專利名稱：富集和純化糖基化蛋白的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及的是一種將凝集素連接到修飾后的磁微粒上，利用這種固定在磁微粒上的凝集素特異地結合糖基化蛋白，從而對其分離、富集和純化的方法。
背景技術：
凝集素(Lectins)是一類非抗體的蛋白質或糖蛋白，能與糖類專一的非共價結合，并具有凝集細胞和沉淀聚糖和復合糖的作用。其結構含有糖類識別域(CRD)，并因此能與糖類發(fā)生專一結合，對殘基的異頭構型、糖苷鍵類型以及寡糖鏈的結構或構象具有專一性。如伴刀豆凝集素(Con A)是來自刀豆的一種凝集素，能專一的結合糖鏈內部的或非還原端的α-甘露糖(Man)。而伴刀豆凝集素可通過適當的化學方法連接到固相支持物上，N-連接的高甘露糖型糖蛋白中富含甘露糖殘基，因此可以利用固相支持物上的伴刀豆凝集素從蛋白混合物中提純高甘露糖型糖蛋白。目前，國外已有商品化的用于分離一些特異結構糖基化蛋白的親和層析柱。
現有糖基化蛋白分離富集技術主要存在如下缺點1.由于已有商品化的是用于分離一些特異結構糖基化蛋白的親和層析柱。親和層析純化必須針對某一分離對象，制備專一的配基和尋求層析的穩(wěn)定條件，這就要求親和層析柱專柱專用，即一個柱子只能提純一類糖蛋白，因此親和層析的應用范圍受到了一定的限制，方法較為復雜。
2.分離富集糖基化蛋白的親和層析柱對糖基化蛋白的回收率較低。
3.分離富集糖基化蛋白的親和層析柱價格昂貴。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種基于微納米磁性技術分離、富集和純化糖基化蛋白的方法，其解決了背景技術中用親和層析柱對糖基化蛋白分離富集方法復雜、回收率較低及價格昂貴的技術問題。
本發(fā)明的技術解決方案是一種富集和純化糖基化蛋白的方法，其特征在于該方法包括以下步驟1)凝集素的固定化(1)環(huán)氧乙基衍生化磁粒的預制將環(huán)氧乙基衍生化的磁粒加入離心管中，標為1號離心管；再加入偶聯緩沖液，搖勻，在磁性分離器上分離、棄上清液；(2)固定化反應取凝集素溶液，加于1號離心管中，搖勻；置于空氣振蕩器中，攝氏35～40℃反應40～90分鐘；反應完畢，在磁性分離器上分離、棄上清液；則，1號離心管中的凝集素固定化到環(huán)氧乙基衍生化磁粒上；(3)清洗向1號離心管中加入清洗緩沖液，搖勻，在磁性分離器上分離、棄上清液；(4)封閉向1號離心管中加入封閉液，搖勻，置于空氣振蕩器中，攝氏35～40℃反應1～2小時；反應完畢，在磁性分離器上分離、棄上清液；(5)清洗在1號離心管中加入清洗緩沖液，混勻，在磁性分離器上分離、棄上清液；重復清洗3次；(6)保存加入保存緩沖液，于攝氏2～6℃保存；2)糖基化蛋白的分離純化(1)預制取制備好的凝集素固定化到環(huán)氧乙基衍生化磁粒，加入4號離心管，在磁性分離器上分離、棄上清液；(2)結合向4號離心管中加入結合緩沖液，再加入標準糖基化蛋白，然后再加入超純水，置于搖床上，在室溫下搖動4～6小時；將4號離心管，在磁性分離器上分離、棄上清液；(3)清洗向4號離心管中加入清洗緩沖液1，置于搖床上，搖動1～3分鐘，在磁性分離器上分離、棄上清液；再重復清洗一次；(4)清洗向4號離心管中加入清洗緩沖液2，清洗1～3分鐘，在磁性分離器上分離、棄上清液；再重復清洗二次；(5)洗脫向4號離心管中加入清洗緩沖液3，攝氏20～30℃清洗20～40分鐘，在磁性分離器上分離，取上清液移入5號離心管中，即得富集純化的糖基化蛋白；(6)脫鹽將富集純化的糖基化蛋白裝入透析袋中，用水于攝氏2～6℃透析1.5～2.5小時后換水，重復透析三次，脫去清洗緩沖液3。
上述凝集素的固定化中，所述的偶聯緩沖液以采用pH8.3 0.1M的NaHC030.5M的NaCl緩沖液為宜；也可采用或磷酸鹽、碳酸鹽或乙酸鹽等緩沖液。
上述凝集素的固定化中，所述的封閉液為加入1mg/ml的脫脂奶粉或牛血清白蛋白的磷酸鹽、碳酸鹽或乙酸鹽等緩沖液。
上述凝集素的固定化中，所述的清洗緩沖液、保存緩沖液均以采用0.5％的含吐溫-201×磷酸鹽為宜，也可采用或碳酸鹽緩沖液，或乙酸鹽緩沖液等。
上述糖基化蛋白的分離純化中，所述的結合緩沖液以采用1mM CaCl2、1mMMnCl2、10mM Tris-HCl、pH7.0的緩沖液為宜，也可采用磷酸鹽、碳酸鹽或乙酸鹽等緩沖液；所述的清洗緩沖液1以采用1mM CaCl2、1mM MnCl2、10mM Tris-HCl、pH7.0的緩沖液為宜，也可采用磷酸鹽、碳酸鹽或乙酸鹽等緩沖液；所述的清洗緩沖液2以采用1mM CaCl2、1mM MnCl2、10mM Tris-HCl、pH7.0的緩沖液為宜，也可采用磷酸鹽、碳酸鹽或乙酸鹽等緩沖液。
上述糖基化蛋白的分離純化中，清洗緩沖液3以采用1mM CaCl2、1mM MnCl2、1mM KCl、100mM α-甲基甘露糖、10mM Tris-HCl、pH7.0的緩沖液為宜，也可采用磷酸鹽、碳酸鹽或乙酸鹽等緩沖液；所述的再生緩沖液1以采用1mM CaCl2，1mM MnCl2、10mM Tris-HCl、pH4.5的緩沖液為宜，也可采用磷酸鹽、碳酸鹽或乙酸鹽等緩沖液；所述的再生緩沖液2以采用1mM CaCl2、1mM MnCl2、10mMTris-HCl、pH8.0的緩沖液為宜，也可采用磷酸鹽、碳酸鹽或乙酸鹽等緩沖液。
上述凝集素的固定化中，于空氣振蕩器上的反應溫度以攝氏37℃為宜，反應時間以60分鐘為宜；所述凝集素固定化到環(huán)氧乙基衍生化磁粒的保存溫度以攝氏4℃為宜；所述糖基化蛋白的分離純化中，富集純化的糖基化蛋白的透析溫度以攝氏4℃為宜，每次透析的時間以1小時為宜。
上述糖基化蛋白經分離純化后，凝集素固定化到環(huán)氧乙基衍生化磁粒上的凝集素可再生，再生步驟包括1)再生向4號離心管中加入再生緩沖液1，攝氏20～30℃清洗20～40分鐘，在磁性分離器上分離、棄上清液；重復再生一次；2)保存向4號離心管中加入保存緩沖液，于攝氏2～6℃保存。
上述環(huán)氧乙基衍生化磁粒經預制、固定化反應、清洗后，凝集素固定化到環(huán)氧乙基衍生化磁粒上，該凝集素固定化到環(huán)氧乙基衍生化磁粒上的固定化效率可進行檢測，檢測步驟包括1)將固定化反應中1號離心管在磁性分離器上所棄的上清液液移入2號離心管中；2)在固定化反應后的清洗中將1號離心管在磁性分離器上所棄的上清液移入3號離心管中；3)固定化效率的檢測以偶聯緩沖液為空白，取凝集素溶液及2號離心管中的溶液，將兩者在280nm處的吸光度值記作OD1及OD2；以清洗緩沖液為空白，3號離心管中溶液在280nm處的吸光度值記作OD3，則偶聯效率為偶聯效率％＝(OD1-OD2-OD3)/OD1。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點1.分離、富集和純化糖基化蛋白的方法簡便。
2.回收率較高。
3.分離富集糖基化蛋白的親和層析柱成本低。
4.使用便利。用時可隨時連接，不受凝集素種類的影響。


圖1為本發(fā)明的原理示意圖；圖2為本發(fā)明富集純化的糖基化蛋白的SDS-PAGE電泳效果示意圖。
附面說明1-泳道1，是蛋白Mark；2-泳道2，是未連接到磁微粒上的蛋白泳道；3-泳道3，是由洗液1洗下來的蛋白泳道；4-泳道4，是由洗液2洗下來的蛋白泳道；5-泳道5，是由洗液3洗下來的蛋白泳道。
具體實施例方式
本發(fā)明將凝集素連接到功能化的納米級的磁微粒，如環(huán)氧乙基、氨基衍生化的納米級的磁微粒上，用于分離富集糖基化蛋白。糖基化蛋白是蛋白質和單糖鏈共價相連接后形成的，主要用于細胞識別，生理功能主要用于免疫系統(tǒng)的細胞識別等。
本發(fā)明實施例的實現步驟如下1)凝集素的固定化(1)環(huán)氧乙基衍生化磁粒的預制將環(huán)氧乙基衍生化的磁粒搖勻后，用移液器移取200μl于離心管中，標為1號離心管。向1號離心管中加入400μl偶聯緩沖液，用手搖勻，在磁性分離器上分離3分鐘，保持1號離心管在磁性分離器上，用移液器移取上清液棄去。
(2)固定化反應取凝集素溶液，如伴刀豆凝集素(ConA)溶液300μL，約150μg，加于1號離心管中，搖勻，并將其置于空氣振蕩器中，在37℃條件下反應1小時。反應完畢，磁性分離3分鐘，保持1號離心管在磁性分離器上，用移液器移取上清液于2號離心管中。則，1號離心管中的伴刀豆凝集素固定化到環(huán)氧乙基衍生化磁粒上。
(3)清洗向1號離心管中加入400μl清洗緩沖液，用手搖勻，置于磁性分離器上，分離3分鐘，保持1號離心管在磁性分離器上，用移液器移取上清液于3號離心管中。
(4)固定化效率的檢測以偶聯緩沖液為空白，取800μl伴刀豆凝集素溶液及2號離心管中的溶液，兩者在280nm處的吸光度值記作OD1及OD2；以清洗緩沖液為空白，3號離心管中溶液在280nm處的吸光度值記作OD3，則偶聯效率為偶聯效率％＝(OD1-OD2-OD3)/OD1(5)封閉將1號離心管置于磁性分離器上，分離3分鐘，保持1號離心管在磁性分離器上，用移液器移取上清棄去。向1號離心管中加入封閉液800μl，輕搖混勻，置于空氣振蕩器中，在37℃條件下反應2小時。反應完畢，磁性分離3分鐘，保持1號離心管在磁性分離器上，用移液器移取上清液棄去。
(6)清洗在1號離心管中加入800μl的清洗緩沖液，用移液器混勻，置于磁性分離器上分離3分鐘，保持1號離心管在磁性分離器上，用移液器移取上清液棄去，重復此步驟3次。
(7)保存在伴刀豆凝集素固定化到環(huán)氧乙基衍生化磁粒中加入1ml的保存緩沖液，于4℃保存。
2)糖基化蛋白的分離純化本實施例中的糖蛋白為高甘露糖型蛋白核糖核酸酶B，核糖核酸酶B是一種甘露糖修飾的蛋白酶，其能與伴刀豆凝集素特異結合。
(1)伴刀豆凝集素固定化到環(huán)氧乙基衍生化磁粒的預制取制備好的伴刀豆凝集素固定化到環(huán)氧乙基衍生化磁粒，加入4號離心管，在磁性分離器上分離3分鐘，保持4號離心管在磁性分離器上，用移液器吸取上清液棄去。
(2)結合向4號離心管中加入200μl的結合緩沖液，如1mM CaCl2、1mMMnCl2，10mM Tris-HCl pH7.0的緩沖液；再加入2mg/ml的標準糖基化蛋白，如核糖核酸酶B 300μl；再加300μl超純水，置于搖床上，在室溫下搖動4～6小時，使之充分偶聯。取出4號離心管，搖勻后置于磁性分離器上分離3分鐘，移取上清液于5號離心管中。
(3)清洗向4號離心管中加400μl的清洗緩沖液1，如1mM CaCl2、1mMMnCl2、10mM Tris-HCl pH7.04的緩沖液，在搖床上搖動2分鐘，置于磁性分離器上分離3分鐘，吸取上清液置于6號離心管中；重復清洗一次。
(4)清洗向4號離心管中加400μl的清洗緩沖液2，如1mM CaCl2、1mMMnCl2、10mM Tris-HCl pH7.0的緩沖液，清洗2分鐘，置于磁性分離器上分離3分鐘，吸取上清置于7號離心管中；再重復清洗兩次。清洗緩沖液1、2用于除去非特異性結合的蛋白。
(5)洗脫向4號離心管中加入800μl洗清緩沖液液3，如1mM CaCl2，1mMMnCl2，1mM KCl，100mM α-甲基甘露糖(a-methyl mannose)，10mM Tris-HCl pH7.0；于25℃清洗30分鐘。置于磁性分離器上分離3分鐘，吸取上清于8號離心管中，即為富集純化的高甘露糖型蛋白。
(6)脫鹽將富集純化的高甘露糖型蛋白裝入透析袋中，用1L水于4℃透析過2小時后換水，重復三次。
(7)檢測用SDS-PAGE電泳檢測富集純化的蛋白，參見圖2。清洗緩沖液3中有α-甲基甘露糖，其與伴刀豆凝集素的特異結合能力要比核糖核酸酶B與伴刀豆凝集素特異結合能力強。在此發(fā)生了競爭性結合，而將核糖核酸酶B洗下來，所以泳道5出現了明顯的核糖核酸酶B的條帶。
(8)再生向4號離心管中加入800μl的再生緩沖液1，如1mM CaCl2，1mMMnCl2，10mM Tris-HCl pH4.5，于25℃清洗30分鐘。置于磁性分離器上分離3分鐘，吸取上清液，棄去。
(9)再生向4號離心管中加入800μl的再生緩沖液2，如lmM CaCl2，1mMMnCl2，10mM Tris-HCl pH8.0，25℃清洗30min左右。置磁性分離器上分離3分鐘，吸取上清液，棄去。
(10)保存向4號離心管中加入500μl的保存緩沖液，如1mM CaCl2，1mMMnCl2，0.02％NaN3，10mM Tris-HCl pH6.0，于4℃保存。
這種固定在伴刀豆凝集素固定化到環(huán)氧乙基衍生化磁粒上的凝集素可多次再生，重復使用，富集純化糖蛋白的次數至少為10次。
本實施例中的糖蛋白為高甘露糖型蛋白核糖核酸酶B，核糖核酸酶B是一種甘露糖修飾的蛋白酶，因為其具有與伴刀豆凝集素(Con A)特異結合能力，所以由清洗緩沖液1、2洗出的量少，而清洗緩沖液3中有甘露糖，可以和核糖核酸酶B競爭性結合，而將核糖核酸B洗下，所以泳道5的條帶更明顯。參見圖2。
權利要求
1.一種富集和純化糖基化蛋白的方法，其特征在于該方法包括以下步驟1)凝集素的固定化(1)環(huán)氧乙基衍生化磁粒的預制將環(huán)氧乙基衍生化的磁粒加入離心管中，標為1號離心管；再加入偶聯緩沖液，搖勻，在磁性分離器上分離、棄上清液；(2)固定化反應取凝集素溶液，加于1號離心管中，搖勻；置于空氣振蕩器中，攝氏35～40℃反應40～90分鐘；反應完畢，在磁性分離器上分離、棄上清液；則，1號離心管中的凝集素固定化到環(huán)氧乙基衍生化磁粒上；(3)清洗向1號離心管中加入清洗緩沖液，搖勻，在磁性分離器上分離、棄上清液；(4)封閉向1號離心管中加入封閉液，搖勻，置于空氣振蕩器中，攝氏35～40℃反應1～2小時；反應完畢，在磁性分離器上分離、棄上清液；(5)清洗在1號離心管中加入清洗緩沖液，混勻，在磁性分離器上分離、棄上清液；重復清洗3次；(6)保存加入保存緩沖液，于攝氏2～6℃保存；2)糖基化蛋白的分離純化(1)預制取制備好的凝集素固定化到環(huán)氧乙基衍生化磁粒，加入4號離心管，在磁性分離器上分離、棄上清液；(2)結合向4號離心管中加入結合緩沖液，再加入標準糖基化蛋白，然后再加入超純水，置于搖床上，在室溫下搖動4～6小時；將4號離心管，在磁性分離器上分離、棄上清液；(3)清洗向4號離心管中加入清洗緩沖液1，置于搖床上，搖動1～3分鐘，在磁性分離器上分離、棄上清液；再重復清洗一次；(4)清洗向4號離心管中加入清洗緩沖液2，清洗1～3分鐘，在磁性分離器上分離、棄上清液；再重復清洗二次；(5)洗脫向4號離心管中加入清洗緩沖液3，攝氏20～30℃清洗20～40分鐘，在磁性分離器上分離，取上清液移入5號離心管中，即得富集純化的糖基化蛋白；(6)脫鹽將富集純化的糖基化蛋白裝入透析袋中，用水于攝氏2～6℃透析1.5～2.5小時后換水，重復透析三次，脫去清洗緩沖液3。
2.根據權利要求1所述的富集和純化糖基化蛋白的方法，其特征在于所述凝集素的固定化中，所述的偶聯緩沖液為pH8.3 0.1M的NaHCO30.5M的NaCl緩沖液；或為磷酸鹽、碳酸鹽或乙酸鹽緩沖液。
3.根據權利要求1或2所述的富集和純化糖基化蛋白的方法，其特征在于所述凝集素的固定化中，所述的封閉液為加入1mg/ml的脫脂奶粉或牛血清白蛋白的磷酸鹽、碳酸鹽或乙酸鹽緩沖液。
4.根據權利要求3所述的富集和純化糖基化蛋白的方法，其特征在于所述凝集素的固定化中，所述的清洗緩沖液、保存緩沖液均為0.5％的含吐溫-20 1×磷酸鹽，或碳酸鹽緩沖液，或乙酸鹽緩沖液。
5.根據權利要求4所述的富集和純化糖基化蛋白的方法，其特征在于所述糖基化蛋白的分離純化中，所述的結合緩沖液為1mM CaCl2、1mM MnCl2、10mMTris-HCl pH7.0的緩沖液，或為磷酸鹽、碳酸鹽或乙酸鹽緩沖液；所述的清洗緩沖液1為1mM CaCl2、1mM MnCl2、10mM Tris-HCl pH 7.0的緩沖液，或為磷酸鹽、碳酸鹽或乙酸鹽緩沖液；所述的清洗緩沖液2為1mM CaCl2、1mM MnCl2、10mM Tris-HCl pH 7.0的緩沖液，也可采用磷酸鹽、碳酸鹽或乙酸鹽緩沖液。
6.根據權利要求5所述的富集和純化糖基化蛋白的方法，其特征在于所述糖基化蛋白的分離純化中，所述的清洗緩沖液3為1mM CaCl2、1mM MnCl2、1mMKCl、100mM α-甲基甘露糖(a-methyl mannose)、10mM Tris-HCl pH 7.0的緩沖液，或磷酸鹽、碳酸鹽或乙酸鹽緩沖液；所述的再生緩沖液1為1mM CaCl2、1mM MnCl2、10mM Tris-HCl pH 4.5的緩沖液，或磷酸鹽、碳酸鹽或乙酸鹽緩沖液；所述的再生緩沖液2為1mM CaCl2，1mM MnCl2，10mM Tris-HCl pH 8.0的緩沖液，或磷酸鹽、碳酸鹽或乙酸鹽緩沖液。
7.根據權利要求6所述的富集和純化糖基化蛋白的方法，其特征在于所述的凝集素的固定化中，于空氣振蕩器上的反應溫度為攝氏37℃，反應時間60分鐘；所述凝集素固定化到環(huán)氧乙基衍生化磁粒的保存溫度為攝氏4℃；所述糖基化蛋白的分離純化中，富集純化的糖基化蛋白的透析溫度為攝氏4℃，每次透析的時間為1小時。
8.根據權利要求7所述的富集和純化糖基化蛋白的方法，其特征在于所述的糖基化蛋白經分離純化后，凝集素固定化到環(huán)氧乙基衍生化磁粒上的凝集素的再生步驟包括1)再生向4號離心管中加入再生緩沖液1，攝氏20～30℃清洗20～40分鐘，在磁性分離器上分離、棄上清液；重復再生一次；2)保存向4號離心管中加入保存緩沖液，于攝氏2～6℃保存。
9.根據權利要求8所述的富集和純化糖基化蛋白的方法，其特征在于所述的環(huán)氧乙基衍生化磁粒經預制、固定化反應、清洗后，凝集素固定化到環(huán)氧乙基衍生化磁粒上，該凝集素固定化到環(huán)氧乙基衍生化磁粒上的固定化效率的檢測步驟包括1)將固定化反應中1號離心管在磁性分離器上所棄的上清液液移入2號離心管中；2)在固定化反應后的清洗中將1號離心管在磁性分離器上所棄的上清液移入3號離心管中；3)固定化效率的檢測以偶聯緩沖液為空白，取凝集素溶液及2號離心管中的溶液，將兩者在280nm處的吸光度值記作OD1及OD2；以清洗緩沖液為空白，3號離心管中溶液在280nm處的吸光度值記作OD3，則偶聯效率為偶聯效率％＝(OD1-OD2-OD3)/OD1。
全文摘要
一種富集和純化糖基化蛋白的方法，其凝集素的固定化是將環(huán)氧乙基衍生化的磁粒加入離心管中，經固定化反應、清洗、封閉、重復清洗，凝集素固定化到環(huán)氧乙基衍生化磁粒，加入保存緩沖液保存。其糖基化蛋白的分離純化是將制備好的凝集素固定化到環(huán)氧乙基衍生化磁粒經結合，加入標準糖基化蛋白充分偶聯，再經多次清洗后，洗脫，得富集純化的糖基化蛋白，裝入透析袋中脫鹽。本發(fā)明解決了背景技術中用親和層析柱對糖基化蛋白分離富集方法復雜、回收率較低及價格昂貴的技術問題。本發(fā)明實現方法簡便，回收率較高，分離富集糖基化蛋白的親和層析柱成本低，使用便利。
文檔編號C12N9/24GK1958599SQ200510096270
公開日2007年5月9日 申請日期2005年11月3日 優(yōu)先權日2005年11月3日
發(fā)明者李錚, 陳超, 楊剛龍, 崔亞麗 申請人:陜西西大北美基因股份有限公司