專利名稱：：高純度稻米蛋白濃縮物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及稻米蛋白濃縮物，和其制備方法。該方法包括在低于稻米底物中的蛋白質(zhì)的變性溫度和在該蛋白質(zhì)的等電pH處或附近，酶促水解稻米底物，以獲得包括溶解的顆粒淀粉水解物的組分和包括不溶性稻米蛋白的殘余物，將溶解的淀粉水解物組分與包括不溶性稻米蛋白的殘余物分離，以獲得稻米蛋白濃縮物，特別是高純度稻米蛋白濃縮物。
背景技術(shù)：
：稻米是世界半數(shù)以上人口的主要的糧食。蛋白質(zhì)(8%)和淀粉(80%)構(gòu)成了稻米的兩大主要成分。盡管稻米蛋白是有價(jià)值的食物成分，然而稻米在工業(yè)上的加工是為了獲得它的淀粉和淀粉水解產(chǎn)物，稻米蛋白卻主要用于動(dòng)物飼料應(yīng)用中。生產(chǎn)溶解的稻米淀粉水解產(chǎn)物以及從淀粉中分離稻米蛋白的方法是已知的。一般地，從稻米粉末中分離稻米蛋白如下進(jìn)行通過高溫加熱溶解稻米淀粉，然后用降解淀粉的淀粉酶水解(參見例如Hansen等，(1981)Foodrec力朋/ogy35:38-42;Chen等，(1984)/5W.Foo"gWc.35:1128-1135;和Shin等，(1997)Ce廂/Ctem.74:437,441和JulianoB.O.(1984)INSTARCH:CHEMISTRYANDTECHNOLOGY,第二版Ed.R.L.Whistler等，AcademicPress,NewYork,pp.507-528)。更具體地，Mitchell等，(美國專利4，744，922)公開了用傳統(tǒng)的高溫噴射蒸煮工藝產(chǎn)生稻米淀粉水解產(chǎn)物的方法。Slott等(美國專利3,912,590)公開了溶解稻米淀粉之后用熱穩(wěn)定a淀粉酶水解的方法。Euber等(美國專利4,990,344)報(bào)道了通過用熱穩(wěn)定a淀粉酶在提高的溫度中溶解和水解稻米淀粉來制備稻米蛋白濃縮物，該稻米蛋白濃縮物具有減少的錳、鋁和肌醇六磷酸水平和改進(jìn)的可消化性，可用于嬰幼食品。上面描述的方法是在高溫中進(jìn)行，通常在90。C的范圍內(nèi)。在這些顆粒淀粉的溶解溫度中，稻米中的蛋白質(zhì)會(huì)變性。據(jù)報(bào)道，稻米蛋白通常在75'C以上的溫度中變性(Ju等，(2001)乂66:229-232)。蛋白質(zhì)變性導(dǎo)致在食物制品中發(fā)揮作用的許多功能特性喪失。例如，在高溫處理中產(chǎn)生的稻米蛋白濃縮物的營養(yǎng)值和可消化性低于乳蛋白一酪蛋白的營養(yǎng)值，酪蛋白被用作行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(Morita等，(1993)乂58:1393-1406和Chang等(1993)J51:464-467)。因此，如上面提到的，工業(yè)上由高溫蒸煮產(chǎn)生的稻米蛋白主要在動(dòng)物飼料市場(chǎng)上出售。在不經(jīng)淀粉溶解作用的情況下，將稻米蛋白與稻米淀粉分離開來具有許多缺點(diǎn)。該方法耗時(shí)的也是昂貴的，而且產(chǎn)品的產(chǎn)量低。此外，常常用于該方法的高堿、酸和表面活性劑化合物使得該方法未得人心，特別是如果該蛋白質(zhì)打算用于食品應(yīng)用的話。因?yàn)榈久椎鞍资堑瓦^敏原性的(Helm等,(1996)Ce"a/FooA41:839-843)，并且必需氨基酸諸如甲硫氨酸含量高(Tecson等，(1971)Cem//CTzm.48:91-202)，稻米蛋白是有價(jià)值的。因此，通過開發(fā)某種方法來提高作為淀粉加工的副產(chǎn)品的稻米蛋白的質(zhì)量和數(shù)量是值得期待的，在該方法中，從在淀粉加工中使用的稻米底物獲得的稻米蛋白不被變性。該蛋白質(zhì)然后可以用于各種應(yīng)用，諸如用于人類食品用途。例如，在生產(chǎn)谷氨酸單鈉的微生物發(fā)酵期間，使用了大量的稻米底物，這產(chǎn)生了大量的變性稻米蛋白副產(chǎn)品。僅僅在中國，估計(jì)需要大約2.6公噸的稻米底物來滿足超過1.0x106公噸的谷氨酸單鈉年生產(chǎn)量。如果MSG的生產(chǎn)能產(chǎn)生高稻米蛋白濃縮物，而不是變性的蛋白質(zhì)副產(chǎn)品，則有望獲得巨大的益處。本發(fā)明提供了生產(chǎn)稻米蛋白濃縮物，特別是高純度稻米蛋白濃縮物的方法，其是在淀粉加工期間獲得的，其中所述加工不包括使含有淀粉和蛋白質(zhì)的稻米底物經(jīng)受高溫處理，取而代之地是使稻米底物經(jīng)受低于稻米底物蛋白的變性溫度的溫度。由本發(fā)明包括的方法產(chǎn)生的稻米蛋白濃縮物可以用于各種用途，包括用于人類食物制品和動(dòng)物飼料中。因?yàn)榭傮w上說稻米蛋白具有高水平的某些必需氨基酸和低的人類過敏原性，根據(jù)本發(fā)明包括的方法來獲得稻米蛋白濃縮物具有額外的優(yōu)點(diǎn)。發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)目的是提供由稻米底物制備高純度稻米蛋白濃縮物的方法，該方法包括在低于包含在稻米底物中的稻米蛋白的變性溫度下，在該稻米蛋白的等電pH處或附近，通過將稻米底物與兩種淀粉水解酶接觸，水解顆粒稻米淀粉，其中第一淀粉水解酶是顆粒淀粉水解(GSH)酶。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及從稻米底物產(chǎn)生稻米蛋白濃縮物的方法，該方法包括(a)在等于或低于包含在稻米底物中的稻米蛋白的變性溫度的溫度，在稻米蛋白的等電pH附近，將具有10至55%之間的干固體含量的稻米底物與兩種淀粉水解酶的組合接觸，以獲得溶解的淀粉水解物，其中第一淀粉水解酶是顆粒淀粉水解(GSH)酶，和(b)分離溶解的淀粉水解產(chǎn)物，以獲得稻米蛋白濃縮物。在該方面的一個(gè)實(shí)施方案中，變性溫度在70。C或低于7(TC，pH在約pH3.0至pH6.0之間。在第二個(gè)實(shí)施方案中，淀粉水解酶是a淀粉酶和葡糖淀粉酶。在第三個(gè)實(shí)施方案中，葡糖淀粉酶是顆粒淀粉水解酶(GSHE),其來自灰腐質(zhì)霉高溫變種(i&m/co/agn'wavar.Amno/cfea)菌株(H-GSHE)或泡盛曲霉河內(nèi)變種(z4，rg飾51var.femYc/i)菌株。在第四個(gè)實(shí)施方案中，a淀粉酶來自芽孢桿菌屬(5a。7/M)，特別是嗜熱脂肪芽孢桿菌CS.sfeflroAerwop/j//""的菌株。在第五個(gè)實(shí)施方案中，GSHE是葡糖淀粉酶，其獲自重組木霉屬(7WWoc/m^)菌株，特別是里氏木霉(r."""')菌株，該菌株表達(dá)編碼灰腐質(zhì)霉GSHE的異源基因(rH-GSHE)或泡盛曲霉河內(nèi)變種的基因(rA-GSHE)。在第六個(gè)實(shí)施方案中，由分離步驟獲得的稻米蛋白濃縮物的蛋白含量(Nx5.92)為約至少40。/。。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，由分離步驟獲得的稻米蛋白濃縮物的蛋白含量(Nx5.92)為約至少60。/。。在其他實(shí)施方案中，稻米蛋白濃縮物是高純度稻米蛋白濃縮物，其蛋白含量為至少約65%。在第七個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明包含的方法獲得的稻米蛋白濃縮物。在第二個(gè)方面，本發(fā)明涉及從稻米底物產(chǎn)生高純度稻米蛋白濃縮物的方法，該方法包括(a)在低于包含在稻米底物中的稻米蛋白的變性溫度的溫度，在約3.0至6.0之間的pH，將稻米底物的漿體與兩種淀粉水解酶溫育足夠的時(shí)間，以水解稻米底物中的顆粒淀粉的實(shí)質(zhì)部分(substantialportion)，其中，其中一種淀粉水解酶是顆粒淀粉水解酶，和(b)將淀粉水解產(chǎn)物從溫育的漿體中分離出來，以獲得包括基本上不溶的稻米蛋白濃縮物的殘留物。在該方面的一個(gè)實(shí)施方案中，該方法還包括(c)在低于包含在稻米底物中的稻米蛋白的變性溫度的溫度，將包括基本上不溶的稻米蛋白濃縮物的殘余物與淀粉水解酶溫育足夠的時(shí)間，直到殘余物基本上無所有的淀粉，以獲得高純度稻米蛋白濃縮物；和(d)分離該高純度稻米蛋白濃縮物。在該方面的第二個(gè)實(shí)施方案中，溫育溫度為約70'C，在其他實(shí)施方案中，溫育溫度為約6(TC。在第三個(gè)實(shí)施方案中，步驟a)中的第二淀粉水解酶是a淀粉酶。在第四個(gè)實(shí)施方案中，ct淀粉酶來自芽孢桿菌屬，特別是嗜熱脂肪芽孢桿菌的菌株。在第五個(gè)實(shí)施方案中，顆粒淀粉水解酶(GSHE)是來自灰腐質(zhì)霉高溫變種菌株的葡糖淀粉酶(H-GSHE)。在第六個(gè)實(shí)施方案中，GSHE是來自灰腐質(zhì)霉高溫變種菌株的GSHE，其表達(dá)在木霉屬菌株，特別是里氏木霉菌株中(rH-GSHE)。在第七個(gè)實(shí)施方案中，溫育步驟的pH在約4.0至6.0之間。在第八個(gè)實(shí)施方案中，其中一個(gè)溫育步驟或兩個(gè)溫育步驟中的酶反應(yīng)通過將pH降至低于約pH4.0的值而終止。在第九個(gè)實(shí)施方案中，步驟(a)的溫育進(jìn)行約24小時(shí)。在第十個(gè)實(shí)施方案中，在溫育步驟(a)中，90%以上的顆粒稻米淀粉被水解，在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在溫育步驟(c)中，90%以上的剩余淀粉被水解。在第十一個(gè)實(shí)施方案中，高純度稻米蛋白濃縮物中的蛋白含量為至少65%。在第十二個(gè)實(shí)施方案中，稻米蛋白濃縮物被千燥，直到水分含量少于10%。在第三個(gè)方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本文中描述的方法獲得的高純度稻米蛋白濃縮物，其中所述高純度稻米蛋白濃縮物包括至少65%的蛋白質(zhì)。在第四個(gè)方面，本發(fā)明涉及從稻米底物生產(chǎn)高純度稻米蛋白濃縮物的方法，該方法包括(a)在約70'C至50'C之間的溫度，在約3.0至6.0之間的pH中，將稻米底物的漿體與i)獲自嗜熱脂肪芽孢桿菌的a-淀粉酶和ii)通過灰腐質(zhì)霉高溫變種GSHE在里氏木霉宿主中表達(dá)而獲得的顆粒淀粉水解酶溫育足夠的時(shí)間，以水解稻米底物中至少卯％的顆粒淀粉；(b)將淀粉水解產(chǎn)物與溫育的漿體分離開來，以獲得包括稻米蛋白濃縮物的殘余物；(c)在7(TC至5(TC之間的溫度和約3.0至6.0之間的pH，將包括稻米蛋白濃縮物的殘余物與a淀粉酶和GSHE溫育足夠的時(shí)間，以水解殘余物中至少80%的顆粒淀粉，從而獲得包括高純度稻米蛋白濃縮物的殘余物，其蛋白含量為至少65%;和(d)回收該高純度稻米蛋白濃縮物。在第五個(gè)方面，本發(fā)明涉及增加動(dòng)物飼料的蛋白含量的方法，該方法包括在低于72'C的溫度，將稻米底物與包括顆粒淀粉水解(GSH)酶在內(nèi)的淀粉水解酶的組合接觸足夠的時(shí)間，以水解稻米底物中60%的淀粉；獲得溶解的淀粉部分和包含不溶性蛋白的殘余物；分離殘余物以獲得稻米蛋白濃縮物；并將稻米蛋白濃縮物加入到動(dòng)物飼料中。在一個(gè)實(shí)施方案中，淀粉水解酶的組合包括GSH酶和a淀粉酶。在第二個(gè)實(shí)施方案中，該方法還包括，將包含不溶性蛋白的殘余物與包含顆粒淀粉水解酶的淀粉水解酶接觸，以獲得包括可溶性淀粉和不溶性稻米蛋白的組分；分離不溶性稻米蛋白，以獲得高純度稻米蛋白濃縮物；和將高純度稻米蛋白濃縮物加入到動(dòng)物飼料中。圖1提供了編碼天然的灰腐質(zhì)霉高溫變種顆粒淀粉水解酶(GSHE)的基因組DNA序列(SEQIDN0:1)。推斷的內(nèi)含子用粗體和下劃線表示。圖2A提供了灰腐質(zhì)霉高溫變種GSHE的信號(hào)序列和成熟氨基酸序列(SEQIDN0:2)。推斷的信號(hào)序列用粗體和下劃線表示。圖2B提供了灰腐質(zhì)霉高溫變種GSHE的成熟氨基酸序列(SEQIDNO:3)。圖3顯示了pTrex3g—N13質(zhì)粒，該質(zhì)粒用于表達(dá)編碼灰腐質(zhì)霉GSHE的核酸，該質(zhì)粒在真菌表達(dá)載體的側(cè)翼含有Xbal位點(diǎn)，其中a)cMI啟動(dòng)子是里氏木霉纖維二糖水解酶啟動(dòng)子，b)灰腐質(zhì)霉g/al是編碼SEQIDNO:3的灰腐質(zhì)霉GSHE的多核苷酸，c)flw必是構(gòu)巢曲霉04wwg/〃MwWw/""力乙酰胺酶標(biāo)記基因，和d)cMI終止子是里氏木霉纖維二糖水解酶終止子。圖4提供了圖3中的pTrex3g—N13質(zhì)粒的核苷酸序列(SEQIDN0:4)(10739bp)。圖5提供了編碼天然泡盛曲霉河內(nèi)變種顆粒淀粉水解酶(A-GSHE)的基因組DNA序列(SEQIDNO:5)。圖6提供了泡盛曲霉河內(nèi)變種GSHE的推斷的信號(hào)序列(粗體和下劃線表示)和成熟氨基酸序列(分別是SEQIDNO:6和SEQIDNO:7)。圖7提供了在pH5.5和6(TC，作為時(shí)間函數(shù)的溶解的顆粒稻米淀粉的百分?jǐn)?shù)(％)，分別使用下述酶a)a淀粉酶，G-ZymeG997，0.1kg/MTG997),(——-);b)表達(dá)于里氏木霉的灰腐質(zhì)霉高溫變種顆粒淀粉水解酶(rH-GSHE)，1.0GS朋單位/g);(—■—)和c)兩者的組合(---▲—-)。也參考實(shí)施例2，表2;實(shí)施例4，表4;和實(shí)施例5，表5。發(fā)明詳述在一些方面，本發(fā)明依靠用于遺傳工程和分子生物學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)和方法。下述文獻(xiàn)中包含對(duì)可用于本發(fā)明的普通方法學(xué)的描述Sambrook等，MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL(第二版，1989);Kreigler,GENETRANSFERANDEXPRESSION;ALABORATORYMANUAL(1990)和Ausubel等，Eds.CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(1994)。本文中如無其它限定，在此應(yīng)用的所有技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語具有被本發(fā)明所涉及領(lǐng)域的普通技術(shù)人員普遍理解的相同意義。Singleton,等，DICTIONARYOFMICROBIOLOGYANDMOLECULARBIOLOGY,第二版，JohnWiley和Sons,NewYork(1994)，以及Hale和Markham,THEHARPERCOLLINSDICTIONARYOFBIOLOGY,HarperPerennial,NY(1991)為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供了本發(fā)明中應(yīng)用的許多術(shù)語的一般性釋義。雖然與此處描述相似或等價(jià)的任何方法和物質(zhì)在本發(fā)明的實(shí)踐或試驗(yàn)中是有用的，但此處描述了優(yōu)選的方法和物質(zhì)。本發(fā)明現(xiàn)將僅僅使用下面的定義和實(shí)施例，以參考的方式進(jìn)行詳細(xì)的描述。本文中參考的所有專利和出版物，包括在這些專利和出版物中公開的所有序列，特意并入本文作為參考。數(shù)值范圍包括限定該范圍的數(shù)。此處如無其它的說明，分別地，核酸的書寫方向從左至右是5'至3';氨基酸序列的書寫方向從左至右是氨基至羧基端。此處提供的標(biāo)題不是對(duì)本發(fā)明各個(gè)方面或?qū)嵤┓桨傅南拗疲梢詤⒖颊f明書整體，對(duì)其進(jìn)行理解。A.定義術(shù)語"稻米(rice)"指歸為水稻(Oo;zara"va)種類的植物。術(shù)語"稻米底物(ricesubstrate)"包含所有形式的稻米(精制或未精制的)，諸如整粒谷物(wholegrain)、碎粒谷物(brokengrains)、稻米渣(ricegrits)和稻米粉(riceflour)以及任何植物部分。如本文中所使用地，術(shù)語"淀粉(starch)"指由植物的復(fù)雜多糖碳水化合物組成的任何物質(zhì)，由式為(C6HKA)x的直鏈淀粉和支鏈淀粉組成，其中x可以是任何數(shù)。術(shù)語"顆粒淀粉(gra皿larstarch)"指未蒸煮過的(未加工的)淀粉，其未經(jīng)歷膠凝化作用。術(shù)語"膠凝化(gelatinization)"指淀粉分子溶解形成粘性懸浮液。術(shù)語"稻米蛋白濃縮物(riceproteinconcentrate)"指根據(jù)本發(fā)明的方法，從稻米底物分離出溶解的稻米淀粉水解物的實(shí)質(zhì)部分后而得到的蛋白質(zhì)組分，其中稻米蛋白濃縮物的蛋白含量大于約10%。術(shù)語"高純度稻米蛋白濃縮物(Wgh-purityriceproteinconcentrate)"指根據(jù)本發(fā)明的方法，從稻米底物分離溶解的稻米淀粉水解產(chǎn)物的實(shí)質(zhì)部分而得到的蛋白質(zhì)組分，其中高純度稻米蛋白濃縮物的蛋白含量為至少約60%、63%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、72%、75%、80%或更大。術(shù)語"蛋白質(zhì)(protein)"指大分子量的聚合物，其由一個(gè)或多個(gè)多肽鏈組成，其單體是通過肽鍵連接起來的氨基酸。術(shù)語"蛋白質(zhì)(protein)"和"多肽(polypeptide)"在本文中有時(shí)可以交換使用。本文中使用氨基酸殘基的常規(guī)單字母或三字母代碼。術(shù)語"變性溫度(denaturationtemperature)"指蛋白質(zhì)因二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的分解而失去它們的功能時(shí)的溫度。一般而言，蛋白質(zhì)從溶液中沉淀出來。術(shù)語"等電點(diǎn)(isoelectricpoint)"指蛋白質(zhì)或許多蛋白質(zhì)攜帶零凈電荷時(shí)的溶液pH。術(shù)語"DE"或"葡萄糖當(dāng)量(dextroseequivalent)"指測(cè)量總還原糖濃度的一個(gè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，基于千重量以D-葡萄糖進(jìn)行計(jì)算。未水解的顆粒淀粉的DE基本上為O，D-葡萄糖的DE為100。術(shù)語"總糖含量(totalsugarcontent)"指淀粉組合物中存在的總糖含量。術(shù)語"干固體含量(ds)"指漿體的總固體(以％表示)，基于干重量來計(jì)算。術(shù)語"漿(sluny)"指包括不溶性物的含水混合物。"白利(Brk)"指一種熟知的液體比重計(jì)標(biāo)度，用于量度在給定溫度下溶液的糖含量。白利標(biāo)度測(cè)量的是每100克含水糖溶液中存在的蔗糖的克數(shù)(總的溶解固體含量)。白利測(cè)量值通常通過使用液體比重計(jì)或折光計(jì)來獲得。術(shù)語"淀粉的水解(hydrolysisofstarch)"指在加入水分子的情況下糖苷鍵的切割。短語"稻米底物中的淀粉的實(shí)質(zhì)部分的水解(hydrolysisofasubstantialportionofthestarchofaricesubstrate)"或"從稻米底物中分離溶解的稻米淀粉水解產(chǎn)物的實(shí)質(zhì)部分(separationofasubstantialportionofthesolubilizedricestarchhydrolysatefromaricesubstrate)"指稻米底物或殘留物中至少80%的淀粉已被溶解和水解。術(shù)語"聚合度(degreeofpolymerization,DP)"是指，在給定的糖中脫水吡喃型葡萄糖單位的數(shù)量。DPI的實(shí)例是單糖，如葡萄糖和果糖。DP2的實(shí)例是二糖，如麥芽糖和蔗糖。"DP4+"表示聚合度大于3的聚合物。術(shù)語"淀粉酶(amylases)"指催化淀粉水解的酶。術(shù)語"cc-淀粉酶(E.C.分類3.2丄l)"指催化a-l，4-糖苷鍵水解的酶。這些酶也已經(jīng)被描述為在含有1，4-a-連接的D-葡萄糖單元的多糖中實(shí)現(xiàn)1,4-a-D-糖苷鍵的外切或內(nèi)切水解的那些酶。用于描述這些酶的另一個(gè)術(shù)語是糖原酶(glycogenase)。例證性的酶包括a-1,4-葡聚糖4-葡聚糖水化酶葡聚糖水解酶(a-l，4-glucan4-glucanohydraseglucanohydrolase)。術(shù)語"葡糖淀粉酶(glucoamylase)"在此指淀粉葡糖苷酶類別的酶(E.C.3.2丄3，葡糖淀粉酶，a-l,4-D-葡聚糖葡糖水解酶)。這些是外切作用的酶，其從直鏈淀粉和支鏈淀粉分子的非還原末端釋放葡糖殘基。這些酶也水解a-l,6和a-l,3-鍵，盡管是以比a-l,4-鍵低得多的速率水解。如本文中所使用的，術(shù)語"顆粒淀粉水解酶(granularstarchhydrolyzingenzyme)(GSHE)，，或"具有顆粒淀粉水解(GSH)活性的酶(anenzymehavinggranularstarchhydrolyzing(GSH)activity)"指具有水解粒狀形式的淀粉的能力的酶。術(shù)語"重組子(recombinant)"當(dāng)用于指例如細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體時(shí)，表示所述細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體已經(jīng)通過引入異源核酸或蛋白質(zhì)或者通過改變天然核酸或蛋白質(zhì)而被修飾，或者表明細(xì)胞是來源于如此而被修飾的細(xì)胞。因此，例如，重組的細(xì)胞表達(dá)在該細(xì)胞的天然(非重組的)形式中不存在的基因；或者表達(dá)天然基因，但這些天然基因以別的方式被異常表達(dá)、不足地表達(dá)或者根本不表達(dá)。術(shù)語"重組GSHE"、"重組表達(dá)的GSHE"和"重組產(chǎn)生的GSHE"指成熟GSHE蛋白質(zhì)序列，其是在宿主細(xì)胞中由異源多核苷酸產(chǎn)生。符號(hào)"r"可以用于表示重組子。rGSHE的蛋白序列不包括信號(hào)序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，在里氏木霉的菌株中表達(dá)的灰腐質(zhì)霉高溫變種GSHE，用"rH-GSHE"表示。術(shù)語"天然GSHE"和"nGSHE，，指源自宿主生物的GSHE，其中編碼GSHE的多核苷酸對(duì)于宿主生物是內(nèi)源性。優(yōu)選的天然GSHE來自灰腐質(zhì)霉菌株或泡盛曲霉菌株。術(shù)語"糖基化(glycosylation)"指通過加入碳水化合物部分(moieties)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄后修飾，其中碳水化合物是N-連接的或者O-連接的，由此產(chǎn)生糖蛋白。糖蛋白的N-連接碳水化合物部分通過糖苷鍵連接到天冬酰胺殘基的p-酰胺氮上。通過絲氨酸或蘇氨酸殘基的羥基，O-連接碳水化合物通過糖苷鍵連接到蛋白質(zhì)上。"信號(hào)序列(signalsequence)"指與蛋白質(zhì)的N末端部分結(jié)合的氨基酸的序列，其有助于成熟形式的蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞外。信號(hào)序列的定義是功能性定義。胞外蛋白質(zhì)的成熟形式缺乏信號(hào)序列，其在分泌過程中被切割掉。"基因(gene)"指在產(chǎn)生多肽中所涉及的DNA片段，包括該編碼區(qū)域之前的區(qū)域和之后的區(qū)域，以及在各編碼片段(外顯子)之間的間插序列(內(nèi)含子)。術(shù)語"核酸(nucleicacid)"指DNA、RNA、單鏈或雙鏈及其化學(xué)修飾。術(shù)語"核酸"和"多核苷酸"在此處可以被交替使用。由于遺傳密碼是簡并的，所以不止一種密碼子可以被用于編碼特定氨基酸，本發(fā)明包括多核苷酸，其編碼特定的氨基酸序列。"載體(vector)"是指被設(shè)計(jì)用于將核酸引入到一種或多種細(xì)胞類型中的多核苷酸序列。載體包括克隆載體、表達(dá)載體、穿梭載體、質(zhì)粒、噬菌體顆粒、序列盒及類似物。如本文中所使用地，"表達(dá)載體(expressionvector)"指DNA構(gòu)建物，其包括可操作地連接到適當(dāng)?shù)目刂菩蛄猩系腄NA序列，所述適當(dāng)?shù)目刂菩蛄心軐?shí)現(xiàn)DNA在適當(dāng)宿主中的表達(dá)。這樣的控制序列可以包括啟動(dòng)子以實(shí)施轉(zhuǎn)錄、任選的操縱子序列以控制轉(zhuǎn)錄、編碼mRNA上合適的核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列、增強(qiáng)子以及控制轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。"啟動(dòng)子(promoter)"是在結(jié)合RNA聚合酶以啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄中所涉及的調(diào)節(jié)序列。啟動(dòng)子可以是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子。本發(fā)明中使用的優(yōu)選啟動(dòng)子是里氏木霉cMl，其是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。"在轉(zhuǎn)錄控制之下(undertranscriptionalcontrol)"是本
技術(shù)領(lǐng)域：
充分理解的一個(gè)術(shù)語，該術(shù)語表明，多核苷酸序列——通常是DNA序列——的轉(zhuǎn)錄依賴于其被可操作地連接到對(duì)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)有貢獻(xiàn)或者促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的元件上。如本文中所使用地，當(dāng)描述蛋白質(zhì)和編碼它們的基因時(shí)，用于該基因的術(shù)語不用大寫字母，并且是斜體字，例如編碼灰腐質(zhì)霉GSHE的基因可以表示為g/"l。用于該蛋白質(zhì)的術(shù)語通常不是斜體字，第一個(gè)字母是大寫的，例如由gtol基因編碼的蛋白質(zhì)可以表示為Glal。術(shù)語"可操作性連接(operablylinked)"是指并列關(guān)系，其中元件以可允許它們?cè)诠δ苌舷嚓P(guān)的方式排列。例如，如果啟動(dòng)子控制編碼序列的轉(zhuǎn)錄，那么啟動(dòng)子就是可操作地連接到該序列上。術(shù)語"選擇性標(biāo)記(selectivemarker)"指能在宿主中表達(dá)的基因，其可以使得含有被引入的核酸或載體的那些宿主的選擇容易一些。選擇性標(biāo)記的實(shí)例包括但不限于抗微生物劑(例如潮霉素、博來霉素或氯霉素)或賦予代謝優(yōu)勢(shì)例如營養(yǎng)優(yōu)勢(shì)給宿主細(xì)胞的基因。術(shù)語"來源(derived)"包含術(shù)語源自(originatedfrom)、獲自(obtainedfrom)或可獲自(obtainablefrom)，和分離自(isolatedfrom)。"宿主菌株(hoststrain)"或"宿主細(xì)胞(hostcell)"指包含編碼本發(fā)明GSHE的多核苷酸的表達(dá)載體或DNA構(gòu)建物的合適宿主。具體地，宿主菌株是絲狀真菌細(xì)胞。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，"宿主細(xì)胞"不但指絲狀真菌菌株特別是木霉屬某種的細(xì)胞，也指由它們產(chǎn)生的原生質(zhì)體。術(shù)語"絲狀真菌(filamentousfiingi)"包括所有絲狀形式的真菌亞門(Eumycotina)(參見Alexopoulos,C.J.(1962)，IntroductoryMycology,NewYork:^Viley)。這些真菌的特征在于營養(yǎng)菌絲，具有由幾丁質(zhì)、纖維素和其它復(fù)合多糖組成的細(xì)胞壁。本發(fā)明的絲狀真菌在形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和遺傳性上不同于酵母。絲狀真菌的營養(yǎng)生長是通過菌絲的延長，并且碳代謝是專性需氧的。在本發(fā)明中，絲狀真菌親本細(xì)胞可以是下述種的細(xì)胞，包括但不限于木霉屬，例如里氏木霉(先前分類為長梗木霉(r./o"g泊racWa加m)，目前也稱為紅褐肉座菌(/f，ocre"j'eow'/"")),綠色木霉(7Wc/zotfer畫v/W(ie)、康寧木霉(Jh'c/wc/ermaAom'wg//)、哈茨木霉(7Hc/wtfem7a/za/"zZamwj);青霄屬某禾中(尸em'c/〃/wn);腐質(zhì)霉屬某禾中(//w附/co/aW.)，包括異常腐質(zhì)霉(Hwm'co/a!7wo/era)和灰腐質(zhì)霉(Fww/co/agn&a);金孢菌某種(C/o;my/on'ww印.)，包括拉克淖金孢菌(C./wcA"mw"");粘帚霉某種(G//oc/a^/m^.);曲霉屬某種，包括米曲霉C4.、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉".m'ger)和泡盛曲霉U.cwamonO;鐮孢菌屬某種(Fayan'wm平)、脈孢菌屬某種(A^wmypora5p.)、肉座菌屬某禾中(//j^ocrea5p.)和裸孢殼屬某種(￡we〃'ce//a5p.)。也可以參考I皿is等，(1985)5W.228:21-26。如本文中所使用的，術(shù)語"木霉"或"木霉屬某種"指之前已被歸入木霉屬的任何真菌菌株或目前被歸入木霉屬的任何真菌菌株。術(shù)語"接觸(contacting)"指將各酶充分近距離地靠近各稻米底物放置。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到，將酶的溶液和各稻米底物混合可以實(shí)現(xiàn)接觸。術(shù)語"溫育(incubating)"指在給定的條件下，將稻米底物和水解酶混合限定的一段時(shí)間。術(shù)語"酶促轉(zhuǎn)化(enzymaticconversion)"指對(duì)稻米底物的修飾，以產(chǎn)生可溶的水解的顆粒稻米淀粉，優(yōu)選產(chǎn)生葡萄糖。術(shù)語"漿(slurry)"指含有不溶性顆粒淀粉的含水混合物。有時(shí)，術(shù)語"漿"和"懸浮液"在本文中可以交換使用。術(shù)語"培養(yǎng)(culturing)"指在液體或固體培養(yǎng)基中，在合適的條件下，培育微生物細(xì)胞群。在一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)指將顆粒淀粉底物通過發(fā)酵生物轉(zhuǎn)化為葡萄糖糖漿或其他期望的最終產(chǎn)物(通常在容器或反應(yīng)器中)。當(dāng)指多核苷酸或蛋白質(zhì)時(shí)，術(shù)語"異源的(heterologous)"或"外源的(exogenous)"是指在宿主細(xì)胞中不天然發(fā)生的多核苷酸或蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，該蛋白質(zhì)是商業(yè)上重要的工業(yè)蛋白質(zhì)。這意味著，該術(shù)語包括由天然發(fā)生的基因、突變的基因和/或合成基因編碼的蛋白質(zhì)。談及多核苷酸或蛋白質(zhì)時(shí)，術(shù)語"同源的"或"內(nèi)源的"，指在宿主細(xì)胞中天然發(fā)生的多核苷酸或蛋白質(zhì)。如本文中所使用地，術(shù)語"回收的(recovered)"、"分離的(isolated)"和"分離的(separated)"指蛋白質(zhì)、細(xì)胞、核酸或氨基酸，其與同其天然相關(guān)的至少一個(gè)成分是分離的。該術(shù)語也指將包括可溶性的淀粉水解產(chǎn)物的混合物與包括基本上不溶性的稻米蛋白的殘留物分離開。如本文所應(yīng)用，當(dāng)用于描述細(xì)胞時(shí)，術(shù)語"轉(zhuǎn)化的(transformed)"、"穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的(stablytransformed)"或者"轉(zhuǎn)基因的(transgenic)"是指該細(xì)胞具有非天然的(異源的)核酸序列，其被整合到它的基因組中或者作為在多個(gè)世代中被維持的附加型質(zhì)粒而存在。如本文所應(yīng)用，術(shù)語"表達(dá)(expression)"是指根據(jù)基因的核酸序列產(chǎn)生多肽的過程。此過程既包括轉(zhuǎn)錄又包括翻譯。在談及將核酸序列插入到細(xì)胞中時(shí)，術(shù)語"引入(introduced)"是指"轉(zhuǎn)染"或者"轉(zhuǎn)化"或者"轉(zhuǎn)導(dǎo)"，包括指將核酸序列導(dǎo)入到真核或原核細(xì)胞中，其中核酸序列可以被整合入到細(xì)胞的基因組中(例如，染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)，被轉(zhuǎn)化為自主復(fù)制子，或者被短暫地表達(dá)(例如，轉(zhuǎn)染的mRNA)。如本文中所使用地，術(shù)語"比活性(specificactivity)"指酶的單位，定義為在特定條件下，每單位時(shí)間內(nèi)通過酶制劑轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的底物摩爾數(shù)。比活性表示為單位(U)/mg蛋白質(zhì)。如本文中所使用地，"酶活性(enzymeactivity)"指酶對(duì)其底物的作用。如本文中所使用地，術(shù)語"酶單位(enzymeunit)"指在最佳測(cè)定條件下，每分鐘將1mg的底物轉(zhuǎn)化為底物產(chǎn)物的酶數(shù)量。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語"顆粒淀粉水解酶單位(GSHEU)"定義為在例如5(TC，pH4.5的測(cè)定條件下，每分鐘由顆粒淀粉產(chǎn)生1mg的葡萄糖所需要的酶的數(shù)量。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語a淀粉酶酶單位(AAU)定義為在pH5.2和4CTC的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定條件下，1分鐘內(nèi)水解1微摩爾的淀粉底物的a淀粉酶的量。在其他實(shí)施方案中，葡糖淀粉酶單位(GAU)定義為在60°C,pH4.2的條件下，每小時(shí)由可溶性淀粉底物產(chǎn)生1gm還原糖所需的酶量，所述還原糖以葡萄糖計(jì)算。[106]"ATCC，，指美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection),位于Manassas，VA20108(ATCC，www/atcc.org)。"NRRL，寸旨AgriculturalResearchServiceCultureCollection,NationalCenterforAgriculturalUtilizationResearch(先前稱為USDANorthernRegionalResearchLaboratory),Peoria，ILL。"—(a)"、"一(an)"和"該(the)"包括復(fù)數(shù)，除非在上下文中明確另外指出。[109]如本文中所使用地，術(shù)語"包含(comprising)"和它的同源詞以它們的包含性的含義使用，也就是，相當(dāng)于術(shù)語"包括(induding)"和它對(duì)應(yīng)的同源詞。B.優(yōu)選實(shí)施方案稻米底物-被用于本發(fā)明方法的稻米底物可以從任何來源獲得。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，稻米底物是稻米面粉，而在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，稻米底物是精米底物。盡管不想以任何方式限制本發(fā)明，一般而言，來自谷物的稻米面粉含有約6-10%的蛋白質(zhì)(Nx5.95);約70-82%的糖類；約9-12%的水分；約0.4-1.5%的粗脂肪；約0.6至0.8%的灰分和約0.2至0.6%的纖維。谷物中發(fā)現(xiàn)的稻米蛋白質(zhì)在水中具有有限的溶解性。發(fā)現(xiàn)這些蛋白質(zhì)主要是不溶性的(堿溶性的)谷蛋白(約80-卯％);鹽溶性的球蛋白(7-15%);水溶性的白蛋白(9-10%)和醇溶性的醇溶谷蛋白(prolamin)(約2-5%)。參見Houston等，(1970)C"ea/47:5;Perdon等，(1978)P/^oc/e肌17:351;和Landers等，(1994)Cerea/71:409-411。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，將稻米底物磨成期望的顆粒尺寸，然后分散在水中，或者在加工期間進(jìn)行濕磨。在本發(fā)明包括的方法的一些實(shí)施方案中，稻米底物，諸如稻米粉被制成漿(一般用水)，稻米底物將包含i)約10%至約55%的干固體(ds);ii)約20%至約50%ds;iii)約25%至約45%ds;iv)約20%至約40%ds;v)約20%至約35%ds;和vi)以及約30%至35%ds。酶顆粒淀粉水解酶一_用于本發(fā)明包含的方法中的淀粉水解酶中的至少一種是顆粒淀粉水解酶(GSHEs)。一些顆粒淀粉水解酶具有葡糖淀粉酶活性，這些酶中的一些具有a淀粉酶活性(參見Tosi等，(1993)Ca".■/M/craWo/.39:846-855和Kanlayakrit等，(1987)/Fem7eW.rec/z"o/.65:379-385)。合適的GSH酶可以是天然存在的，重組的和突變的GSH酶。天然存在的GSHEs已從真菌細(xì)胞諸如腐質(zhì)霉屬某種、曲霉屬某種、毛霉屬某種(Mucorsp.)和根霉屬某種(Rhizopussp.)中回收得到。米根霉GSHE已經(jīng)描述于Ashikari等，(1986)Agric.Biol.Chem.50:957-964和USP4,863,864中。灰腐質(zhì)霉GSHE已經(jīng)描述于Allison等，(1992)Curr.Genet.21:225-229和歐洲專利171218中。編碼這種酶的基因也是本領(lǐng)域已知的，為g/al。泡盛曲霉河內(nèi)變種GSHE已被Hayashida等，(1989)Agric.Biol.Chem53:923-929描述。AspergillusshirousamiGSHE已被Shibuya等，(1990)Agric.Biol.Chem.54:1905-1914描述。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，GSHE從真菌回收得到，這些真菌包括ATCC16453、NRRL15219、NRRL15220、NRRL15221、NRRL15222、NRRL15223、NRRL15224和NRRL15225,以及它們經(jīng)遺傳改變的菌株。(EP0171218)。在一個(gè)實(shí)施方案中，GSHE可以源自灰腐質(zhì)霉的菌株，特別是灰腐質(zhì)霉高溫變種的菌株(H-GSHE)(參見USP4,618,579)。在一個(gè)實(shí)施方案中，GSHE可以源自泡盛曲霉的菌株，特別是泡盛曲霉河內(nèi)變種的菌株(A-GSHE)(參見Hayashida等，(1989)Agric.Biol.Chem.53:923-929)。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于本發(fā)明包括的方法中的GSHE與SEQIDNO:3中闡述的氨基酸序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、93%、95%、97%、98%和99%的序列同一性。在其他實(shí)施方案中，包括SEQIDNO:3的氨基酸序列的GSHE或與SEQIDNO:3的序列具有至少80%序列同一性的GSHE，由與SEQIDNO:1具有至少70%、80%、85%、卯％、93%、95%、97%、98%和99%序列同一性的多核苷酸編碼。在另一實(shí)施方案中，用于本發(fā)明包括的方法中的GSHE與SEQIDNO:7中闡述的氨基酸序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、93%、95%、97%、98%和99%的序列同一性。在其他實(shí)施方案中，包括SEQIDNO:7的氨基酸序列的GSHE或與SEQIDNO:7的序列具有至少80%序列同一性的GSHE,由與SEQIDNO:5具有至少70%、80%、85%、90%、93%、95%、97%、98%和99%序列同一性的多核苷酸編碼。與另一序列具有一定的序列同一性百分?jǐn)?shù)(例如80%、85%、90%或99%)的多核苷酸或多肽指，當(dāng)被比對(duì)時(shí)，在比較兩序列中，堿基或氨基酸殘基相同的百分?jǐn)?shù)。該比對(duì)和百分同源性或同一性可以用本領(lǐng)域已知的任何合適的軟件程序測(cè)定，例如那些在CurrentProtocolsinMolecularBiology(Ausubel等，eds1987Supplement30，section7.7.18)中描述的。優(yōu)選的程序包括GCGPileup程序、FASTA和BLAST。另一優(yōu)選的比對(duì)程序是ALIGNPlus和TFASTA。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，GSHE酶可以源自根霉屬的菌株。諸如源自雪白根霉(R.niveus)的Koji菌株的酶(在商品名"CUCONC"下出售)，或在商品名GLUCZYME下出售的來自根霉屬的酶。a淀粉酶一一在本發(fā)明包括的某些實(shí)施方案中，顆粒淀粉水解酶將與a淀粉酶組合。a淀粉酶是微生物酶，E.C.編號(hào)是E.C.32丄l-3，特別是E.C.3.2丄1。在一些實(shí)施方案中，a淀粉酶是熱穩(wěn)定性細(xì)菌a淀粉酶，在其他實(shí)施方案中，a淀粉酶是真菌a淀粉酶。合適的a淀粉酶可以是天然存在的以及重組和突變的a淀粉酶。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，a淀粉酶衍生自芽孢桿菌屬的種。優(yōu)選的芽孢桿菌屬種包括枯草芽孢桿菌(及犯te7的、嗜熱脂肪芽孢桿菌、緩慢芽孢桿菌(及/e"加力、地衣芽孢桿菌(及//c&m;/bm^)、凝結(jié)芽孢桿菌(5.coagM/a"力和解淀粉芽孢桿菌C8.am;;/o/zXfldera)(USP5,763,385;USP5,824,532;USP5,958,739;USP6,008,026和USP6,361,809)。特別優(yōu)選的a淀粉酶來自芽孢桿菌屬菌株，嗜熱脂肪芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌。也可以參考菌株ATCC39709;ATCC11945;ATCC6598;ATCC6634;ATCC8480;ATCC9945A和NCIB8059。[120]考慮用于本發(fā)明方法的商業(yè)上可獲得的a淀粉酶包括SPEZYMEAA;SPEZYMEFRED;GZYMEG997(GenencorInternationalInc.)和TE脂AMYL120-L、LC、SC和SUPRA(NovozymesBiotech.)。葡糖淀粉酶一一[122]葡糖淀粉酶(E.C.3.2丄3)是從淀粉的非還原端除去連續(xù)的葡萄糖單元的酶。該酶可以水解淀粉，直鏈淀粉和支鏈淀粉的線性和分支糖苷鍵。盡管葡糖淀粉酶可以衍生自細(xì)菌、植物和真菌，本發(fā)明包括的優(yōu)選的葡糖淀粉酶衍生自真菌菌株。合適的葡糖淀粉酶不但包括天然存在的葡糖淀粉酶，也包括重組和突變的葡糖淀粉酶。[123]從曲霉屬、根霉屬、腐質(zhì)霉屬和毛霉屬的真菌分泌的葡糖淀粉酶已從真菌菌株獲得，真菌菌株包括黑曲霉、米曲霉0^戸^7/1^00;加￡)、泡盛曲霉、雪白根霉、米根霉、米赫毛霉(Mwcww'e/ze)、灰腐質(zhì)霉、yl，/'g/〃iws/h'tows,/禾口//wm/co/a(7Tzew2om;;c^)/朋/gZ"o^(參見Boel等(1984)3:1097隱1102;WO92/00381;WO00/04136;Chen等，(1996)iVW.9:499-505;Taylor等，(1978)C"Ao/j>^ra/eL61:301-308和Jensen等，(1988)Om.JM/croWo/.34:218-223)。[124]商業(yè)上被使用的具有葡糖淀粉酶活性的酶例如從黑曲霉產(chǎn)生(商品名OPTIDEXL-400,來自GenencorInternationalInc.),或從根霉種產(chǎn)生(商品名CU.CONC.，來自ShinNihonChemicals,J叩an和商品名GLUCZYME，來自AmanoPharmaceuticals,Japan)。重組產(chǎn)生的GSHEs—[125]在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，在本發(fā)明所包括的方法中使用的GHSE是重組表達(dá)的GSHE(rGSHE)，其獲自絲狀真菌菌株，該真菌菌株已被遺傳工程改造，以表達(dá)異源多核苷酸，該異源多核苷酸編碼源自宿主菌株以外來源的GSHE。[126]在一些實(shí)施方案中，絲狀真菌菌株是曲霉屬某種、木霉屬某種、鐮孢菌屬某種或青霉屬某種的菌株。特別優(yōu)選的真菌宿主包括構(gòu)巢曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、針尾曲霉(J.flcw/ea加力、黑曲霉、日本曲霉UJ印o"/cm)、里氏木霉、綠色木霉、尖鐮孢菌(F.oxwpor畫)和茄腐鐮孢菌(F.w/am')。曲霉屬菌株公開于Ward等,(1993)^7//.M/cra6,W.^ofec/"o/.39:738-743和Goedegebuur等，(2002)Cwm41:89-98中。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，宿主是木霉屬菌株，特別是里氏木霉菌株。里氏木霉的菌株是已知的，非限制性的例子包括ATCC號(hào)13631、ATCC號(hào)26921、ATCC號(hào)56764、ATCC號(hào)56765、ATCC號(hào)56767和NRRL15709。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，宿主菌株是RL-P37的衍生物。RL-P37公開于Sheir-Neiss等,(1984)M/cto6/o/._B/ofec/o/.20:46-53中。[127]表達(dá)GSHE的宿主菌株可以以前已經(jīng)通過遺傳工程被改造。在一些實(shí)施方案中，真菌宿主的各種基因已進(jìn)行失活。這些基因包括例如編碼纖維素水解酶，諸如內(nèi)切葡聚糖酶(EG)和外切纖維二糖水解酶(CBH)的基因(例如cWzl、cM2、eg/1和eg/3)。美國專利5,650,322公開了RL-P37的衍生菌株，該衍生菌株已剔除了d>W基因和cM2基因。[128]在一些實(shí)施方案中，真菌宿主已進(jìn)行遺傳工程改造，以包含編碼源自灰腐質(zhì)霉的GSHE的多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，該rGSHE與SEQIDNO:3中闡述的氨基酸序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、卯％、93%、95%、97%、98%和99%的序列同一性。在其他實(shí)施方案中，編碼SEQIDNO:3的GSHE的多核苷酸將與SEQIDNO:l的序列具有至少70%的序列同一性。[129]在其他實(shí)施方案中，真菌宿主已進(jìn)行遺傳工程改造，以表達(dá)編碼源自泡盛曲霉河內(nèi)變種的GSHE的多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，該rGSHE與SEQIDNO:7中闡述的氨基酸序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、卯％、93%、95%、97%、98°/。和99%的序列同一性。在其他實(shí)施方案中，編碼SEQIDNO:7的GSHE的多核苷酸與SEQIDNO:5的序列具有至少70%的序列同一性。載體和真菌轉(zhuǎn)化[130]根據(jù)本發(fā)明，編碼GSHE的異源多核苷酸可以通過載體，特別是表達(dá)載體引入真菌宿主細(xì)胞中，所述表達(dá)載體包括可操作性地連接到GSHE編碼序列上的調(diào)控序列。載體可以是任何載體，其當(dāng)引入真菌宿主細(xì)胞時(shí)整合入宿主細(xì)胞基因組并被復(fù)制?？梢詤⒖糉ungalGeneticsStockCenterCatalogueofStrains(www.FGSC.net)中的一組載體。此外，合適的表達(dá)和/或整合載體的例子可以參見Sambrook等，(1989)w;ra;Ausubel(1987)swpra;vandenHondel等(1991)，于Bennett和LasureEds.MOREGENEMANIPULATIONSINFUNGI,AcademicPresspp.396-428中和USP5,874,276。特別有用的載體包括pFB6、pBR322、PUC18、pUC函和pENTR/D。[131]在一些實(shí)施方案中，編碼GSHE的核酸被可操作性地連接到合適的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子在真菌宿主細(xì)胞中顯示出轉(zhuǎn)錄活性。啟動(dòng)子可以衍生自編碼蛋白質(zhì)的基因，或者與宿主細(xì)胞同源或者與宿主細(xì)胞是異源的。優(yōu)選地，啟動(dòng)子是可以用于木霉屬宿主中的，啟動(dòng)子的合適的非限制性例子包括cMl、cM2、eg/l和eg/2。在一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是相對(duì)于宿主細(xì)胞為天然的啟動(dòng)子。例如，當(dāng)里氏木霉是宿主細(xì)胞時(shí)，啟動(dòng)子是天然的里氏木霉啟動(dòng)子。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是里氏木霉cMl，其是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，并保藏在GenBank中，編號(hào)為D86235。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是在環(huán)境或發(fā)育調(diào)控下具有活性的啟動(dòng)子。在另一實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是相對(duì)于真菌宿主細(xì)胞為異源的啟動(dòng)子。有用的啟動(dòng)子的其他例子包括來自泡盛曲霉和黑曲霉葡糖淀粉酶基因的啟動(dòng)子。(參見Nunberg等，(1984)Mo/.Ce//頂o/.4:2306-2315和Boel等，(1984)五MSOJ3:1581-1585)。此外，里氏木霉x/"l基因和纖維二糖水解酶1基因的啟動(dòng)子也是有用的(EPA137280Al)。[132]在一些實(shí)施方案中，GSHE編碼序列可操作性地連接到信號(hào)序列。編碼信號(hào)序列的DNA優(yōu)選是與待被表達(dá)的GSHE基因天然相關(guān)的信號(hào)序歹iJ。優(yōu)選地，信號(hào)序列由編碼GSHE的灰腐質(zhì)霉或泡盛曲霉基因編碼。更優(yōu)選地，該信號(hào)序列與圖2A和6A中描述的信號(hào)序列具有至少90%、至少95%、至少97%和至少99%的序列同一性。在另外的實(shí)施方案中，包括待被引入真菌宿主細(xì)胞的DNA構(gòu)建物或載體的信號(hào)序列和啟動(dòng)子序列來自同樣的來源。例如，在一些實(shí)施方案中，信號(hào)序列是a/W信號(hào)序列，其可操作性地連接到cWl啟動(dòng)子。[133]在一些實(shí)施方案中，表達(dá)載體也包括終止序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，終止子序列和啟動(dòng)子序列來自同樣的來源。在另一實(shí)施方案中，終止子序列與宿主細(xì)胞同源。特別合適的終止子序列是源自木霉屬菌株，特別是里氏木霉的cMl。其他有用的真菌終止子包括來自黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的終止子(Nunberg等(1984)w/ra和Boel等，(1984)5w/ra)。[134]在一些實(shí)施方案中，表達(dá)載體包括選擇性標(biāo)記。優(yōu)選的選擇性標(biāo)記的例子包括賦予抗微生物抗性的選擇性標(biāo)記(例如潮霉素和腐草霉素)。營養(yǎng)型選擇性標(biāo)記也可以用于本發(fā)明，包括那些在本領(lǐng)域已知的標(biāo)記，如fl/m/S、argB和;^M。用于轉(zhuǎn)化木霉屬的載體系統(tǒng)的標(biāo)記描述下述文獻(xiàn)中Finkelstein，第六章，BIOTECHNOLOGYOFFILAMENTOUSFUNGI，F(xiàn)inkelstdn等Eds.Butterworth-Heinemann,Boston,MA(1992),第六章，禾QKinghorn等(1992)APPLIEDMOLECULARGENETICSOFFILAMENTOUSFUNGI，BIackieAcademicandProfessional,ChapmanandHall,London)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中,選擇性標(biāo)記是am必基因，其編碼乙酰胺酶，從而使得轉(zhuǎn)化的細(xì)胞能夠以乙酰胺作為氮源生長(參見Kelley等,(1985)￡M504:475-479和Penttila等，(1987)Ge恥61:155-164)。[135]包含編碼GSHE的多核苷酸的表達(dá)載體可以是能夠在給定真菌宿主生物中自主復(fù)制或能夠整合入宿主DNA的任何載體。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)載體是質(zhì)粒。在優(yōu)選實(shí)施方案中，可以考慮兩類表達(dá)載體，以獲得基因的表達(dá)。[136]第一類表達(dá)載體包括DNA序列，其中啟動(dòng)子、GHSE編碼區(qū)域和終止子都來自待被表達(dá)的基因。在一些實(shí)施方案中，通過刪除不想要的DNA序列(例如編碼不需要的結(jié)構(gòu)域的序列)，以使將要被表達(dá)的結(jié)構(gòu)域處于它自己的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列的控制下，從而獲得截短的基因。[137]第二類表達(dá)載體是預(yù)先裝配的，并含有高水平的轉(zhuǎn)錄所需要的序列和選擇性標(biāo)記。在一些實(shí)施方案中，GSHE基因的編碼區(qū)域或其部分被插入到該多用途表達(dá)載體中，以便它處于表達(dá)構(gòu)建物啟動(dòng)子和終止子序列的轉(zhuǎn)錄控制之下。在一些實(shí)施方案中，基因或其部分被插入到強(qiáng)c^l啟動(dòng)子的下游。[138]用于連接包括編碼GSHE的多核苷酸的載體、啟動(dòng)子、終止子和其他序列的方法，以及將它們插入合適的載體的方法是本領(lǐng)域熟知的。一般地，通過在方便的限制性位點(diǎn)進(jìn)行連接來實(shí)現(xiàn)連接。如果這樣的位點(diǎn)不存在，則根據(jù)常規(guī)的實(shí)踐，使用合成的寡核苷酸連接物。(參見Sambrook(1989)rapra;Bennett禾nLasure,MOREGENEMANIPULATIONSINFUNGI,AcademicPress,SanDiego(1991)pp70-76.)。此外，載體可以用已知的重組技術(shù)構(gòu)建(例如InvitrogenLifeTechnologies,GatewayTechnology)。[139]當(dāng)需要獲得具有一個(gè)或多個(gè)失活基因的真菌宿主細(xì)胞時(shí)，可以使用已知的方法(參見美國專利5,246,853;美國專利5,475,101和WO92/06209)?？梢杂孟率龇椒ㄊ够蚴Щ钔耆虿糠痔蕹?，插入失活，或使得基因?qū)ζ渲付ǖ淖饔脝适Чδ艿娜魏纹渌椒?諸如阻止該基因表達(dá)功能性蛋白)?？梢蕴蕹久箤倌撤N或其他絲狀真菌宿主中的任何基因，該基因已被克隆，例如c6Al、cM2、eg/1和eg/2。在一些實(shí)施方案中，通過用已知的方法將一種形式的待被失活的期望基因插入質(zhì)粒，來實(shí)現(xiàn)基因的剔除。然后在合適的限制性酶位點(diǎn)切割剔除質(zhì)粒，該限制性位點(diǎn)在期望的基因編碼區(qū)域內(nèi)部，該基因編碼序列或其部分用選擇性標(biāo)記替換。待被剔除的基因位置的側(cè)翼DNA序列(優(yōu)選約0.5至2.0kb之間)保留在標(biāo)記基因的每一邊。合適的剔除質(zhì)粒一般具有獨(dú)特的限制性酶位點(diǎn)，以使得包含剔除的基因的片斷——包括側(cè)翼DNA序列和選擇性標(biāo)記基因——可以作為單個(gè)線性片段而被去除。[140]將DNA構(gòu)建物或載體引入宿主細(xì)胞的技術(shù)包括，諸如轉(zhuǎn)化；電穿孔；核顯微注射；轉(zhuǎn)導(dǎo)；轉(zhuǎn)染，包括脂轉(zhuǎn)染介導(dǎo)的和DEAE-Dextrin介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染；用磷酸藥溫育DNA沉淀；用DNA包覆的微射彈進(jìn)行高速轟擊；和原生質(zhì)體融合。Ausubel等，(1987),Mpra第九章，和Sambrook(1989)w戶ra中教導(dǎo)了一般性的轉(zhuǎn)化技術(shù)。更具體地，轉(zhuǎn)化絲狀真菌的方法描述在Campbell等，(1989)Cm/t.16:53-56中。具體地，為了能在木霉屬中表達(dá)異源蛋白質(zhì)，可以參考USP6,022,725;USP6,268,328;Harkki等(1991);五"2y"MM/cro6.Tfec/wo/.13:227-233;Harkki等，(1989)5/oTec/wo/.7:596-603;EP244,234;和EP215,594。也可以參考Nevalainen等，"77^//畫/og,am/i/"e油g薩G認(rèn)f，MOLECULARINDUSTRIALMYCOLOGY,Eds.Leong和Berka，MarcelDekkerInc.,NY(1992)pp.129-148。也可以參考Cao等,(2000)Sci.9:991-1001，以轉(zhuǎn)化曲霉屬菌株。[141]優(yōu)選地，可以用載體系統(tǒng)構(gòu)建遺傳上穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子，由此編碼GSHE的核酸穩(wěn)定整合入宿主菌株染色體。轉(zhuǎn)化子然后可以用已知的技術(shù)純化。[142]在一個(gè)非限制性例子中，包含a/n^S標(biāo)記的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子與不穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子不同，其不同在于它們?cè)诤幸阴０返墓腆w培養(yǎng)基上更快的生長速率，以及形成具有平滑的而不是粗糙的輪廓的環(huán)狀集落。另外，在一些情況下，穩(wěn)定性的進(jìn)一步測(cè)試通過在固體非選擇性培養(yǎng)基(即缺乏乙酰胺)上培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子來進(jìn)行，從該培養(yǎng)基收獲孢子，并且確定隨后將發(fā)芽并在含有乙酰胺的選擇性培養(yǎng)基上生長的這些孢子的百分比。另外，本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的其它方法可以用于選擇轉(zhuǎn)化子。[143]在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，用于轉(zhuǎn)化的木霉屬某種的制備涉及從真菌菌絲制備原生質(zhì)體。(參見Campbell等人(1989)CwrGraW.16:53-56)。在一些實(shí)施方案中，菌絲是從萌發(fā)的營養(yǎng)孢子獲得的。用消化細(xì)胞壁的酶處理菌絲，從而產(chǎn)生原生質(zhì)體。然后原生質(zhì)體通過在懸浮培養(yǎng)基中存在的滲透穩(wěn)定劑得到保護(hù)。這些穩(wěn)定劑包括山梨糖醇、甘露醇、氯化鉀、硫酸鎂及其類似物。通常這些穩(wěn)定劑的濃度在0.8M和1.2M之間變化。優(yōu)選地在懸浮培養(yǎng)基中使用大約1.2M的山梨糖醇溶液。[144]將DNA攝取到宿主木霉屬某種菌株中是依賴于鈣離子濃度。在攝取溶液中通常使用大約10mM和50mM之間的CaCl2。在攝取溶液中除了需要鈣離子，通常所包括的其它項(xiàng)目是緩沖體系，如TE緩沖液(10MmTris，pH7.4;ImMEDTA)或10mMMOPS，pH6.0緩沖液(嗎啉代丙烷磺酸)和聚乙二醇(PEG)。據(jù)信，聚乙二醇發(fā)揮融合細(xì)胞膜的作用，從而允許培養(yǎng)基中的物質(zhì)被傳遞到木霉屬某種菌株的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，并且質(zhì)粒DNA被轉(zhuǎn)移到核中。該融合常常使得質(zhì)粒DNA的多個(gè)拷貝溫和地整合到宿主染色體中。[145]通常在轉(zhuǎn)化中使用含有木霉屬某種原生質(zhì)體或細(xì)胞的懸浮液，其已經(jīng)以105到107/mL，優(yōu)選地2xl06/mL的密度進(jìn)行了可滲透性處理。將lOO^L體積的含有這些原生質(zhì)體或細(xì)胞的適當(dāng)溶液(例如1.2M山梨糖醇；50mMCaCl2)與期望的DNA混合。通常將高濃度的PEG加入到攝取溶液中。0.1到1體積的25%PEG4000可以被加入到原生質(zhì)體懸液中。然而，優(yōu)選地將大約0.25體積加入到原生質(zhì)體懸液中。添加劑如二甲基亞砜、肝素、亞精胺、氯化鉀及其類似物也可以被加入到攝取溶液中，以便有助于轉(zhuǎn)化。對(duì)于其它真菌宿主細(xì)胞，類似方法是可以獲得的。例如參見美國專利6,022,725和6,268,328，其內(nèi)容通過引用方式被并入。通常，混合物然后在大約0'C被溫育10到30分鐘。然后在混合物中再次加入PEG，以進(jìn)一步增強(qiáng)期望基因或DNA序列的攝取。25%PEG4000通常以轉(zhuǎn)化混合物體積的5到15倍體積加入；然而，更大或更小的體積也可以是合適的。25%PEG4000優(yōu)選地是轉(zhuǎn)化混合物體積的大約IO倍。在加入PEG后，在加入山梨糖醇和CaCl2溶液之前，在室溫或在冰上溫育轉(zhuǎn)化混合物。原生質(zhì)體懸液然后被進(jìn)一步加入到融化的生長培養(yǎng)基等份中。該生長培養(yǎng)基僅僅允許轉(zhuǎn)化子生長。本領(lǐng)域技術(shù)人員將充分意識(shí)到，類似的程序和方法可以用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞以及在宿主細(xì)胞中異源表達(dá)其他酶，諸如淀粉水解酶。細(xì)胞培養(yǎng)物[147]合適的宿主細(xì)胞通常在含有生理鹽分和營養(yǎng)物的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，如下述文獻(xiàn)中所描述的Pourquie，J等人，BIOCHEMISTRYANDGENETICSOFCELLULOSEDEGRADATION,Aubert,J.P.等人編著，AcademicPress,71-86頁,1988，和Ilmen,M.等人,(1997)々^/,M/croWo/.63:1298-1306。也可以參考普通的商業(yè)上制備的培養(yǎng)基，如YeastMaltExtract(YM)培養(yǎng)基，LuriaBertani(LB)培養(yǎng)基和SabouraudDextrose(SD)培養(yǎng)基。[148]培養(yǎng)條件也是標(biāo)準(zhǔn)的，例如培養(yǎng)物在大約28i:，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中，在振蕩培養(yǎng)器或發(fā)酵罐中培養(yǎng)，直到實(shí)現(xiàn)期望的GSHE表達(dá)水平。給定的絲狀真菌的優(yōu)選的培養(yǎng)條件可以在科學(xué)文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)，和/或從真菌的來源發(fā)現(xiàn)，如AmericanTypeCultureCollection禾卩FungalGeneticsStockCenter(www.FGSC.net)。[149]在真菌生長已經(jīng)建立后，將細(xì)胞暴露于可以有效地導(dǎo)致或允許淀粉水解酶尤其是本文所定義的GSHE表達(dá)的條件下。在GSHE編碼序列處于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下的情況下，誘導(dǎo)劑，例如糖、金屬鹽或抗生素，以可以有效地誘導(dǎo)GSHE表達(dá)的濃度加入到培養(yǎng)基中。GSHE活性的鑒定[150]為了評(píng)價(jià)細(xì)胞系的淀粉水解酶表達(dá)，所'述細(xì)胞系已用編碼淀粉水解酶例如GSHE的異源多核苷酸轉(zhuǎn)化，可以在蛋白質(zhì)水平、RNA水平進(jìn)行分析，或利用針對(duì)葡糖淀粉酶活性和/或產(chǎn)生的特定功能性生物分析。[151]—般而言，用于分析GSHE表達(dá)的分析方法包括Northern印跡，點(diǎn)印跡(DNA或RNA分析)、RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))或原位雜交、使用適當(dāng)標(biāo)記的探針(基于核酸編碼序列)和常規(guī)的Southern印跡和放射自顯影。[152]此外，淀粉水解酶的產(chǎn)生和/或表達(dá)可以直接在樣品中測(cè)量，例如通過直接測(cè)量在培養(yǎng)基中的還原糖如葡萄糖的分析方法，通過測(cè)量葡糖淀粉酶活性、表達(dá)和/或產(chǎn)生的分析方法。例如，可以用于分析GSHE活性的底物包括顆粒淀粉底物。例如，葡萄糖濃度可以通過任何便利的方法來確定，如通過使用葡萄糖試劑盒No15-UV(SigmaChemicalCo.)，或設(shè)備如TechniconAutoanalyzer。也可以參考葡萄糖氧化酶試劑盒和葡萄糖己糖試劑盒，它們可從InstrumentationLab.(Lexington,MA)商購。葡糖淀粉酶活性可以通過3，5-二硝基水楊酸(DNS)方法測(cè)定(參見Goto等人，(1994)Biosci.Biotechnol.Biochetn.58:49-54)。在非限制性例子中，rGSHE有能力在15%淀粉固體水懸液中水解顆粒淀粉，水解為至少90%、95%和97。/。wt葡萄糖的糖溶液，以干物質(zhì)為基礎(chǔ)進(jìn)行計(jì)算。[153]此外，蛋白質(zhì)表達(dá)可以通過免疫學(xué)方法評(píng)價(jià)，如細(xì)胞的免疫組織化學(xué)染色、組織切片或組織培養(yǎng)基的免疫測(cè)定法，例如通過Western印跡或ELISA。這樣的免疫測(cè)定法可以用于定性地和定量地評(píng)價(jià)淀粉水解酶的表達(dá)。這樣的方法的細(xì)節(jié)對(duì)本
技術(shù)領(lǐng)域：
技術(shù)人員是已知的，實(shí)踐這樣的方法的許多試劑可以商購獲得。[154]示范性的測(cè)定方法包括ELISA、競(jìng)爭性免疫測(cè)定、放射性免疫測(cè)定、Western印跡、間接免疫熒光測(cè)定和類似方法。一般而言，商業(yè)上可以獲得的抗體和/或試劑盒可以用于定量免疫測(cè)定GSHE的表達(dá)水平。[155]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，由重組木霉屬宿主表達(dá)的GSHE為每升(g/L)培養(yǎng)基中大于l克蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，由重組木霉屬宿主表達(dá)的GSHE的量為，每升培養(yǎng)基大于2克。在其他實(shí)施方案中，由重組木霉屬宿主表達(dá)的GSHE的量為，每升培養(yǎng)基大于5克。在還有其他實(shí)施方案中，由重組木霉屬宿主表達(dá)的GSHE的量為，每升培養(yǎng)基將大于10克。在一些例子中，表達(dá)的GSHE的量為，大于20g/L，大于25g/L，大于30g/L，大于50g/L培養(yǎng)基。純化淀粉水解酶的方法[156]—般而言，在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的淀粉水解酶(例如nGSHE或rGSHE)被分泌到培養(yǎng)基中，并且可以被純化或分離，例如通過從細(xì)胞培養(yǎng)基中去除不需要的組分。在一些情況下，GSHE可以以細(xì)胞內(nèi)形式產(chǎn)生，從而必須從細(xì)胞裂解物進(jìn)行回收。在這樣的情況下，從細(xì)胞中純化該酶，其中它是使用本
技術(shù)領(lǐng)域：
技術(shù)人員常規(guī)使用的技術(shù)產(chǎn)生。實(shí)例包括但不限于，親和層析(Tibeurgh等人，(1984)W然Ze//.6:215);離子交換層析方法(Goyal等人(1991)Rc/mo/.36:37;Fliess等人(1983)￡欲J.v4邵/.M/craWo/.歷o&c/wo/.17:314;Bhikhabhai等人(1984)乂v4pp/.6:336;禾HEllouz等人(1987)C7zrawa/ograp/y;396:307)，包括使用具有高分辨能力材料的離子交換(Medve等人(1998)乂C/zrom^ogra/^j^808:153;疏水相互作用層析(Tomaz和Queiroz,(1999)JC/zrawfltogra;/^爿865:123;兩相分離(Brumbauer等人(1999)所oy印waft'o"7:287);乙醇沉淀；反相HPLC;硅或陽離子交換樹脂上的層析，如DEAE;層析聚焦(chromatofocusing);SDS-PAGE;硫酸銨沉淀；和膠凝過濾，使用例如SephadexG-75。工藝條件[157]將稻米底物，優(yōu)選是漿狀形式的，與淀粉水解酶接觸或溫育，以水解稻米底物中的顆粒淀粉。GSHE可以以無細(xì)胞提取物的形式提供(這樣GSHE是從細(xì)胞培養(yǎng)基分離)，或以培養(yǎng)基形式提供(發(fā)酵肉湯)，其包括表達(dá)和分泌GSHE的真菌細(xì)胞。[158]在一些實(shí)施方案中，GSHE可以加入到包括稻米底物的組合物中，加入量為約0.001至15.0GSHE單位(U)/g漿ds，干固體調(diào)整到10-55%。在其他實(shí)施方案中，GSHE可以加入到包括稻米底物的組合物中，加入量為約0.01至10.0GSHE單位(U)/g漿中淀粉干固體(ds)，干固體調(diào)整到10-55%。在一些實(shí)施方案中，以每克此溶液約0.01至5.0GSHEU的量加入GSHE。在其他實(shí)施方案中，以每克此溶液約0.01至2.0GSHEU的量加入GSHE。在一些實(shí)施方案中，以每克此溶液約0.01至1.5GSHEU的量加入GSHE。也在其他實(shí)施方案中，以每克此溶液約0.05至1.5GSHEU的量，以及約0.1至1.0GSHEU的量加入GSHE。[159]在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，GSHE將具有葡糖淀粉酶活性，第二淀粉水解酶將是a淀粉酶。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解地，用于本發(fā)明方法的a淀粉酶的量將取決于a淀粉酶的酶活性。一般地，將約0.001至5.0kg的a淀粉酶加入到一公噸(MT)稻米底物中。在一些實(shí)施方案中，將0.01至5.0kg的a淀粉酶加入到一公噸(MT)稻米底物中。盡管在一些實(shí)施方案中，a淀粉酶以每MT約0.05至4.0kg的量加入。在其他實(shí)施方案中，a淀粉酶以每MT約O.l至2.5kg的量加入，也以每MT約0.5至1.5kg的量加入。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可以采用其他數(shù)量。例如，通常將約0.01至1.5kg量的GZYMEG997或SPEZYMEFRED(GenencorInternationalInc.)加入到一公噸的淀粉中。在其他實(shí)施方案中，酶以每公噸淀粉約0.05至1.0kg;約0.1至0.6kg;約0.2至0.6kg;約0.4至0.6kgGZYMEG997或SPEZYMEFRED的量加入。[160]在一些實(shí)施方案中，GSHE與a淀粉酶一起加入到稻米底物中，以基本上同時(shí)進(jìn)行溫育。然而，在其他實(shí)施方案中，依次加入GSHE和ot淀粉酶，但是一般地，水解酶相互之間在約1至60分鐘之內(nèi)，相互之間在1至30分鐘之內(nèi)加入。[161]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中a淀粉酶單位與GSHE單位之比(a淀粉酶GSHE)將在15:1至1:15范圍內(nèi)，在一些實(shí)施方案中，范圍在10:1至1:10范圍內(nèi)。在其他實(shí)施方案中，比率在5:l至l:5范圍內(nèi)，在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，ct淀粉酶GSHE將是4:1至1:4。在優(yōu)選實(shí)施方案中，比率為約2:1至1:4,在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，約2:1至1:2。[162]在一些實(shí)施方案中，將包含稻米底物和水解酶的混合物在等于或低于包括在稻米底物中的蛋白質(zhì)的變性溫度的溫度中溫育。在一些實(shí)施方案中，該溫度低于約72。C、70。C、68。C、65°C、63°C、60°C、58。C、55°C、50°C、45。C和40。C，但是不低于l(TC。在其他實(shí)施方案中，該工藝在約7(TC至5(TC之間的溫度進(jìn)行。在迸一步的實(shí)施方案中，該工藝在約7(TC至55r之間的溫度進(jìn)行，也在約65"至55'C之間的溫度進(jìn)行。[163]在一些實(shí)施方案中，包括稻米底物和淀粉水解酶的混合物在下述范圍內(nèi)的pH溫育在約pH3.0至pH6.5的范圍內(nèi)；在約pH3.0至pH6.0的范圍內(nèi)；在約pH3.0至pH5.5的范圍內(nèi)；在約pH3.5至pH5.0的范圍內(nèi)；在約pH3.0至pH4.0的范圍內(nèi)；在約pH4.5至6.5的范圍內(nèi)；和在約pH5.0至6.0的范圍內(nèi)。[164]在一些實(shí)施方案中，包括稻米底物和淀粉水解酶(優(yōu)選GSHE和a淀粉酶)的混合物在上述溫度和pH中溫育約2至100小時(shí)，約5至100小時(shí)，約10至100小時(shí)，約5至50小時(shí)，約10至50小時(shí)，和約10-24小時(shí)。[165]在一些實(shí)施方案中，稻米底物中至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、94%、95%、96%、97%、98%和99%的干固體被轉(zhuǎn)化為溶解的淀粉水解產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，稻米底物中的千固體完全被溶解。優(yōu)選地，可溶的淀粉水解產(chǎn)物是葡萄糖，最優(yōu)選地，以總的溶解的干固體的百分?jǐn)?shù)計(jì)，葡萄糖的產(chǎn)量為至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%和99.5%。[166]在某些實(shí)施方案中，稻米底物中至少80%、85%和90%的顆粒淀粉在24小時(shí)內(nèi)溶解并水解。在其他實(shí)施方案中，稻米底物中至少95%的顆粒淀粉在24小時(shí)內(nèi)溶解并水解。在還有其他的實(shí)施方案中，稻米底物中至少98%的顆粒淀粉在24小時(shí)內(nèi)溶解并水解。[167]在一些實(shí)施方案中，包括稻米底物和淀粉水解酶(例如GSHE和a淀粉酶)的混合物在約5.0至6.0的pH溫育足夠的時(shí)間(例如，在2至96小時(shí)之間)。在一些實(shí)施方案中，溫育的漿的pH將被降低至約3.0至4.0。如此降低pH將導(dǎo)致對(duì)稻米底物的酶反應(yīng)的終止。[168]足夠的溫育時(shí)間后，將含有溶解的稻米淀粉水解產(chǎn)物的組分從溫育的漿中分離出來，留下殘留物，其包含基本上不溶性的稻米蛋白濃縮物。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知進(jìn)行分離的各種方法。一般而言，這些分離方法中的一些包括離心；常規(guī)過濾方法和膜分離方法。[169]包含稻米蛋白濃縮物的殘留物的蛋白含量(Nx5.95)為大于10%、20%、30%、40%和50%。在一些實(shí)施方案中，稻米蛋白濃縮物的蛋白含量在約10%至60%的范圍內(nèi)；在約10%至50%的范圍內(nèi)；在約20%至45%的范圍內(nèi)；和在約30%至40%的范圍內(nèi)。[170]在其他實(shí)施方案中，將獲得高純度稻米蛋白濃縮物。在一些實(shí)施方案中，通過第二個(gè)酶促水解步驟獲得高純度稻米蛋白濃縮物，因而，包括基本上不溶性的稻米蛋白濃縮物、且獲自第一次酶促水解的殘余物進(jìn)一步溫育一段時(shí)間，溫育的溫度和pH如上所述，以水解剩余的粒狀或不溶性淀粉。在一些實(shí)施方案中，通過在約55'C至60'C的溫度，將pH降低至低于溫育時(shí)的pH的值，例如從pH5.5降至pH3.0-4.0的范圍內(nèi)，終止對(duì)在殘余物中剩余的淀粉的酶水解作用。然后如上述描述地，將可溶性的稻米淀粉水解產(chǎn)物從殘留物中分離出來，以獲得高純度稻米蛋白濃縮物。[171]在該實(shí)施方案中，同樣的淀粉水解酶可以如上面描述地那樣使用。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，淀粉水解酶中的至少一種將是GSHE。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，GSHE可以與a淀粉酶聯(lián)合使用；在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，GSHE可以與葡糖淀粉酶聯(lián)合使用。然而，無論是第一還是第二酶促水解過程都不限于僅僅使用這些酶。其他的酶可以用于該工藝，這些酶包括但是不限于纖維素酶、果膠酶、支鏈淀粉酶和卩葡聚糖酶。[172]高純度稻米蛋白濃縮物的蛋白質(zhì)含量(Nx5.95)通常大于60%、63%、65%、68%、70%和75%。在一些實(shí)施方案中，高純度稻米蛋白濃縮物的蛋白質(zhì)含量為約65°/?；蚋螅约凹s70%或更大。[173]根據(jù)該工藝獲得的稻米蛋白濃縮物或高純度稻米蛋白濃縮物可以用常規(guī)的和熟知的技術(shù)干燥，例如真空干燥、噴霧干燥和冷凍干燥。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明獲得的稻米蛋白濃縮物的水分含量將低于約10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%和2%。在一些實(shí)施方案中，獲得的高純度的蛋白質(zhì)濃縮物將干燥到水分含量低于6%、5%、4%、3%和2%。在一些實(shí)施方案中，水分含量將在約2%至5%之間。[174]相比通過使用常規(guī)高溫處理的淀粉加工方法獲得的蛋白質(zhì)組分，根據(jù)本文的方法獲得的蛋白質(zhì)濃縮物和高純度蛋白質(zhì)濃縮物具有改善的特性。在一些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)濃縮物和高純度蛋白質(zhì)濃縮物包含這樣的蛋白質(zhì)，其相比從在淀粉加工中使用的現(xiàn)有工藝獲得的蛋白質(zhì)殘留物的蛋白質(zhì)溶解性，在堿性pH水平，特別是在10.0的pH水平具有更大的溶解性。在一些實(shí)施方案中，在pHIO的溶解度為至少20%、至少40%和至少50%。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)濃縮物和高純度蛋白質(zhì)濃縮物包含這樣的蛋白質(zhì)，其相比從在淀粉加工中使用的現(xiàn)有工藝獲得的蛋白質(zhì)殘留物的蛋白質(zhì)溶解性，在酸性pH水平，特別是在2.0的pH水平具有更大的溶解性。在一些實(shí)施方案中，在pH2.0的溶解度為至少15%、至少20%、至少25%和至少30%。[175]在其他的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明獲得的蛋白質(zhì)濃縮物和高純度蛋白質(zhì)濃縮物將具有這樣的氨基酸組成，其中，相比從在淀粉加工中使用的現(xiàn)有方法獲得的殘留物中的蛋白質(zhì)組分的氨基酸分布型，某些氨基酸的百分?jǐn)?shù)增加。例如，在一些實(shí)施方案中，在根據(jù)本發(fā)明獲得的蛋白質(zhì)濃縮物中谷氨酸、纈氨酸、亮氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、精氨酸、天冬氨酸或丙氨酸的數(shù)量較大。實(shí)驗(yàn)[176]提供下列實(shí)施例，目的是證明和進(jìn)一步闡述本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案和優(yōu)選方面，不是為了構(gòu)成對(duì)其范圍的限制。事實(shí)上，應(yīng)該認(rèn)為這些教導(dǎo)可用于進(jìn)一步優(yōu)化本文中描述的工藝系統(tǒng)。[177]在隨后的公開和實(shí)驗(yàn)部分中，使用下面的縮寫H-GSHE(天然灰腐質(zhì)霉高溫變種GSHE);rH-GSHE(表達(dá)在里氏木霉中的灰腐質(zhì)霉高溫變種GSHE);wt。/。(重量百分比)；。C(攝氏度)；rpm(每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù))；&0(水)；dH20和Di(去離子水)；bp(堿基對(duì))；kb(千堿基對(duì))；kD(千道爾頓)；gm(克)；嗎(微克)；mg(毫克)；ng(納克)；pl(微升)；ml和mL(毫升)；mm(毫米)；nm(納米)；pm(微米)；M(摩爾每升)；mM(毫摩爾每升)；HM(微摩爾每升)；U(單位)；V(伏特)；MW(分子量)；Sec(秒)；min(S)(分鐘)；hr(S)(小時(shí))；MT(公噸)；PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)；鄰苯二甲酸鹽緩沖液(鄰苯二甲酸鈉，水中，20mM,pH5.0);SDS(十二烷基硫酸鈉)；Tris(三(羥甲萄氨基甲烷)；w/v(重量與體積之比)；v/v(體積與體積之比)；Genencor(GenencorInternational,Inc.,PaloAlto,CA);ShinNihon(ShinNihon,Japan);HPLC(高壓液相色譜方法)；ds(干固體含量)。一般方法[178]稻米底物——白稻米粉，ElephantBrand,購自ThaiBetterFoods,Co.,Ltd.Bangpong,Thailand。[179]總蛋白分析一一使用Kjeldhal方法測(cè)定稻米粉末和稻米蛋白質(zhì)制備物的總氮含量(參見Methods22B608,AmericanAssociationofCerealChemists(AACC)1983，StPaul,MN)。對(duì)總氮使用5.95的mortification因子，計(jì)算蛋白質(zhì)含量(％)(JulianoB.O.(;i98。Rice:ChemistryandTechnology;AACC，St.Paul顧》[180]總淀粉含量的測(cè)定一一通過酶-酶淀粉液化和糖化方法，測(cè)定總淀粉含量。在典型的分析中，將兩克(g)干樣品放入100mlKohlraucsh瓶中，并加入45ml的MOPS緩沖液pH7.0。充分?jǐn)嚢铦{體30min。加入1.0mlSPEZYMEFRED(用H20以1:50稀釋)，并加熱到沸騰3-5min。將瓶置于維持在12rC的高壓滅菌器中15min。高壓滅菌后，將瓶置于維持在95'C的水浴中，加入1.0ml的1:50稀釋的SPEZYMEFRED，并溫育45min。將pH調(diào)整到pH4.2，溫度降到60。C,然后將20ml醋酸鹽緩沖液pH4.2加入到混合物中。通過加入1.0ml的1:100稀釋的OPTIDEXL-400(GenencorInternational,Inc.)進(jìn)行糖化，并在6(TC再繼續(xù)溫育18小時(shí)。通過在95'C加熱lOmin終止酶反應(yīng)。通過使用葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行HPLC分析，測(cè)定總糖組成。從在室溫未經(jīng)酶促處理的樣品的水提取物中獲得的可溶性淀粉水解產(chǎn)物從該總糖中扣除。[181]寡糖分析——寡糖反應(yīng)產(chǎn)物的組成通過配備有HPLC柱(Rezex8u8%H，Monosaccharides)的HPLC(BeckmanSystemGold32KaratFullerton,California,USA)來測(cè)定，溫度維持在5(TC，并安裝有折射率(RI)檢測(cè)儀(ERC-7515A，RIDetector,來自TheAnspecCompany,Inc.)。稀硫酸(0.01N)被用作移動(dòng)相，流速為0.6ml/分鐘。將20微升的4.0%溶液注射到柱上。依靠糖的分子量進(jìn)行柱分離。例如DPI指單糖，諸如葡萄糖；DP2指二糖，諸如麥芽糖；DP3指三糖，諸如麥芽三糖；DP4+指聚合度(DP)為4或大于4的寡糖。[182]固體的相對(duì)溶解一一傳統(tǒng)低溫噴射蒸煮工藝被用來溶解稻米淀粉(參見美國專利3,912,590)。清澈的上清液被用來測(cè)量Brix(ABBERefractometer,AmericanOpticalCorporation,ScientificInstrumentDivision,Buffalo,NewYork)。在低溫噴射工藝下，從30%稻米粉漿體(300克稻米粉，在700gdH20中)獲得的溶解淀粉的Brix取為100%溶解，并被用于計(jì)算不同處理?xiàng)l件下的淀粉的相對(duì)溶解百分比。[183]在典型的低溫噴射蒸煮試驗(yàn)中，在塑料燒杯中將700g蒸餾水加入到300g白稻米粉中，以制備30。/。ds的稻米粉漿。攪拌漿體，用6.0NH2SO4將pH調(diào)整到6.0。加入來自嗜熱脂肪芽孢桿菌的a淀粉酶(G-zymeG997)(GenencorInternationalInc.),加入劑量為0.8kg/MT(w/wdss)。用泵使衆(zhòng)體通過105。C的加熱圈5min，并保持在部分浸沒于95。C水浴的閉口Erienmeyer瓶中2小時(shí)。使用塑料移液管將2ml的液化物(Iiquefact)轉(zhuǎn)移入離心管，在8000rpm離心3分鐘。上清液的Brix值為27。[184]假設(shè)利用G-ZymeG997的稻米淀粉的溶解為100%,Brix值27代表參照Brix，并在隨后的實(shí)施例中被用來計(jì)算稻米淀粉的相對(duì)溶解。RS=(Brix/參照Brix)xl00%[185]其中，RS=相對(duì)溶解；BrixH式驗(yàn)(Expt)Brix，參照Brix=在100%溶解時(shí)的Brix。實(shí)施例[186]本發(fā)明在下面的實(shí)施例中得到進(jìn)一步詳細(xì)的描述，這些實(shí)施例絕不是為了限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1[187]灰腐質(zhì)霉高溫變種GSHE在里氏木霉中的表達(dá)(rH-GSHE)[188]克隆灰腐質(zhì)霉高溫變種GSHE基因——[189]從冷凍的嗜熱小柱孢霉(&jto/WMmf/zem印/H7fww)(ATCC16453，無性型，灰腐質(zhì)霉高溫變種)菌絲體提取基因組DNA(SEQIDNO:l)。冷凍的菌絲體在咖啡磨具中用干冰研磨，通過EasyDNA方案(Invitrogen)提取DNA。將過量的氯仿/酚/異戊醇提取劑加入到該標(biāo)準(zhǔn)方案中?；贜CBI數(shù)據(jù)庫登記號(hào)M89475，設(shè)計(jì)PCR引物。正向引物含有用于定向克隆入pENTR/D載體(Invitrogen)的基序。[190]RSH003f引物的序列是CAACATGCATACCTTCTCCAAGCTCCTC(SEQIDNO:8)，RSH004r引物的序列是TTAACGCCACGAATCATTCACCGTC(SEQIDNO:9)。[192]根據(jù)InvitrogenGateway系統(tǒng)方案，將PCR產(chǎn)物克隆到pENTR7D中。然后將載體轉(zhuǎn)化到化學(xué)感受態(tài)T叩10大腸桿菌(Stratagene)中，卡那霉素選擇。來自幾個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA被限制性消化，以確認(rèn)正確尺寸的插入物。隨后從幾個(gè)克隆對(duì)g/"l插入物進(jìn)行測(cè)序(Sequetech，MountainView,CA)。來自一個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA，pENTR/D—N13，被加入到帶有pTrex3g/aw必目的載體DNA的LR克隆酶反應(yīng)(InvitrogenGateway系統(tǒng))中。在LR克隆酶反應(yīng)中，通過重組，目的載體的CmR和cc必基因被來自pENTR/D載體的灰腐質(zhì)霉g/a/代替。[193]該重組在目的載體的啟動(dòng)子和終止子之間定向插入g/a/。48bp和50bp的重組位點(diǎn)序列分別保持在g/a7的上游和下游。將等份的LR克隆酶反應(yīng)轉(zhuǎn)化到化學(xué)感受態(tài)Top10大腸桿菌中，過夜培養(yǎng)，用羧芐青霉素選擇。將來自幾個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA進(jìn)行限制性消化，以確認(rèn)正確的插入物大小。用JK^1消化來自克隆的質(zhì)粒DNA，pTrex3g_N13(參見圖3和4)，以釋放包含c6W啟動(dòng)子g/a/:cM/和終止子^H^S的表達(dá)盒子。該6.6kb盒子通過瓊脂糖提取進(jìn)行純化，并轉(zhuǎn)化到源自可公開獲得的菌株QM6a的里氏木霉菌株中，正如下面進(jìn)一步描述的。[194]通過Sequetech，MountainView,CA對(duì)表達(dá)盒測(cè)序，GSHE的DNA示于圖l(SEQIDNO:l)中，多肽序列示于圖2(SEQIDNO:2和3)中。里氏木霉的轉(zhuǎn)化一一[195]將平板上約二分之一拭樣(或l-2cn^)的形成孢子的菌絲體(在PDA平板上在3(TC生長5天)接種到置于250ml的、帶有4個(gè)擋板的搖瓶中的50mMYEG'(5g/L酵母提取物加上20g/L葡萄糖)肉湯中，37'C在200rpm培養(yǎng)16-20小時(shí)。通過將液體體積轉(zhuǎn)移到50ml錐形管中并于2500卬m旋轉(zhuǎn)離心10分鐘，回收菌絲體。吸走上清液。將菌絲體沉淀物轉(zhuǎn)移到250ml的、0.22微米CAComing過濾瓶中，CACorning過濾瓶中含有40ml的(3-葡聚糖酶溶液，30°C、200rpm溫育2小時(shí)，以產(chǎn)生用于轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體。[196]通過用無菌濾布(miracloth)進(jìn)行過濾，原生質(zhì)體被收獲到50tnl錐形管中。通過以2000rpm旋轉(zhuǎn)離心5分鐘將它們沉淀，并抽吸掉液體。用50ml的UM山梨糖醇將原生質(zhì)體沉淀物洗滌一次，旋轉(zhuǎn)沉淀下來，抽吸掉液體，用25ml的山梨糖醇/CaCl2洗滌。對(duì)原生質(zhì)體計(jì)數(shù)，然后以2000rpm5分鐘沉淀，倒盡上清液，將原生質(zhì)體沉淀物重懸在足夠量的山梨糖醇/CaCl2中，以獲得每毫升含1.25xl()8個(gè)原生質(zhì)體的原生質(zhì)體濃度，從而產(chǎn)生原生質(zhì)體溶液。[197]將最多20嗎的表達(dá)載體DNA(體積不超過2(HU)的等份物放置到15ml錐形管中，將管子置于冰上。然后在每份轉(zhuǎn)化等份物中加入200nl的原生質(zhì)體，以及50plPEG溶液。輕輕地混合管子，冰上溫育20分鐘。將PEG溶液(2ml)加入到轉(zhuǎn)化等份物管子中，室溫下將這些管子溫育5分鐘。加入山梨糖醇/CaCl2溶液(4ml)至管子中，得到的總體積為6.2ml。將轉(zhuǎn)化混合物分為3個(gè)等份，每份含有大約2ml。通過將這三份等份物中的每一份加入到含有融化的頂層瓊脂的三個(gè)管子中(通過維持在5(TC而保持融化狀態(tài))，產(chǎn)生表層混合物(overlaymixture),并將該表層混合物傾倒到轉(zhuǎn)化平板上。然后將轉(zhuǎn)化平板在3(TC溫育4至7天。[198]實(shí)施轉(zhuǎn)化，用"m/S進(jìn)行選擇。乙酰胺/山梨醇板和表層(overlays)被用于轉(zhuǎn)化。對(duì)于選擇平板，使用同樣的平板，但是無山梨醇。通過將分離的菌落轉(zhuǎn)移到含有乙酰胺的新鮮選擇性培養(yǎng)基中來純化轉(zhuǎn)化子。參考實(shí)施例，如下制備下述溶液。1)40mlP-D-葡聚糖酶溶液在1.2M山梨醇中制備，包括600mgP-D-葡聚糖酶和400mgMgS04-7H20。(InterSpexProductsInc.SanMateo,CA)。2)200mlPEG混合物，含有50gPEG4000(BDHLaboratorySuppliesPoole，England)和1.47gCaCl2.2H20，在dH20中制備。3)山梨醇/CaCl2，含有1.2M山梨醇和50mMCaCl2。4)乙酰胺/山梨醇瓊脂第I部分——0.6g乙酰胺(Aldrich,99%升華)、1.68gCsCl、20g葡萄糖、20gKH2P04、0.6gMgS04.7H2O、0.6gCaCl2.2H20、lml1000x鹽(見下面)，調(diào)整到pH5.5，用dH20補(bǔ)足體積(300ml)，過濾并滅菌。第II部分——20gNoble瓊脂和218g山梨醇，用dH20補(bǔ)足體積(700ml)，高壓滅菌。將第II部分加入到第I部分，至終體積為1L。5)lOOOx鹽-將FeS04.7H20，1.6gMnS04'H20，1.4gZnS04'7H20，lgCoCl2'6H20混合，用dH20將體積補(bǔ)足到1L。將溶液過濾并滅菌。用灰腐質(zhì)霉高溫變種葡糖淀粉酶基因轉(zhuǎn)化的里氏木霉的發(fā)酵——[199]一般地，遵照如Foreman等人所描述的發(fā)酵方案(Foreman等人(2003)J說W.CAem278:31988-31997)。更具體地，對(duì)每一菌株進(jìn)行雙份發(fā)酵。用1.5ml冷凍的孢子懸液接種含有5%葡萄糖的0.8L的Vogels基本培養(yǎng)基(Davis等人(1997)MethodsinEnzymology17A，第79-143頁；禾卩Davis,Rowland,NEUROSPORA,CONTRIBUTIONSOFAMODELORAGNISM,OxfordUniversityPress,(2000))。48小時(shí)后，將每一培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到14LBk)lafitte發(fā)酵罐中的6.2L的相同培養(yǎng)基中。發(fā)酵罐在25'C、750RPM和每分鐘8個(gè)標(biāo)準(zhǔn)升的空氣流中運(yùn)行。在初始葡萄糖消耗完畢后1小時(shí)，開始進(jìn)行25y。(w/w)的乳糖供給，以碳限制方式供給，以防止乳糖累積。用葡萄糖氧化酶測(cè)定試劑盒或者葡萄糖己糖激酶測(cè)定試劑盒(InstrumentationLaboratoryCo.,Lexington,MA)分別監(jiān)控葡萄糖和乳糖的濃度，其中p-半乳糖苷酶被加入以裂解乳糖。以規(guī)律的時(shí)間間隔獲得樣品，以便監(jiān)控發(fā)酵進(jìn)程。收集的樣品用InternalEquipmentCompany(NeedhamHeights,MA)的臨床離心機(jī)在50ml離心管中以3/4速率旋轉(zhuǎn)離心。[200]樣品上清液在4-12%的BIS-TRISSDS-PAGE凝膠上跑膠，在還原條件下采用MOPS(嗎啉代丙烷磺酸)SDS跑膠緩沖液和LDS樣品緩沖液進(jìn)行。在不同的時(shí)間階段，觀察68kDrGSHE條帶(數(shù)據(jù)未顯示)。轉(zhuǎn)化的里氏木霉克隆的GSHE活性分析——[201]酶活性——測(cè)定GSHE活性，即在0.1M醋酸鹽緩沖液，pH4.5中，50°C，將5ml的10%粒狀玉米淀粉與等份的酶制備物溫育期間，每分鐘(min)釋放的還原糖(測(cè)為葡萄糖等價(jià)物)的毫克(mg)數(shù)。[202]來自灰腐質(zhì)霉高溫變種的天然GSHE(nGSHE)和從里氏木霉產(chǎn)生的重組灰腐質(zhì)霉高溫變種rGSHE，是通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化的，其中采用使用了苯基-瓊脂糖的疏水相互作用色譜(AmershamBiosciences,Piscataway，NJ)，隨后采用使用了SP-瓊脂糖的離子交換色譜(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)。由里氏木霉克隆最初表達(dá)的重組GSHE包括兩個(gè)蛋白峰組分，以大約相等的濃度存在。這些峰被標(biāo)記為rGSHEl和rGSHE2。這兩個(gè)峰值在質(zhì)量上相差1500D,且相差0.3個(gè)pH單位，正如通過基質(zhì)輔助激光解吸附和電離方法(MALDI-TOF)測(cè)量的，這是在voyageur質(zhì)譜儀(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)和等電聚焦凝膠(SERVAElectrophoresis,GmbH,Heidelberg,Germany)上根據(jù)制造商的指導(dǎo)進(jìn)行的。rGSHEl和rGSHE2具有相同的比活性，如通過生淀粉水解分析和蛋白質(zhì)測(cè)定測(cè)量的，所述測(cè)定使用了MicroBCA蛋白分析試劑盒(Pierce,Rockland,IL)和百分溶液消光系數(shù)(A2800.1%=1.%3)。在一段時(shí)間后，在初始的rGSHE表達(dá)后的大約72小時(shí)時(shí)進(jìn)行測(cè)量，只有一種形式的rGSHE被呈現(xiàn)(rGSHE3)。參考表l。表1GSHE的來源比活性GSHE單位/mg%總碳水化合物(totalcarbohydrate)天然GSHE9.01.12rGSHEl/rGSHE28.0/8.02.70rGSHE38.00.57[203]GSHEs的％碳水化合物(CHO)是通過使用4N三氟乙酸在IO(TC酸水解5小時(shí)來確定的，使用對(duì)羥苯甲酸酰肼，依據(jù)釋放的還原糖進(jìn)行測(cè)量。當(dāng)最初被表達(dá)時(shí)，rGSHEl和rGSHE2的糖基化是總碳水化合物的2.70%。然而，在72小時(shí)后，在培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的rGSHE3的糖基化水平是0.57%總CHO。天然GSHE的糖基化水平是1.12%。根據(jù)本實(shí)施例獲得的rGSHE被用作下面實(shí)施例中的重組GSHE的來源，并稱為rH-GSHE。[205]泡盛曲霉河內(nèi)變種GSHE在里氏木霉中表達(dá)——[206]編碼圖6中描述的成熟氨基酸序列的泡盛曲霉河內(nèi)變種GSHE基因被克隆和轉(zhuǎn)化，按照與上述相同的方式轉(zhuǎn)化入里氏木霉。[207]簡言之，根據(jù)上面描述的方法從泡盛曲霉河內(nèi)變種菌株的冷凍菌絲體提取基因組DNA。依據(jù)泡盛曲霉河內(nèi)變種葡糖淀粉酶(GAI)的公開序列，設(shè)計(jì)引物序列(Hayashida等(1989)Agric.Biol.Chem.53:923-929)。使用下面的引物[208]RSH10f引物的序列為CACCATGTCGTTCCGATCTCTTCTC(SEQIDNO.10)[209]其包括Gateway(Invitrogen)定向克隆基序CACC，RSHUr引物的序列為CTACCGCCAGGTGTCGGTCAC(SEQIDNO.11)。[210]DNA序列提供在圖5(SEQIDNO:5)中。按照上述方法構(gòu)建載體和轉(zhuǎn)化里氏木霉。通過SequetechCorp.(MountainView,CA)對(duì)A-GSHE插入片段進(jìn)行測(cè)序。按照上面針對(duì)rH-GSHE表達(dá)的描述，測(cè)定rA-GSHE的表達(dá)。測(cè)得表達(dá)水平為大于2g/L。實(shí)施例2[211]利用a淀粉酶對(duì)顆粒稻米淀粉的溶解[212]在1000ml不銹鋼容器中，將350gdH2O加入到150g白稻米粉中，以制備30y。ds稻米粉漿。攪拌漿體，用6NH2S04將pH調(diào)整到5.5。將不銹鋼攪拌器放入容器中，并將玻璃蓋放在頂部。在將酶加入到容器之前，將容器放在70'C水浴中15分鐘。比較嗜熱脂肪芽孢桿菌的a淀粉酶(G-zymeG997，來自GenencorInternational,Inc)和地衣芽孢桿菌的a淀粉酶(SPEZYMEFRED，來自GenencorInternational,Inc)溶解顆粒稻米淀粉的能力，它們以0.8kg/MT(w/wdss)的劑量加入。加入酶之后，于70'C在攪拌下溫育懸液2小時(shí)，然后6(TC溫育48小時(shí)。用塑料移液管，在預(yù)先確定的時(shí)間間隔，從每一容器取2ml樣品，并轉(zhuǎn)移到離心管中。樣品在8000rpm離心3分鐘。從離心管取出上清液，將幾滴置于LeciaAR200數(shù)字手持折射計(jì)(digitalhandheldrefractometer)的樣品孔中。記錄Brix值，計(jì)算相對(duì)溶解度(RS)。結(jié)果如表2所示，這表明，嗜熱脂肪芽孢桿菌的a淀粉酶(G-zymeG997)在溶解顆粒稻米淀粉方面比地衣芽孢桿菌的a淀粉酶(SPEZYMEFRED)更為有效。表2[213]在pH5.5，6(TC，a淀粉酶對(duì)顆粒稻米淀粉溶解的影響酶相對(duì)溶解度(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>實(shí)施例3[214]G-zymeG997濃度對(duì)顆粒稻米淀粉溶解的影響[215]在1000ml不銹鋼容器中，將蒸餾水(350g)加入到150g白稻米粉中，以制備30Wds稻米粉懸浮液。攪拌懸浮液，用6NH2S04將pH調(diào)整到5.5。將不銹鋼攪拌器放入容器中，并將玻璃蓋放在頂部。將含有懸浮液的不銹鋼容器置于6(TC水浴中15分鐘，之后加入a淀粉酶。制備三個(gè)容器的上述懸浮液。以0.1、0.25和0.5kg/MT稻米粉(ds)的劑量，將G-zymeG997加入到每一容器中。加入酶之后，伴隨著攪拌，在6(TC溫育懸浮液24小時(shí)。用塑料移液管，在預(yù)先確定的時(shí)間間隔，從每一容器取2ml樣品，并轉(zhuǎn)移到離心管中。樣品在8000rpm離心3分鐘。然后從離心管小心取出幾滴上清液，并測(cè)量Brix。記錄Brix值，計(jì)算相對(duì)溶解度(RS)。結(jié)果如表3所示，表明，當(dāng)G-zymeG997的劑量增加到0.25kg/MT稻米粉(ds)以上時(shí)，顆粒稻米淀粉的相對(duì)溶解度沒有明顯的差異。表3[216]在pH5.5和6CTC，G-ZymeG997濃度對(duì)顆粒稻米淀粉溶解的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>[217]實(shí)施例4一一rH-GSHE濃度對(duì)顆粒稻米淀粉溶解的影響[218]以在30。/。含水漿體中的每克稻米粉不同濃度的GSHEU，將上面實(shí)施例1中描述的顆粒淀粉水解酶(rH-GSHE)加入，將pH調(diào)整到pH5.5。漿體在6(TC溫育，在不同的時(shí)間點(diǎn)取樣品。將樣品按上述方法離心，清澈的上清液用于測(cè)定Brix。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>實(shí)施例5在0.1kg/MT稻米粉(ds)和G-zymeG997存在下，rH-GSHE對(duì)顆粒稻米淀粉溶解的影響[220]在1000ml不銹鋼容器中，將蒸餾水(350g)加入到150g白稻米粉中，以制備30%ds稻米粉懸浮液。攪拌懸浮液，用6NH2SCU將pH調(diào)整到5.5。將不銹鋼攪拌器放入容器中，并將玻璃蓋放在容器頂部。將含有懸浮液的不銹鋼容器置于60°C水浴中15分鐘，之后加入酶。[221]按照上述方法，制備兩個(gè)容器的懸浮液。以O(shè).lkg/MT稻米粉(ds)的劑量，將G-zymeG997加入到每一容器中；以0和1.0GSHE單位/g稻米粉ds的劑量，加入rH-GSHE。加入酶之后，伴隨著攪拌，在6(TC溫育懸浮液24小時(shí)。用塑料移液管，在預(yù)先確定的時(shí)間間隔，從每一容器取2ml樣品，并轉(zhuǎn)移到離心管中。帶有樣品的管在8000rpm離心3分鐘。從離心管小心地取出幾滴上清液，并測(cè)量Brix。記錄Brix值，計(jì)算相對(duì)溶解度(RS)。將另外0.5ml上清液轉(zhuǎn)移到配備有螺帽的試管中。給試管戴上螺帽，并置于沸水浴中15分鐘，以使得酶失活。用蒸餾水稀釋上清液，以便Brix約為3。充分混合每一管，將2ml的內(nèi)容物通過0.45pm過濾器進(jìn)行過濾，收集到自動(dòng)進(jìn)樣瓶(autosamplervial)中。使用HPLC分析上清液中的糖分布型。[222]結(jié)果如表5和6所示，表明在0.1kg/MTdssG-ZymeG997存在下，僅僅24小時(shí)之后，rH-GSHE顯著增加顆粒稻米淀粉的溶解至90%以上。也參考圖7，比較單獨(dú)的G-ZymeG997、單獨(dú)的rH-GSHE、rH-GSHE和G-Zyme-G997組合隨時(shí)間推移的％溶解淀粉。觀察到，使用rH-GSHE和G-Zyme-G997組合時(shí)，20小時(shí)之后，超過90%的顆粒淀粉被溶解，與之相比，當(dāng)G-ZymeG997單獨(dú)使用時(shí)，約50%溶解，當(dāng)rH-GSHE單獨(dú)使用時(shí)，約28%溶解。此外，僅僅在24小時(shí)之后，rH-GSHE和G-ZymeG997便能夠產(chǎn)生具有96。/。以上的葡萄糖的糖漿。然而，單獨(dú)的G-ZymeG997既不能溶解超過90%的顆粒稻米淀粉，也不能產(chǎn)生高葡萄糖糖漿。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>表6<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>實(shí)施例6在rH-GSHE和G-zymeG997存在下，pH對(duì)顆粒稻米淀粉溶解的影響[223]在1000ml不銹鋼容器中，將蒸餾水(350g)加入到150g白稻米粉(Elephantbrand,ThaiBetterFoods,Co.Ltd.,Bangpong,Thailand)中，以制備30%ds稻米粉懸浮液。制備四個(gè)容器的上述這樣的懸浮液。用6NH2S04和/或lNNaOH，將pH調(diào)整到pH4.5、5.0、5.5和6.0。將不銹鋼攪拌器放入到每一容器中，并將玻璃蓋放在每一容器頂部作為蓋子。將不銹鋼容器置于6(TC水浴中15分鐘，之后加入酶。[224]以0.5GSHE單位/g稻米粉的劑量，將rH-GSHE加入到每一容器中；以0.1kg/MT稻米粉的劑量比，加入G-zymeG997。加入酶之后，伴隨著攪拌，在60°C溫育懸浮液24小時(shí)。用塑料移液管，在預(yù)先確定的時(shí)間間隔，從每一容器取2ml樣品，并然后轉(zhuǎn)移到離心管中。將樣品在8000rpm離心3分鐘。從離心管小心地取出幾滴上清液，并測(cè)量Brix。記錄Brix值，計(jì)算相對(duì)溶解度(RS)，如表7所示。結(jié)果顯示，在60'C，pH5.0至6.0之間，顆粒稻米淀粉的溶解沒有明顯的差異，但是在pH4.5，溶解速率明顯較低。表7在0.5GSHE單位/gdsrH-GSHE和0.1kg/MT稻米粉dsG-ZymeG997存在下，在6(TC，pH對(duì)顆粒稻米淀粉溶解的影響。<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>實(shí)施例7在rH-GSHE和G-zymeG997存在下，在pH5.5,溫度對(duì)顆粒稻米淀粉溶解的影響[225]在IOOOml不銹鋼容器中，將蒸餾水(350g)加入到150g白稻米粉(El印hantbrand,ThaiBetterFoods,Co.Ltd.,Bangpong,Thailand)中，以制備30%ds稻米粉懸浮液。攪拌懸浮液，并用6NH2S04將pH調(diào)整到pH5.5。制備四個(gè)容器的上述這樣的懸浮液。將不銹鋼攪拌器放入到每一容器中，并將玻璃蓋放在每一容器頂部作為蓋子。將不銹鋼容器置于55°C、60°C、65'C和7(TC水浴中15分鐘，之后加入酶。[226]以1.0GSHE單位/g稻米粉ds的劑量，將rH-GSHE加入到每一容器中；以0.1kg/MT稻米粉ds的劑量比，加入G-zymeG997。加入酶之后，伴隨著攪拌，溫育懸浮液24小時(shí)。用塑料移液管，在預(yù)先確定的時(shí)間間隔，從每一容器取2ml樣品，并然后轉(zhuǎn)移到離心管中。將樣品在8000rpm離心3分鐘。從離心管小心地取出幾滴上清液，并測(cè)量Brix。記錄Brix值，計(jì)算相對(duì)溶解度，如表8所示。結(jié)果表明，在pH5.5時(shí)，6CTC是最佳溫度。表8在1.0GSHE單位/gdsrH-GSHE和0.1kg/MT稻米粉dsG-ZymeG997存在下，在pH5.5，溫度對(duì)顆粒稻米淀粉溶解的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>實(shí)施例8在pH5.5和60°C，在0.1kgGZymeG997/MT稻米粉ds存在下，rH-GSHE濃度對(duì)顆粒稻米淀粉溶解的影響[227]在1000ml不銹鋼容器中，將蒸餾水(350g)加入到150g白稻米粉(Elephantbrand,ThaiBetterFoods,Co.Ltd"Bangpong,Thailand)中，以制備30%ds稻米粉懸浮液。攪拌懸浮液，并用6NH2S04，將pH調(diào)整到pH5.5。將不銹鋼攪拌器放入到容器中，并將玻璃蓋放在容器頂部作為蓋子。以這樣的方式，制備六個(gè)容器，并置于6(TC水浴中15分鐘，之后加入酶。[228]以0.1kg/MT稻米粉,ds的劑量率，將G-zymeG997加入到每一容器中；以0、0.5、1.0、1.5、2.0或3.0GSHE單位/g稻米粉ds的劑量，加入rH-GSHE。加入酶之后，伴隨著攪拌，在60'C溫育懸浮液24小時(shí)。用塑料移液管，在預(yù)先確定的時(shí)間間隔，從每一容器取2ml樣品，然后轉(zhuǎn)移到離心管中。將樣品在8000rpm離心3分鐘。從離心管小心地取出幾滴上清液，并測(cè)量Brix。記錄Brbc值，計(jì)算相對(duì)溶解度(RS)，如表9所示。結(jié)果證實(shí)了在60。C的溫度時(shí)稻米淀粉溶解度超過90。/。的工藝，其產(chǎn)生了大于95%的葡萄糖產(chǎn)量。當(dāng)rH-GSHE的劑量增加到1.5GSHE單位/gds以上時(shí)，％RS沒有明顯的差異。用0.1kgGZymeG997MT/稻米粉,ds和1.5GSHE單位的H-GSHE/g稻米粉,ds，可以獲得超過90%的顆粒稻米淀粉水解。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>實(shí)施例9在pH5.5和60°C，在0.5GSHE單位/g稻米粉,ds存在下，G-ZymeG997濃度對(duì)顆粒稻米淀粉溶解的影響[229]在1000ml不銹鋼容器中，將蒸餾水(350g)加入到150g白稻米粉(Elephantbrand,ThaiBetterFoods,Co.Ltd.,Bangpong,Thailand)中，以制備30%ds稻米粉懸浮液。攪拌懸浮液，并用6NH2S04，將pH調(diào)整到pH5.5。將不銹鋼攪拌器放入到容器中，并將玻璃蓋放在容器頂部作為蓋子。以這樣的方式，制備四個(gè)容器，并置于6(TC水浴中15分鐘，之后加入酶。[230]以0.5GSHE單位/g稻米粉,ds的劑量率，將rH-GSHE加入到每一容器中；以0.1、0.25、0.5和1.0kg/MT稻米粉ds的劑量，加入變化數(shù)量的G-zymeG997。加入酶之后，伴隨著攪拌，在6(TC溫育懸浮液24小時(shí)。用塑料移液管，在預(yù)先確定的時(shí)間間隔，從每一容器取2ml樣品，然后轉(zhuǎn)移到離心管中。將樣品在8000rpm離心3分鐘。從離心管小心地取出幾滴上清液，并測(cè)量Brix。記錄Brix值，計(jì)算相對(duì)溶解度(RS),如表10所示。[231]結(jié)果表明，在0.5H-GSHE存在下，增加G-ZymeG997的劑量，對(duì)顆粒稻米淀粉的RS具有正效應(yīng)，用0.5G-ZymeG997MT/稻米粉,ds，可以獲得顆粒稻米淀粉超過90。/。的RS。表10<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>實(shí)施例10在用G-ZymeG997和不同濃度的rH-GSHE溫育期間，稻米粉濃度對(duì)顆粒稻米淀粉溶解和水解的影響[232]在不同的瓶中，制備稻米粉漿體，分別含有a)105g，于395gDH20中；b)142.5g，于357.5gDH20中；禾Pc)178.5g，于321.5gDH20中。使用6NH2S04，將漿的pH調(diào)整到pH5.5。以0.2kg/MT稻米粉，加入G-ZymeG997。向每一瓶，加入不同濃度的rH-GSHE。將瓶保持在維持于6(TC的水浴中，在溫育期間持續(xù)攪拌混合物，以獲得均勻混合。在不同的時(shí)間間隔，取出樣品，離心，并用于測(cè)量Brix，如上所述。將樣品進(jìn)行HPLC分析。結(jié)果示出于表ll中，表明，在高達(dá)25%的濃度，將稻米粉漿與a淀粉酶和H-GSHE溫育，導(dǎo)致顆粒稻米淀粉完全溶解，并產(chǎn)生大于96%葡萄糖產(chǎn)量的葡萄糖。表11<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>R^稻米粉；IT^溫育時(shí)間；^=溶解的淀粉實(shí)施例ll一稻米蛋白濃縮物和高純度稻米蛋白濃縮物的蛋白質(zhì)含量的評(píng)價(jià)[233]在IOOOml不銹鋼容器中，將蒸餾水(700g)加入到300g白稻米粉(Elephantbrand,ThaiBetterFoods,Co.Ltd"Bangpong，Thailand)中，以制備30%ds稻米粉漿。用6NH2S04，將漿的pH調(diào)整到pH5.5。將漿體置于60'C的水浴中，持續(xù)攪拌，以獲得均勻混合，之后加入酶。rH-GSHE以1.0GSHE單位/g稻米粉，ds的劑量率加入，G-ZymeG997以0.1kg/MT稻米粉ds的劑量加入。加入酶之后，伴隨著攪拌，將懸浮液在6(TC溫育24小時(shí)(直到99%以上的顆粒稻米被溶解)。[234]在稻米蛋白質(zhì)溶解度最低時(shí)的pH(pH3.0-5.5)溶解稻米淀粉，有助于不溶性稻米蛋白與溶解的稻米淀粉分離。在稻米淀粉的水解完成之后，使用Buchner漏斗，將溫育的漿體在WhatmanNo.1濾紙上過濾，獲得濕餅。將小部分的濕餅用dH20洗滌若干次，并在6(TC干燥(一次處理)。剩余的濕餅在300gdH2O中再次制成漿，并在60。C用G-ZymeG997(0.1kg/MT稻米粉)和rH-GSHE(1.0GSHE單位/g稻米粉)再溫育12小時(shí)。在6(TC，使用6NH2S04將漿的pH調(diào)整到pH3.5，以終止酶反應(yīng)。使用Buchner漏斗，用Whatman濾紙過濾，分離不溶性的稻米蛋白。餅用dH20洗滌，以除去任何溶解的淀粉。在6(TC干燥稻米蛋白濃縮物，直到水分含量降到小于5.0%(雙次處理)。[235]測(cè)定稻米蛋白質(zhì)的近似組成，并在表12中給出。如下獲得來自高溫噴射蒸煮工藝的蛋白質(zhì)濃縮物將SPEZYMEFRED(GenencorInternationalInc.)(0.1kg/MT稻米粉)加入到30。/o的稻米底物含水漿體中，pH5.5。使?jié){體通過維持在105。C的噴射蒸煮器(保持8min),然后迅速轉(zhuǎn)移(flash)到大氣壓。在95。C，再繼續(xù)液化90min。液化淀粉的pH調(diào)整到pH4.2,溫度降到60"。以0.4kg/MT稻米底物加入OPTIMAX4060VHP(葡糖淀粉酶和支鏈淀粉酶的混合物，獲自GenencorInternationalInc.),并溫育48小時(shí)，至少洗滌2次。按照所述方法，通過離心分離溶解物，以獲得包括不溶性蛋白質(zhì)殘留物的餅。將蛋白質(zhì)殘留物用dH20洗滌，并在6(TC干燥。[236]結(jié)果證明，本發(fā)明的方法通過水解顆粒稻米淀粉從稻米底物分離得到高純度稻米蛋白濃縮物。表12通過水解顆粒稻米淀粉獲得的稻米蛋白質(zhì)的組成<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>高純度蛋白質(zhì)濃縮物70.03.9(雙次處理)實(shí)施例12稻米蛋白濃縮物的水溶性評(píng)價(jià)[237]根據(jù)上面實(shí)施例11獲得稻米蛋白濃縮物。此外，按照在實(shí)施例11給出的描述，在傳統(tǒng)的高溫中，制備蛋白質(zhì)組分。獲得蛋白質(zhì)濃縮物和蛋白質(zhì)組分的懸浮液，適當(dāng)?shù)脑挘肗aOH或H2S04調(diào)整pH，以獲得2.0、4.0、6.0、8.0和10.0的pH水平。在室溫下持續(xù)攪拌懸浮液，每隔15分鐘，將樣品調(diào)整到它們各自的起始pH。按照上面的描述，通過離心分離溶解的蛋白質(zhì)，清澈的溶液被用于測(cè)定總氮(N)。按照Nx5.95計(jì)算蛋白質(zhì)含量(％P)。表13<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>實(shí)施例13-蛋白酶處理對(duì)稻米蛋白濃縮物溶解和水解的影響[238]在典型的研究中，在50'C和pH2.0，將根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的2.0%稻米蛋白濃縮物和根據(jù)上述傳統(tǒng)方法獲得的2.0%稻米蛋白質(zhì)組分，與酸性真菌蛋白酶(單位/g蛋白質(zhì))溫育。在溫育期間，樣品的pH每隔15分鐘進(jìn)行一次調(diào)整。在60min、120min、240min、360min和720min取出樣品，加入等體積的10。/。三氯醋酸(TCA)溶液，以沉淀未水解的蛋白質(zhì)。樣品在5'C冷卻，然后過濾。分析清澈的濾液，以獲得總氮(數(shù)據(jù)未顯示)。[239]在進(jìn)一步的研究中，在55。C和pH7.0，將根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的2.0%稻米蛋白懸浮液和根據(jù)上述傳統(tǒng)方法獲得的2.0%稻米蛋白質(zhì)組分，與ProteinaseT和PROTEX6L(Genencor)溫育，以模擬人低位消化系統(tǒng)。在溫育期間，樣品的pH每15分鐘進(jìn)行一次調(diào)整。在不同的時(shí)間間隔取樣品，通過加入10MTCA沉淀未水解的蛋白質(zhì)。樣品在5t:冷卻，然后過濾。分析清澈的濾液，以獲得總氮(數(shù)據(jù)未顯示)。實(shí)施例14一高純度稻米蛋白濃縮物的氨基酸組成將如上面實(shí)施例11中描述的高純度稻米蛋白濃縮物(雙次處理)的氨基酸組成(％)與按照實(shí)施例11中描述的高溫傳統(tǒng)工藝獲得的蛋白質(zhì)組分的氨基酸組成進(jìn)行比較，參見表14。將高純度蛋白質(zhì)濃縮物和蛋白質(zhì)組分的氨基酸組成與酪蛋白的氨基酸組成(。/。)進(jìn)行比較。酪蛋白的數(shù)值從Shih等，(2000)WOCS77:885-889和Morita等(1993)J:Fooc/5W.58:1393-1396獲得。表14<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>LT=低溫，雙次處理，如實(shí)施例ll所述。HT=高溫，傳統(tǒng)處理，如實(shí)施例11所述。權(quán)利要求1.由稻米底物生產(chǎn)稻米蛋白濃縮物的方法，包括a)在72'C或低于72'C的溫度，在約3.0至6.5的pH中，用i)具有顆粒淀粉水解(GSH)活性的酶和ii)第二淀粉水解酶酶促水解稻米底物足夠的時(shí)間，水解所述稻米底物中的淀粉的實(shí)質(zhì)部分，以獲得溶解的淀粉組分和包括不溶性蛋白的殘留物組分；和b)將所述溶解的淀粉組分與所述殘留物分離，獲得稻米蛋白濃縮物。2.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述具有GSH活性的酶是葡糖淀粉酶。3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述葡糖淀粉酶源自腐質(zhì)霉屬(i^;m'co/fl)、根霉屬(i/n'zop^)或曲霉屬(v4^erg^iw)的菌株。4.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述第二淀粉水解酶是a-淀粉酶。5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述a淀粉酶源自細(xì)菌來源。6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述具有GSH活性的酶獲自GSH酶在木霉屬菌株或曲霉屬菌株中的異源表達(dá)。7.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，還包括純化所述稻米蛋白濃縮物的步驟。8.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，還包括干燥所述稻米蛋白濃縮物的步驟。9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述稻米蛋白濃縮物的蛋白質(zhì)含量為至少約20%。10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述稻米底物被制成漿，并具有在10%至55%之間的干固體含量。11.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中溫度在7(TC至55t:之間。12.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，還包括步驟c):在約3.0至6.5的pH，70。C至55匸范圍內(nèi)的溫度，用具有GSH活性的酶和淀粉水解酵酶促水解步驟b)中獲得的稻米蛋白濃縮物，以獲得包括溶解的淀粉和不溶性的稻米蛋白的組分，和步驟d):分離所述組分，以獲得高純度的稻米蛋白濃縮物。13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，還包括干燥步驟d)中獲得的所述高純度的稻米蛋白濃縮物。14.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中步驟c)的淀粉水解酶是a淀粉酶。15.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述高純度的稻米蛋白濃縮物的蛋白質(zhì)含量為至少約60%。16.稻米蛋白濃縮物，其根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求12的方法獲得。17.動(dòng)物飼料制品，包括根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求12的方法獲得的稻米蛋白濃縮物。18.人用食物制品，包括根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求12的方法獲得的稻米蛋白濃縮物。19.增加動(dòng)物飼料中的蛋白質(zhì)含量的方法，包括a)在低于72'C的溫度，將稻米底物與包括淀粉水解酶和顆粒淀粉水解(GSH)酶的酶組合接觸足夠的時(shí)間，以水解所述稻米底物中60%的淀粉，b)獲得溶解的淀粉組分和殘余物，所述殘余物包括可溶性蛋白質(zhì)，c)分離所述殘余物以獲得稻米蛋白濃縮物，和d)將所述稻米蛋白濃縮物添加入動(dòng)物詞料中。20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述淀粉水解酶是a淀粉酶。21.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，還包括步驟將在步驟d)中獲得的所述殘余物與GSH酶以及可選的淀粉水解酶接觸，以獲得包括溶解的淀粉的組分和包括不溶性稻米蛋白質(zhì)的殘余物，分離所述殘余物以獲得高純度稻米蛋白濃縮物，將所述高純度稻米蛋白濃縮物加入到動(dòng)物詞料中。22.動(dòng)物飼料，包括根據(jù)權(quán)利要求21的方法獲得的高純度稻米蛋白濃縮物。全文摘要本發(fā)明涉及從稻米底物產(chǎn)生稻米蛋白濃縮物的方法，該方法包括在72℃或低于72℃的溫度和約3.0至6.5的pH，用具有顆粒淀粉水解(GSH)活性的酶和第二淀粉水解酶來酶促水解稻米底物，以獲得溶解的淀粉組分和包括不溶性蛋白的殘留物組分，和將溶解的淀粉組分與殘余物分離，以獲得稻米蛋白濃縮物。該稻米蛋白濃縮物可以用于動(dòng)物飼料和人類食物制品。文檔編號(hào)A23L1/10GK101123883SQ200580005644公開日2008年2月13日申請(qǐng)日期2005年2月17日優(yōu)先權(quán)日2004年2月23日發(fā)明者A·宋,G·段,J·K·謝提,N·鄧恩-科爾曼,Y·錢申請(qǐng)人:金克克國際有限公司