專利名稱：一株枯草芽孢桿菌及其應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一株枯草芽孢桿菌及其應用，特別涉及以該株枯草芽孢桿菌為活性成分的微生物菌劑。
背景技術(shù)：
隨著菜籃子工程的實施和農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整，我國豆類、瓜類和蔬菜、苜蓿等種植面積呈現(xiàn)迅速發(fā)展的態(tài)勢。同時因為國際、國內(nèi)市場需求量的增大，無公害、綠色和有機農(nóng)業(yè)生產(chǎn)基地栽培面積和基地建設規(guī)模逐年遞增。根據(jù)周年動態(tài)多點監(jiān)測和調(diào)查表明，由于保護地蔬菜的連年重茬種植，不規(guī)范的輪作，土傳病原菌大量積累、繁衍，致使蔬菜苗期猝倒病(Pythium aphanidermatum)、立枯病(Rhizoctoniasolani)、枯萎病(Fusarium oxysporum)和由腐霉、疫霉及鐮刀菌復合侵染造成的根腐病等土傳病害的危害日益加重，導致嚴重的減產(chǎn)或降低產(chǎn)品質(zhì)量，甚至絕收。某些串株鐮刀菌和再育鐮刀菌等菌株還可產(chǎn)生伏馬霉素等聚酮類真菌毒素，直接影響農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)及危害人和動物的健康。生產(chǎn)中主要依靠化學農(nóng)藥和化肥的施用，制約高產(chǎn)高效農(nóng)業(yè)的發(fā)展。
化學防治在世界農(nóng)業(yè)發(fā)展史上占有重要的地位。幾個世紀以來，化學農(nóng)藥在植物病蟲草鼠害的防治中發(fā)揮著積極的作用，為農(nóng)業(yè)的穩(wěn)產(chǎn)、增產(chǎn)、挽回損失和提高品質(zhì)做出了重要貢獻。但同時也因過量施用和濫用農(nóng)藥導致地力衰退和環(huán)境污染，影響非靶標生物及導致有害生物的抗藥性產(chǎn)生和迅速發(fā)展等嚴重問題。尤其近年來因為農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留超標，造成人畜中毒事件不斷發(fā)生，嚴重威脅著人民的生活質(zhì)量，也限制了我國農(nóng)產(chǎn)品的外貿(mào)出口。土傳病害的發(fā)生猖獗和化學殺菌劑的潛在污染已成為農(nóng)業(yè)安全生產(chǎn)中首要的關(guān)鍵問題。
隨著社會文明的發(fā)展，農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展問題使人類對資源與環(huán)境的認識有了新的飛躍，對農(nóng)藥提出了高效、低毒、環(huán)境友好型的要求。世界各國也在采取實際步驟減少化學合成農(nóng)藥的使用，如美國EPA在20世紀90年就宣布撤消91種化學農(nóng)藥的登記，荷蘭、丹麥在1990年就制定了減少一半農(nóng)藥使用量的五年和十年計劃，歐盟也制定了類似的計劃。我國也已撤消十幾種化學農(nóng)藥的登記。為了解決農(nóng)產(chǎn)品提高產(chǎn)量和保證質(zhì)量之間的矛盾，達到綜合防治蔬菜重大病蟲害、減少化學農(nóng)藥使用量的目的，發(fā)展生物防治技術(shù)越來越受到各國政府、科技工作者和民眾的關(guān)注。生物菌劑(BCA)以其低毒、環(huán)境兼容性好、具有在作物幼苗根際建群的能力，持效期長，有害生物不易對其產(chǎn)生抗藥性等特點得到廣泛的關(guān)注和重視，目前國際上先進的農(nóng)化公司大多積極參與生物菌劑的研究和市場化，特別是有益細菌在土傳、種傳病害的防治中已取得了一定進展，并有系列產(chǎn)品得到成功的應用，取得了顯著的經(jīng)濟和生態(tài)效益。生物防治作為綜合防治的一項重要措施，在植物病蟲害綜合治理中發(fā)揮著愈來愈重要的作用。
PGPR(促進植物生長的根際細菌)是目前比較受到廣泛關(guān)注的一類生防細菌。也是國內(nèi)應用于土傳病害綜合防治的主要生防因子之一，其通過移植于根系和優(yōu)先占領根系或抑制根上的有害根際細菌和有害真菌(DRMO)來促進植物的生長。其中芽孢桿菌屬(Bacillus spp.)以其分布廣，易分離培養(yǎng)，能產(chǎn)生耐熱耐干燥的內(nèi)生孢子，貯藏期長，使用方便等特點，成為一種理想的生防微生物，自1945年Johnson等報道枯草芽孢桿菌產(chǎn)生抗菌物質(zhì)后，半個多世紀以來各國的研究工作者對它可望成為一種生物控制因素而寄予極大關(guān)注，并在多種作物上進行了廣泛的控制病害能力試驗，有許多成功應用，在生產(chǎn)實踐中表現(xiàn)出明顯的防病增產(chǎn)作用，也進一步證實了芽孢桿菌生防菌劑在產(chǎn)品中的穩(wěn)定性，與化學農(nóng)藥的相容性和不同植物不同年份防效的一致性方面明顯優(yōu)于非芽孢桿菌和真菌生防菌。
國內(nèi)外學者先后分別報道了具有生物控制作用的各個不同株系的枯草芽孢桿菌的生物學特征、定殖條件、抗菌物質(zhì)理化特性等相關(guān)研究及其在不同作物根部定植情況、對腐霉、鐮刀菌等引起的不同土傳病害的防治效果、潛在的誘導植物產(chǎn)生抗病性及促進幼苗生長等方面的研究。已有研究表明，因芽孢桿菌能產(chǎn)生內(nèi)生芽孢，具有極強的抗逆能力，相比其他類型的生防因子，更有利于菌劑的生產(chǎn)，劑型加工及在環(huán)境中存活，定殖與繁殖。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一株具有廣譜殺菌活性的枯草芽孢桿菌。
本發(fā)明所提供的枯草芽孢桿菌，是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259，已于2005年09月01日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCC No.1451。
枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451，是從黑龍江齊齊哈爾市克山縣大豆田間土壤中分離得到的。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種具有廣譜殺菌活性的微生物菌劑。
本發(fā)明所提供的微生物菌劑，它的活性成分為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)HL259 CGMCC No.1451。
所述微生物菌劑可按如下方法獲得在YMA或玉米漿培養(yǎng)基中發(fā)酵枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451，將得到的發(fā)酵液與基質(zhì)混合得到微生物菌劑。
所述玉米漿培養(yǎng)基中含有蔗糖5g，玉米粉2g，KH2O40.05g，(NH4)2SO40.5g，K2HPO40.05g，MgSO40.025g，CaCO32g，蒸餾水1000ml。
YMA培養(yǎng)基中含有甘露醇10g，酵母粉3g，K2HPO40.25g，KH2PO40.25g，0.2g MgSO4.7H2O，NaCl 0.1g，CaCO33g，瓊脂10g，蒸餾水1000ml，pH值7.2。
所述發(fā)酵條件中，培養(yǎng)溫度可為25-30℃，通氣量可為1∶0.5-1∶1.6，攪拌速度可為200-400rpm，培養(yǎng)時間可為24-48h；所述通氣量為每分鐘通入發(fā)酵罐的空氣體積與發(fā)酵罐中發(fā)酵液的體積比值。
其中，所述培養(yǎng)溫度優(yōu)選為28-30℃，通氣量優(yōu)選為1∶1-1∶1.2，攪拌速度優(yōu)選為250-300rpm，培養(yǎng)時間優(yōu)選為24-30h。
發(fā)酵時可加入植物油或有機硅油作為消沫劑。
所述植物油的質(zhì)量百分含量可為1-2％；所述有機硅油的質(zhì)量百分含量可為0.04-0.1％。
所述基質(zhì)可為草炭、微粉碳酸鈣、凹凸棒土或膨潤土。
所述微生物菌劑中枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №.1451的活菌數(shù)可為5×109cfu/g，pH值可為6.0-7.8。
實驗結(jié)果表明枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №.1451對除假單胞菌屬之外的四個真菌亞門13屬的22種植物病原真菌和5個重要屬的代表性病原細菌均具有明顯的抑制生長作用，其中對瓜果腐霉，辣椒疫霉，膠胞鐮刀菌、小麥禾谷絲核菌，苜蓿根腐病鐮刀菌，棉花黃萎病菌，棉花枯萎病菌，蘋果腐爛病菌和小麥立枯絲核菌的抑制率達到72.76％～94.86％。室內(nèi)及溫室試驗表明該菌株用作土壤調(diào)控、種子處理和地上部噴霧，對土傳、種傳等病原菌引起的根腐病具有良好防治效果。在黑龍江省大豆重迎茬田和吉林省、北京郊區(qū)根腐病發(fā)生比較嚴重的多個蔬菜保護地和苜蓿田進行了防治試驗，結(jié)果表明HL259及其代謝產(chǎn)物能夠顯著控制由Pythium，Phytophthora，F(xiàn)usarium和Rhizoctonia等引起的爛種、猝倒、立枯、根腐等病害，并兼治部分細菌性病害，具有一定的增產(chǎn)作用，尤其用于種子處理和土壤處理后對于多種病原菌復合侵染導致的根腐病具有顯著的防病保苗效果，是一株具有廣譜殺菌活性的生防菌株。
枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451對作物均無致病作用，且剪葉接種法接種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451對番茄莖長、辣椒莖長和西葫蘆莖長有促進作用；針刺接種法接種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451對黃瓜莖長、鮮重有促進作用；蘸根接種法接種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451對甜瓜莖長、鮮重和苜蓿莖長有促進作用。
實驗結(jié)果表明，以枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451為活性成分的微生物菌劑可有效防治蔬菜、瓜類、豆類和苜蓿生產(chǎn)中由鐮刀菌、腐霉菌、疫霉菌和立枯絲核菌引起的根腐病、猝倒病和立枯病等植物病害，而且該微生物菌劑的制備工藝簡單、發(fā)酵周期短、投入低和易于保存。


圖1A為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451的光學顯微鏡照片圖1B和圖1C為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451的電鏡照片圖2為根據(jù)16SrRNA序列用DNAMAN Version 4.0分析獲得的進化樹結(jié)果圖3為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451與Bacillussubtilis US116的16SrRNA基因序列源性比較結(jié)果具體實施方式
下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。
實施例1、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451的分離及鑒定1、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451的分離從黑龍江齊齊哈爾市克山縣大豆田間采集土樣10g，加入內(nèi)裝100ml無菌水和玻璃珠的三角瓶中，于100轉(zhuǎn)/min搖床上振蕩20min，取0.5ml加入4.5ml無菌水中，依次稀釋10-2，10-3，10-4倍，分別取以上懸濁液0.1ml在YMA、牛肉膏蛋白胨(細菌培養(yǎng)基)、馬丁氏(真菌分離培養(yǎng)基)、改良高氏1號(放線菌培養(yǎng)基)培養(yǎng)基上涂布，每個濃度重復3次，置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)24h、3d和5d，分別進行細菌，真菌和放線菌的分離和純化。并分別以Pythium，Phytophthora，F(xiàn)usarium和Rhizoctonia為靶標菌，進行拮抗菌的篩選。從中篩選出對各個供試菌具有明顯抑菌效果的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451。
2、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451的鑒定(1)菌體的形態(tài)特征枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451在土壤浸汁瓊脂培養(yǎng)基上(土壤1kg加水1000ml，高壓蒸汽(121℃)滅菌30min。浸液加滑石粉后用雙層濾紙過濾，pH值調(diào)節(jié)至中性，則按照土壤浸液100ml，瓊脂17g，水900ml制備培養(yǎng)基)培養(yǎng)24h后菌落為圓形，白色不透明，隨著培養(yǎng)時間增長，菌落變厚變干，邊緣不整齊，菌落上有皺褶狀凸起，變?yōu)槿橹?，生長在其上的細胞物質(zhì)不易在液體中分散，光學顯微鏡下觀察到桿狀細胞(圖2A)，大多數(shù)運動，鞭毛周生，細胞為0.6～0.8×3～5μm，革蘭氏染色均勻，并可見細胞中被染成藍紫色芽孢。掃描電子顯微鏡觀察進一步確證芽孢桿狀形態(tài)，細胞壁外帶有厚薄均一的黏質(zhì)層，產(chǎn)生橢圓型芽孢，無伴胞晶體(圖2B和圖2C)。
(2)菌株的生理生化鑒定將枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451與枯草芽孢桿菌標準菌株1.504(中國菌種保藏管理委員會)在相同的實驗條件下進行生理生化性狀檢測，結(jié)果如表1。
表1.HL259鑒定項目及結(jié)果

注a表示HL259在10％NaCl中也能生長?！?”表示陽性結(jié)果；“-”表示陰性結(jié)果。
(2)HL259菌株16SrRNA序列測定和質(zhì)粒提取16SrRNA基因序列測序結(jié)果表明HL259菌株的16SrRNA基因序列具有序列表中序列1的核苷酸序列，根據(jù)測序結(jié)果與Genbank中芽孢桿菌16SrRNA基因序列進行同源性比較，結(jié)果表明HL259與Bacillus subtilis US116的同源性達到99.52％(圖3，圖中，HL259行中的“-”表示與US116相應位點的堿基相同，“g、c、a”表示與US116相應位點的堿基不同)，說明HL259菌株屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)。質(zhì)粒提取和電泳結(jié)果表明，HL259含有一個大約4.5kb左右質(zhì)粒，在含有50μg/ml氨芐青霉素(Amp)的平板上可以正常生長。
文獻顯示枯草芽孢桿菌可運動，革蘭氏陽性，芽孢橢圓形或柱狀、中生或偏中生，接觸酶試驗陽性，V-P試驗陽性，7％-10％氯化鈉中生長，從葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露醇產(chǎn)酸，水解淀粉，利用檸檬酸鹽作為碳源，還原硝酸鹽成亞硝酸鹽，分解酪素，卵黃反應陰性，在葡萄糖和酪氨酸瓊脂上不形成黑色素，不利用丙酸鹽和不分解酪氨酸等特點。將以上HL259的部分生理生化性狀檢測結(jié)果與枯草芽孢桿菌標準菌株相比較，根據(jù)《一般細菌常用鑒定方法》(中國科學院微生物細菌研究所細菌分類組編，科學出版社，1978年)，《芽孢桿菌屬》(蔡妙英，戰(zhàn)立克等譯，農(nóng)業(yè)出版社，1988年)和《微生物分類學》(張繼忠，上海復旦大學出版社，1998)中的檢索表進行檢索，確定HL259生理生化性狀與枯草芽孢桿菌相應性狀吻合。同時16SrRNA序列及根據(jù)16SrRNA序列用DNAMAN Version 4.0分析獲得的進化樹結(jié)果(圖2)進一步確認生化鑒定結(jié)果，鑒定HL259為枯草芽孢桿菌。
實施例2、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №.1451的抑菌活性(抑菌譜測定)一、抑菌活性測定采用菌絲生長速率測定法和孢子萌發(fā)法檢測了枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)HL259 CGMCC No.1451菌株及代謝產(chǎn)物對包括四個真菌亞門13屬的22種植物病原真菌立枯絲核病菌Rhizoctonia solani、蘋果腐爛病菌Valsa mali、小麥赤霉病菌Fusarium graminearum、黃瓜蔓枯病菌Mycosphaerella melonis、番茄早疫病菌Alternaria solani、串珠鐮刀菌Fusarium moniliforme、棉花枯萎病菌Fusariun oxysporum f.sp.vasinfectum、番茄灰霉病菌Botrytis cinerea、豌豆茄形鐮刀菌、Fusarium solani f.sp.pisi、玉米小斑病菌Bipolaris maydis、蘋果輪紋病菌Physalospora piricola、炭疽病菌Colletotrichumgloeosporioides、棉花黃萎病菌Verticillium dahliae、水稻稻瘟菌Piriculariaoryzae、辣椒疫霉Phytophthora capsici、瓜果腐霉菌Pythium aphanidermatum、膠孢鐮刀菌Fusarium subglutinans、小麥紋枯病菌Rhizoctonia cerealis、苜蓿根腐病鐮刀菌Fusarium avenaceam、玉米絲黑穗病菌Sporisoriumholci-sorghi(Rivolta)vanky)；采用雙層平板培養(yǎng)法和牛津杯方法測定了5個重要屬的代表性病原細菌薄壁菌門主要屬中的土壤桿菌屬(Agrobacterium)k27病菌，布克氏菌屬(Ralstonia)茄青枯病菌，假單胞菌屬(Pseudomonas)黃瓜角斑病菌，黃單胞菌屬(Xanthomonas)水稻白葉枯病菌、棉花角斑病菌和番茄瘡痂病菌；厚壁菌門主要屬中的棒形桿菌屬(Clavibacter)番茄潰瘍病菌的抑菌活性和抑菌譜。
1、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451抑制病原真菌效果檢測采用平板培養(yǎng)法，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451在523斜面28℃下活化48h，用0.85％生理鹽水制成菌懸液，用麥克比濁法確定最終菌懸液濃度為109cfu/ml備用。供試真菌在PDA平板上25℃活化5d，使其形成菌落，用打孔器(直徑5mm)制取菌餅，將菌絲面朝下接菌于PDA平板中央。將高溫滅菌的雙層濾紙片(直徑5mm)在枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCCNo1451菌懸液中浸濕，均勻擺放在PDA平板上，每皿3片，距離均勻，以放置浸濕無菌水紙片的PDA平板為對照，每個處理4次重復，25℃下黑暗培養(yǎng)4、5、6、7d后分別測量真菌菌落直徑，并計算抑制生長率。

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451對供試病原真菌的抑制作用結(jié)果如表2所示。
表2.枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451對供試病原真菌的抑制作用


注玉米絲黑穗病菌采用混濁度法測定，即于650nm波長下分別測定不同處理的吸光度，并與不加藥液的空白處理相比求出相對抑制百分率。

2、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451抑制病原細菌效果檢測分別將枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451和靶標細菌活化48h后制成菌懸液，用麥克比濁法將菌懸液調(diào)整到1.5×109cfu/ml，吸取0.1ml靶標菌菌懸液加到培養(yǎng)基平板上用涂布鏟鋪平。將牛津杯(牛津杯的直徑為0.85cm)放在培養(yǎng)基上，在每個牛津杯內(nèi)加入100μl的菌懸液，以津杯內(nèi)加入100μl的無菌水的PDA平板為對照，每皿3個牛津杯，距離均勻，4℃下保存16h，每個處理3次重復，28℃下黑暗培養(yǎng)24-48h后測量抑菌圈直徑?？莶菅挎邨U菌(BACILLUSSUBTILIS)HL259 CGMCC No1451對供試病原真菌的抑制作用如表3所示，所用對照的抑菌圈直徑均為0cm。
表3.枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451對供試主要病原細菌的抑制作用


檢測結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451對馬鈴薯軟腐、水稻白葉枯、K27、番茄潰瘍、茄青枯、番茄瘡痂、棉花角斑有效果，對黃瓜角斑無效。
本實施例以包括四個真菌亞門13屬的22種植物病原真菌和5個重要屬的代表性病原細菌為靶標菌，測定枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC№1451的抑菌譜；結(jié)果表明枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC№1451對除假單胞菌屬之外的其它供試靶標病菌均具有明顯的抑制生長作用，表明枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451具有廣泛的抑菌譜。其中對瓜果腐霉，辣椒疫霉，膠胞鐮刀菌、小麥紋枯病菌，苜蓿根腐病鐮刀菌，棉花黃萎病菌，棉花枯萎病菌，蘋果腐爛病菌和立枯絲核病菌的抑制率達到72.76％～94.86％。
二、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451對作物的安全性測定首先進行室內(nèi)種子發(fā)芽安全性檢測，即使用濃度為108cfu/ml的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451菌懸液浸種處理幾種主要作物種子后觀測種子發(fā)芽安全性，以明確枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCCNo1451用以種子處理的安全性，為田間試驗應用提供理論依據(jù)。結(jié)果表明，菌懸液浸種處理后的番茄、辣椒、甜瓜、黃瓜、苜蓿、菜豆、西葫蘆、茄子八種作物種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率與對照無明顯差異，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259CGMCC No1451浸種處理對菜豆發(fā)芽率、茄子發(fā)芽勢還有明顯促進作用。進一步采用蘸根接種法，針刺接種法和剪葉接種法在大棚或大田試驗條件下檢測枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC No1451對以上八種作物有無致病性，為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC No1451在生產(chǎn)中的進一步試驗推廣奠定基礎。結(jié)果表明，接種枯枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC No1451的八種作物的生長狀況與對照相比較，可以看出枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC No1451對八種作物均無致病作用，且剪葉接種法接種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC No1451對番茄莖長、辣椒莖長和西葫蘆莖長有促進作用；針刺接種法接種枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)HL259 CGMCC No1451對黃瓜莖長、鮮重有促進作用；蘸根接種法接種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC No1451對甜瓜莖長、鮮重和苜蓿莖長有促進作用。
實施例3、以枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC No1451為活性成分的微生物菌劑的制備1、最適產(chǎn)素培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的確定為了確定適合于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC No1451生長的固體和液體培養(yǎng)基，比較了枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCCNo1451在LB、YMA、YEM、PDA、金氏B、蔗糖蛋白胨培養(yǎng)基(蔗糖2.0％，蛋白胨0.5％K2HPO40.05％，MgSO47H2O 0.025％，蒸餾水1000ml，瓊脂17.0g)、YGM(葡萄糖2.5％，酵母膏2.0g，K2HPO40.25g，KH2PO40.25g，MgSO4·7H2O 0.1g，MnSO40.15g，NaCl 0.05g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005g，瓊脂17.0g，蒸餾水1000ml)、523、BPY共9種培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀和生長速度，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259CGMCC No1451經(jīng)劃線接種，在28-30℃下培養(yǎng)24-48h，在9種培養(yǎng)基平板上均能生長培養(yǎng)，分別表現(xiàn)出淺黃褐色或淡灰白色，但不同培養(yǎng)基上菌落生長存在差異，在YMA上培養(yǎng)前期菌膿狀，形成菌落較圓，逐漸菌落變厚，不透明，有皺褶，菌體變白，菌落擴展快；其次測定枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC No1451在不同液體培養(yǎng)基中的生長曲線、OD450值和pH值的變化，進行綜合分析確定YMA培養(yǎng)基較適于液體搖培，YMA培養(yǎng)液中搖培至12h菌量已達108cfu/ml，其菌量達到高峰的時期是24h，菌量為1010cfu/ml；隨后進行枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC No1451的最適產(chǎn)素培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件篩選。試驗表明，適合于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC No1451產(chǎn)素的培養(yǎng)基為YMA和玉米漿培養(yǎng)基(蔗糖5g，玉米粉2g，KH2PO40.05g，(NH4)2SO40.5g，K2HPO40.05g，MgSO40.025g，CaCO32g，加水1000ml)。進而研究了包括搖培溫度，起始pH，裝液量和接種量等搖培條件的選擇試驗，確定斜面種子(108cfu/ml)以1～2％(體積比)接種量至搖床三角瓶，在裝液量為20～40％(體積比)，培養(yǎng)溫度為28～32℃，起始pH為6.0，搖床速度為180～220rpm培養(yǎng)條件下?lián)u培18～24h，其代謝產(chǎn)物的抑菌作用最為顯著。進一步從已確定的搖瓶條件，研究了種子罐至發(fā)酵罐的發(fā)酵條件三角瓶內(nèi)種子(1010cfu/ml)以1～2％(體積比)接種量至種子罐(30～50L)，種子罐內(nèi)發(fā)酵液以3～5％(體積比)接種量接種到發(fā)酵罐(800～1000L)。種子罐和發(fā)酵罐的培養(yǎng)條件25-30℃下培養(yǎng)24～48h，通氣量為1∶0.5～1∶1.6(通氣量定義為每分鐘通入發(fā)酵罐的空氣體積與發(fā)酵罐中發(fā)酵液的體積比值)，消沫劑用質(zhì)量百分含量為1-2％的植物油或質(zhì)量百分含量為0.04-0.1％的有機硅油，攪拌速度為200～400rpm；然后將菌液用草炭吸附制成粉末型菌劑，或?qū)l(fā)酵液離心獲得的菌體沉淀按1∶1的質(zhì)量比與微粉碳酸鈣混合制得生防菌劑，其中枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259CGMCC No1451菌量大于等于5×108cfu/g。
2、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC No1451微生物菌劑(HL259菌劑)的制備枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC No1451經(jīng)劃線接種在YMA培養(yǎng)基上，于30℃下培養(yǎng)24h進行菌種活化；然后將斜面種子(108cfu/ml)以1～2％(體積比)的接種量接種至搖床三角瓶(容積為1000ml)的YMA培養(yǎng)液中，裝液量為30％(體積比)，培養(yǎng)溫度為28℃，起始pH為6.0，搖床速度為200rpm，搖培時間為24h；之后將三角瓶內(nèi)種子(1010cfu/ml)以2％(體積比)接種量接種至種子罐(容積50L)內(nèi)的玉米漿培養(yǎng)基內(nèi)，28±1℃下培養(yǎng)24h，通氣量為1∶1-1∶1.2，消沫劑用有機硅油0.04％，攪拌速度為260rpm；將種子罐內(nèi)發(fā)酵液以5％(體積比)接種量接種到發(fā)酵罐(容積為1000L)的玉米漿培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為28±1℃，通氣量為1∶1-1∶1.2，消沫劑用有機硅油0.04％，攪拌速度為260rpm，培養(yǎng)24h。將菌液用草炭吸附制成粉末型菌劑，或?qū)l(fā)酵液離心獲得的菌體沉淀按1∶1的質(zhì)量比與微粉碳酸鈣混合制得生防菌劑，其中，粉末型菌劑的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)HL259 CGMCC No1451菌量為5×109cfu/g。進一步通過顯微觀察，平板計數(shù)等手段檢測菌劑中的有效活菌數(shù)，pH值及雜菌率，確定菌劑產(chǎn)品質(zhì)量。菌劑產(chǎn)品質(zhì)量分析以比濁、鏡檢和平板計數(shù)三種方法配合。比濁法和鏡檢簡便、快捷，在三角瓶、種子罐和發(fā)酵罐等發(fā)酵過程中發(fā)酵液的含菌量和純度的檢測中使用。比濁檢驗時取發(fā)酵液500ml，以空白液體培養(yǎng)基作對照，測定發(fā)酵液的OD650，OD650高于1.0時，發(fā)酵液應作稀釋，每個樣品設3個重復，按測定的OD650在“含菌量(cfu/ml)-OD650”標準曲線上查出相應的含菌量。鏡檢菌體形態(tài)時取發(fā)酵液500ml，以純菌種作對照，涂片，用番紅染色，在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)，與純菌種比較。在最終的成品質(zhì)量檢驗時采用平板計數(shù)法。檢測結(jié)果表明，粉末型生防菌劑的有效活菌數(shù)為8×109cfu/g，pH值7.2，雜菌率0％。
實施例4、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC No1451菌劑防治西瓜立枯病、猝倒病和枯萎病的效果立枯病、猝倒病、枯萎病是西瓜生長過程中主要病害，本實施例通過田間試驗測定枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC No1451菌劑對西瓜(興農(nóng)一號)出苗率、生長指標的影響及對苗期立枯病、猝倒病及中后期枯萎病的防治效果。具體方法如下供試藥品實施例3步驟2制備的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259CGMCC No1451粉末型菌劑、對照生防菌劑1號(購自北京市土肥工作站，活性成分為蠟質(zhì)芽孢桿菌，有效活菌數(shù)為108cfu/g)、對照生防菌劑2號(購自北京市土肥工作站，活性成分為枯草芽孢桿菌，有效活菌數(shù)為108cfu/g)。
本試驗7個處理，4次重復，共計28個小區(qū)。隨機排列。
處理1HL259菌劑1∶40濃度用于西瓜種子拌種。
處理2HL259菌劑1∶50濃度用于西瓜各子拌種。
處理3HL259菌劑1∶60濃度用于西瓜各子拌種。
處理4對照生防菌劑1號1∶50拌種。
處理5對照生防菌劑2號1∶50拌種。
處理650％福美雙可濕性粉劑1∶200拌種。
處理7不用藥劑處理種子(對照)每小區(qū)面積46.8M2，株距×行距＝36cm×65cm。試驗地土壤為沙壤土。有機質(zhì)(％)1.2828堿解氮93.56mg/kg速效磷55.95mg/kg速效鉀69.2mg/kgpH值8.09。前茬作物是西瓜。
播種前兩天根據(jù)拌種或拌種藥種比例，分別將各小區(qū)所需的藥劑和種子混裝于塑料袋中，采用手工抖動方式，將藥劑均勻包被或粘附在種子表面。采用直播方式進行播種。播種后7天調(diào)查出苗率，每小區(qū)隨機取樣4點，每點固定5株，每個處理共調(diào)查80株。播種20天后每小區(qū)隨機取樣20株西瓜幼苗，調(diào)查和記錄莖粗，蔓長，葉片長、葉寬，根長等主要生長指標。各處理小區(qū)藥劑對西瓜出苗和西瓜生長指標的影響結(jié)果如表4和表5所示，表明HL259菌劑以1∶40和1∶50濃度拌種處理西瓜種子，對西瓜出苗率和生長指標的促進作用均優(yōu)于其他處理。
表4.不同處理小區(qū)西瓜幼苗出苗率(％)調(diào)查結(jié)果

表5.不同處理小區(qū)西瓜生長指標調(diào)查結(jié)果


播種21天后，每小區(qū)隨機調(diào)查40株，記錄發(fā)病死亡株數(shù)，與對照相比計算西瓜立枯和猝倒病的防治結(jié)果。播種60天后，每小區(qū)隨機取樣20株，記錄病株率，并按以下分級標準調(diào)查病情基數(shù)，以病情指數(shù)計算枯萎病的防治效果。
分級標準如下0級—植株生長正常。
1級—病株比正常瓜秧稍短，剖莖維管束變黃褐色，瓜秧生產(chǎn)受到抑制。
2級—病株比正常瓜秧稍短，剖莖維管束變黃褐色，早晚表現(xiàn)正常，中午瓜秧萎蔫，影響西瓜生產(chǎn)。
3級—病株比正常瓜秧明顯縮短，萎蔫枯死，拔出病苗觀察根部變褐色，西瓜失去商品價值。
HL259菌劑對西瓜立枯和猝倒病的防治結(jié)果如表6，HL259菌劑以1∶40、1∶50和1∶60濃度拌種處理西瓜種子，對西瓜猝倒病具有較好的防治效果，分別為81.66％、77.08％和72.49％；對立枯病防效分別為88.89％、88.89％和72.22％。HL259菌劑對枯萎病的防治效果如表6，防病效果分別為91.24％、83.00％和75.95％，優(yōu)于其他處理。
采用Duncan’s新復極差測驗方法對猝倒病、立枯病和枯萎病防治效果進行了分析比較，以評價本試驗中藥劑處理之間防治西瓜三種主要病害的差異顯著性。方差分析表明，HL259菌劑三種不同的拌種濃度對猝倒病和立枯病的防治效果差異不顯著；對枯萎病的防治效果在5％和1％水平上均表現(xiàn)出顯著的的差異，且與其他各處理在5％和1％水平上也存在著較大的差異。
整個試驗期間西瓜生長正常，沒有發(fā)現(xiàn)藥害。說明HL259菌劑以1∶40和1∶50濃度拌種處理西瓜種子對西瓜生長安全。調(diào)查中未發(fā)現(xiàn)供試藥劑對非靶標生物的不良影響，說明該藥劑對環(huán)境安全。種子拌種的藥種比為1∶40-50防治效果較好。
表6.HL259菌劑防治西瓜枯萎病、猝倒病和立枯病試驗結(jié)果

實施例5、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC No.1451菌劑防治黃瓜蔓枯病的效果黃瓜蔓枯病是黃瓜生產(chǎn)中的重要病害，主要危害莖基部，初生油漬狀病斑，表面變白，出現(xiàn)裂痕，有時溢出膠狀物，該病害從秋到春季相對低溫時期危害作物，尤其是多濕條件下迅速蔓延。本實施例通過田間試驗測定HL259菌劑對津春2號(天津黃瓜研究所)黃瓜蔓枯病的防治效果。具體方法如下供試藥品實施例3步驟2制備的枯草芽孢桿菌(Baciillus subtilis)HL259CGMCC No.1451生防菌劑、對照生防菌劑1號(購自北京市土肥工作站，活性成分為蠟質(zhì)芽孢桿菌，有效活菌數(shù)為108cfu/g)。
本試驗設5個處理，4次重復，共計20個小區(qū)。采用隨機區(qū)組排列。每個大棚小區(qū)面積15.5m2，株距×行距＝30cm×90cm。試驗地土壤為沙壤土。前茬作物是黃瓜。
處理1HL259菌劑1∶20比例稀釋用于黃瓜噴施根部。
處理2HL259菌劑1∶10比例稀釋用于黃瓜噴施根部。
處理3HL259菌劑1∶5比例稀釋用于黃瓜噴施根部。
處理4對照生防菌劑1號1∶5比例稀釋噴施根部。
處理5清水對照施藥前調(diào)查病情基數(shù)，施藥后20d調(diào)查上次施藥結(jié)果，計算總體防效。蔓枯病的防效調(diào)查參照農(nóng)業(yè)部藥檢所《農(nóng)藥田間藥效試驗準則》(二)中有關(guān)“防治瓜類枯萎病藥效試驗準則”的方法。試驗中采用小區(qū)普查，記錄病株率，以病株率計算防治效果。
HL259菌劑的3個不同稀釋濃度及對照生防菌劑1號對黃瓜蔓枯病防治效果如表7所示，HL259菌劑分別按照1∶20、1∶10和1∶5比例稀釋劑量噴施黃瓜根莖部，對黃瓜蔓枯病的防效分別為53.31％、60.01％和86.60％；對照生防菌劑1號以1∶5比例稀釋劑量噴霧后防效為53.24％。從結(jié)果可以看出HL259菌劑分別按照1∶10和1∶5的防效明顯好于對照生防菌劑1號以1∶5比例稀釋處理(處理4)。HL259菌劑分別按照1∶20稀釋劑量的防效與處理4相當。
采用Duncan’s新復極差測驗方法對蔓枯病防治效果進行了分析比較，以評價本試驗中HL259菌劑不同劑量以及對照對照生防菌劑1號防治黃瓜蔓枯病的差異顯著性。方差分析表明，處理3(1∶5)在5％水平上和其它處理存在顯著差異，在1％水平上處理3(1∶5)和處理2(1∶10)差異不顯著，但與對照生防菌劑1號之間存在顯著差異。整個試驗期間黃瓜生長正常，沒有發(fā)現(xiàn)藥害。說明HL259菌劑以供試濃度噴施處理黃瓜植株根部對作物生長安全。調(diào)查中未發(fā)現(xiàn)供試藥劑對非靶標生物的不良影響，說明該藥劑對環(huán)境安全。HL259菌劑在黃瓜蔓枯病發(fā)病初期進行根莖部土壤噴施處理可有效控制該病的發(fā)展和傳播，是防治黃瓜蔓枯病的有效藥劑，對作物正常生長無不良危害，且防治效果顯著好于常規(guī)用藥品種和應用劑量。HL259菌劑可按照1∶10和1∶5稀釋比例劑量噴施黃瓜根莖部土壤。
表7.HL259菌劑的以不同稀釋比例劑量噴施黃瓜根莖部土壤防治黃瓜蔓枯病結(jié)果

實施例6、HL259菌劑防治辣椒疫霉病的效果辣椒疫病是辣椒生產(chǎn)中的一種毀滅性病害，在我國南方和北方都有分布，在溫室和大棚及露地均有發(fā)生，尤其大棚移栽的辣椒幼苗受害最為嚴重，常導致幼苗期成片死亡，成株期受害會造成落葉和整株萎蔫枯萎，生產(chǎn)中需要提供有效的防治措施。本實施例通過田間試驗測定HL259菌劑對京研辣椒3號、茄門甜椒辣椒疫病的防治效果。具體方法如下供試藥品實施例3步驟2制備的HL259粉末型菌劑、對照生防菌劑1號(購自北京市土肥工作站，活性成分為蠟質(zhì)芽孢桿菌，有效活菌數(shù)為108cfu/g)。
本試驗設5個處理，4次重復，共計20個小區(qū)。采用隨機區(qū)組排列。每個大棚小區(qū)面積15.5m2，株距×行距＝30cm×90cm。試驗地土壤為沙壤土。前茬作物是辣椒。
處理1HL259菌劑1∶50比例稀釋用于辣椒葉片噴霧和灌根處理；處理2HL259菌劑1∶20比例稀釋用于辣椒葉片噴霧和灌根處理；處理3HL259菌劑1∶10比例稀釋用于辣椒葉片噴霧和灌根處理；處理4對照生防菌劑1號1∶50比例稀釋用于辣椒葉片噴霧和灌根處理；處理5對照生防菌劑1號1∶20比例稀釋用于辣椒葉片噴霧和灌根處理；處理6對照生防菌劑1號1∶10比例稀釋用于辣椒葉片噴霧和灌根處理。
施藥前調(diào)查病情基數(shù)；施藥后15天調(diào)查上次施藥結(jié)果，計算總體防效。疫病的防效調(diào)查參照農(nóng)業(yè)部藥檢所《農(nóng)藥田間藥效試驗準則》(二)中有關(guān)“防治瓜類疫病藥效試驗準則”的方法。試驗中采用五點取樣方法，記錄病情指數(shù)，計算防治效果。其中，病情指數(shù)分級方法為0級，健康無癥；1級，地上部僅葉、果有病斑；3級，地上莖、枝有褐腐斑；5級，莖基部有褐腐斑；7級，地上莖、枝和莖基部均有褐腐斑；9級，全株枯死。
HL259菌劑的3個不同稀釋濃度及對照生防菌劑1號不同稀釋濃度對京研辣椒3號辣椒疫病的防治效果如表8所示，HL259菌劑分別按照1∶50、1∶20和1∶10比例稀釋劑量灌根施藥，對辣椒疫病的防效分別為45.74％、73.46％和83.46％；對照生防菌劑1號以1∶50、1∶20和1∶10比例稀釋劑量灌根后防效為37.60％、56.96％和58.70％；說明HL259菌劑分別按照1∶20和1∶10的灌根施藥防效明顯好于對照生防菌劑1號處理。HL259菌劑分別按照1∶50、1∶20和1∶10比例稀釋劑量噴霧葉片，對辣椒疫病的防效分別為56.33％、66.53％和74.48％；對照生防菌劑1號以1∶50、1∶20和1∶10比例稀釋劑量噴霧葉片后防效為42.64％、52.25％和59.97％；說明HL259菌劑分別按照1∶20和1∶10的噴霧施藥防效明顯好于對照生防菌劑1號處理。
HL259菌劑的3個不同稀釋濃度及對照生防菌劑1號不同稀釋濃度對茄門甜椒辣椒疫病的防治效果如表9所示，HL259菌劑分別按照1∶50、1∶20和1∶10比例稀釋劑量灌根施藥，對辣椒疫病的防效分別為77.32％、81.58％和86.35％；對照生防菌劑1號以1∶50、1∶20和1∶10比例稀釋劑量灌根后防效為49.19％、54.17％、57.47％。說明HL259菌劑分別按照1∶50、1∶20和1∶10的灌根施藥防效明顯好于對照生防菌劑1號處理。HL259菌劑分別按照1∶50、1∶20和1∶10比例稀釋劑量噴霧葉片，對辣椒疫病的防效分別為53.85％、59.52％和70.87％；對照生防菌劑1號以1∶50、1∶20和1∶10比例稀釋劑量噴霧葉片后防效為39.54％、51.44％和47.52％。說明HL259菌劑分別按照1∶50、1∶20和1∶10的防效明顯好于對照生防菌劑1號處理。
整個試驗期間辣椒生長正常，沒有發(fā)現(xiàn)藥害。說明HL259菌劑以供試濃度噴施處理辣椒植株葉片或灌根對作物生長安全。調(diào)查中未發(fā)現(xiàn)供試藥劑對非靶標生物的不良影響，說明該藥劑對環(huán)境安全。HL259菌劑在辣椒疫病發(fā)病初期進行根部灌根處理和葉部噴霧處理可有效控制該病的發(fā)展和傳播，是防治辣椒疫病的有效藥劑，對作物正常生長無不良危害，且防治效果顯著好于對照菌劑1號。較好的使用方式是HL259菌劑按照1∶20和1∶10稀釋比例劑量噴施辣椒，灌根處理根莖部土壤。
表8.HL259菌劑對京研辣椒3號的防治效果

表9.HL259菌劑對茄門甜椒的防治效果


序列表<160>1<210>1<211>1448<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)<400>1tgcctaatac atgcaagtcg agcggacaga tgggagcttg ctccctgatg ttagcggcgg 60acgggtgagt aacacgtggg taacctgcct gtaagactgg gataactccg ggaaaccggg120gctaataccg gatggttgtt tgaaccgcat ggttcagaca taaaaggtgg cttcggctac180cacttacaga tggacccgcg gcgcattagc tagttggtga ggtaacggct caccaaggcg240acgatgcgta gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac acggcccaga300ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg acggagcaac360gccgcgtgag tgatgaaggt tttcggatcg taaagctctg ttgttaggga agaacaagtg420ccgttcaaat agggcggcac cttgacggta cctaaccaga aagccacggc taactacgtg480ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg gaattattgg gcgtaaaggg540ctcgcaggcg gtttcttaag tctgatgtga aagcccccgg ctcaaccggg gagggtcatt600ggaaactggg gaacttgagt gcagaagagg agagtggaat tccacgtgta gcggtgaaat660gcgtagagat gtggaggaac accagtggcg aaggcgactc tctggtctgt aactgacgct720gaggagcgaa agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac780gatgagtgct aagtgttagg gggtttccgc cccttagtgc tgcagctaaa cgcattaagc840actcccgcct ggggagtacg gtcgcaagac tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc900acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac caggtcttga960catcctctga caatcctaga gataggacgt ccccttcggg ggcagagtga caggtggtgc 1020atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc 1080ttgatcttag ttgccagcat tcagttgggc actctaaggt gactgccggt gacaaaccgg 1140aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg acctgggcta cacacgtgct 1200acaatggaca gaacaaaggg cagcgaaacc gcgaggttaa gccaatccca caaatctgtt 1260ctcagttcgg atcgcagtct gcaactcgac tgcgtgaagc tggaatcgct agtaatcgcg 1320gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccacg 1380agagtttgta acacccgaag tcggtgaggt aaccttttag gagccagccg ccgaaggtgg 1440gacagatg1448
權(quán)利要求
1.枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC No.1451。
2.一種微生物菌劑，它的活性成分為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC No.1451。
3.一種制備權(quán)利要求2所述的微生物菌劑的方法，是在YMA或玉米漿培養(yǎng)基中發(fā)酵枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC No.1451，將得到的發(fā)酵液與基質(zhì)混合得到微生物菌劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述玉米漿培養(yǎng)基中含有蔗糖5g，玉米粉2g，KH2PO40.05g，(NH4)2SO40.5g，K2HPO40.05g，MgSO40.025g，CaCO32g，加水1000ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵條件中，培養(yǎng)溫度為25-30℃，通氣量為1∶0.5-1∶1.6，攪拌速度為200-400rpm，培養(yǎng)時間為24-48h；所述通氣量為每分鐘通入發(fā)酵罐的空氣體積與發(fā)酵罐中發(fā)酵液的體積比值。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)溫度為28-30℃，通氣量為1∶1-1∶1.2，攪拌速度為250-300rpm，培養(yǎng)時間為24-30h。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述方法中，發(fā)酵時加入植物油或有機硅油作為消沫劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述植物油的質(zhì)量百分含量為1-2％；所述有機硅油的質(zhì)量百分含量為0.04-01％。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述基質(zhì)為草炭、微粉碳酸鈣或凹凸棒土或膨潤土。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述微生物菌劑中枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC No.1451的活菌數(shù)為5×109cfu/g，pH值為6.0-7.8。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株枯草芽孢桿菌及其應用，其目的是提供一株具有廣譜殺菌活性的枯草芽孢桿菌和以該株枯草芽孢桿菌為活性成分的微生物菌劑。本發(fā)明所提供的枯草芽孢桿菌是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC No1451。以枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC No1451為活性成分的微生物菌劑可有效防治蔬菜、瓜類、豆類和苜蓿生產(chǎn)中由鐮刀菌、腐霉菌、疫霉菌和立枯絲核菌引起的根腐病、猝倒病和立枯病等植物病害，而且該微生物菌劑的制備工藝簡單、發(fā)酵周期短、投入低和易于保存。
文檔編號C12R1/125GK1766091SQ20051010487
公開日2006年5月3日 申請日期2005年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月23日
發(fā)明者劉西莉, 李健強, 賈小紅, 盧志軍, 王建輝, 李旭軍, 王紅梅 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學