(xiàn).E.，Gene，1，153(1977))，都可以使用。除了這些方法以外，可以使用將重組DNA導(dǎo)入原生質(zhì)體狀或原生質(zhì)球狀受體細(xì)胞中的方法，其已被報(bào)道適用于枯草芽孢桿菌，放線菌(actinomycetes)和酵母(Chang S.和Choen，S.N.，Molec.Gen.Genet.，168，111(1979)；Bibb，M.J.，Ward，J.M.和Hopwood，O.A.，Nature，274，398(1978)；Hinnen A.，Hicks，J.B.和Fink，G.R.，Proc.Natl.Sci.，USA，75，1929(1978))。
也可以通過(guò)將pgl基因的多個(gè)拷貝整合到微生物的染色體DNA上來(lái)增加pgl基因的拷貝數(shù)。為了將pgl基因的多個(gè)拷貝整合到微生物的染色體DNA上，可以通過(guò)將序列以多拷貝定向于染色體DNA上來(lái)進(jìn)行同源重組。作為在染色體DNA上以多拷貝存在的序列，重復(fù)DNA和轉(zhuǎn)座子末端存在的反向重復(fù)序列可以用作在染色體DNA上存在有多個(gè)拷貝的序列。或者，如JP2-109985A所公開(kāi)的，也可能將pgl基因摻入轉(zhuǎn)座子，并允許其被轉(zhuǎn)移，以使得該基因的多個(gè)拷貝整合到染色體DNA中。pgl基因整合入染色體可以使用具有pgl基因部分序列的探針通過(guò)southern雜交來(lái)證實(shí)。
本發(fā)明的細(xì)菌包括一種這樣的細(xì)菌，其中通過(guò)改變?cè)摷?xì)菌的染色體上編碼如(A)或(B)所定義的蛋白質(zhì)的DNA的表達(dá)調(diào)控序列，來(lái)增強(qiáng)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的活性(WO00/18935)?？梢酝ㄟ^(guò)將本發(fā)明的DNA置于取代天然啟動(dòng)子的更強(qiáng)的啟動(dòng)子的控制之下來(lái)實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的增強(qiáng)。例如，lac啟動(dòng)子，trp啟動(dòng)子，trc啟動(dòng)子，tac啟動(dòng)子，PR啟動(dòng)子等等都是已知的強(qiáng)啟動(dòng)子。術(shù)語(yǔ)“天然啟動(dòng)子”指在野生型生物體中存在的DNA區(qū)域，其位于基因的開(kāi)放閱讀框(ORF)的上游，并具有促進(jìn)該基因轉(zhuǎn)錄的功能。啟動(dòng)子的強(qiáng)度由RNA合成起始的作用頻率來(lái)定義。評(píng)估啟動(dòng)子強(qiáng)度的方法在，例如，Deuschle U.，Kammerer W.，Gentz R.，Bujard H.(Promoters in Escherichia colia hierarchy of in vivo strength indicates alternate structures.EMBO.J.1986，5，2987-2994)中描述。Goldstein等(Prokaryotic promoters in biotechnology.Biotechnol.Annu.Rev.，1995，1，105-128)公開(kāi)了一種評(píng)估啟動(dòng)子強(qiáng)度的方法和強(qiáng)啟動(dòng)子的例子。
可以通過(guò)向本發(fā)明的DNA中引入更高效的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)取代天然的RBS序列來(lái)實(shí)現(xiàn)翻譯的增強(qiáng)。RBS序列是位于mRNA的起始密碼子上游的一個(gè)區(qū)域，其與核糖體的16S RNA相互作用(Shine J.和DalgamoL.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1974，71，4，1342-6)。術(shù)語(yǔ)“天然的RBS序列”是指野生型生物體中存在的RBS序列。來(lái)自T7噬菌體基因10的RBS序列是高效的RBS序列的一個(gè)例子(Olins P.O.等，Gene，1988，73，227-235)。
可以通過(guò)將上述的DNAs導(dǎo)入本身具有產(chǎn)L-氨基酸能力的細(xì)菌中而得到本發(fā)明的細(xì)菌?；蛘?，可以通過(guò)將產(chǎn)生L-氨基酸的能力賦予已經(jīng)包含了上述DNAs的細(xì)菌而得到本發(fā)明的細(xì)菌。
作為有待增強(qiáng)本發(fā)明的蛋白活性的親代菌株，可以使用屬于埃希氏菌屬的產(chǎn)L-色氨酸細(xì)菌，缺失了突變的trpS基因所編碼的色氨酰-tRNA合成酶的大腸桿菌菌株JP4735/pMU3028(DSM10122)和JP6015/pMU91(DSM10123)(美國(guó)專(zhuān)利5,756,345)，具有不受絲氨酸反饋抑制的serA等位基因的大腸桿菌菌株SV164(pGH5)(美國(guó)專(zhuān)利6,180,373)；色氨酸酶缺陷的大腸桿菌菌株AGX17(pGX44)(NRRL B-12263)和AGX6(pGX50)aroP(NRRL B-12264)(美國(guó)專(zhuān)利4,371,614)，及磷酸烯醇丙酮酸生產(chǎn)能力增強(qiáng)的大腸桿菌菌株AGX17/pGX50，pACKG4-pps(WO9708333，美國(guó)專(zhuān)利6,319,696)。本發(fā)明的發(fā)明人先前已確認(rèn)，yddG基因編碼不參與任何L-氨基酸的生物合成途徑的膜蛋白，而當(dāng)該基因的野生型等位基因在微生物中的多拷貝載體上擴(kuò)增時(shí)，使得該微生物獲得對(duì)于L-苯丙氨酸和數(shù)種氨基酸的類(lèi)似物的抗性。另外，當(dāng)將額外的拷貝分別導(dǎo)入產(chǎn)生L-苯丙氨酸和L-色氨酸的菌株時(shí)，yddG基因可以增強(qiáng)L-苯丙氨酸和L-色氨酸的生產(chǎn)(俄羅斯專(zhuān)利申請(qǐng)2002121670，WO03044192)。因此，希望進(jìn)一步修飾產(chǎn)L-色氨酸細(xì)菌以增強(qiáng)yddG開(kāi)放閱讀框的表達(dá)。
對(duì)L-色氨酸生物合成有效的基因包括trpEDCBA操縱子的基因，芳香族酸共有途徑的基因，諸如aroF，aroG，aroH，aroB，aroD，aroE，aroK，aroL，aroA，和aroC基因，L-絲氨酸生物合成基因，諸如serA，serB和serC基因等等。
作為有待增強(qiáng)本發(fā)明的蛋白活性的親代菌株，可以使用屬于埃希氏菌屬的產(chǎn)苯丙氨酸細(xì)菌，大腸桿菌AJ12739株(tyrA::Tn10，tyrR)；含有pheA34基因的HW1089株(ATCC登記號(hào)55371)(US5,354,672)；突變的MWEC101-b株(KR8903681)；NRRL B-12141，NRRL B-12145，NRRLB-12146和NRRL B-12147株(US4,407,952)等。屬于埃希氏菌屬的產(chǎn)苯丙氨酸細(xì)菌進(jìn)一步包括大腸桿菌菌株K-12[W3110(tyrA)/pPHAB]，大腸桿菌菌株K-12[W3110(tyrA)/pPHAD]；大腸桿菌K-12[W3110(tyrA)/pPHATerm]，及命名為AJ 12604的大腸桿菌菌株K-12[W3110(tyrA)/pBR-aroG4，pACMAB]等(歐洲專(zhuān)利EP488424B1)。
作為有待增強(qiáng)本發(fā)明的蛋白活性的親代菌株，還可以使用屬于埃希氏菌屬的產(chǎn)酪氨酸細(xì)菌，產(chǎn)磷酸烯醇丙酮酸的能力被增強(qiáng)或者芳香族共有途徑的酶被增強(qiáng)的大腸桿菌菌株等等(EP0877090A)。
本發(fā)明的方法包括生產(chǎn)L-氨基酸的方法，其包括下列步驟在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的細(xì)菌，使L-氨基酸在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累，然后從培養(yǎng)基中收集L-氨基酸。同時(shí)，本發(fā)明的方法包括生產(chǎn)L-色氨酸的方法，其包括下列步驟在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的細(xì)菌，使L-色氨酸在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累，然后從培養(yǎng)基中收集L-色氨酸。本發(fā)明的方法包括生產(chǎn)L-苯丙氨酸的方法，其包括下列步驟在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的細(xì)菌，使L-苯丙氨酸在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累，然后從培養(yǎng)基中收集L-苯丙氨酸。本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括生產(chǎn)L-酪氨酸的方法，其包括下列步驟在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的細(xì)菌，使L-酪氨酸在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累，然后從培養(yǎng)基中收集L-酪氨酸。
在本發(fā)明中，培養(yǎng)、收集并從培養(yǎng)基中純化L-氨基酸，尤其是芳香族氨基酸例如L-色氨酸，L-苯丙氨酸和L-酪氨酸等，可以用與常規(guī)的發(fā)酵方法相似的方式進(jìn)行，其中使用微生物來(lái)產(chǎn)生氨基酸。
用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基可以是合成或天然的培養(yǎng)基，只要該培養(yǎng)基包括碳源和氮源和礦物質(zhì)及，必要的話，還包括微生物生長(zhǎng)所需的適量營(yíng)養(yǎng)物。
碳源包括多種碳水化合物例如葡萄糖和蔗糖，和多種有機(jī)酸。根據(jù)所選擇的微生物的同化作用模式，可以使用醇類(lèi)，包括乙醇和甘油。
作為氮源，可以使用各種銨鹽如氨和硫酸銨，其它的氮化合物諸如胺類(lèi)，天然氮源如蛋白胨，大豆水解物，和經(jīng)過(guò)消化的發(fā)酵微生物。
作為礦物質(zhì)，可以使用單磷酸鉀(potassium monophosphate)，硫酸鎂，氯化鈉，硫酸亞鐵，硫酸錳，氯化鈣等等。
必要時(shí)，可將附加營(yíng)養(yǎng)物加入培養(yǎng)基。例如，如果微生物生長(zhǎng)需要酪氨酸(酪氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型)，可以將足量的酪氨酸加入培養(yǎng)基用于培養(yǎng)。
優(yōu)選在有氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)，例如在20至42℃，優(yōu)選37至40℃的溫度振蕩培養(yǎng)和通氣攪拌培養(yǎng)。培養(yǎng)的pH通常在5和9之間，優(yōu)選在6.5和7.2之間?？梢杂冒?，碳酸鈣，多種酸，多種堿和緩沖液調(diào)節(jié)培養(yǎng)的pH。通常，1-5天的培養(yǎng)導(dǎo)致目標(biāo)L-氨基酸在液體培養(yǎng)基中的積累。
培養(yǎng)后，可以通過(guò)離心或膜過(guò)濾將固體如細(xì)胞從液體培養(yǎng)基中移除，然后收集目標(biāo)L-氨基酸，并通過(guò)離子交換，濃縮和結(jié)晶方法純化。
實(shí)施例下面，參考如下非限定性的實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明作更具體的說(shuō)明。
實(shí)施例1.從大腸桿菌中鑒定pgl基因及核苷酸序列的比較Kupor和Fraekel將pgl突變定位于大腸桿菌染色體上chlD(現(xiàn)在稱(chēng)為modC)和bioA基因之間(Kupor，S.R.和Fraenkel，D.G.，J.Bacteriol.，1003，1296-1301(1969))。這對(duì)應(yīng)于大腸桿菌遺傳圖譜上17.18和17.40分鐘的位置。在這個(gè)區(qū)域中有8個(gè)編碼功能未知的蛋白的開(kāi)放閱讀框。另外，E.coliStock Center Database將pgl突變定位于17.20和17.22分鐘之間。此坐標(biāo)幾乎與位于ybhA和ybhD開(kāi)放閱讀框(ORF)之間的ybhE開(kāi)放閱讀框的坐標(biāo)完全相符(圖1)。
對(duì)ybhE編碼的YbhE蛋白進(jìn)行BLAST搜索顯示在不同的生物體中存在許多功能未知的同源物，這些生物體例如弗氏志賀氏菌(Shigella flexmeri)(98.8％相似度)，傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonella typhi)(92.8％相似度)，鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)(68.4％相似度)，有些同源物具有已知的功能，例如來(lái)自炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)的細(xì)胞色素D1血紅素域(28％同一性)，通過(guò)自動(dòng)計(jì)算分析預(yù)測(cè)的來(lái)自熒光假單孢菌(Pseudomonasfluorescens)的3-羧甲基粘康酸環(huán)化酶(28％同一性)，來(lái)自白吉利絲孢酵母(Trichosporon beigelii)的黏康酸環(huán)式異構(gòu)酶(26％同一性)，以及來(lái)自蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)，在數(shù)據(jù)庫(kù)中以登記號(hào)為NP_833107被稱(chēng)為6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶的一種，但其沒(méi)有引用已發(fā)表的實(shí)驗(yàn)工作。
同時(shí)，使用NCBI保守域搜索(NBCI Conserved Domain Search)找到了3個(gè)重疊的保守蛋白域。其中的兩個(gè)屬于功能未被表征的保守蛋白質(zhì)家族，另外一個(gè)屬于3-羧甲基粘康酸環(huán)化酶家族。
在大腸桿菌蛋白質(zhì)組中進(jìn)行的BLAST搜索并沒(méi)有揭示出，例如來(lái)自惡臭假單孢菌(Pseudomonas putida)的所述6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶的同源物。
于是，為了鑒定大腸桿菌染色體中標(biāo)記為ybhE的ORF是否是編碼6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶的pgl基因，將ybhA、ybhE和ybhD ORF破壞，并檢查所得的突變體的“麥芽糖藍(lán)色”表型(見(jiàn)下)。
實(shí)施例2.ybhE ORF的破壞。用帶有氯霉素抗性基因(CmR)的DNA片段取代ybhE ORF。
為了破壞ybhE ORF，將帶有由cat基因編碼的氯霉素抗性標(biāo)記(CmR)的DNA片段整合到大腸桿菌菌株BW25113[pKD46]的染色體中取代天然的ybhE ORF，使用Datsenko K.A.和Wanner B.L.所描述的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97，6640-6645)，該方法又被稱(chēng)為“Red介導(dǎo)整合”(Red-mediated integration)和/或“Red驅(qū)動(dòng)整合”(Red-driven integration)。被取代的天然的ybhE ORF區(qū)域的核苷酸序列和由該ORF編碼的氨基酸序列在序列表中列出(分別為SEQ ID NO1和2)。含有該重組質(zhì)粒pKD46的大腸桿菌菌株BW25113可以從美國(guó)耶魯大學(xué)大腸桿菌遺傳保藏中心(E.coli Genetic Stock Center，Yale University，New Haven，USA)獲得，其登記號(hào)為CGSC7630。
使用商業(yè)上可得到的質(zhì)粒pACYC184(GenBank/EMBL登記號(hào)X06403，“Fermentas”，立陶宛)作為模板，和引物P1(SEQ ID NO3)和P2(SEQID NO4)，通過(guò)PCR獲得了含有CmR標(biāo)記的DNA片段。引物P1含有與ybhE ORF的5’端同源的36個(gè)核苷酸，引物P2含有與ybhE ORF的3’端同源的36個(gè)核苷酸。這些ybhE基因的序列被引入到P1和P2引物中用于進(jìn)一步整合到細(xì)菌染色體中。
使用“TermoHybaid PCR Express”擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR。反應(yīng)混合物(總體積-50μl)由下列組成含有15mM MgCl2的10xPCR緩沖液(“Fermentas”，立陶宛)5μl，dNTP每種200μM，選用的引物各25pmol，及Taq-聚合酶(“Fermentas”，立陶宛)1U。在反應(yīng)混合物中加入大約5ng的質(zhì)粒DNA作為PCR擴(kuò)增的模板DNA。溫度變化情況是95℃初始DNA變性5分鐘；然后進(jìn)行25個(gè)循環(huán)95℃下變性30秒，55℃下退火30秒，72℃下延伸30秒；和在72℃最終延伸7分鐘。
然后，將擴(kuò)增的DNA片段通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳純化，用“GenElute SpinColumns”(“Sigma”，美國(guó))提取，并用乙醇沉淀。構(gòu)建的DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO5所示。
將由上述純化所得的DNA片段用于電穿孔及Red介導(dǎo)整合入大腸桿菌菌株BW25113[pKD46]的細(xì)菌染色體。用含有該熱敏感復(fù)制子的重組質(zhì)粒pKD46(Datsenko K.A.和Wanner B.L.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97，6640-6645)作為供體提供負(fù)責(zé)在Red介導(dǎo)的重組系統(tǒng)中起作用的源于λ噬菌體的基因。
BW25113[pKD46]細(xì)胞在加入了氨芐青霉素(100μg/ml)的液體LB培養(yǎng)基中在30℃生長(zhǎng)過(guò)夜，然后用加入了氨芐青霉素(100μg/ml)和L-阿拉伯糖(10mM)(阿拉伯糖用于誘導(dǎo)編碼Red系統(tǒng)的基因的質(zhì)粒)的SOB培養(yǎng)基(酵母提取物，5g/l；NaCl，0.5g/l；胰蛋白胨，20g/l；KCl，2.5mM；MgCl2，10mM)按1∶100稀釋?zhuān)⒃?0℃生長(zhǎng)以達(dá)到細(xì)菌培養(yǎng)物的光密度OD600＝0.4-0.7。將來(lái)自10ml細(xì)菌培養(yǎng)物的培養(yǎng)細(xì)胞用冰冷的去離子水洗滌3次，再用100μl這樣的水重懸。將10μl溶于去離子水的DNA片段(100ng)加入細(xì)胞懸浮液。通過(guò)“Bio-Rad”電穿孔儀(美國(guó))(No.165-2908，版本2-89)參照制造商的說(shuō)明進(jìn)行電穿孔。將被電擊的細(xì)胞加入到1ml SOC培養(yǎng)基中(Sambrook等，“Molecular Cloning A Laboratory Manual，SecondEdition”，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))，37℃下溫育2小時(shí)，然后鋪到含有25μg/ml氯霉素的L-瓊脂上。使用引物P3(SEQ ID NO6)和P4(SEQ ID NO7)通過(guò)PCR來(lái)檢測(cè)生長(zhǎng)24小時(shí)之內(nèi)的菌落中取代了天然ybhE ORF的CmR標(biāo)記的存在。為此，將新鮮分離的菌落懸浮于20μl水中，然后將1μl所得的懸液用于PCR。溫度變化情況是在95℃初始DNA變性10分鐘；然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)95℃下變性30秒，55℃下退火30秒，72℃下延伸1分鐘；在72℃最終延伸7分鐘。少數(shù)受試的CmR菌落含有預(yù)期的1279bp的DNA片段，這證明了取代了天然ybhE ORF的CmR標(biāo)記DNA的存在。將所得菌株中的一個(gè)通過(guò)在37℃培養(yǎng)以消除(cure)其熱敏感型質(zhì)粒pKD46，由此得到的菌株被命名為大腸桿菌菌株BW25113-ΔybhE。
圖2顯示了ybhE ORF被破壞的細(xì)菌DNA區(qū)域的結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例3.ybha和ybhD ORF的破壞。用帶有氯霉素抗性基因(CmR)的DNA片段取代ybhA和ybhD ORFs。
為了破壞ybhA和ybhD ORFs，通過(guò)實(shí)施例2中描述的方法，將帶有由cat基因編碼的氯霉素抗性標(biāo)記(CmR)的DNA片段單獨(dú)地整合到大腸桿菌BW25113[pKD46]的染色體中分別取代天然的ybhA和ybhD ORFs。
為了得到用于電穿孔和破壞ybhA和ybhD ORFs的片段，分別合成兩對(duì)引物P5(SEQ ID NO8)和P6(SEQ ID NO9)，及P7(SEQ ID NO10)和P8(SEQ ID NO11)用于PCR。P5引物含有與ybhA ORF的3’端同源的36個(gè)核苷酸。P6引物含有與ybhA ORF的5’端同源的36個(gè)核苷酸。P7引物含有與ybhD ORF的3’端互補(bǔ)的36個(gè)核苷酸。P8引物含有與ybhD ORF的5’端互補(bǔ)的36個(gè)核苷酸。這些序列被引入引物P5、P6、P7和P8中以用于進(jìn)一步整合到細(xì)菌染色體中。
構(gòu)建的DNA片段的核苷酸序列分別顯示在SEQ ID NO12和SEQ IDNO13中。被取代的天然的ybhA和ybhD區(qū)域的核苷酸序列以登記號(hào)NC_000913.1顯示在GenBank中(分別為核苷酸號(hào)796836至797654和798845至799777，gi16128734和gi33347481)。圖3和圖4分別顯示了ybhA和ybhD ORFs被破壞的細(xì)菌DNA區(qū)域的結(jié)構(gòu)。
電穿孔以后，通過(guò)PCR檢測(cè)相應(yīng)菌落中CmR標(biāo)記的存在，對(duì)于ybhA ORF的破壞，使用引物P9(SEQ ID NO14)和P10(SEQ ID NO15)；對(duì)于ybhDORF的破壞，使用引物P11(SEQ ID NO16)和P12(SEQ ID NO17)。
在第一種情況下，少數(shù)受試的CmR菌落含有預(yù)期的1424bp的DNA片段，這證明取代了天然ybhA ORF的CmR基因的存在。在第二種情況下，少數(shù)受試的CmR菌落含有預(yù)期的1386bp的DNA片段，這證明取代了天然ybhD ORF的CmR基因的存在。在每一種情況中，將所得菌株中的一個(gè)通過(guò)在37℃培養(yǎng)以消除其熱敏感型質(zhì)粒pKD46，由此得到的菌株分別被命名為大腸桿菌菌株BW25113-ΔybhA和BW25113-ΔybhD。
實(shí)施例4.檢查ybhE-、ybhA-和ybhD-突變體的“麥芽糖藍(lán)色”表型。
用Kupor，S.R.和Fraenkel，D.G.的方法(J.Bacteriol.，1003，1926-1301(1969))檢測(cè)所得三種突變體菌株的每一種的“麥芽糖藍(lán)色”表型。在培養(yǎng)物點(diǎn)樣在含有0.8％麥芽糖的M9基本培養(yǎng)基平板上。6小時(shí)后，用5ml含0.01M I2和0.03M KI的溶液浸沒(méi)培養(yǎng)平板，將點(diǎn)樣顏色視覺(jué)評(píng)價(jià)為“藍(lán)色”或“不是藍(lán)色”。
所得的BW25113-ΔybhE被記為“藍(lán)色”，而B(niǎo)W25113-ΔybhA、BW25113-ΔybhD和BW25113株(作為對(duì)照菌株)則“不是藍(lán)色”。
實(shí)施例5.構(gòu)建帶有pgi以及ybhE或ybhD缺失的雙突變菌株。比較所述菌株在不同碳源上的生長(zhǎng)。
缺少磷酸葡糖異構(gòu)酶的突變株(pgi-)只使用戊糖磷酸途徑中的氧化性分支，在葡萄糖上生長(zhǎng)緩慢。第二個(gè)突變株還缺少了催化此分支中第二步的磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶(pgl)，這個(gè)突變株應(yīng)生長(zhǎng)得更慢，因?yàn)?-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶只能自發(fā)地水解為6-磷酸葡糖酸。因此，如果ybhE ORF真的是pgl基因，那么pgi，ybhE雙突變體將比野生型菌株和pgi突變體生長(zhǎng)得更慢。為支持這個(gè)意見(jiàn)，制備了pgi，ybhE雙突變體。
pgi基因的突變是這樣進(jìn)行的通過(guò)實(shí)施例2描述的方法，用帶有卡那霉素抗性基因(KmR)的DNA片段取代大腸桿菌菌株BW25113[pKD46]中的天然細(xì)菌染色體區(qū)域。被取代的天然pgi基因區(qū)域的核苷酸序列以登記號(hào)NC_000913.1顯示于GenBank中所示(核苷酸號(hào)4231337至4232986；gi16131851)。
使用商業(yè)上可得到的質(zhì)粒pUC4KAN(GenBank/EMBL登記號(hào)X06404，“Fermentas”，立陶宛)作為模板，和引物P13(SEQ ID NO18)和P14(SEQ ID NO19)，通過(guò)PCR獲得了含有KmR標(biāo)記的DNA片段。P13引物含有與pgi基因的3’端同源的36個(gè)核苷酸，而P14引物含有與pgi基因的5’端同源的36個(gè)核苷酸。這些來(lái)自pgi基因的序列被引入P13和P14引物中用于進(jìn)一步整合到細(xì)菌染色體中。
PCR按實(shí)施例2描述的方法進(jìn)行。
然后，將擴(kuò)增的DNA片段通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳濃縮，通過(guò)經(jīng)“GenEluteSpin Columns”(“Sigma”，美國(guó))離心從凝膠上提取，并用乙醇沉淀。構(gòu)建的DNA區(qū)域的核苷酸序列如SEQ ID NO20所示。
如實(shí)施例2所描述的一樣，將如上所述純化所得的DNA片段用于電穿孔及Red介導(dǎo)整合入大腸桿菌菌株BW25113[pKD46]的細(xì)菌染色體，不同之處是將細(xì)胞被鋪于含有50μg/ml卡那霉素的L-瓊脂平板上。
使用引物P15(SEQ ID NO21)和P16(SEQ ID NO22)進(jìn)行PCR來(lái)檢測(cè)生長(zhǎng)24小時(shí)之內(nèi)的菌落中取代pgi基因的KmR標(biāo)記的存在。為此，將新鮮分離的菌落懸于20μl水中，然后將1μl所得的懸液用于PCR。PCR的條件如實(shí)施例2所描述的。少數(shù)受試的KmR菌落含有預(yù)期的1286bp的DNA片段，這證明取代了pgi基因的KmR基因的存在。將所得菌株中的一個(gè)通過(guò)在37℃培養(yǎng)以消除其熱敏感型質(zhì)粒pKD46，并將得到的菌株命名為大腸桿菌菌株BW25113-Δpgi。
圖5顯示pgi基因缺失的細(xì)菌DNA區(qū)域的結(jié)構(gòu)。
用Fraenkel的方法(J.Bacteriol.93(1967)，1582-1587)將pgi缺失轉(zhuǎn)導(dǎo)入大腸桿菌MG1655菌株，然后在含有卡那霉素的平板上篩選。將獲得的菌株命名為MG-Δpgi。然后，從實(shí)施例2和3描述的菌株BW25113-ΔybhE和BW25113-ΔybhD中將ybhE和ybhD ORFs中突變轉(zhuǎn)導(dǎo)到所得的該菌株中，然后在含氯霉素的平板上篩選。將所得的菌株分別命名為MG-Δpgi-ΔybhE和MG-Δpgi-ΔybhD。
將這兩種菌株連同MG1655和MG1655-Δpgi點(diǎn)樣到用葡萄糖或葡糖酸作碳源的M9基本培養(yǎng)基平板上。經(jīng)過(guò)24小時(shí)溫育，視覺(jué)觀察測(cè)定菌株的生長(zhǎng)情況。MG-Δpgi-ΔybhE在含葡萄糖的平板上的生長(zhǎng)比其他菌株都差，而在含葡糖酸的平板上則無(wú)差別。
實(shí)施例6.構(gòu)建帶有來(lái)自惡臭假單孢菌的pgl基因的質(zhì)粒及ybhE突變的互補(bǔ)。
已描述了來(lái)自數(shù)種生物的pgl基因。其中包括來(lái)自惡臭假單孢菌的6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶，惡臭假單孢菌與大腸桿菌的親緣關(guān)系相當(dāng)近。已經(jīng)將數(shù)個(gè)基因從惡臭假單孢菌克隆到大腸桿菌中，而且報(bào)道了大腸桿菌中出現(xiàn)了相應(yīng)突變的互補(bǔ)(Ramos-Gonzalez，M.I.和Molin，S.，J.Bacteriol.，v180，13，p.3421，1998)。
使用引物17(SEQ ID NO23)和18(SEQ ID NO24)克隆了來(lái)自惡臭假單孢菌的pgl基因。引物P17含有一段序列，其與來(lái)自惡臭假單孢菌的pgl基因的1到19bp的序列相同。該引物還包含位于上游來(lái)自大腸桿菌lacZ基因的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)，以及引入到其5’末端的限制酶SacI的識(shí)別位點(diǎn)。引物P18含有與來(lái)自惡臭假單孢菌的pgl基因的709到729bp的序列互補(bǔ)的序列，以及引入到其5’末端的限制酶EcoRI的識(shí)別位點(diǎn)。
用通常的方法制備惡臭假單孢菌KT2440菌株TG1的染色體DNA(Bagdasarian，M和Timmis，K.N.Current Topics of Microbiology andImmunology，Goebel，W和Hofschneider，P.H.編(Springer，Berlin)，pp.47-67(1981))。在“Perkin Elmer GeneAmp PCR System 2400”中進(jìn)行PCR，條件如下95℃下40秒，53℃下40秒，72℃下40秒，25個(gè)循環(huán)，使用Taq聚合酶(Fermentas)。用SacI和EcoRI限制酶處理所得的含有來(lái)自惡臭假單孢菌的pg1基因并具有l(wèi)acZ基因RBS的PCR擴(kuò)增片段，并將其插入預(yù)先用同樣的限制酶處理過(guò)的多拷貝載體pUC19。于是得到了質(zhì)粒pUC19-pgl。
用所得的質(zhì)粒pUCl9-pgl轉(zhuǎn)化菌株BW25113-ΔybhE。將該培養(yǎng)物點(diǎn)樣到含100μl氨芐青霉素的基本麥芽糖平板上，并如前所述處理以檢查其“麥芽糖藍(lán)色”表型。與對(duì)照菌株BW25113-ΔybhE相反，轉(zhuǎn)化子并沒(méi)有顯示“麥芽糖藍(lán)色”表型。
因此，來(lái)自惡臭假單孢菌的pgl基因的克隆的拷貝與大腸桿菌中ybhE突變互補(bǔ)，這再一次支持了我們關(guān)于ybhE ORF是pgl基因的編碼區(qū)的假設(shè)。
實(shí)施例7.測(cè)定ybhE突變體中6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶的活性。
將菌株BW25113和BW25113-ΔybhE的過(guò)夜培養(yǎng)物用含葡萄糖的基本M9培養(yǎng)基稀釋50倍。培養(yǎng)細(xì)胞直到培養(yǎng)物的光密度達(dá)到OD540＝1。從3ml培養(yǎng)物中制備提取物。用生理溶液洗滌細(xì)胞，將細(xì)胞重懸于400μl磷酸鉀緩沖液(pH7.0)并超聲處理。然后將離心所得的上清組分用于分析，不需進(jìn)一步稀釋。
使用Collard，F(xiàn).等描述的方法(FEBS Letters 459(1999)223-226)測(cè)量6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶的活性。通過(guò)在30℃將50μM 6-磷酸葡萄糖(Sigma，美國(guó))在0.2mM NADP、25mM HEPES(pH7.1)、2mM MgCl2和1.75U的酵母6-磷酸葡萄糖脫氫酶(Sigma，美國(guó))存在的條件下溫育(總體積-1ml)來(lái)即時(shí)制備內(nèi)酯。當(dāng)反應(yīng)混合物的光密度在A340達(dá)到穩(wěn)定水平時(shí)，加入0.5U/ml的6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(Sigma，美國(guó))連同先前所得的待測(cè)上清級(jí)分，再于A340測(cè)量光密度10分鐘。根據(jù)Bradford，M.M.(Anal.Biochem.72，248-254(1976))的方法測(cè)量蛋白質(zhì)的量。所得的數(shù)據(jù)如表1所示。活性以每mg總蛋白的相對(duì)單位數(shù)表示。
表1

從上表可見(jiàn)，ybhE突變體中的6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶活性比“野生型”菌株中至少低1個(gè)數(shù)量級(jí)(one order of magnitude)，并且可以和自發(fā)水解的速率相比較。
實(shí)施例8.zwf-edd-eda操縱子的缺失。用帶有卡那霉素抗性基因(KmR)的DNA片段取代zwf-edd-eda基因區(qū)域。
為了獲得具有增加的YbhE表達(dá)的菌株，我們計(jì)劃使用Red-介導(dǎo)的整合(見(jiàn)實(shí)施例9)將來(lái)自Ptac的組成型啟動(dòng)子整合到y(tǒng)bhE RBS和其天然啟動(dòng)子之間。
但是我們未能提供“野生型”菌株MG1665的這種染色體修飾。我們不能解釋pgl(ybhE)增強(qiáng)表達(dá)的毒性效應(yīng)，但我們認(rèn)為這和增加的6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶活性有關(guān)，6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶活性增加造成戊糖磷酸途徑(PPP)的不平衡，并可能造成某些有毒的中間產(chǎn)物的積累(或某些對(duì)細(xì)胞生存必需的中間產(chǎn)物的缺乏)。因此，我們決定通過(guò)缺失編碼PPP的第一個(gè)酶的zwf基因來(lái)徹底關(guān)閉PPP。
缺失zwf-edd-eda通過(guò)實(shí)施例5描述的缺失pgi基因的方法來(lái)進(jìn)行。被取代的天然zwf-edd-eda操縱子區(qū)域的核苷酸序列以登記號(hào)NC_000913.1顯示于GenBank中(zwf、edd和eda基因分別為核苷酸號(hào)1932863至1934338，gi16129805；1930817至1932868，gi16129804；和1930139至1930780，gi16129803)。使用引物P19(SEQ ID NO25)和P20(SEQ ID NO26)通過(guò)PCR獲得帶有KmR基因的DNA片段。引物P19含有與eda基因的3’端互補(bǔ)的36個(gè)核苷酸，引物P20含有與zwf基因的5’端互補(bǔ)的36個(gè)核苷酸。構(gòu)建的DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO27所示。
使用引物P21(SEQ ID NO28)和P22(SEQ ID NO29)通過(guò)PCR來(lái)檢測(cè)生長(zhǎng)24小時(shí)之內(nèi)的菌落中取代zwf-edd-eda操縱子的KmR標(biāo)記的存在。少數(shù)受試的KmR菌落含有預(yù)期的1287bp的DNA片段，這證明了取代zwf-edd-eda操縱子的KmR基因的存在。將所得菌株中的一個(gè)通過(guò)在37℃下培養(yǎng)以消除其熱敏感型質(zhì)粒pKD46，并將得到的菌株命名為大腸桿菌菌株BW25113-Δzwf-edd-eda。圖6顯示zwf-edd-eda操縱子被缺失的細(xì)菌DNA區(qū)域的結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例9.用帶有合成的Ptac*啟動(dòng)子的新調(diào)控元件取代位于大腸桿菌染色體上的ybhE基因的天然上游區(qū)域。
為了進(jìn)一步將不同強(qiáng)度的人工Ptac*啟動(dòng)子整合到pgl(ybhE)基因的上游，用pKD46質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株BW25113-Δzwf-edd-eda。所得的卡那霉素和氨芐青霉素抗性菌株命名為大腸桿菌菌株BW25113-Δzwf-edd-eda[pKD46]。由于pKD46質(zhì)粒是熱敏感的，進(jìn)一步的轉(zhuǎn)化子篩選在30℃下進(jìn)行。
具有由帶有σ70的大腸桿菌RNA聚合酶復(fù)合物所識(shí)別的修飾的啟動(dòng)子“-35”區(qū)的突變體，具有顯著變化的轉(zhuǎn)錄起始效率，這是一個(gè)確證的事實(shí)(WO00/18935)。所以，在獲得的由初始的隨機(jī)啟動(dòng)子樣序列產(chǎn)生的啟動(dòng)子當(dāng)中，可以獲得具有不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子。因此，這種普通方法可以用來(lái)對(duì)目標(biāo)基因的表達(dá)水平進(jìn)行微調(diào)。本發(fā)明的發(fā)明人先前獲得了具有不同強(qiáng)度的經(jīng)過(guò)修飾的Ptac啟動(dòng)子(以下將這種修飾過(guò)的Ptac啟動(dòng)子以星號(hào)標(biāo)記)的文庫(kù)。這些啟動(dòng)子在“-35”區(qū)的4個(gè)中心核苷酸上有差異。在本發(fā)明中，使用具有不同強(qiáng)度的兩個(gè)Ptac*啟動(dòng)子。基于在相應(yīng)啟動(dòng)子控制下所表達(dá)的β-半乳糖苷酶的活性值，這些啟動(dòng)子被命名為Ptac-10000(通常的Ptac)和Ptac-3900(以TTGC中心核苷酸代替原始的TGAC)。
然后，通過(guò)上述的方法(參見(jiàn)實(shí)施例2)將這些人工Ptac*啟動(dòng)子的每一個(gè)整合到大腸桿菌菌株BW25113-Δzwf-edd-eda[pKD46]染色體中pgl基因編碼區(qū)的上游。另外，還整合了在啟動(dòng)子區(qū)的上游具有氯霉素抗性基因(CmR)的人工DNA片段(參見(jiàn)圖7)。
構(gòu)建上述的整合到細(xì)菌染色體的相應(yīng)區(qū)域中的人工DNA片段是通過(guò)如下幾個(gè)步驟進(jìn)行的。第一步，通過(guò)PCR獲得在上游區(qū)帶有BglII限制性位點(diǎn)并帶有相應(yīng)的Ptac*啟動(dòng)子的DNA片段。
使用染色體中整合了人工Ptac-3900啟動(dòng)子和Ptac-10000啟動(dòng)子的大腸桿菌MG1655菌株的染色體DNA作為PCR的模板。Ptac-3900(3000)和Ptac-10000的PCR分別使用引物P23(SEQ ID NO30)和P24(SEQ ID NO31)，并在兩種情況中都使用引物P25(SEQ ID NO32)。引物P23和P24含有在其5’末端引入的BglII限制性位點(diǎn)。引物P25含有pgl基因上游的11個(gè)核苷酸(包括RBS)以及pgl編碼區(qū)的最前面的25個(gè)核苷酸。將上述序列導(dǎo)入引物P25中用于進(jìn)一步整合到細(xì)菌染色體中。
使用擴(kuò)增式“TermoHybaid PCR Express PCR System”進(jìn)行PCR。反應(yīng)混合物(總體積50μl)由下列組成含有15mM MgCl2的10xPCR緩沖液(“Fermentas”，立陶宛)5μl，dNTP每種200μM，選用的引物各25pmol，及Taq-聚合酶(“Fermentas”，立陶宛)1U。反應(yīng)混合物中加入0.5μg的染色體DNA作為模板DNA用于進(jìn)一步PCR驅(qū)動(dòng)的擴(kuò)增。PCR溫度條件如下在95℃初始DNA變性5分鐘；然后進(jìn)行25個(gè)循環(huán)95℃下變性30秒，53℃下退火30秒，72℃下延伸30秒；和在72℃最終聚合7分鐘。
進(jìn)行構(gòu)建目標(biāo)DNA片段的第二個(gè)階段。使用商業(yè)上可得到的質(zhì)粒pACYC184(GenBank/EMBL登記號(hào)X06403，“Fermentas”，立陶宛)作為模板和引物P26(SEQ ID NO33)和P27(SEQ ID NO34)，通過(guò)PCR擴(kuò)增CmR基因。引物P26含有用于進(jìn)一步與先前獲得的帶有Ptac*啟動(dòng)子的DNA片段相連接的BglII限制性位點(diǎn)。引物P27含有與位于來(lái)自大腸桿菌pgl(ybhE)基因起始密碼子上游的核苷酸58至12互補(bǔ)的46個(gè)核苷酸，它們對(duì)于進(jìn)一步將該片段整合入細(xì)菌染色體是必需的。
然后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳濃縮擴(kuò)增后的DNA片段，通過(guò)經(jīng)“GenEluteSpin Columns”(“Sigma”，美國(guó))離心從凝膠中提取，并用乙醇沉淀。然后用BglII限制性?xún)?nèi)切酶處理所得的兩個(gè)DNA片段，然后使用T4 DNA連接酶連接(Maniatis T.，F(xiàn)ritsch E.F.，Sambrook，J.Molecular CloningALaboratory Manual.2ndedn.Cold Spring Harbor，NYCold Spring Harbor Press，1989)。
將連接產(chǎn)物使用引物P25和P27通過(guò)PCR擴(kuò)增。PCR的反應(yīng)混合物(總體積50μl)由下列組成10xAccuTaq LA緩沖液(“Sigma”，美國(guó))5μl，dNTP每種200μM，選用的引物各25pmol，及AccuTaq LA聚合酶(“Sigma”，美國(guó))1U(μ)。在反應(yīng)混合物中加入大約50ng的DNA連接產(chǎn)物作為模板。PCR溫度循環(huán)如下在95℃初始DNA變性5分鐘；然后進(jìn)行25個(gè)循環(huán)95℃下變性30秒，55℃下退火30秒，72℃下延伸4分鐘；并在72℃最終聚合7分鐘。
對(duì)Ptac-3900和Ptac-10000啟動(dòng)子，所構(gòu)建的DNA區(qū)域的核苷酸序列分別如SEQ ID NO35和SED ID NO26所示。
將如上所述純化所得的DNA片段用于電穿孔并Red介導(dǎo)整合入大腸桿菌菌株BW25113-Δzwf-edd-eda[pKD46]的細(xì)菌染色體中，如實(shí)施例2所述。
用引物P27(SEQ ID NO34)和P10(SEQ ID NO15)通過(guò)PCR來(lái)檢測(cè)在含有氯霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)了24小時(shí)之內(nèi)的菌落中pgl基因上游CmR標(biāo)記的存在。還通過(guò)PCR檢測(cè)相同菌落中pgl基因上游的Ptac*啟動(dòng)子區(qū)域的存在，對(duì)Ptac-3900和Ptac-10000分別使用引物P23(SEQ ID NO30)和P24(SEQID NO31)，以及P10(SEQ ID NO15)。為此，將新鮮分離的菌落懸浮于20μl水中，然后將1μl的懸浮液用于PCR。PCR的條件如下在95℃初始DNA變性10分鐘；然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)95℃下變性30秒，54℃下退火30秒，72℃下延伸1分鐘；并在72℃最終聚合7分鐘。少數(shù)受試的CmR菌落含有預(yù)期的1193bp和124bp的DNA片段，這分別證明pgl基因的上游存在著整個(gè)構(gòu)建的DNA區(qū)域；大腸桿菌染色體上存在帶有Ptac*啟動(dòng)子的雜合調(diào)控元件。在兩種情況下都將所得菌株中的一個(gè)通過(guò)在37℃培養(yǎng)以消除其熱敏感型質(zhì)粒pKD46，并將得到的菌株分別命名為大腸桿菌菌株BW25113-Ptac-3900-ybhE和BW25113-Ptac-10000-ybhE。Pgl基因上游的構(gòu)建的DNA區(qū)域的結(jié)構(gòu)如圖7所示。
實(shí)施例10.測(cè)定具有增強(qiáng)的Pgl基因表達(dá)的菌株中的6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶活性。
如實(shí)施例7所述，測(cè)量了菌株BW25113-Ptac-3900-ybhE和BW25113-Ptac-10000-ybhE的6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶活性。所得數(shù)據(jù)如表2所示。已經(jīng)減去了自發(fā)水解的水平。
表2.


所以，增強(qiáng)的pgl基因的表達(dá)導(dǎo)致6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶活性的增加。
實(shí)施例11.增強(qiáng)的pgl基因表達(dá)對(duì)色氨酸生產(chǎn)的影響。
用產(chǎn)色氨酸的大腸桿菌菌株SV164[pMW-PlacUV5-serA5-fruR，pYDDG2]作為親本菌株來(lái)評(píng)估增強(qiáng)的pgl基因表達(dá)對(duì)色氨酸生產(chǎn)的影響。美國(guó)專(zhuān)利6,180,373詳細(xì)描述了菌株SV164。菌株SV164[pMW-PlacUV5-serA5-fruR，pYDDG2]是菌株SV164的衍生物，并附加地含有質(zhì)粒pMW-PlacUV5-serA5-fruR和pYDDG2。質(zhì)粒pMW-PlacUV5-serA5-fruR帶有編碼蛋白的突變體serA5基因，其不受絲氨酸的反饋抑制(WO2004090125 A2)。serA5基因的擴(kuò)增對(duì)增加L-色氨酸的前體—絲氨酸的量是必要的(美國(guó)專(zhuān)利6,180,373)。質(zhì)粒pYDDG2是根據(jù)pAYCTER3載體(WO03/044192)而構(gòu)建的，其含有編碼對(duì)L-色氨酸生產(chǎn)有用的跨膜蛋白(推定的輸出蛋白(exporter))的yddG基因。pAYCTER3載體是pAYC32的衍生物，pAYC32是一種具有中等拷貝數(shù)且非常穩(wěn)定的載體，其基于質(zhì)粒RSF1010構(gòu)建，且含有鏈霉素抗性標(biāo)記(Christoserdov A.Y.，Tsygankov Y.D，Broad-host rangevectors derived from a RSF 1010 Tnl plasmid，Plasmid，1986，v.16，pp.161-167)。pAYCTER3是通過(guò)將來(lái)自pUC19質(zhì)粒的多接頭和強(qiáng)終止子rrnB導(dǎo)入pAYC32質(zhì)粒以取代其啟動(dòng)子從而得到的。
為了測(cè)試受Ptac*啟動(dòng)子控制的pgl基因的增強(qiáng)的表達(dá)對(duì)于色氨酸生產(chǎn)的影響，通過(guò)P1轉(zhuǎn)導(dǎo)(Miller，J.H.(1972)Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring Harbor Lab.Press，Plainview，NY)將來(lái)自上述大腸桿菌菌株BW25113-Ptac-3900-ybhE和BW25113-Ptac-10000-ybhE的染色體的DNA片段轉(zhuǎn)入產(chǎn)色氨酸的大腸桿菌菌株SV164[pMW-PlacUV5-serA5-fruR]中。然后將質(zhì)粒pYDDG2引入SV164[pMW-PlacUV5-serA5-fruR]菌株和所得的轉(zhuǎn)導(dǎo)物中。
將SV164[pMW-PlacUV5-serA5-fruR，pYDDG2]、SV164-Ptac-3900-ybhE[pMW-PlacUV5-serA5fruR，pYDDG2]和SV164-Ptac-10000-ybhE[pMW-PlacUV5-serA5-fruR，pYDDG2]菌株都在3ml添加了100μl/ml氨芐青霉素和50μl/ml鏈霉素的營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37℃振蕩下培養(yǎng)過(guò)夜。將0.3ml所得的培養(yǎng)物接種到20×200mm的試管中的3ml含上述抗生素的發(fā)酵培養(yǎng)基中，用250rpm的旋轉(zhuǎn)振蕩器在37℃培養(yǎng)40小時(shí)。
發(fā)酵培養(yǎng)基的組成如表3所示。
表3

A部分用NH4OH調(diào)到pH7.1。每部分單獨(dú)消毒。
培養(yǎng)后，通過(guò)TLC測(cè)定培養(yǎng)基中積累的L-色氨酸的量。使用包被0.11mm Sorbfil硅膠層而無(wú)熒光指示劑的10×15cm TLC平板(Stock CompanySorbpolymer，Krasnodar，俄羅斯)。Sorbfil平板用流動(dòng)相2-丙醇∶乙酸乙酯∶25％氨水∶水＝16∶16∶3∶9(v/v)展開(kāi)，用茚三酮的丙酮溶液(2％)作顯色劑。所得的數(shù)據(jù)如表4所示。
表4

從表4可見(jiàn)，pgl基因表達(dá)的增強(qiáng)改進(jìn)了SV164[pMW-PlacUV5-serA5-fruR，pYDDG2]菌株的色氨酸生產(chǎn)能力。
實(shí)施例12.純化帶組氨酸標(biāo)簽的YbhE蛋白及測(cè)定其6-PGL(6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶)活性。
前面實(shí)施例1-7描述的所有結(jié)果間接地顯示ybhE ORF是大腸桿菌中編碼功能活性的6-PGL的pgl基因。另一方面，可能ybhE ORF編碼例如另一種未知基因表達(dá)的正調(diào)節(jié)物，而該未知基因又編碼6-PGL。因此，只有通過(guò)直接確定ybhE ORF的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的生物學(xué)活性，才能最終作出有關(guān)ybhEORF性質(zhì)的最終結(jié)論。
為此，通過(guò)利用T7表達(dá)系統(tǒng)過(guò)表達(dá)ybhE ORF，T7表達(dá)系統(tǒng)包括作為受體菌株的大腸桿菌BL21(DE3)，其在染色體中帶有T7RNA聚合酶，和pET-22b(+)載體質(zhì)粒，該質(zhì)粒帶有T7后期啟動(dòng)子(late protmoter)和T7基因10的有效RBS。為了后續(xù)蛋白純化的方便，在ybhE ORF的5’端緊接著ATG起始密碼子的后面插入了6個(gè)組氨酸的密碼子。
為了在T7表達(dá)系統(tǒng)中克隆帶有組氨酸標(biāo)簽序列的ybhE ORF，使用引物P28(SEQ ID NO37)和P29(SEQ ID NO38)，以大腸桿菌菌株MG1655的染色體DNA作為模板進(jìn)行PCR。引物P28含有NdeI限制性位點(diǎn)，以及與6個(gè)附加的組氨酸密碼子相連的ATG密碼子，之后則是ybhE ORF的第二個(gè)密碼子。引物P29在其5’末端含有BamHI限制性位點(diǎn)用于進(jìn)一步克隆。將擴(kuò)增的DNA片段分離，用NdeI和BamHI限制酶處理，并連接到已用同樣的限制酶處理過(guò)的pET-22b(+)質(zhì)粒中。通過(guò)測(cè)序來(lái)驗(yàn)證所得pET-HT-ybhE質(zhì)粒的構(gòu)建。
然后，用pET-HT-ybhE質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)細(xì)胞，所述細(xì)胞在其染色體上帶有在乳糖啟動(dòng)子控制之下的T7RNA聚合酶基因。將來(lái)自單菌落的過(guò)夜培養(yǎng)物用LB稀釋50倍，并生長(zhǎng)至OD600～1.0，然后加入IPTG(1mM)以誘導(dǎo)重組質(zhì)粒中T7RNA聚合酶驅(qū)動(dòng)的ybhE ORF的表達(dá)。溫育2小時(shí)后，從20ml中收集細(xì)胞，在含20mM Tris-HCl，pH8.0和2mM PMSF的緩沖液中通過(guò)超聲處理制備細(xì)胞提取物。然后，在16,000xg，4℃將探針離心20min，然后使用Hitrap Chelating HP Columns(Amersham Biosciences)按照制造商的推薦從上清中純化組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)。
在指數(shù)培養(yǎng)中誘導(dǎo)T7表達(dá)系統(tǒng)2個(gè)小時(shí)后，觀察到蛋白質(zhì)的積累，所述蛋白質(zhì)具有對(duì)應(yīng)于帶組氨酸標(biāo)簽的YbhE(MW＞＞37Kda的蛋白)的電泳遷移率。該蛋白質(zhì)的量為總細(xì)胞多肽的大約15％。觀察到該蛋白質(zhì)大部分存在于可溶相中(參見(jiàn)圖8A)。
使用Ni-NTA柱純化所得的His6-YbhE蛋白。通過(guò)根據(jù)由Laemmli U.K.(Nature，227，680-685(1970))描述的方法進(jìn)行SDS-PAGE電泳來(lái)測(cè)定重組蛋白質(zhì)的合成水平及純化過(guò)程的控制。由圖8B可見(jiàn)，所得蛋白質(zhì)的純度高于90％，而且其在標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)酯酶測(cè)試中顯示出6-PGL活性(Collard，F(xiàn).等，F(xiàn)EBSLetters，459，223-226(1999)；實(shí)施例7)。有趣的是測(cè)得的純化的His6-YbhE的6-PGL比活性(780U/mg)與先前報(bào)道的類(lèi)似地帶有His6標(biāo)簽的人6-PGL(710U/mg)(Collard，F(xiàn).等，F(xiàn)EBS Letters，459，223-226(1999))非常接近。
因此，可以斷定來(lái)自大腸桿菌的功能未知的ybhE ORF的確是編碼6-PGL的pgl基因。
實(shí)施例13.增強(qiáng)的pgl基因表達(dá)對(duì)于苯丙氨酸生產(chǎn)的影響。
將產(chǎn)苯丙氨酸的大腸桿菌菌株AJ12739用作親代菌株用于評(píng)價(jià)增強(qiáng)的pgl基因表達(dá)對(duì)于苯丙氨酸生產(chǎn)的影響。此菌株AJ12739在2001年11月6日以登記號(hào)VKPM B-8197保藏在工業(yè)微生物俄羅斯國(guó)家保藏中心(RussianNational Collection of Industrial Microorganisms)(VKPM)(Russia，113545Moscow，1stDorozhny proezd，1)。
通過(guò)P1轉(zhuǎn)導(dǎo)將來(lái)自BW25113-Ptac-3900-ybhE和BW25113-Ptac-10000-ybhE菌株的染色體DNA片段轉(zhuǎn)入產(chǎn)苯丙氨酸的菌株AJ12739中，分別獲得AJ12739Ptac-3900-ybhE和AJ12739Ptac-10000-ybhE菌株。將這些菌株分別在含25mg/l氯霉素的營(yíng)養(yǎng)肉湯中在37℃培養(yǎng)18小時(shí)，并將0.3ml所得的培養(yǎng)物接種到20×200mm的試管中的3ml含25mg/l氯霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基中，并用旋轉(zhuǎn)振蕩器在34℃培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)后，通過(guò)TLC測(cè)定培養(yǎng)基中積累的苯丙氨酸的量。使用包被0.11mm Sorbfil硅膠層而無(wú)熒光指示劑的10×15cm TLC平板(Stock Company Sorbpolymer，Krasnodar，俄羅斯)。將Sorbfil平板用流動(dòng)相2-丙醇∶乙酸乙酯∶25％氨水∶水＝40∶40∶7∶9(v/v)展開(kāi)，用茚三酮的丙酮溶液(2％)作顯色劑。
發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為(g/l)葡萄糖40.0(NH4)2SO416.0K2HPO40.1MgSO4·7H2O 1.0FeSO4·7H2O 0.01MnSO4·5H2O 0.01鹽酸硫胺素0.0002酵母提取物2.0酪氨酸0.125CaCO320.0葡萄糖和硫酸鎂單獨(dú)消毒。CaCO3在180℃干熱消毒2h。pH調(diào)到7.0?？股卦谙竞蠹尤肱囵B(yǎng)基中。結(jié)果如表5所示。
表5

從表5可見(jiàn)Pgl基因的表達(dá)的提高改善了AJ12739菌株的苯丙氨酸的生產(chǎn)。
本發(fā)明已參照其優(yōu)選的實(shí)施例得以詳細(xì)地說(shuō)明，但對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)地可以作出多種改變或使用同等方案，而不背離本發(fā)明的范圍。所有引用的參考文獻(xiàn)在此都引入作為本申請(qǐng)的一部分供參考。
工業(yè)應(yīng)用性根據(jù)本發(fā)明，可以提高L-氨基酸例如L-色氨酸，L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的生產(chǎn)。
序列表<110>味之素株式會(huì)社<120>生產(chǎn)L-氨基酸的方法<130>C255OPC4299<140>
<141>
<150>RU2004105179<151>2004-02-25<150>US60/604,698<151>2004-08-27<150>RU2005101700<151>2005-01-26<160>38<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>996<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(996)<400>1atg aag caa aca gtt tat atc gcc agc cct gag agc cag caa att cac48Met Lys Gln Thr Val Tyr Ile Ala Ser Pro Glu Ser Gln Gln Ile His1 5 10 15gtc tgg aat ctg aat cat gaa ggc gca ctg acg ctg aca cag gtt gtc96Val Trp Asn Leu Asn His Glu Gly Ala Leu Thr Leu Thr Gln Val Val20 25 30gat gtg ccg ggg cag gtg cag ccg atg gtg gtc agc ccg gac aaa cgt144Asp Val Pro Gly Gln Val Gln Pro Met Val Val Ser Pro Asp Lys Arg35 40 45tat ctc tat gtt ggt gtt cgc cct gag ttt cgc gtc ctg gcg tat cgt192Tyr Leu Tyr Val Gly Val Arg Pro Glu Phe Arg Val Leu Ala Tyr Arg50 55 60atc gcc ccg gac gat ggc gca ctg acc ttt gcc gca gag tct gcg ctg240Ile Ala Pro Asp Asp Gly Ala Leu Thr Phe Ala Ala Glu Ser Ala Leu65 70 75 80ccg ggt agt ccg acg cat att tcc acc gat cac cag ggg cag ttt gtc288Pro Gly Ser Pro Thr His Ile Ser Thr Asp His Gln Gly Gln Phe Val85 90 95
ttt gta ggt tct tac aat gcg ggt aac gtg agc gta acg cgt ctg gaa336Phe Val Gly Ser Tyr Asn Ala Gly Asn Val Ser Val Thr Arg Leu Glu100 105 110gat ggc ctg cca gtg ggc gtc gtc gat gtg gtc gag ggg ctg gac ggt384Asp Gly Leu Pro Val Gly Val Val Asp Val Val Glu Gly Leu Asp Gly115 120 125tgc cat tcc gcc aat atc tca ccg gac aac cgt acg ctg tgg gtt ccg432Cys His Ser Ala Asn Ile Ser Pro Asp Asn Arg Thr Leu Trp Val Pro130 135 140gca tta aag cag gat cgc att tgc ctg ttt acg gtc agc gat gat ggt480Ala Leu Lys Gln Asp Arg Ile Cys Leu Phe Thr Val Ser Asp Asp Gly145 150 155 160cat ctc gtg gcg cag gac cct gcg gaa gtg acc acc gtt gaa ggg gcc528His Leu Val Ala Gln Asp Pro Ala Glu Val Thr Thr Val Glu Gly Ala165 170 175ggc ccg cgt cat atg gta ttc cat cca aac gaa caa tat gcg tat tgc576Gly Pro Arg His Met Val Phe His Pro Asn Glu Gln Tyr Ala Tyr Cys180 185 190gtc aat gag tta aac agc tca gtg gat gtc tgg gaa ctg aaa gat ccg624Val Asn Glu Leu Asn Ser Ser Val Asp Val Trp Glu Leu Lys Asp Pro195 200 205cac ggt aat atc gaa tgt gtc cag acg ctg gat atg atg ccg gaa aac672His Gly Asn Ile Glu Cys Val Gln Thr Leu Asp Met Met Pro Glu Asn210 215 220ttc tcc gac acc cgt tgg gcg gct gat att cat atc acc ccg gat ggt720Phe Ser Asp Thr Arg Trp Ala Ala Asp Ile His Ile Thr Pro Asp Gly225 230 235 240cgc cat tta tac gcc tgc gac cgt acc gcc agc ctg att acc gtt ttc768Arg His Leu Tyr Ala Cys Asp Arg Thr Ala Ser Leu Ile Thr Val Phe245 250 255agc gtt tcg gaa gat ggc agc gtg ttg agt aaa gaa ggc ttc cag cca816Ser Val Ser Glu Asp Gly Ser Val Leu Ser Lys Glu Gly Phe Gln Pro260 265 270acg gaa acc cag ccg cgc ggc ttc aat gtt gat cac agc ggc aag tat864Thr Glu Thr Gln Pro Arg Gly Phe Asn Val Asp His Ser Gly Lys Tyr275 280 285ctg att gcc gcc ggg caa aaa tct cac cac atc tcg gta tac gaa att912Leu Ile Ala Ala Gly Gln Lys Ser His His Ile Ser Val Tyr Glu Ile290 295 300gtt ggc gag cag ggg cta ctg cat gaa aaa ggc cgc tat gcg gtc ggg960Val Gly Glu Gln Gly Leu Leu His Glu Lys Gly Arg Tyr Ala Val Gly305 310 315 320cag gga cca atg tgg gtg gtg gtt aac gca cac taa996Gln Gly Pro Met Trp Val Val Val Asn Ala His
325 330<210>2<211>331<212>PRT<213>大腸桿菌<400>2Met Lys Gln Thr Val Tyr Ile Ala Ser Pro Glu Ser Gln Gln Ile His1 5 10 15Val Trp Asn Leu Asn His Glu Gly Ala Leu Thr Leu Thr Gln Val Val20 25 30Asp Val Pro Gly Gln Val Gln Pro Met Val Val Ser Pro Asp Lys Arg35 40 45Tyr Leu Tyr Val Gly Val Arg Pro Glu Phe Arg Val Leu Ala Tyr Arg50 55 60Ile Ala Pro Asp Asp Gly Ala Leu Thr Phe Ala Ala Glu Ser Ala Leu65 70 75 80Pro Gly Ser Pro Thr His Ile Ser Thr Asp His Gln Gly Gln Phe Val85 90 95Phe Val Gly Ser Tyr Asn Ala Gly Asn Val Ser Val Thr Arg Leu Glu100 105 110Asp Gly Leu Pro Val Gly Val Val Asp Val Val Glu Gly Leu Asp Gly115 120 125Cys His Ser Ala Asn Ile Ser Pro Asp Asn Arg Thr Leu Trp Val Pro130 135 140Ala Leu Lys Gln Asp Arg Ile Cys Leu Phe Thr Val Ser Asp Asp Gly145 150 155 160His Leu Val Ala Gln Asp Pro Ala Glu Val Thr Thr Val Glu Gly Ala165 170 175Gly Pro Arg His Met Val Phe His Pro Asn Glu Gln Tyr Ala Tyr Cys180 185 190Val Asn Glu Leu Asn Ser Ser Val Asp Val Trp Glu Leu Lys Asp Pro195 200 205His Gly Asn Ile Glu Cys Val Gln Thr Leu Asp Met Met Pro Glu Asn210 215 220Phe Ser Asp Thr Arg Trp Ala Ala Asp Ile His Ile Thr Pro Asp Gly225 230 235 240Arg His Leu Tyr Ala Cys Asp Arg Thr Ala Ser Leu Ile Thr Val Phe245 250 255Ser Val Ser Glu Asp Gly Ser Val Leu Ser Lys Glu Gly Phe Gln Pro260 265 270Thr Glu Thr Gln Pro Arg Gly Phe Asn Val Asp His Ser Gly Lys Tyr275 280 285Leu Ile Ala Ala Gly Gln Lys Ser His His Ile Ser Val Tyr Glu Ile290 295 300Val Gly Glu Gln Gly Leu Leu His Glu Lys Gly Arg Tyr Ala Val Gly305 310 315 320Gln Gly Pro Met Trp Val Val Val Asn Ala His325 330<210>3<211>58<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述引物P1<400>3catgaagcaa acagtttata tcgccagccc tgagagctta cgccccgccc tgccactc58<210>4<211>59<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物P2<400>4ttagtgtgcg ttaaccacca cccacattgg tccctggctg atgtccggcg gtgcttttg 59<210>5<211>1096<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述來(lái)自ybhE基因5’-端的36個(gè)核苷酸，Cm-抗性基因，來(lái)自ybhE基因3’-端的36個(gè)核苷酸<400>5catgaagcaa acagtttata tcgccagccc tgagagctta cgccccgccc tgccactcat 60cgcagtactg ttgtaattca ttaagcattc tgccgacatg gaagccatca cagacggcat 120gatgaacctg aatcgccagc ggcatcagca ccttgtcgcc ttgcgtataa tatttgccca 180tggtgaaaac gggggcgaag aagttgtcca tattggccac gtttaaatca aaactggtga 240aactcaccca gggattggct gagacgaaaa acatattctc aataaaccct ttagggaaat 300aggccaggtt ttcaccgtaa cacgccacat cttgcgaata tatgtgtaga aactgccgga 360aatcgtcgtg gtattcactc cagagcgatg aaaacgtttc agtttgctca tggaaaacgg 420tgtaacaagg gtgaacacta tcccatatca ccagctcacc gtctttcatt gccatacgga 480attccggatg agcattcatc aggcgggcaa gaatgtgaat aaaggccgga taaaacttgt 540gcttattttt ctttacggtc tttaaaaagg ccgtaatatc cagctgaacg gtctggttat 600aggtacattg agcaactgac tgaaatgcct caaaatgttc tttacgatgc cattgggata 660tatcaacggt ggtatatcca gtgatttttt tctccatttt agcttcctta gctcctgaaa 720atctcgataa ctcaaaaaat acgcccggta gtgatcttat ttcattatgg tgaaagttgg 780aacctcttac gtgccgatca acgtctcatt ttcgccaaaa gttggcccag ggcttcccgg 840tatcaacagg gacaccagga tttatttatt ctgcgaagtg atcttccgtc acaggtattt 900attcggcgca aagtgcgtcg ggtgatgctg ccaacttact gatttagtgt atgatggtgt 960ttttgaggtg ctccagtggc ttctgtttct atcagctgtc cctcctgttc agctactgac 1020ggggtggtgc gtaacggcaa aagcaccgcc ggacatcagc cagggaccaa tgtgggtggt 1080ggttaacgca cactaa 1096<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物P3
<400>6tacaccgata ccactatcgg acaaa25<210>7<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物P4<400>7gaacgccaga gacacgcgt 19<210>8<211>59<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物P5<400>8ttaaatcagg tggctataaa tgaactgggc aatgctgctg atgtccggcg gtgcttttg 59<210>9<211>57<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物P6<400>9atgaccacac gcgtgattgc tctcgactta gacggcttac gccccgccct gccactc 57<210>10<211>59<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物P7<400>10ttaacctatc tcctgtaacg cgtgtctctg gcgttcgctg atgtccggcg gtgcttttg 59<210>11<211>57<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述引物P8<400>11atgcagttaa aatttttaac ggccagccac ccaaaattac gccccgccct gccactc 57<210>12<211>1095<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述來(lái)自ybhE基因3’-端的36個(gè)核苷酸，Cm-抗性基因，來(lái)自ybhA基因5’-端的36個(gè)核苷酸<400>12ttaaatcagg tggctataaa tgaactgggc aatgctgctg atgtccggcg gtgcttttgc 60cgttacgcac caccccgtca gtagctgaac aggagggaca gctgatagaa acagaagcca 120ctggagcacc tcaaaaacac catcatacac taaatcagta agttggcagc atcacccgac 180gcactttgcg ccgaataaat acctgtgacg gaagatcact tcgcagaata aataaatcct 240ggtgtccctg ttgataccgg gaagccctgg gccaactttt ggcgaaaatg agacgttgat 300cggcacgtaa gaggttccaa ctttcaccat aatgaaataa gatcactacc gggcgtattt 360tttgagttat cgagattttc aggagctaag gaagctaaaa tggagaaaaa aatcactgga 420tataccaccg ttgatatatc ccaatggcat cgtaaagaac attttgaggc atttcagtca 480gttgctcaat gtacctataa ccagaccgtt cagctggata ttacggcctt tttaaagacc 540gtaaagaaaa ataagcacaa gttttatccg gcctttattc acattcttgc ccgcctgatg 600aatgctcatc cggaattccg tatggcaatg aaagacggtg agctggtgat atgggatagt 660gttcaccctt gttacaccgt tttccatgag caaactgaaa cgttttcatc gctctggagt 720gaataccacg acgatttccg gcagtttcta cacatatatt cgcaagatgt ggcgtgttac 780ggtgaaaacc tggcctattt ccctaaaggg tttattgaga atatgttttt cgtctcagcc 840aatccctggg tgagtttcac cagttttgat ttaaacgtgg ccaatatgga caacttcttc 900gcccccgttt tcaccatggg caaatattat acgcaaggcg acaaggtgct gatgccgctg 960gcgattcagg ttcatcatgc cgtctgtgat ggcttccatg tcggcagaat gcttaatgaa 1020ttacaacagt actgcgatga gtggcagggc ggggcgtaag ccgtctaagt cgagagcaat 1080cacgcgtgtg gtcat 1095<210>13<211>1095<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述來(lái)自ybhE基因3’-端的36個(gè)核苷酸，Cm-抗性基因，來(lái)自ybhD基因5’-端的36個(gè)核苷酸<400>13ttaacctatc tcctgtaacg cgtgtctctg gcgttcgctg atgtccggcg gtgcttttgc 60cgttacgcac caccccgtca gtagctgaac aggagggaca gctgatagaa acagaagcca 120ctggagcacc tcaaaaacac catcatacac taaatcagta agttggcagc atcacccgac 180gcactttgcg ccgaataaat acctgtgacg gaagatcact tcgcagaata aataaatcct 240ggtgtccctg ttgataccgg gaagccctgg gccaactttt ggcgaaaatg agacgttgat 300cggcacgtaa gaggttccaa ctttcaccat aatgaaataa gatcactacc gggcgtattt 360tttgagttat cgagattttc aggagctaag gaagctaaaa tggagaaaaa aatcactgga 420tataccaccg ttgatatatc ccaatggcat cgtaaagaac attttgaggc atttcagtca 480gttgctcaat gtacctataa ccagaccgtt cagctggata ttacggcctt tttaaagacc 540gtaaagaaaa ataagcacaa gttttatccg gcctttattc acattcttgc ccgcctgatg 600
aatgctcatc cggaattccg tatggcaatg aaagacggtg agctggtgat atgggatagt 660gttcaccctt gttacaccgt tttccatgag caaactgaaa cgttttcatc gctctggagt 720gaataccacg acgatttccg gcagtttcta cacatatatt cgcaagatgt ggcgtgttac 780ggtgaaaacc tggcctattt ccctaaaggg tttattgaga atatgttttt cgtctcagcc 840aatccctggg tgagtttcac cagttttgat ttaaacgtgg ccaatatgga caacttcttc 900gcccccgttt tcaccatggg caaatattat acgcaaggcg acaaggtgct gatgccgctg 960gcgattcagg ttcatcatgc cgtctgtgat ggcttccatg tcggcagaat gcttaatgaa 1020ttacaacagt actgcgatga gtggcagggc ggggcgtaat tttgggtggc tggccgttaa 1080aaattttaac tgcat 1095<210>14<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物P9<400>14cggccaggtg gaagtgg 17<210>15<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物P10<400>15ggctctcagg gctggc 16<210>16<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物P11<400>16cgagcagggg ctactgc 17<210>17<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物P12<400>17aacgcgcccc tcgagg 16
<210>18<211>68<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物P13<400>18ttaaccgcgc cacgctttat agcggttaat cagaccgaaa gccacgttgt gtctcaaaat 60ctctgatg 68<210>19<211>65<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物P14<400>19aatgaaaaac atcaatccaa cgcagaccgc tgcctggcgc tgaggtctgc ctcgtgaaga 60aggtg 65<210>20<211>1286<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述來(lái)自pgi基因3’-端的36個(gè)核苷酸，Km-抗性基因，來(lái)自pgi基因5’-端的36個(gè)核苷酸<400>20ttaaccgcgc cacgctttat agcggttaat cagaccgaaa gccacgttgt gtctcaaaat 60ctctgatgtt acattgcaca agataaaaat atatcatcat gaacaataaa actgtctgct 120tacataaaca gtaatacaag gggtgttatg agccatattc aacgggaaac gtcttgctcg 180aggccgcgat taaattccaa catggatgct gatttatatg ggtataaatg ggctcgcgat 240aatgtcgggc aatcaggtgc gacaatctat cgattgtatg ggaagcccga tgcgccagag 300ttgtttctga aacatggcaa aggtagcgtt gccaatgatg ttacagatga gatggtcaga 360ctaaactggc tgacggaatt tatgcctctt ccgaccatca agcattttat ccgtactcct 420gatgatgcat ggttactcac cactgcgatc cccgggaaaa cagcattcca ggtattagaa 480gaatatcctg attcaggtga aaatattgtt gatgcgctgg cagtgttcct gcgccggttg 540cattcgattc ctgtttgtaa ttgtcctttt aacagcgatc gcgtatttcg tctcgctcag 600gcgcaatcac gaatgaataa cggtttggtt gatgcgagtg attttgatga cgagcgtaat 660ggctggcctg ttgaacaagt ctggaaagaa atgcataagc ttttgccatt ctcaccggat 720tcagtcgtca ctcatggtga tttctcactt gataacctta tttttgacga ggggaaatta 780ataggttgta ttgatgttgg acgagtcgga atcgcagacc gataccagga tcttgccatc 840ctatggaact gcctcggtga gttttctcct tcattacaga aacggctttt tcaaaaatat 900ggtattgata atcctgatat gaataaattg cagtttcatt tgatgctcga tgagtttttc 960taatcagaat tggttaattg gttgtaacac tggcagagca ttacgctgac ttgacgggac 1020ggcggctttg ttgaataaat cgaacttttg ctgagttgaa ggatcagatc acgcatcttc 1080ccgacaacgc agaccgttcc gtggcaaagc aaaagttcaa aatcaccaac tggtccacct 1140acaacaaagc tctcatcaac cgtggctccc tcactttctg gctggatgat ggggcgattc 1200aggcctggta tgagtcagca acaccttctt cacgaggcag acctcagcgc caggcagcgg 1260
tctgcgttgg attgatgttt ttcatt 1286<210>21<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物P15<400>21ttaaccgcgc cacgct 16<210>22<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物P16<400>22aatgaaaaac atcaatccaa cg 22<210>23<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物P17<400>23gacaaagagc tccacacagg aaacagctat gggagggcgt ggtatgg47<210>24<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物P18<400>24ttagtagaat tctcatgggc accagtagat gtc 33<210>25<211>68<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物P19
<400>25ttacagctta gcgccttcta cagcttcacg cgccaggaaa gccacgttgt gtctcaaaat 60ctctgatg 68<210>26<211>65<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物P20<400>26atggcggtaa cgcaaacagc ccaggcctgt gacctggcgc tgaggtctgc ctcgtgaaga 60aggtg 65<210>27<211>1286<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述來(lái)自eda基因3’-端的36個(gè)核苷酸，Km-抗性基因，來(lái)自zwf基因5’-端的36個(gè)核苷酸<400>27ttacagctta gcgccttcta cagcttcacg cgccaggaaa gccacgttgt gtctcaaaat 60ctctgatgtt acattgcaca agataaaaat atatcatcat gaacaataaa actgtctgct 120tacataaaca gtaatacaag gggtgttatg agccatattc aacgggaaac gtcttgctcg 180aggccgcgat taaattccaa catggatgct gatttatatg ggtataaatg ggctcgcgat 240aatgtcgggc aatcaggtgc gacaatctat cgattgtatg ggaagcccga tgcgccagag 300ttgtttctga aacatggcaa aggtagcgtt gccaatgatg ttacagatga gatggtcaga 360ctaaactggc tgacggaatt tatgcctctt ccgaccatca agcattttat ccgtactcct 420gatgatgcat ggttactcac cactgcgatc cccgggaaaa cagcattcca ggtattagaa 480gaatatcctg attcaggtga aaatattgtt gatgcgctgg cagtgttcct gcgccggttg 540cattcgattc ctgtttgtaa ttgtcctttt aacagcgatc gcgtatttcg tctcgctcag 600gcgcaatcac gaatgaataa cggtttggtt gatgcgagtg attttgatga cgagcgtaat 660ggctggcctg ttgaacaagt ctggaaagaa atgcataagc ttttgccatt ctcaccggat 720tcagtcgtca ctcatggtga tttctcactt gataacctta tttttgacga ggggaaatta 780ataggttgta ttgatgttgg acgagtcgga atcgcagacc gataccagga tcttgccatc 840ctatggaact gcctcggtga gttttctcct tcattacaga aacggctttt tcaaaaatat 900ggtattgata atcctgatat gaataaattg cagtttcatt tgatgctcga tgagtttttc 960taatcagaat tggttaattg gttgtaacac tggcagagca ttacgctgac ttgacgggac 1020ggcggctttg ttgaataaat cgaacttttg ctgagttgaa ggatcagatc acgcatcttc 1080ccgacaacgc agaccgttcc gtggcaaagc aaaagttcaa aatcaccaac tggtccacct 1140acaacaaagc tctcatcaac cgtggctccc tcactttctg gctggatgat ggggcgattc 1200aggcctggta tgagtcagca acaccttctt cacgaggcag acctcagcgc caggtcacag 1260gcctgggctg tttgcgttac cgccat 1286<210>28<211>23<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述引物P21<400>28ttacagctta gcgccttcta cag 23<210>29<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物P22<400>29catggcggta acgcaaac18<210>30<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物P23<400>30ctagtaagat ctccctgttt gcaattaatc atcgg 35<210>31<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物P24<400>31ctagtaagat ctccctgttg acaattaatc atcgg 35<210>32<211>59<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物P25<400>32tggcgatata aactgtttgc ttcatgaatg ctcctttcct gtgtgaaatt gttatccgc 59<210>33<211>35<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物P26<400>33ctagtaagat ctgctgatgt ccggcggtgc ttttg 35<210>34<211>67<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物P27<400>34gccaaaagcg actaatttta gctgttacag tcagttgcta aatgcattac gccccgccct 60gccactc67<210>35<211>1099<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述Cm-抗性基因，Ptac-3900啟動(dòng)子<400>35ttacgccccg ccctgccact catcgcagta ctgttgtaat tcattaagca ttctgccgac 60atggaagcca tcacagacgg catgatgaac ctgaatcgcc agcggcatca gcaccttgtc 120gccttgcgta taatatttgc ccatggtgaa aacgggggcg aagaagttgt ccatattggc 180cacgtttaaa tcaaaactgg tgaaactcac ccagggattg gctgagacga aaaacatatt 240ctcaataaac cctttaggga aataggccag gttttcaccg taacacgcca catcttgcga 300atatatgtgt agaaactgcc ggaaatcgtc gtggtattca ctccagagcg atgaaaacgt 360ttcagtttgc tcatggaaaa cggtgtaaca agggtgaaca ctatcccata tcaccagctc 420accgtctttc attgccatac ggaattccgg atgagcattc atcaggcggg caagaatgtg 480aataaaggcc ggataaaact tgtgcttatt tttctttacg gtctttaaaa aggccgtaat 540atccagctga acggtctggt tataggtaca ttgagcaact gactgaaatg cctcaaaatg 600ttctttacga tgccattggg atatatcaac ggtggtatat ccagtgattt ttttctccat 660tttagcttcc ttagctcctg aaaatctcga taactcaaaa aatacgcccg gtagtgatct 720tatttcatta tggtgaaagt tggaacctct tacgtgccga tcaacgtctc attttcgcca 780aaagttggcc cagggcttcc cggtatcaac agggacacca ggatttattt attctgcgaa 840gtgatcttcc gtcacaggta tttattcggc gcaaagtgcg tcgggtgatg ctgccaactt 900actgatttag tgtatgatgg tgtttttgag gtgctccagt ggcttctgtt tctatcagct 960gtccctcctg ttcagctact gacggggtgg tgcgtaacgg caaaagcacc gccggacatc 1020agcagatctc cctgtttgca attaatcatc ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg 1080ataacaattt cacacagga 1099<210>36<211>1099<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述Cm-抗性基因，Ptac-10000啟動(dòng)子<400>36ttacgccccg ccctgccact catcgcagta ctgttgtaat tcattaagca ttctgccgac 60atggaagcca tcacagacgg catgatgaac ctgaatcgcc agcggcatca gcaccttgtc 120gccttgcgta taatatttgc ccatggtgaa aacgggggcg aagaagttgt ccatattggc 180cacgtttaaa tcaaaactgg tgaaactcac ccagggattg gctgagacga aaaacatatt 240ctcaataaac cctttaggga aataggccag gttttcaccg taacacgcca catcttgcga 300atatatgtgt agaaactgcc ggaaatcgtc gtggtattca ctccagagcg atgaaaacgt 360ttcagtttgc tcatggaaaa cggtgtaaca agggtgaaca ctatcccata tcaccagctc 420accgtctttc attgccatac ggaattccgg atgagcattc atcaggcggg caagaatgtg 480aataaaggcc ggataaaact tgtgcttatt tttctttacg gtctttaaaa aggccgtaat 540atccagctga acggtctggt tataggtaca ttgagcaact gactgaaatg cctcaaaatg 600ttctttacga tgccattggg atatatcaac ggtggtatat ccagtgattt ttttctccat 660tttagcttcc ttagctcctg aaaatctcga taactcaaaa aatacgcccg gtagtgatct 720tatttcatta tggtgaaagt tggaacctct tacgtgccga tcaacgtctc attttcgcca 780aaagttggcc cagggcttcc cggtatcaac agggacacca ggatttattt attctgcgaa 840gtgatcttcc gtcacaggta tttattcggc gcaaagtgcg tcgggtgatg ctgccaactt 900actgatttag tgtatgatgg tgtttttgag gtgctccagt ggcttctgtt tctatcagct 960gtccctcctg ttcagctact gacggggtgg tgcgtaacgg caaaagcacc gccggacatc 1020agcagatctc cctgttgaca attaatcatc ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg 1080ataacaattt cacacagga 1099<210>37<211>53<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物P28<400>37gatatacata tgcaccacca ccaccaccac aagcaaacag tttatatcgc cag 53<210>38<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物P29<400>38agactaggat ccttagtgtg cgttaaccac cac 3權(quán)利要求
1.屬于腸桿菌科的產(chǎn)L-氨基酸的細(xì)菌，其中該細(xì)菌受到修飾以具有增強(qiáng)的6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)菌，其中6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶基因的表達(dá)已通過(guò)增加該基因的拷貝數(shù)或通過(guò)修飾該基因的表達(dá)調(diào)控序列而增強(qiáng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)菌，其中所述基因的天然啟動(dòng)子已被更強(qiáng)的啟動(dòng)子所取代。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)菌，其中所述基因的天然SD序列已被更高效的SD序列所取代。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌選自如下菌屬埃希氏菌屬、腸桿菌屬、歐文氏菌屬、克雷伯氏菌屬、泛菌屬、普羅威登斯菌屬、沙門(mén)氏菌屬、沙雷氏菌屬、志賀氏菌屬和摩根氏菌屬。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5的任一項(xiàng)的細(xì)菌，其中所述6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶基因源自腸桿菌科。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的細(xì)菌，其中所述6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶基因編碼選自下述的蛋白質(zhì)(A)包括SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；和(B)包括在SEQ ID NO2所示氨基酸序列中含有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的缺失、取代、插入或添加的氨基酸序列，并具有6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶活性的蛋白質(zhì)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的細(xì)菌，其中所述6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶基因選自(a)包括SEQ ID NO1中的核苷酸1至993的核苷酸序列的DNA；和(b)可以與SEQ ID NO1中的核苷酸1至993的核苷酸序列或者與可從上述核苷酸序列制備得到的探針在嚴(yán)緊條件下雜交，并且編碼具有6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的細(xì)菌，其中所述嚴(yán)緊條件包括在對(duì)應(yīng)于1xSSC和0.1％SDS的鹽濃度、60℃下洗滌15分鐘。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌被進(jìn)一步修飾以具有增強(qiáng)的yddG開(kāi)放閱讀框的表達(dá)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)菌，其中所述L-氨基酸是芳香族L-氨基酸，其選自L-色氨酸、L-苯丙氨酸和L-酪氨酸。
12.生產(chǎn)L-氨基酸的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的細(xì)菌，并從該培養(yǎng)基中收集該L-氨基酸。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述L-氨基酸選自L-色氨酸、L-苯丙氨酸和L-酪氨酸。
全文摘要
本發(fā)明提供一種使用腸桿菌科細(xì)菌生產(chǎn)L－氨基酸例如L－色氨酸，L－苯丙氨酸和L－酪氨酸的方法。通過(guò)增強(qiáng)由pgl基因(ybhE ORF)編碼的6－磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶的活性來(lái)增加所述細(xì)菌的L－氨基酸生產(chǎn)能力。
文檔編號(hào)C12P13/00GK101052707SQ200580006099
公開(kāi)日2007年10月10日 申請(qǐng)日期2005年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月25日
發(fā)明者丹尼拉·V·齊門(mén)科夫, 安德雷·Y·格萊維奇, 亞歷克山德拉·Y·斯科羅克霍多瓦, 喬安娜·Y·卡塔什基納, 亞歷山大·D·基弗羅, 艾里納·V·比爾尤科瓦, 維拉·G·多羅申科, 瑟蓋·V·馬什科 申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社