專利名稱：產(chǎn)乳酸途徑缺失的工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及產(chǎn)乳酸途徑缺失的工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，特別是涉及產(chǎn)乳酸途徑缺失的工程菌及其構(gòu)建方法與其在生產(chǎn)1，3-丙二醇和/或2，3-丁二醇中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1，3-丙二醇是一種重要的化工原料，可作為有機(jī)溶劑制備油墨、印染、涂料、藥物、潤(rùn)滑劑、抗凍劑等，其最主要的用途是作為聚酯和聚氨酯類以及環(huán)狀化合物的生產(chǎn)中具有潛在應(yīng)用價(jià)值的單體。已知有多種化學(xué)方法能夠生產(chǎn)1，3-丙二醇，例如，用環(huán)氧乙烷為原料經(jīng)催化加氫再?；姆椒梢院铣沙?，3-丙二醇；用丙烯醛水合得到3-羥基丙醛，3-羥基丙醛經(jīng)催化加氫可生成1，3-丙二醇。雖然這些方法目前已用于工業(yè)生產(chǎn)，但這些方法需要高溫、高壓和復(fù)雜的貴重金屬催化劑才能實(shí)現(xiàn)，不僅投資大，分離提純困難，還會(huì)造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。
2，3-丁二醇可作為燃料，也可作為有機(jī)溶劑或化工原料用于合成其它化學(xué)品，例如香料物質(zhì)二乙酰和應(yīng)用相當(dāng)廣泛的化工原料甲乙酮。由于2，3-丁二醇結(jié)構(gòu)特殊，化學(xué)法合成2，3-丁二醇成本很高，一直沒(méi)有實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，因而其用途也沒(méi)有得到充分開(kāi)發(fā)，但由于具有良好的應(yīng)用前景，目前國(guó)際上對(duì)2，3-丁二醇的需求日益增高。盡管發(fā)酵法生產(chǎn)2，3-丁二醇水平相對(duì)較高，但也沒(méi)有實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。
早在1881年，F(xiàn)reund就發(fā)現(xiàn)巴斯德梭菌能發(fā)酵甘油產(chǎn)生1，3-丙二醇。至今所發(fā)現(xiàn)的1，3-丙二醇生產(chǎn)者均為細(xì)菌，主要有腸道細(xì)菌中的肺炎克雷伯氏菌、弗氏檸檬酸桿菌及成團(tuán)腸桿菌，梭菌屬的丁酸梭菌和巴斯德梭菌及乳桿菌屬的短乳桿菌和布氏乳桿菌，它們只能利用甘油(而不能利用糖類等廉價(jià)碳源)產(chǎn)生1，3-丙二醇。在產(chǎn)生1，3-丙二醇的過(guò)程中，甘油發(fā)生岐化反應(yīng)，氧化途徑中的產(chǎn)物與糖類發(fā)酵產(chǎn)物一致，并產(chǎn)生供細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的ATP，在某些產(chǎn)物形成的同時(shí)釋放還原力NADH2；還原途徑則消耗氧化途徑中多余的還原力，生成1，3-丙二醇。氧化途徑中生成丙酮酸的反應(yīng)在各菌中是相同的，丙酮酸的去向則因微生物種類而異。在腸道細(xì)菌中，丙酮酸被丙酮酸甲酸裂解酶催化分解為乙酰CoA和甲酸，甲酸往往又會(huì)分解為CO2和H2；乙酰CoA在經(jīng)乙酰磷酸形成乙酸的過(guò)程中生成過(guò)量的ATP，而在經(jīng)乙醛形成乙醇的反應(yīng)中要消耗2摩爾還原力；丙酮酸也可能轉(zhuǎn)化為2，3-丁二醇；此外，腸道細(xì)菌發(fā)酵甘油的產(chǎn)物中還有乳酸和琥珀酸，生成乳酸的過(guò)程要消耗1個(gè)還原力，而生成琥珀酸的過(guò)程要消耗2個(gè)還原力。在丁酸梭菌中，有兩個(gè)典型的氧化產(chǎn)物乙酸和丁酸。丁酸在由兩分子乙酰CoA氧化2個(gè)NADH2后的一連串反應(yīng)中生成，并伴隨著ATP的產(chǎn)生。在巴斯德梭菌中丁醇是主要的氧化產(chǎn)物，生成丁醇的過(guò)程要消耗4個(gè)還原力，另外，也有少量的乙醇產(chǎn)生。還原途徑包括兩步反應(yīng)第一步，由依賴于輔酶B12的甘油脫水酶催化甘油脫水生成3-羥基丙醛；第二步，由1，3-丙二醇氧化還原酶催化3-羥基丙醛還原生成1，3-丙二醇，此過(guò)程消耗一分子還原力。
能夠產(chǎn)生2，3-丁二醇的菌種主要有克雷伯氏菌屬、芽孢桿菌屬、氣單胞菌屬和沙雷氏菌屬。肺炎克雷伯氏菌多粘芽孢桿菌是最具工業(yè)化潛力的。它們可以利用糖類經(jīng)丙酮酸、α-乙酰乳酸、3-羥基丁酮并最終轉(zhuǎn)化為2，3-丁二醇，此過(guò)程消耗一分子還原力。
在細(xì)菌發(fā)酵甘油產(chǎn)生1，3-丙二醇的過(guò)程中，細(xì)胞的生長(zhǎng)受到底物甘油和多種產(chǎn)物的抑制作用。在肺炎克氏桿菌中，副產(chǎn)物乳酸最多。野生型肺炎克氏桿菌發(fā)酵甘油產(chǎn)生1，3-丙二醇的過(guò)程中乳酸產(chǎn)量可達(dá)40g/L以上，如此大量乳酸的生成不但對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)不利，還會(huì)造成底物甘油的浪費(fèi)。由于產(chǎn)生乳酸的途徑會(huì)爭(zhēng)奪還原力，乳酸的產(chǎn)生必然導(dǎo)致1，3-丙二醇產(chǎn)量降低。作為肺炎克氏桿菌發(fā)酵甘油產(chǎn)生1，3-丙二醇的副產(chǎn)物，2，3-丁二醇對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和1，3-丙二醇產(chǎn)生的副作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于其它副產(chǎn)物，而其價(jià)值卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他副產(chǎn)物，因此減少其它副產(chǎn)物產(chǎn)量，使2，3-丁二醇成為氧化途徑的主要產(chǎn)物是非常合理有效的途徑。
為了提高甘油的轉(zhuǎn)化率及1，3-丙二醇和2，3-丁二醇的產(chǎn)量，有人采取菌種篩選、菌種化學(xué)誘變、優(yōu)化培養(yǎng)基和發(fā)酵條件等方法，這些方法雖然對(duì)甘油轉(zhuǎn)化率及1，3-丙二醇和2，3-丁二醇產(chǎn)量有所提高，但無(wú)法從根本上解決多種副產(chǎn)物積累對(duì)細(xì)胞的毒害作用對(duì)1，3-丙二醇和2，3-丁二醇生產(chǎn)所帶來(lái)的巨大負(fù)面影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供產(chǎn)乳酸途徑缺失的工程菌。
本發(fā)明所提供的產(chǎn)乳酸途徑缺失的工程菌，是通過(guò)同源重組的方法將產(chǎn)1，3-丙二醇和/或2，3-丁二醇的野生型菌株中的乳酸脫氫酶基因(ldhA)沉默后獲得的工程菌。
所述可用于生產(chǎn)1，3-丙二醇和/或2，3-丁二醇的野生型菌株包括克雷伯氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、腸桿菌屬和沙雷氏等菌屬的菌株。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種上述產(chǎn)乳酸途徑缺失的工程菌的構(gòu)建方法。
本發(fā)明所提供的構(gòu)建方法，包括以下步驟1)PCR擴(kuò)增乳酸脫氫酶基因的部分同源序列；2)將步驟1擴(kuò)增的乳酸脫氫酶基因的部分同源序列導(dǎo)入到雙親本雜交供體菌株中；3)將步驟2)獲得的攜帶有乳酸脫氫酶基因的部分同源序列的重組菌與產(chǎn)1，3-丙二醇和/或2，3-丁二醇的野生型菌株進(jìn)行雙親本雜交，經(jīng)抗性篩選后得到產(chǎn)乳酸途徑缺失的工程菌。
根據(jù)同源重組的原理，所述步驟1)擴(kuò)增的乳酸脫氫酶基因的部分同源序列是該基因的哪一部分序列并不重要，只要是其同源的序列即可，如以產(chǎn)1，3-丙二醇和/或2，3-丁二醇的野生型菌株的基因組DNA為模板，經(jīng)由序列表中SEQ ID №1和SEQ ID№2或是由序列表中SEQ ID №3和SEQ ID №4組成的引物對(duì)PCR擴(kuò)增的序列。
所述步驟2)中乳酸脫氫酶基因的部分同源序列可通過(guò)含有所述乳酸脫氫酶基因的部分同源序列的自殺載體導(dǎo)入到用于雙親本雜交的供體菌株中，所述自殺載體可為pGPCm(趙德華、李季倫.肺炎克氏桿菌固氮酶雙突變株的構(gòu)建及其對(duì)底物還原的特性.科學(xué)通報(bào)，2004，49(15)1512-1518)、pGP704(Miller VL and Mekalanos JJ.Anovel suicide vector and its use in construction of insertion mutationsOsmoregulation of outer membrane proteins and virulence determinants in VibrioCholerae requires toxR.J Bacteriol 1988，170(6)2575-2583.)、pUX19(ZhangYP，et al.Functional Characterization of Three GlnB Homologs in thePhotosynthetic Bacterium Rhodospirillum rubrumRoles in Sensing Ammonium andEnergy Status.J Bacteriol 2001，183(21)6159-6168.)、pSUP202(Simon R，PrieferU，Pühler A(1983)A broad-host range mobilization system for in vivo geneticengineeringtransposon mutagenesis in Gram-negative bacteria.Biotechnology1784-791.)、pJQ200SK(Quadt，J.，and M.F.Hynes.1993.Versatile suicidevectors which allow direct selection for gene replacement in Gram-negativebacteria.Gene 12715-21.)或pPHU281(Hübner，P.，B.Masepohl，W.Klipp，andT.A.Bickle.1993.nif gene expression studies in Rhodobacter capsulatusntrC-independent repression by high ammonium concentrations.Mol.Microbiol.10123-132.)等。
以pGPCm為出發(fā)載體，構(gòu)建的攜帶有乳酸脫氫酶基因部分同源序列的自殺載體為pGP-ldhA或pGP704-ldhAk12。
攜帶有乳酸脫氫酶基因部分同源序列的自殺載體可通過(guò)使用熱激法、電轉(zhuǎn)化法、接合轉(zhuǎn)化法等常規(guī)方法轉(zhuǎn)化宿主菌。
所述步驟2)中用于雙親本雜交的菌株為含有λpir的大腸桿菌菌株，如大腸桿菌SM10(λpir)(Miller VL and Mekalanos JJ.A novel suicide vector and its usein construction of insertion mutationsOsmoregulation of outer membraneproteins and virulence determinants in Vibrio Cholerae requires toxR.JBacteriol 1988，170(6)2575-2583.)、S17-1(λpir)(Simon R，Priefer U，PühlerA(1983)A broad-host range mobilization system for in vivo genetic engineeringtransposon mutagenesis in Gram-negative bacteria.Biotechnology 1784-791.)等。
通過(guò)雙親雜交，使乳酸脫氫酶基因的部分同源序列與產(chǎn)1，3-丙二醇和/或2，3-丁二醇的目的菌株發(fā)生同源重組，從而使產(chǎn)1，3-丙二醇和/或2，3-丁二醇的野生型菌株中的乳酸脫氫酶基因沉默。
所述可用于生產(chǎn)1，3-丙二醇和/或2，3-丁二醇的野生型菌株包括克雷伯氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、腸桿菌屬、埃希氏菌屬、志賀氏菌屬、沙門氏菌屬和沙雷氏等菌屬的菌株。其中，肺炎克氏桿菌產(chǎn)乳酸最多，因此本發(fā)明的方法也適用于其它的產(chǎn)1，3-丙二醇和/或2，3-丁二醇的野生型菌株。
本發(fā)明利用同源重組的方法使產(chǎn)1，3-丙二醇和/或2，3-丁二醇的野生型菌株中的乳酸脫氫酶基因沉默，從而得到產(chǎn)乳酸途徑被阻斷的基因工程菌。用本發(fā)明的工程菌進(jìn)行1，3-丙二醇和/或2，3-丁二醇的發(fā)酵生產(chǎn)，不產(chǎn)生乳酸，使得副產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的毒害作用大大減少；另外，由于副產(chǎn)物種類減少，也簡(jiǎn)化了后提取工藝。實(shí)驗(yàn)證明，將本發(fā)明的工程菌按常規(guī)方法發(fā)酵40小時(shí)，1，3-丙二醇濃度可達(dá)50g/L以上，2，3-丁二醇濃度可達(dá)40g/L以上；發(fā)酵60小時(shí)，1，3-丙二醇濃度可達(dá)80g/L以上，2，3-丁二醇濃度可達(dá)70g/L以上。本發(fā)明將在1，3-丙二醇和2，3-丁二醇的工業(yè)化生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用，具有廣闊的應(yīng)用前景。
以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
說(shuō)明書(shū)附1為載體pGPCm的物理圖譜具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，引物合成工作由上海生工完成，甘油百分比濃度為質(zhì)量百分比濃度，硫酸銨百分比濃度為質(zhì)量百分比濃度。
實(shí)施例1、產(chǎn)乳酸途徑缺失的工程菌的構(gòu)建一、乳酸脫氫酶基因ldhA部分序列的克隆根據(jù)乳酸脫氫酶基因ldhA完整的DNA序列(GenBank號(hào)WUGSC_573)設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增其部分同源序列，引物序列如下primer1(上游引物)5’-ACGGTTGCGAACGGTATGTA-3’(序列表中SEQ ID №1)
primer2(下游引物)5’-AGTGGTCTCCGAAATGCTGA-3’(序列表中SEQ ID №2)以野生型肺炎克氏桿菌基因組DNA為模板，在引物primer1和primer2的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增乳酸脫氫酶基因ldhA的部分序列，PCR擴(kuò)增條件為先94℃5min；然后94℃1min，56℃1min，72℃1min，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃10min。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行0.8％瓊脂糖凝膠電泳，回收并純化約800bp的目的片段，將其克隆入載體pGEM-T easy(TaKaRa公司)中，將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，提質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶EcoR I進(jìn)行酶切鑒定，經(jīng)酶切獲得了805bp的酶切片段，表明獲得了插入序列正確的重組載體，命名為pT-ldhA。
二、乳酸脫氫酶基因ldhA自殺載體pGP-ldhA的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶EcoR I酶切pT-ldhA質(zhì)粒，回收并純化步驟一擴(kuò)增的長(zhǎng)度為805bp的ldhA的部分片段，再將其與經(jīng)EcoR I酶切的載體pGPCm(其物理圖譜如

圖1所示)用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌SM10(λpir)感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，提質(zhì)粒，得到乳酸脫氫酶基因ldhA的自殺載體，命名為pGP-ldhA。
三、肺炎克氏桿菌產(chǎn)乳酸途徑缺失突變株的構(gòu)建將攜帶有載體pGP-ldhA的大腸桿菌SM10(λpir)(供體菌)和野生型肺炎克氏桿菌(受體菌)進(jìn)行雙親本雜交，具體方法為在含有氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)供體和受體菌；供體菌和受體菌按3∶1比例混合于10mM的MgSO4溶液中，過(guò)濾，將濾膜置于LB平板上，37℃培養(yǎng)8-12小時(shí)；用10mM的MgSO4溶液洗下長(zhǎng)在濾膜上的菌苔，梯度稀釋后涂布于氯霉素抗性平板上，37℃培養(yǎng)進(jìn)行篩選。最終得到具有氯霉素(Cm)抗性的重組菌株，即為產(chǎn)乳酸途徑被阻斷的肺炎克氏桿菌突變株。
實(shí)施例2、產(chǎn)乳酸途徑缺失的工程菌的構(gòu)建根據(jù)大腸桿菌K12菌株ldhA基因(GenBank號(hào)U36928)設(shè)計(jì)如下引物primer3(上游引物)5’-CGAGTCCTTTGGCTTTGAGC-3’(序列表中SEQ ID №3)primer4(下游引物)5’-TCAGTGCTTCTGCTGTCAGG-3’(序列表中SEQ ID №4)以大腸桿菌K12菌株基因組DNA為模板，在引物primer3和primer4的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增大腸桿菌K12菌株乳酸脫氫酶基因ldhA的部分序列，PCR擴(kuò)增條件為先94℃5min；然后94℃1min，58℃1min，72℃1min，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃10min。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行0.8％瓊脂糖凝膠電泳，回收得到854bp大小的片段，將此片段連接入自殺載體pGP704中得到乳酸脫氫酶基因ldhA的自殺載體，命名為pGP704-ldhAk12，將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌SM10(λpir)感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，用攜帶自殺質(zhì)粒pGP704-ldhAk12的大腸桿菌SM10(λpir)與大腸桿菌K12菌株進(jìn)行雙親本雜交，選擇具有氨芐青霉素(Ap)抗性的菌株，即為產(chǎn)乳酸途徑被阻斷的大腸桿菌K12菌株突變株。
實(shí)施例3、產(chǎn)乳酸途徑缺失的工程菌的乳酸脫氫酶的活性檢測(cè)對(duì)實(shí)施例1和實(shí)施例2構(gòu)建的產(chǎn)乳酸途徑缺失的工程菌進(jìn)行乳酸脫氫酶的活性檢測(cè)，以野生型菌株為對(duì)照，具體方法包括以下步驟(1)將工程菌接種于200mL rich broth培養(yǎng)基(每L水中含有胰蛋白胨10g，酵母粉1g，NaCl 5g，pH7.0，121℃滅菌30min)中，在37℃下振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，離心收集菌體；(2)用100mL磷酸緩沖液(0.1M，pH7.5)懸浮洗滌菌體2次；(3)用2.5mL磷酸緩沖液(0.1M，pH7.5)懸浮菌體；(4)超聲波破碎菌體；(5)1270g離心1小時(shí)，取上清測(cè)定酶活，測(cè)定方法為用BECKMAN DU640紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定OD340nm在1min內(nèi)的變化，其中乳酸脫氫酶反應(yīng)體系包含NADH0.33mM，丙酮酸鈉30mM，酶液20μl，用磷酸緩沖液補(bǔ)至1mL。加入丙酮酸鈉開(kāi)始反應(yīng)。
結(jié)果實(shí)施例1和實(shí)施例2構(gòu)建的其中4株產(chǎn)乳酸途徑缺失突變株的乳酸脫氫酶活性最低的為野生型菌株的3.85％，最高的為野生型菌株的6.92％，表明獲得了乳酸脫氫酶活性幾乎喪失的工程菌，可用于發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇和/或2，3-丁二醇。
實(shí)施例4、產(chǎn)乳酸途徑缺失的工程菌的發(fā)酵(1)種子培養(yǎng)基配方(1L)K2HPO4(磷酸氫二鉀)3.4g，KH2PO4(磷酸二氫鉀)1.3g，(NH4)2SO4(硫酸銨)2.0g，MgSO4·7H2O(硫酸鎂)0.2g，CaCl2·2H2O(氯化鈣)0.02g，yeast extract(酵母粉)1.0g，sucrose(蔗糖)20g，F(xiàn)e solution(鐵溶液)2.0mL，trace element solution(微量元素溶液)1.0mL。
(2)發(fā)酵培養(yǎng)基配方(1L)K2HPO4(磷酸氫二鉀)1.0g，KH2PO4(磷酸二氫鉀)0.5g，(NH4)2SO4(硫酸銨)2.0g，MgSO4·7H2O(硫酸鎂)0.2g，CaCl2·2H2O(氯化鈣)0.02g，yeast extract(酵母粉)1.0g，glycerol(甘油)20g，F(xiàn)e solution(鐵溶液)1.0mL，trace element solution(微量元素溶液)1.0mL。
鐵溶液(1L)FeSO4·7H2O 5g，HCl(37％)4mL。
微量元素溶液(1L)ZnCl270mg，CuCl2·2H2O 20mg，MnCl2·4H2O 0.1g，NiCl2·6H2O25mg，H3BO360mg，Na2MO4·2H2O 35mg，CoCl2·2H2O 0.2g，HCl(37％)4mL。
一、種子培養(yǎng)從平板上挑取經(jīng)實(shí)施例3檢測(cè)的產(chǎn)乳酸途徑缺失的肺炎克氏桿菌突變菌株的單菌落，接入到裝有100mL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，37℃、180r/min培養(yǎng)14h，使OD600nm達(dá)3.0以上。
二、發(fā)酵按10％接種量將步驟一培養(yǎng)的種子液接入裝有4L發(fā)酵培養(yǎng)基的NBS公司7.5L自動(dòng)發(fā)酵罐中，發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)加80％甘油和40％硫酸銨，并用氫氧化鉀控制pH值為7.0。分別于發(fā)酵40和60小時(shí)后取樣，測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物中1，3-丙二醇濃度和2，3-丁二醇的濃度。結(jié)果發(fā)酵40小時(shí)，1，3-丙二醇濃度可達(dá)50g/L以上，2，3-丁二醇濃度可達(dá)40g/L以上，發(fā)酵60小時(shí)，1，3-丙二醇濃度可達(dá)80g/L以上，2，3-丁二醇濃度可達(dá)70g/L以上，在此過(guò)程中沒(méi)有乳酸產(chǎn)生，表明本發(fā)明構(gòu)建的工程菌可用于1，3-丙二醇和2，3-丁二醇的發(fā)酵生產(chǎn)。
序列表<160>4<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1acggttgcga acggtatgta20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2agtggtctcc gaaatgctga 20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3cgagtccttt ggctttgagc 20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>4tcagtgcttc tgctgtcagg 20
權(quán)利要求
1.產(chǎn)乳酸途徑缺失的工程菌，是通過(guò)同源重組的方法將產(chǎn)1，3-丙二醇和/或2，3-丁二醇的野生型菌株中的乳酸脫氫酶基因沉默后獲得的工程菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程菌，其特征在于所述產(chǎn)1，3-丙二醇和/或2，3-丁二醇的野生型菌株包括克雷伯氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、腸桿菌屬、埃希氏菌屬、志賀氏菌屬、沙門氏菌屬和沙雷氏菌屬的菌株。
3.一種產(chǎn)乳酸途徑缺失的工程菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟1)PCR擴(kuò)增乳酸脫氫酶基因的部分同源序列；2)將步驟1擴(kuò)增的乳酸脫氫酶基因的部分同源序列導(dǎo)入到雙親本雜交供體菌株中；3)將步驟2)獲得的攜帶有乳酸脫氫酶基因的部分同源序列的重組菌與產(chǎn)1，3-丙二醇和/或2，3-丁二醇的野生型菌株進(jìn)行雙親本雜交，經(jīng)抗性篩選后得到產(chǎn)乳酸途徑缺失的工程菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述步驟1)中乳酸脫氫酶基因的部分同源序列是以產(chǎn)1，3-丙二醇和/或2，3-丁二醇的野生型菌株的基因組DNA為模板，經(jīng)由序列表中SEQ ID №1和SEQ ID №2或是由序列表中SEQ ID №3和SEQ ID №4組成的引物對(duì)PCR擴(kuò)增的序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述步驟2)中乳酸脫氫酶基因的部分同源序列通過(guò)含有所述乳酸脫氫酶基因的部分同源序列的自殺載體導(dǎo)入到用于雙親本雜交的供體菌株中；所述自殺載體為pGPCm、pGP704、pUX19、pSUP202、pJQ200SK或pPHU281。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述攜帶有乳酸脫氫酶基因部分同源序列的自殺載體為pGP-ldhA或pGP704-ldhAk12。
7.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述步驟2)用于雙親本雜交的供體菌株為含有λpir的大腸桿菌菌株，包括大腸桿菌SM10(λpir)、S17-1(λpir)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述用于雙親本雜交的菌株為大腸桿菌SM10(λpir)。
9.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述步驟3)中用于生產(chǎn)1，3-丙二醇和/或2，3-丁二醇的野生型菌株包括克雷伯氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、腸桿菌屬和沙雷氏菌屬的菌株。
10.權(quán)利要求1所述的產(chǎn)乳酸途徑缺失的工程菌在生產(chǎn)1，3-丙二醇和/或2，3-丁二醇中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一株產(chǎn)乳酸途徑缺失的工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。其目的是提供一株產(chǎn)乳酸途徑缺失的工程菌及其構(gòu)建方法與其在生產(chǎn)1，3－丙二醇和/或2，3－丁二醇中的應(yīng)用。該工程菌是通過(guò)同源重組的方法將產(chǎn)1，3－丙二醇和/或2，3－丁二醇的野生型菌株中的乳酸脫氫酶基因沉默后獲得的工程菌。所述產(chǎn)1，3－丙二醇和/或2，3－丁二醇的野生型菌株包括克雷伯氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、腸桿菌屬和沙雷氏菌屬的菌株。本發(fā)明將在1，3－丙二醇和2，3－丁二醇的工業(yè)化生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12R1/425GK1800364SQ20051012774
公開(kāi)日2006年7月12日 申請(qǐng)日期2005年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月5日
發(fā)明者李季倫, 楊光, 田杰生 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)