專利名稱：一種以家蠶為宿主工廠化生產(chǎn)微孢子蟲的工藝的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及害蟲生物防治的研究，尤其涉及一種利用家蠶為宿主工廠化生產(chǎn)微孢子蟲的工藝。
背景技術：
微孢子蟲是專性細胞內寄生蟲，它不僅可引起宿主昆蟲食下發(fā)病死亡，而且多數(shù)微孢子蟲可經(jīng)雌蟲胚種傳染子代導致子代蟲體死亡，這種垂直傳播既可保存病原物種又能繼續(xù)擴大傳播形成流行病，這是細菌、真菌等其他昆蟲病原微生物所不具備的顯著特點，從控制害蟲種群數(shù)量的角度而言，具有特殊意義。因此，微孢子蟲作為殺蟲微生物農(nóng)藥應用，殺蟲效力高，防治時間長，是一類極具潛力和應用前景的微生物農(nóng)藥資源。目前，利用微孢子蟲防治作物害蟲的研究不多。
影響微孢子蟲生防實用化的一個重要原因是微孢子蟲的大量繁殖問題。微孢子蟲是一種專性細胞內寄生物，與昆蟲病毒一樣，不能在人工培養(yǎng)基上生長，必須采用活寄主繁殖或細胞培養(yǎng)繁殖。細胞培養(yǎng)的成本高，生產(chǎn)上不可取。目前國內外對微孢子蟲的繁殖方法通常是利用原分離宿主來繁殖，但原分離宿主普遍存在飼養(yǎng)困難，成本高，難以實用化。利用微孢子蟲對昆蟲寄生存在較寬松寄主范圍的特點，我們首次提出以飼養(yǎng)技術成熟、易養(yǎng)易繁、全年可多次飼養(yǎng)的家蠶為替代宿主，人為創(chuàng)造感染致病條件，大量增殖目標害蟲強病原性微孢子蟲的設想。家蠶個體大、產(chǎn)量高、成本低、可規(guī)?；a(chǎn)微孢子蟲，形成產(chǎn)業(yè)，解決微孢子蟲來源困難的問題。這一方法將可解決微孢子蟲在害蟲生物防治實用化存在的關鍵問題。國內目前尚未見利用家蠶大量繁殖微孢子蟲開展生防應用的研究報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種以家蠶為宿主工廠化生產(chǎn)微孢子蟲的工藝。
本發(fā)明提供的一種以家蠶為宿主工廠化生產(chǎn)微孢子蟲的工藝，包括以下步驟(1)選擇無微孢子蟲胚種傳染的健康家蠶種作為繁殖宿主；(2)家蠶幼蟲在溫度為25～30℃、濕度為70～85％及自然光照的條件下，用新鮮的正常桑葉飼養(yǎng)；
(3)將提純的孢子液配制成濃度1～5×106個/mL，涂于桑葉表面，在2～3齡起蠶連續(xù)添食4～8小時，然后換用新鮮正常桑葉進行正常飼養(yǎng)，飼養(yǎng)至化蛹、化蛾，收集病死蟲尸和蛾體，0～5℃保存；(4)將保存的病死蟲和蛾體取出，用研磨器研磨，尼龍紗布過濾，差速離心多次，所得沉淀即為粗提純微孢子蟲液，分裝于三角瓶于0～5℃保存。
微孢子蟲是細胞內專性寄生物，不能在人工培養(yǎng)基上生長。通常采用活體繁殖，一般是通過飼養(yǎng)原宿主來繁殖，但原分離宿主普遍存在飼養(yǎng)困難，成本高，難以實用化，因此，要獲得大量的微孢子蟲比較困難。
過去認為原生動物的寄主范圍窄，但通過人工接種感染試驗發(fā)現(xiàn)，微孢子蟲的寄主譜不象以前想象的那么嚴格，昆蟲間存在交叉感染現(xiàn)象。日本學者廣瀨對102種昆蟲共25000頭進行調查，在65種昆蟲中檢出微孢子蟲，其中12種對家蠶有病原性。國內報道從51種昆蟲中鏡檢出54種微孢子蟲，其中有18種可以感染家蠶。
利用微孢子蟲對昆蟲寄生存在較寬松種特異性的特點，本發(fā)明提出以飼養(yǎng)技術成熟、易養(yǎng)易繁、全年可多次飼養(yǎng)的家蠶為替代宿主，人為創(chuàng)造感染致病條件，大量增殖目標微孢子蟲。宿主家蠶個體大、產(chǎn)量多、養(yǎng)蠶成本低，可規(guī)?；曫B(yǎng)，形成產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，從而解決微孢子蟲來源困難的問題。
下面通過具體實施方式
對本發(fā)明作進一步的說明。
具體實施例方式
下面以家蠶為宿主工廠化生產(chǎn)微孢子蟲M-Px和M-Le的兩個實施例用于闡述本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于此。
微孢子蟲M-Px(從小菜蛾分離的一種微孢子蟲)和M-Le(從甜菜夜蛾分離的一種微孢子蟲)對小菜蛾和甜菜夜蛾具有極強的致病力，是有應用潛力的2株微孢子蟲，通過實驗室研究發(fā)現(xiàn)，這兩種微孢子蟲均可以感染家蠶，且對家蠶的食下感染病原性較弱，M-Px主要寄生于家蠶脂肪體細胞，M-Le主要寄生于中腸后部氣管叢，均不寄生家蠶絲腺，亦未發(fā)現(xiàn)有胚種傳染現(xiàn)象，故對養(yǎng)蠶危害較輕微。這為利用家蠶為宿主繁殖這兩種微孢子蟲提供了實際可能。通過開展最佳接種劑量、接種時期、飼養(yǎng)條件、收獲時期等研究，本發(fā)明提出了以家蠶為宿主的工廠化生產(chǎn)這2種微孢子蟲的工藝流程。
實施例1 利用家蠶繁殖微孢子蟲M-Px蠶種選擇選擇無微孢子蟲胚種傳染的健康蠶種作為繁殖宿主。
飼養(yǎng)條件家蠶幼蟲的飼養(yǎng)溫度為25～30℃，濕度70～85％，自然光照，新鮮的正常桑葉飼養(yǎng)。
接種劑量及時期將提純的M-Px孢子液配制成濃度2×106個/mL，涂于桑葉表面，在3齡起蠶連續(xù)添食8小時，然后換用新鮮正常桑葉進行正常飼養(yǎng)，飼養(yǎng)至化蛹、化蛾，收集病死蟲尸和蛾體，冰箱5℃保存。
微孢子蟲收集及提純將冰箱保存的病死蟲和蛾體取出，用研磨器研磨，尼龍紗布過濾，差速離心多次，所得沉淀即為粗提純微孢子蟲液，分裝于三角瓶于5℃保存。通常可保存1年以上。
實施例2 利用家蠶繁殖微孢子蟲M-Le蠶種選擇選擇無微孢子蟲胚種傳染的健康蠶種作為繁殖宿主。
飼養(yǎng)條件家蠶幼蟲的飼養(yǎng)溫度為25～30℃，濕度70～85％，自然光照，新鮮的正常桑葉飼養(yǎng)。
接種劑量及時期將提純的M-Le孢子液配制成濃度1×106個/mL，涂于桑葉表面，在3齡起蠶連續(xù)添食8小時，然后換用新鮮正常桑葉進行正常飼養(yǎng)，飼養(yǎng)至化蛹、化蛾，收集病死蟲尸和蛾體，冰箱5℃保存。
微孢子蟲收集及提純將冰箱保存的病死蟲和蛾體取出，用研磨器研磨，尼龍紗布過濾，差速離心多次，所得沉淀即為粗提純微孢子蟲液，分裝于三角瓶于5℃保存。通常可保存1年以上。
權利要求
1.一種以家蠶為宿主工廠化生產(chǎn)微孢子蟲的工藝，其特征在于包括以下步驟(1)選擇無微孢子蟲胚種傳染的健康家蠶種作為繁殖宿主；(2)家蠶幼蟲在溫度為25～30℃、濕度為70～85％及自然光照的條件下，用新鮮的正常桑葉飼養(yǎng)；(3)將提純的孢子液配制成濃度1～5×106個/mL，涂于桑葉表面，在2～3齡起蠶連續(xù)添食4～8小時，然后換用新鮮正常桑葉進行正常飼養(yǎng)，飼養(yǎng)至化蛹、化蛾，收集病死蟲尸和蛾體，0～5℃保存；(4)將保存的病死蟲和蛾體取出，用研磨器研磨，尼龍紗布過濾，差速離心多次，所得沉淀即為粗提純微孢子蟲液，分裝于三角瓶于0～5℃保存。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以家蠶為宿主工廠化生產(chǎn)微孢子蟲的工藝，該工藝利用微孢子蟲對昆蟲寄生存在較寬松種特異性的特點，提出以飼養(yǎng)技術成熟、易養(yǎng)易繁、全年可多次飼養(yǎng)的家蠶為替代宿主，人為創(chuàng)造感染致病條件，大量增殖目標微孢子蟲。宿主家蠶個體大、產(chǎn)量多、養(yǎng)蠶成本低，可規(guī)模化飼養(yǎng)，形成產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，從而解決微孢子蟲來源困難的問題。
文檔編號C12N1/10GK1807570SQ20051012065
公開日2006年7月26日 申請日期2005年12月16日 優(yōu)先權日2005年12月16日
發(fā)明者楊瓊, 鄭祥明, 方定堅, 廖森泰, 黃炳輝, 鄒宇曉, 蔡月仙, 羅國慶, 吳福泉, 唐翠明, 李夫濤, 劉新濤 申請人:廣東省農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所