專利名稱：一種促進(jìn)微生物酶法合成谷胱甘肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種促進(jìn)微生物酶法合成谷胱甘肽的方法，通過(guò)向反應(yīng)體系中直接添加通透劑，降低細(xì)胞外膜的通透性屏障，促進(jìn)微生物細(xì)胞酶法合成谷胱甘肽，提高谷胱甘肽產(chǎn)量，涉及利用微生物細(xì)胞酶法合成高價(jià)值有用化合物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
利用微生物整細(xì)胞生物催化合成高價(jià)值有用化合物因其具有大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用的潛力，越來(lái)越受到人們的廣泛關(guān)注。如基因工程菌酶法合成谷胱甘肽。通過(guò)克隆編碼γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶的基因gsh I和gsh II，并構(gòu)建一株具有高谷胱甘肽合成活性的重組大腸桿菌，然后利用其中的谷胱甘肽合成酶系酶法合成谷胱甘肽。與使用分離的純酶相比，在整細(xì)胞生物催化中，由于微生物細(xì)胞外殼的保護(hù)，胞內(nèi)的酶源通常更為穩(wěn)定，但是由于微生物細(xì)胞外膜的通透性屏障，使得整細(xì)胞生物催化的效率明顯要低于純酶體系，因而如何在保證胞內(nèi)有關(guān)酶活性的基礎(chǔ)上，盡可能地提高細(xì)胞膜的通透性就顯得尤為關(guān)鍵。
當(dāng)前提高通透性的處理方法主要包括物理和化學(xué)的處理方法。這些方法主要為通透性預(yù)處理，處理程序主要為通透性處理-離心-洗滌等操作，處理過(guò)程較為繁瑣，另外，在進(jìn)行通透性預(yù)處理時(shí)，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞膜的過(guò)分損傷和細(xì)胞的裂解等現(xiàn)象，導(dǎo)致離心操作時(shí)微生物胞內(nèi)物質(zhì)的丟失，降低了微生物細(xì)胞生物催化的效率。通過(guò)向反應(yīng)體系中直接添加低濃度的通透劑將有可能避免上述問(wèn)題的出現(xiàn)，并最終促進(jìn)高價(jià)值有用化合物的生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種降低細(xì)胞外膜通透性屏障促進(jìn)微生物酶法合成高價(jià)值有用化合物的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案采用在微生物法合成谷胱甘肽的反應(yīng)體系中直接添加低濃度的有機(jī)溶劑或表面活性劑作為通透劑，通透劑在谷胱甘肽合成基礎(chǔ)反應(yīng)液中的體積百分終濃度達(dá)到0.25％～2％，以降低細(xì)胞外膜的通透性屏障，提高谷胱甘肽的產(chǎn)量。
菌株重組大腸桿菌E.coli WSH-KE1(該菌種已在“Process Biochemistry”第33卷第7期，P709-714，1998年公開(kāi))。
培養(yǎng)基平板培養(yǎng)基蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化鈉10g/L，瓊脂20g/L，氨芐青霉素100mg/L，pH7.0。
種子培養(yǎng)基蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化鈉10g/L，葡萄糖30g/L，氨芐青霉素100mg/L，pH7.0。
發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖10g/L，KH2PO413.3g/L，(NH4)2HPO48g/L，MgSO4·7H2O1.2g/L，檸檬酸1.7g/L，EDTA 8.4mg/L，CoCl2·6H2O 2.5mg/L，MnCl2·4H2O 15.0mg/L，CuCl2·2H2O 1.5mg/L，H3BO33.0mg/L，Na2MoO4·2H2O 2.5mg/L，Zn(CH3COO)2·2H2O 13.0mg/L，檸檬酸鐵100.0mg/L，鹽酸硫胺素4.5mg/L，氨芐青霉素100mg/L，pH7.0。
培養(yǎng)方法種子培養(yǎng)從平板培養(yǎng)基上挑取單菌落接種至裝有10mL種子培養(yǎng)基的100mL三角瓶中培養(yǎng)，37℃，200rpm培養(yǎng)10-14h。
發(fā)酵培養(yǎng)將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液按10％(v/v)的接種量，接種至裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵溫度37℃，搖床轉(zhuǎn)速200rpm，發(fā)酵20h。
菌體酶法合成谷胱甘肽的反應(yīng)過(guò)程發(fā)酵液經(jīng)4800rpm，10min離心后，用蒸餾水洗滌2次，得到的濕菌體在-70℃下保存。將保存菌體解凍后，加入谷胱甘肽合成基礎(chǔ)反應(yīng)液，反應(yīng)體系中菌體濃度為200mg濕菌體/ml，直接加入低濃度的有機(jī)溶劑或表面活性劑，37℃，150rpm反應(yīng)2h，沸水浴中加熱5min終止反應(yīng)，離心收集上清，測(cè)定上清中谷胱甘肽含量。谷胱甘肽合成基礎(chǔ)反應(yīng)液L-Glu 40～60mmol.L-1，L-Cys 20～40mmol.L-1，Gly 20～40mmol.L-1，MgCl2·6H2O 25～30mmol.L-1，三磷酸腺苷20～30mmol.L-1，pH7.0磷酸鉀緩沖液100～200mmol.L-1，pH7.0。
在微生物酶法合成高價(jià)值有用化合物反應(yīng)體系中直接添加低濃度的有機(jī)溶劑或表面活性劑作為通透劑，以降低細(xì)胞外膜通透性屏障，提高高價(jià)值有用化合物的產(chǎn)量，例如在微生物酶法合成三磷酸腺苷的反應(yīng)體系中，使用直接添加低濃度有機(jī)溶劑或表面活性劑作為通透劑，以降低細(xì)胞外膜通透性屏障，提高三磷酸腺苷的產(chǎn)量。
谷胱甘肽測(cè)定5，5’-二硫代-雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)法。在2mL比色皿中順序加入100μL6mmol.L-1DTNB，700μL 0.3mmol.L-1NADPH和200μL適當(dāng)濃度的樣品，室溫下加入100μL 50u.mL-1谷胱甘肽還原酶啟動(dòng)反應(yīng)，測(cè)定412nm處反應(yīng)體系的起始OD值以及1.5min后的OD值，根據(jù)OD值的變化速率與谷胱甘肽濃度關(guān)系計(jì)算出樣品中的谷胱甘肽含量。
本發(fā)明的有益效果傳統(tǒng)的通透性預(yù)處理方法通常包括將整細(xì)胞用通透劑進(jìn)行處理-離心-洗滌等程序，本發(fā)明簡(jiǎn)化了微生物細(xì)胞通透性處理的程序，而只是向反應(yīng)體系中直接添加低濃度的有機(jī)溶劑或表面活性劑，不再進(jìn)行離心、洗滌等程序，避免了通透劑對(duì)細(xì)胞膜的損傷或細(xì)胞的裂解而造成離心時(shí)胞內(nèi)物質(zhì)丟失的可能，以降低細(xì)胞外膜的通透性屏障，最終谷胱甘肽產(chǎn)量達(dá)到4.8g/L。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1對(duì)重組大腸桿菌E.coli WSH-KE1未作通透性處理，即在酶法合成谷胱甘肽基礎(chǔ)反應(yīng)液中，不加入低濃度的通透劑，利用其菌體酶法合成谷胱甘肽，其余條件如說(shuō)明書所述，最終谷胱甘肽產(chǎn)量為1.4g/L。
實(shí)施例2對(duì)重組大腸桿菌E.coli WSH-KE1采用不同濃度甲苯、二甲苯或聚氧乙烯硬脂酸酰胺進(jìn)行傳統(tǒng)的預(yù)處理-離心-洗滌程序，利用其菌體酶法合成谷胱甘肽，其余條件如說(shuō)明書所述，其最優(yōu)的谷胱甘肽產(chǎn)量?jī)H為2.5g/L。
實(shí)施例3在重組大腸桿菌E.coli WSH-KE1酶法合成谷胱甘肽的反應(yīng)體系中，直接添加0.25％～2％(v/v)不同終濃度二甲苯，其余條件如說(shuō)明書所述，在二甲苯終濃度達(dá)到1％(v/v)時(shí)，其最優(yōu)的谷胱甘肽產(chǎn)量為3.5g/L。
實(shí)施例4在重組大腸桿菌E.coli WSH-KE1酶法合成谷胱甘肽的反應(yīng)體系中，直接添加0.25％～2％(v/v)不同終濃度聚氧乙烯硬脂酸酰胺，其余條件如說(shuō)明書所述，在聚氧乙烯硬脂酸酰胺終濃度達(dá)到1％(v/v)時(shí)，其最優(yōu)的谷胱甘肽產(chǎn)量為3.6g/L。
實(shí)施例5在重組大腸桿菌E.coli WSH-KE1酶法合成谷胱甘肽的反應(yīng)體系中，直接添加0.25％～2％(v/v)不同終濃度甲苯，其余條件如說(shuō)明書所述，在甲苯終濃度達(dá)到0.5％(v/v)時(shí)，其最優(yōu)的谷胱甘肽產(chǎn)量達(dá)到4.8g/L。
權(quán)利要求
1.一種促進(jìn)微生物酶法合成谷胱甘肽的方法，其特征是在微生物酶法合成谷胱甘肽的反應(yīng)體系中直接添加低濃度的有機(jī)溶劑或表面活性劑作為通透劑，通透劑在谷胱甘肽合成基礎(chǔ)反應(yīng)液中的體積百分終濃度達(dá)到0.25％～2.0％，以降低細(xì)胞外膜通透性屏障，提高谷胱甘肽的產(chǎn)量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是向微生物酶法合成谷胱甘肽的反應(yīng)體系中直接添加的通透劑，包括直接添加有機(jī)溶劑甲苯或二甲苯；或直接添加表面活性劑聚氧乙烯硬脂酸酰胺。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是向微生物酶法合成谷胱甘肽的反應(yīng)體系中直接添加的通透劑甲苯，在谷胱甘肽合成基礎(chǔ)反應(yīng)液中的體積百分終濃度達(dá)到0.5％為最佳；直接添加的通透劑二甲苯，在谷胱甘肽合成基礎(chǔ)反應(yīng)液中的體積百分終濃度達(dá)到1％為最佳；或直接添加的通透劑聚氧乙烯硬脂酸酰胺，在谷胱甘肽合成基礎(chǔ)反應(yīng)液中的體積百分終濃度達(dá)到1％為最佳。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述微生物酶法合成谷胱甘肽所用的微生物為重組大腸桿菌E.coli WSH-KE1，該菌種已在“ProcessBiochemistry”第33卷第7期，P709-714，1998年公開(kāi)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述微生物酶法合成谷胱甘肽所用的谷胱甘肽合成基礎(chǔ)反應(yīng)液為L(zhǎng)-Glu 40～60mmol.L-1，L-Cys 20～40mmol.L-1，Gly 20～40mmol.L-1，MgCl2·6H2O 25～30mmol.L-1，三磷酸腺苷20～30mmol.L-1，pH7.0磷酸鉀緩沖液100～200mmol.L-1，pH7.0。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述微生物酶法合成谷胱甘肽的條件為發(fā)酵液經(jīng)4800rpm，10min離心后，用蒸餾水洗滌2次，得到的濕菌體在-70℃下保存，將保存菌體解凍后，加入谷胱甘肽合成基礎(chǔ)反應(yīng)液，反應(yīng)體系中菌體濃度為200mg濕菌體/ml，直接加入低濃度的有機(jī)溶劑或表面活性劑，37℃，150rpm反應(yīng)2h，沸水浴中加熱5min終止反應(yīng)，離心收集上清，測(cè)定上清中谷胱甘肽含量。
7.一種促進(jìn)微生物酶法合成高價(jià)值有用化合物的方法，其特征是在微生物酶法合成高價(jià)值有用化合物反應(yīng)體系中直接添加低濃度的有機(jī)溶劑或表面活性劑作為通透劑，以降低細(xì)胞外膜通透性屏障，提高高價(jià)值有用化合物的產(chǎn)量。
全文摘要
一種促進(jìn)微生物酶法合成谷胱甘肽的方法，涉及利用微生物細(xì)胞酶法合成高價(jià)值有用化合物技術(shù)領(lǐng)域。以重組大腸桿菌酶法合成谷胱甘肽為例，本發(fā)明以培養(yǎng)的重組大腸桿菌E.coli WSH－KE1細(xì)胞作為酶源，通過(guò)向反應(yīng)體系中直接添加低濃度的有機(jī)溶劑或表面活性劑，以降低細(xì)胞外膜的通透性屏障，在三磷酸腺苷(ATP)存在下催化L－Glu，L－Cys和Gly合成谷胱甘肽，反應(yīng)2小時(shí)谷胱甘肽合成量可達(dá)4.8g/L。本發(fā)明簡(jiǎn)化了微生物細(xì)胞通透性處理的程序，避免了通透劑對(duì)細(xì)胞膜的損傷或細(xì)胞的裂解而造成離心時(shí)胞內(nèi)物質(zhì)丟失的可能，最終提高了谷胱甘肽產(chǎn)量。
文檔編號(hào)C12P21/02GK1814780SQ200510122930
公開(kāi)日2006年8月9日 申請(qǐng)日期2005年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月5日
發(fā)明者堵國(guó)成, 廖鮮艷, 陳堅(jiān), 朱至 申請(qǐng)人:江南大學(xué)