專利名稱：生產(chǎn)重組人α－乳清蛋白的動物乳腺生物反應(yīng)器——轉(zhuǎn)基因克隆大型家畜的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，特別是涉及轉(zhuǎn)基因—克隆技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)基因動物研究是人類按著自已的意愿有目的、有計劃、有根據(jù)、有預(yù)見地改變動物的遺傳組成，而改變其遺傳組成的目的是多種多樣的。比如遺傳學(xué)家希望通過改變動物的遺傳組成來觀察其表型變化，生理學(xué)家希望通過特定基因的表達(dá)來研究該基因?qū)C(jī)體生理狀況的影響。與動物生產(chǎn)有關(guān)的轉(zhuǎn)基因研究則希望通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)來賦予動物新的表型性狀。該項研究在實驗技術(shù)上依賴分子生物學(xué)、動物胚胎和配子操作技術(shù)。
轉(zhuǎn)基因動物的制作方法目前主要有原核期胚胎的顯微注射，逆轉(zhuǎn)錄病毒感染發(fā)育早期的動物胚胎，精子載體法，ES細(xì)胞技術(shù)，PGCs技術(shù)，體細(xì)胞核移植技術(shù)，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染MII期的卵母細(xì)胞，精子頭與DNA合并注射卵母細(xì)胞法。這些方法上的改進(jìn)與提高大大地促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因動物研究由實驗室向生產(chǎn)實踐轉(zhuǎn)化的進(jìn)程。
其中最傳統(tǒng)和最常用的方法是原核期胚胎的顯微注射，該方法由美國人Gordon發(fā)明，是目前應(yīng)用比較廣泛、效果比較穩(wěn)定的制作轉(zhuǎn)基因動物的方法之一。即在顯微操作儀下通過一毛細(xì)玻璃管將外源DNA注射進(jìn)動物受精卵細(xì)胞的原核內(nèi)，再將該受精卵細(xì)胞移植進(jìn)受體細(xì)胞子宮內(nèi)，再將該受精卵分裂時，外源DNA可能整合入宿主染色體組，待該受精卵發(fā)育成熟即可獲得轉(zhuǎn)基因動物。但是顯微注射法獲得的轉(zhuǎn)基因家畜的效率極低，特別是牛，羊和豬等，往往低于1％，這將大大增加制作轉(zhuǎn)基因家畜的成本。
隨著體細(xì)胞克隆技術(shù)的發(fā)展，基因操作技術(shù)與克隆技術(shù)相結(jié)合是將成為轉(zhuǎn)基因動物，特別是大家畜生產(chǎn)的主要方式。目前，取得的主要進(jìn)展是轉(zhuǎn)基因技術(shù)和靶位操作技術(shù)在克隆動物上的應(yīng)用。首先，利用克隆進(jìn)行轉(zhuǎn)基因是指在核移植前，先把目的基因和標(biāo)記基因的融合基因?qū)肱囵B(yǎng)的體細(xì)胞，再通過標(biāo)記基因的表現(xiàn)來篩選轉(zhuǎn)基因的陽性細(xì)胞及其克隆，然后再移植。1997年，英國PPL公司的科學(xué)家Schnieke與羅斯林研究所的Wilmut等聯(lián)手通過體細(xì)胞核移植技術(shù)率先在世界上制作了轉(zhuǎn)基因綿羊。利用胎兒成纖維細(xì)胞系，經(jīng)過轉(zhuǎn)染之后，再克隆。被轉(zhuǎn)染的外源基因含有人的凝血因子IX基因的完整編碼區(qū)和β-BLG基因啟動子，凝血因子IX能被高效表達(dá)，每毫升奶中包含125μg的凝血因子IX蛋白。利用克隆進(jìn)行轉(zhuǎn)基因，一旦核移植成功，從理論上講，轉(zhuǎn)基因成功率為100％。原核注射的方法會使大量的非轉(zhuǎn)基因胚胎被懷孕，這是一種資源浪費，而利用克隆進(jìn)行轉(zhuǎn)基因技術(shù)不會造成代理母親去懷孕非轉(zhuǎn)基因動物。此外，利用克隆進(jìn)行轉(zhuǎn)基因時，轉(zhuǎn)基因動物的性別會被提前決定。這樣的話，如果想得到能在乳腺中表達(dá)蛋白質(zhì)，就可以使克隆的轉(zhuǎn)基因動物全是雌性動物。
由于動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)能按照人們的意愿改變動物的生產(chǎn)性狀，得到人們所需要的產(chǎn)品，特別是一些蛋白藥品及保健品，科學(xué)家們已經(jīng)開始將動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用到實踐當(dāng)中，目前動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)主要有以下一些應(yīng)用(1)、促進(jìn)動物生長、提高畜產(chǎn)品產(chǎn)量、改善產(chǎn)品品質(zhì)，(2)、動物抗病育種，(3)建立診斷和治療人類疾病的動物模型，(4)生產(chǎn)藥用蛋白。
動物乳腺生物反應(yīng)器是一種利用動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)在乳腺細(xì)胞中表達(dá)多肽藥物、工業(yè)酶、疫苗和抗體等蛋白的技術(shù)。通過基因工程的方法改造乳腺的功能有利于我們進(jìn)一步研究乳腺癌的機(jī)制，提高乳汁的營養(yǎng)成分，甚至可以合成藥物。該技術(shù)具有低投入高產(chǎn)出的特點，其效率是利用以大腸桿菌和動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的一百倍，是一種非常有潛力的高新技術(shù)。1987年，Simons等人在轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺中首次成功地表達(dá)羊乳球蛋白基因，并且小鼠奶樣中的蛋白含量高達(dá)23克/升，大約是動物細(xì)胞表達(dá)蛋白的400倍以上。該技術(shù)一經(jīng)出現(xiàn)就得到迅猛的發(fā)展。目前，牛乳白蛋白基因人組織血纖維蛋白溶酶原因子，人生長激素基因，人體抗胰蛋白酶基因，人尿激酶基因和人干擾素基因等基因都在小鼠的乳腺中得到表達(dá)。許許多多的著名科學(xué)家都認(rèn)為這將是畜牧業(yè)前所未有的革命，可能會給社會帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益。在過去的十年里，已經(jīng)有十幾家公司開展這方面的研究工作。尤其，隨著動物克隆技術(shù)成熟，轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到了更充分的發(fā)展。這將使乳腺生物反應(yīng)器的大規(guī)模生產(chǎn)更加現(xiàn)實，因此一場圍繞該技術(shù)的國際性競爭將是必然。
乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥物的優(yōu)越性讓藥物蛋白基因表達(dá)在某一特定部位，而不是隨機(jī)地在身體任意表達(dá)?？茖W(xué)家們一致認(rèn)為，就藥物而言，理想的表達(dá)場所是乳腺。主要有以下原因1、動物乳腺是一個封閉的系統(tǒng)。乳腺組織表達(dá)的蛋白質(zhì)絕大部分不會回到血液循環(huán)，這樣就避免大量表達(dá)的外源性蛋白質(zhì)對動物健康造成的危害。2、乳腺組織是一種有效的蛋白質(zhì)合成器。一頭奶牛一年可生產(chǎn)乳蛋白250～300kg，一只綿羊和山羊可生產(chǎn)乳蛋白25～30kg，即使一只家兔，一年生產(chǎn)乳蛋白也可達(dá)到3～5kg，如果把百分之一的乳蛋白合成醫(yī)用蛋白，其產(chǎn)量就十分可觀。3、乳腺組織可以對人體蛋白質(zhì)進(jìn)行正確的修飾和后加工，產(chǎn)品的生物學(xué)活性接近天然產(chǎn)品。4、在動物乳腺表達(dá)的外源基因可以遺傳。一旦獲得一個生產(chǎn)某種有價值蛋白質(zhì)的動物個體，可以用常規(guī)畜牧技術(shù)繁殖生產(chǎn)群體，研究技術(shù)雖然復(fù)雜，費用高昂，但其研究生產(chǎn)的放大過程卻較容易5、縮短新藥上市周期。從藥物生產(chǎn)開發(fā)周期方面來看，目前一種新藥從它的研制開發(fā)、藥審，直到上市，整個過程需要10～15年，如果利用轉(zhuǎn)基因動物乳腺反應(yīng)器，新藥生產(chǎn)的周期約5年。6、可以獲取巨額經(jīng)濟(jì)利潤。如荷蘭金發(fā)馬公司用轉(zhuǎn)基因牛生產(chǎn)乳鐵蛋白，預(yù)計每年從乳汁中提煉出來營養(yǎng)奶粉銷售額是50億美元。
利用乳腺生物反應(yīng)器的方法改造奶牛、奶山羊，使生產(chǎn)出的奶成分近似于人奶，既有營養(yǎng)的功能，又有藥用的功能，這種奶可以使孩子長得高大，促進(jìn)大腦和神經(jīng)發(fā)育，增強免疫功能，這種新型保健品一定會有廣闊的前途。改善奶的營養(yǎng)成份或生理生化特征也是人們希望通過改變動物的遺傳組成來實現(xiàn)的目標(biāo)之一，即制造所謂的營養(yǎng)藥品(Nutraceuticals)。家畜奶及其加工產(chǎn)品可提供人類30％的營養(yǎng)蛋白，含有豐富的必需氨基酸、鈣和無機(jī)磷酸鹽，以及消化率很高的酪蛋白，是人類高質(zhì)量的營養(yǎng)來源；但乳用家畜奶在品質(zhì)上還不盡如人意。因此，人們一直在研究如何改善奶品質(zhì)。自Gordon創(chuàng)立動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)以來，世界各國都爭先開展轉(zhuǎn)基因育種及其相關(guān)技術(shù)研究。研究表明外源基因不僅能在轉(zhuǎn)基因動物中得到整合與表達(dá)，而且能獲得組織特異性(乳腺組織、輸卵管)和發(fā)育特異性表達(dá)，并且現(xiàn)在能夠利用分子技術(shù)找到調(diào)節(jié)乳成分的所有基因。
牛乳的蛋白含量比人乳的高，牛乳為33g/L，而人乳僅為10g/L。其中最重要的是人乳中乳清蛋白含量(68％)比酪蛋白(32％)比例高，具有免疫活性的乳鐵蛋白(15％)和溶菌酶(4％)含量高，且缺乏β-乳球蛋白和κ-酪蛋白。然而，牛乳中含有較高的各種酪蛋白，相應(yīng)的乳清蛋白含量較少。蛋白牛乳中的β-乳球蛋白和α-乳白蛋白是主要過敏原，新生兒大約7.5％有腸胃、皮膚和呼吸過敏反應(yīng)，這有望通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)封閉、缺失β-乳球蛋白基因或在牛乳腺細(xì)胞中插入人乳蛋白基因來調(diào)節(jié)它的表達(dá)水平，從而使牛乳更加接近人乳，滿足消費者需求。動物生物反應(yīng)器是目前世界范圍內(nèi)轉(zhuǎn)基因研究的熱點之一，不僅各國政府投資，一些私人財團(tuán)也不惜投入大量資金加以研究和開發(fā)。
α-乳清蛋白是分子量小、酸性的，高親和性的Ca2+結(jié)合蛋白，它幾乎存在于所有的哺乳動物乳汁中。在乳腺分泌細(xì)胞中，α-乳清蛋白作為調(diào)節(jié)亞基通過與半乳糖甘轉(zhuǎn)移酶相互作用催化乳糖的合成。最近還發(fā)現(xiàn)α-乳清蛋白的不同的折疊突變體具有殺菌和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的功能，還能與油酸形成復(fù)合物殺死皮膚的乳突淋瘤，具有廣闊的應(yīng)用前景。
α-乳清蛋白的功能(1)α-乳清蛋白的營養(yǎng)價值。由于α-乳清蛋白是人乳中重要的組成成分，約占總蛋白含量的28％，占乳清蛋白含量的49％，可以想象，α-乳清蛋白除了生理功能以外，還是乳汁中重要的營養(yǎng)成分。如果比較人奶和牛奶蛋白質(zhì)的氨基酸組成，就會發(fā)現(xiàn)，牛奶中色氨酸和半胱氨酸的含量明顯低于人奶中的含量，而造成這一結(jié)果的主要原因是牛奶中α-乳清蛋白的含量比較低。人乳中α-乳清蛋白色氨酸和半胱氨酸的含量(wt/wt)分別為6％和5％。色氨酸為必須氨基酸，必須由母乳供給，而半胱氨酸雖然不是必須氨基酸，但由于初生嬰兒代謝系統(tǒng)不完善，如果食用牛奶的話，也可能造成半胱氨酸的缺乏。色氨酸和半胱氨酸也可能參與嬰幼兒重要的生理活動。例如，色氨酸可能與睡眠行為有關(guān)，一直食用牛奶的嬰幼兒，他們的睡眠可能會受到影響；而半胱氨酸是谷胱苷肽的組成部分，它可作為抗氧化劑，保護(hù)細(xì)胞免受氧化作用的傷害。因此，為使嬰幼兒的奶制品更加營養(yǎng)合理，人們已開始嘗試牛奶人乳化，我們實驗室也正在開展這方面的工作。
(2)α-乳清蛋白調(diào)節(jié)乳糖合成的功能。人們很早就知道，α-乳清蛋白是乳糖合成酶的一個組成部分，葡萄糖存在條件下，與半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶結(jié)合在一起，調(diào)節(jié)該酶的專一性。由于α-乳清蛋白易于從半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶上解聚，可把它看成乳糖合成酶的一個調(diào)節(jié)亞基，因而在乳糖合成中起的是調(diào)節(jié)作用。這個酶的另一個亞基是半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶(GT)，它在多種分泌細(xì)胞中能夠催化半乳糖殘基從UDP-半乳糖到糖蛋白上。而在哺乳動物的乳腺中，專一性的半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶與α-乳清蛋白相互作用，通過這一過程可增加GT對葡萄糖的親和性和專一性，使其催化底物對象變?yōu)槠咸烟?，整個催化過程如下
這個反應(yīng)在高爾基體中發(fā)生，α-乳清蛋白與高爾基體內(nèi)膜上的半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶結(jié)合形成乳糖合成酶，這種結(jié)合使乳糖合成酶對于葡萄糖的親和力大大增加。由于α-乳清蛋白是連續(xù)分泌的，因此，它對于乳糖合成的維持是十分必要的。從已知的各種動物乳中乳糖和α-乳清蛋白的含量看，它們二者之間以及它們與乳的分泌量之間呈正相關(guān)。乳糖的合成開始總與α-乳清蛋白的出現(xiàn)相伴，這在許多實驗中已得到證明。另外，體內(nèi)實驗和體外實驗表明，α-乳清蛋白的合成受催乳素或胎盤催乳素以及糖皮質(zhì)激素的影響，但懷孕期可被孕酮抑制。
金屬離子在乳糖合成酶中的作用還不十分清楚，如乳糖合成酶的催化活性需要Mn2+參與，而半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶和α-乳清蛋白都能與Mn2+緊密結(jié)合。推測Mn2+的作用之一可能在酶復(fù)合體中起橋梁作用。
在乳糖合成酶中，Ca2+與α-乳清蛋白結(jié)合的作用也不清楚。但Zn2+與α-乳清蛋白結(jié)合可以調(diào)節(jié)乳糖合成酶的功能，它可能具有重要的生物學(xué)意義。由于Zn2+結(jié)合改變了乳糖合成酶的米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速度Vmax，并且這種改變還受Mn2+濃度的影響，Zn2+可引起Mn2+激活的乳糖合成酶表觀米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速度Vmax的降低，從而引起乳糖合成酶活性先升高后降低的現(xiàn)象。在高M(jìn)n2+濃度時，Zn2+則降低乳糖合成酶的活性。
(3)α-乳清蛋白的殺菌和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能。Pelligrini等人發(fā)現(xiàn)用胰蛋白酶和糜蛋白酶水解α-乳清蛋白，產(chǎn)生了三種具有殺菌特性的多肽，這些多肽對絕大多數(shù)革蘭氏陽性菌起作用，這說明α-乳清蛋白被內(nèi)肽酶降解后具有抗菌作用。Hakansson et al發(fā)現(xiàn)了一種α-乳清蛋白構(gòu)象的突變體，這個突變體對抗生素敏感和有抗性的肺炎鏈球菌都具有殺傷能力。具有殺菌活性的蛋白可通過離子交換和凝膠色譜從酪蛋白中分離出來。更為有趣的發(fā)現(xiàn)是天然狀態(tài)的α-乳清蛋白，在有C18:1脂肪酸存在下，可以轉(zhuǎn)變成具有殺菌活性的形式，正如前面所提到的，α-乳清蛋白擁有幾個脂肪酸結(jié)合位點。
近來Hakansson和Svensson等描述了α-乳清蛋白可能的更為吸引人的功能，他們發(fā)現(xiàn)一些多聚體，雖然不能完全代表α-乳清蛋白衍生物的特性，但它們是有效的Ca2+增加和編程死亡的誘導(dǎo)劑，具有廣泛的細(xì)胞毒性，能夠殺死所有實驗的胚胎和淋巴細(xì)胞。多聚體的α-乳清蛋白形式可以從奶的酪蛋白部分分離出來。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，α-乳清蛋白誘導(dǎo)編程死亡的部分包含著該蛋白的寡聚體，而寡聚體又要經(jīng)歷類似熔球構(gòu)象的改變，寡聚化似乎保持著α-乳清蛋白具有生物活性的熔球狀態(tài)。前面已經(jīng)提過，在Zn2+存在下，可以得到α-乳清蛋白的積聚體，但卻不知道它們有沒有細(xì)胞毒性。多聚化的α-乳清蛋白結(jié)合到細(xì)胞表面，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)并在細(xì)胞核中積累；同時，我們也發(fā)現(xiàn)脫離子的α-乳清蛋白和Zn2+結(jié)合與磷脂膜的相互作用比Ca2+結(jié)合蛋白與磷脂膜的相互作用更有效，這兩個現(xiàn)象是完全一致的。Kohler等人也指出聚合的α-乳清蛋白可激活Caspases，并誘導(dǎo)編程死亡，而且α-乳清蛋白直接作用線粒體，引起細(xì)胞色素C的釋放，這是細(xì)胞編程死亡起始非常重要的一步。
(4)α-乳清蛋白具有治療乳突淋瘤的功能對于人α-乳清蛋白，最近最激動人心的研究是發(fā)現(xiàn)α-乳清蛋白油酸復(fù)合物能抑制并清除乳突淋瘤。乳突淋瘤是一種由角化細(xì)胞感染乳突淋瘤病毒所引起的，常見的腫瘤，通常發(fā)生在皮膚和粘膜上皮。皮膚乳突淋瘤一般是良性的，而粘膜上皮乳突淋瘤會引起其它一些惡性腫瘤。Gustafsson等人(2005)利用陽離子交換層析獲得人α-乳清蛋白與C18:1脂肪酸復(fù)合物，對40個乳突淋瘤病人進(jìn)行隨機(jī)的、以安慰劑為對照，雙盲的局部治療，一期治療結(jié)果顯示，75％的病人乳突淋瘤病灶明顯縮小，而對照組只有15％；二期治療兩年后，83％的病人乳突淋瘤病灶清除，而且沒有任何副作用，表明α-乳清蛋白油酸復(fù)合物對于乳突淋瘤具有良好療效。α-乳清蛋白油酸復(fù)合物還具有廣普的殺死腫瘤細(xì)胞的作用，并且對正常細(xì)胞沒有損害。
目前人α-乳清蛋白主要從人奶中純化，由于來源有限，限制了人α-乳清蛋白作為藥用蛋白和保健品的使用，因此利用轉(zhuǎn)人α-乳清蛋白基因的克隆牛乳腺生產(chǎn)重組人α-乳清蛋白將具有重要意義。
人、牛、山羊和綿羊的α-乳清蛋白基因分別被定位在第12、5、5和3號染色體上，世界上也已知得到多種編碼α-乳清蛋白的基因。除小袋鼠的α-乳清蛋白基因外，其它物種該基因的轉(zhuǎn)錄單元長度都在2Kb左右，一般包括4個外顯子。人和鼠α-乳清蛋白基因的序列和基因組最先研究清楚。人α-乳清蛋白基因全長2433bp，外顯子長717bp，內(nèi)含子長1636bp。人α-乳清蛋白基因序列含有Alu重復(fù)序列，該序列反向插入內(nèi)含子I中，Alu序列在人類基因組中約有500,000拷貝，占人類總基因組的5％～6％，成員眾多，大約有300,000種，故稱Alu序列家族。人α-乳清蛋白基因中的Alu序列與Alu共同序列其同源性達(dá)88％，含有各種Alu和Alu樣序列的保守內(nèi)部組件。小袋鼠的該基因轉(zhuǎn)錄單元中除具有其它的四種相應(yīng)的外顯子序列，可能還有第五個外顯子結(jié)構(gòu)，在四個其它外顯子5′端上游的一段序列沒有任何調(diào)控序列存在，人們推測它可能包含了第五個外顯子，但這還需要進(jìn)一步證實。
目前對于人α-乳清蛋白，轉(zhuǎn)基因研究報道并不多，主要側(cè)重于α-乳清蛋白基因的調(diào)控和表達(dá)研究。日本的Fuiiwara等1997年利用210kb含人α-乳清蛋白基因完整表達(dá)調(diào)控單元進(jìn)行轉(zhuǎn)基因大鼠研究，在轉(zhuǎn)基因大鼠奶中獲得了2.0-4.3mg/ml人α-乳清蛋白的高效表達(dá)，并且不受位置效應(yīng)的影響。Takase和Hagiwara利用人α-乳清蛋白基因cDNA進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因煙草研究，在5g葉子中表達(dá)了具有天然活性的5mg人α-乳清蛋白。1999年Fuiiwara等做了大量的分析研究工作后，認(rèn)為包含50kb的5’側(cè)翼區(qū)和50kb的3’側(cè)翼區(qū)的人α-乳清蛋白基因可以獲得不受位置效應(yīng)影響的穩(wěn)定表達(dá)，但是只含有20kb的5’和20kb的3’側(cè)翼區(qū)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)會受到位置效應(yīng)的影響。2003年劉思國等人利用人α-乳清蛋白基因7.3kb的5’端調(diào)控區(qū)，2.0kb的編碼區(qū)以及227bp的牛生長激素3’端調(diào)控區(qū)構(gòu)建載體，在五只轉(zhuǎn)基因小鼠中，僅有一只小鼠能檢測到人α-乳清蛋白的表達(dá)(0.3mg/ml)，表明這個表達(dá)載體并不是很理想。
人α-乳清蛋白除了具有重要的營養(yǎng)價值之外，還具有殺菌作用，以及治療腫瘤的功能。由于目前人α-乳清蛋白主要從人奶中提純，來源有限，因此利用轉(zhuǎn)基因動物特別是大家畜生產(chǎn)重組人α-乳清蛋白，將具有重要的應(yīng)用前景?？寺〖夹g(shù)的日趨成熟，不僅使動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到了更充分的發(fā)展和補充，也使利用乳腺生物反應(yīng)器大規(guī)模生產(chǎn)各種重要的功能蛋白更加現(xiàn)實。采用基因組DNA作為目的基因制作轉(zhuǎn)基因動物要比cDNA序列的獲得更高效率的表達(dá)[5]，但過大片段又不便于基因操作，因此獲得高效表達(dá)的小結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)基因載體有著重要的意義。到目前為止，還不曾見到有α-乳清蛋白全基因組DNA的轉(zhuǎn)基因報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對上述領(lǐng)域中的空白，通過轉(zhuǎn)基因、細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)和體細(xì)胞克隆技術(shù)相結(jié)合，提供一種生產(chǎn)重組人α-乳清蛋白的動物乳腺生物反應(yīng)器一人α-乳清蛋白轉(zhuǎn)基因克隆大型家畜的方法，為我們實現(xiàn)牛奶人乳化及開發(fā)出重組人α-乳清蛋白保健品及藥品奠定基礎(chǔ)。
生產(chǎn)重組人α-乳清蛋白的動物乳腺生物反應(yīng)器——人α-乳清蛋白轉(zhuǎn)基因克隆大型家畜的方法，其操作步驟如下(1)利用完整的人α-乳清蛋白基因結(jié)構(gòu)構(gòu)建乳腺特異表達(dá)載體，(2)構(gòu)建雙標(biāo)記選擇載體和單標(biāo)記選擇載體，通過電擊方法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，獲得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，(3)利用轉(zhuǎn)基因細(xì)胞為核供體進(jìn)行體細(xì)胞克隆，獲得有人α-乳清蛋白的轉(zhuǎn)基因克隆大型家畜。
所述完整的人α-乳清蛋白基因是含有6.9kb的5’側(cè)翼區(qū)和159bp的3’側(cè)翼區(qū)，1-4外顯子和1-3內(nèi)含子，全長9459bp。
所述乳腺特異表達(dá)載體為phLa4，重組人α-乳清蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中表達(dá)的人α-乳清蛋白與天然人α-乳消蛋白大小一致，具有與天然人乳中乳清蛋白相同的免疫活性。
所述轉(zhuǎn)基因小鼠的人α-乳清蛋白基因表達(dá)量達(dá)0.48-3.21g/l。
所述雙標(biāo)記選擇載體為phLa4-EGFP-NEO，所述單標(biāo)記選擇載體為phLa4-NEO。
所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞是通過G418進(jìn)行篩選獲得的陽性細(xì)胞。
所述大型家畜為牛、山羊、綿羊、豬或兔。
所述大型家畜為牛。
在動物乳腺生物反應(yīng)器的開發(fā)中，能夠使外源基因獲得不受位置效應(yīng)影響的高效表達(dá)是至關(guān)重要的。本試驗采用包含6.9kb的5’側(cè)翼區(qū)和159bp的3’側(cè)翼區(qū)的全長9.5kb人α-乳清蛋白基因建立轉(zhuǎn)基因小鼠模型，獲得了4只F0代及一只F1代整合陽性母鼠，乳汁中全部檢測到了的人α-乳清蛋白，其中58號鼠表達(dá)量達(dá)到3.01g/L，超過了該蛋白在人乳中2.80g/L的含量，其它個體的表達(dá)量也均達(dá)到了克級。Southern雜交分析顯示這5只母鼠均整合了1個拷貝的外源基因，表達(dá)量上雖有所差異，但表達(dá)水平基本上穩(wěn)定，這說明此結(jié)構(gòu)的表達(dá)受到位置效應(yīng)的影響較小，且僅含有159bp的3’側(cè)翼區(qū)的結(jié)構(gòu)并不會顯著降低人α-乳清蛋白基因的表達(dá)水平。本研究構(gòu)建的結(jié)構(gòu)包含了完整的這個5’區(qū)域，由此可見人α-乳清蛋白基因的表達(dá)，足夠長的5’側(cè)翼區(qū)是必不可少的，而3’側(cè)翼區(qū)長度并不是影響表達(dá)的關(guān)鍵。這也是對人α-乳清蛋白基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制更進(jìn)一步的認(rèn)識。
將人α-乳清蛋白高效表達(dá)于牛的乳腺，進(jìn)而利用乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)人乳化牛乳。本研究側(cè)重于獲得一個便于基因操作且高效表達(dá)的人α-乳清蛋白轉(zhuǎn)基因載體，繼而開展轉(zhuǎn)基因大動物乳腺生物反應(yīng)器的研制。轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立及分析表明，所構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因載體具有結(jié)構(gòu)較小，表達(dá)量較高，可以穩(wěn)定遺傳給后代且在后代中亦能獲得高效表達(dá)等優(yōu)點，為利用人α-乳清蛋白基因改造牛乳成份改善牛乳品質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。
本發(fā)明將在小鼠乳腺中得到高效表達(dá)的phLa4表達(dá)載體連接上雙標(biāo)記選擇載體pEGFP-NEO和單標(biāo)記選擇載體pNEO構(gòu)建成phLa4-EGFP-NEO和phLa4-NEO。利用電擊轉(zhuǎn)染及G418篩選取出轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，再進(jìn)行單克隆培養(yǎng)。利用體細(xì)胞克隆技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因克隆牛，經(jīng)PCR和Southern檢測，共獲得三頭轉(zhuǎn)有phLa4-EGFP-NEO的轉(zhuǎn)基因克隆牛。根據(jù)轉(zhuǎn)基因小鼠中重組人α-乳清蛋白表達(dá)情況，可以推測這些轉(zhuǎn)基因牛也將高效表達(dá)具有生物活性的人α-乳清蛋白。這些轉(zhuǎn)基因奶牛乳腺特異表達(dá)的重組人α-乳清蛋白將可以開發(fā)成保健品和藥品，含重組人α-乳清蛋白的牛奶也可直接開發(fā)成高附加值的保健牛奶及奶制品。
利用乳腺特異表達(dá)的基因調(diào)控元件與目的基因構(gòu)建成乳腺特異表達(dá)載體，將該載體導(dǎo)入動物基因組，從而獲得能在乳腺特異高效表達(dá)外源藥用蛋白的轉(zhuǎn)基因動物即動物乳腺生物反應(yīng)器。乳腺組織可以對人體蛋白質(zhì)進(jìn)行正確的修飾和后加工，產(chǎn)品的生物學(xué)活性接近天然產(chǎn)品，因此動物乳腺生物反應(yīng)器是一種利用動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)在乳腺細(xì)胞中表達(dá)多肽藥物、工業(yè)酶、疫苗和抗體等蛋白的技術(shù)。這樣，轉(zhuǎn)基因克隆動物就成為了“制藥工廠”，為醫(yī)用蛋白和蛋白保健品的開發(fā)和生產(chǎn)開辟了廣闊的應(yīng)用前景。
本發(fā)明探索和完善了細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)和體細(xì)胞克隆技術(shù)相結(jié)合生產(chǎn)攜帶外源功能基因(目的基因自身調(diào)控元件)的轉(zhuǎn)基因動物的途徑，并極大提高了轉(zhuǎn)基因動物，特別是轉(zhuǎn)基因大家畜的制作效率，本發(fā)明所使用的技術(shù)路線適用于轉(zhuǎn)基因牛、山羊、綿羊、豬和兔的基礎(chǔ)群生產(chǎn)和擴(kuò)繁。


圖1人α-乳清蛋白全基因克隆phLa4結(jié)構(gòu)模式2引物為F1-F2的PCR檢測轉(zhuǎn)基因小鼠中α-乳清蛋白基因的整合M為100bp梯度DNA標(biāo)準(zhǔn)，H為人類基因組對照，P為陽性質(zhì)粒對照，B為空白對照，N為野生型小鼠基因組對照，11、24、28、37、46、50、57、58為陽性小鼠。
圖3引物為F4-F5的PCR檢測轉(zhuǎn)基因小鼠中α-乳清蛋白基因的整合M為100bp梯度DNA標(biāo)準(zhǔn)，H為人類基因組對照，P為陽性質(zhì)粒對照，B為空白對照，N為野生型小鼠基因組對照，11、24、28、37、46、50、57、58為陽性小鼠。
圖4Southern雜交檢測轉(zhuǎn)基因小鼠中α-乳清蛋白基因的整合M為梯度DNA標(biāo)準(zhǔn)，P10、P5、P1分別為陽性質(zhì)粒的10、5、1拷貝對照，N為野生型小鼠基因組對照，28、37、46、，50、57、58為F0代陽性小鼠基因組；50-2為F0代50號公鼠的后代陽性母鼠基因組。
圖5 Western印跡分析F0代轉(zhuǎn)基因陽性母鼠全乳樣品P5、P3、P1分別為人α-乳清蛋白純品5μg、3μg、1μg，37、46、57、58分別為對應(yīng)鼠號的全乳樣品N為野生型小鼠的全乳樣品對照。
圖6雙標(biāo)記選擇載體pEGFP-NEO的結(jié)構(gòu)圖EGFP為增強綠色熒光蛋白基因，NEO為新霉素抗性基因，IRES為核糖體結(jié)合位點，SalI，NotI，AscI和BamHI為酶切位點，CMV-IE Enhancer為CMV-IE增強子，pEF321為EF了21啟動子。
圖7單標(biāo)記選擇載體pNEO的結(jié)構(gòu)圖
NEO為新霉素抗性基因，SalI，NotI，AscI和BamHI為酶切位點，pPGK為PGK啟動子，Amp為氨芐抗性基因。
圖8phLa4-EGFP-NEO酶切后的線性圖譜human alpha-lactalbumin為人乳清α-乳清蛋白基因，GFP為增強綠色熒光蛋白基因，Neomycin為新霉素抗性基因，SalI，NotI，BamHI和MluI為酶切位點，Ampicillin為氨芐青霉素抗性基因圖9phLa4-NEO酶切后的線性圖譜human alpha-lactalbumin為人乳清α-乳清蛋白基因，Neomycin為新霉素抗性基因，SalI，NotI，BamHI和MluI為酶切位點，Ampicillin為氨芐青霉素抗性基因圖10hLA5’端引物的擴(kuò)增結(jié)果。
M1kb ladder；1興娃；2隆娃；3會娃；4非轉(zhuǎn)基因克隆牛；5陽性對照；6陰性對照；7blank。
圖11hLA3’端引物的擴(kuò)增結(jié)果。
M1kb ladder；1興娃；2隆娃；3會娃；4非轉(zhuǎn)基因克隆牛；5陽性對照；6陰性對照；7blank。
圖12GFP引物的擴(kuò)增結(jié)果。
M1kb ladder；1興娃；2隆娃；3會娃；4非轉(zhuǎn)基因克隆牛；5陽性對照1；6陽性對照2；7陰性對照；8Blank圖13NEO引物的擴(kuò)增結(jié)果.M1kb ladder；1興娃；2隆娃；3會娃；4非轉(zhuǎn)基因克隆牛；5陽性對照1；6陽性對照2；7陰性對照；8Blank圖14hLA轉(zhuǎn)基因克隆牛的Southern結(jié)果。
泳道1為興娃，泳道2為隆娃，泳道3和4為陰性對照，泳道5-7分別為1，2和5個拷貝的陽性對照。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
實施例1實驗材料1.1質(zhì)粒及菌株宿主菌大腸桿菌DH5α和DH10B，pGEM-5Zf，pGEM-T購自Promega公司，pCMV-EGFP-IRES-NEO和pIRES-NEO購自Clontech公司1.2實驗動物Holstein奶牛約3月齡的胎兒取自屠宰場，黃牛卵巢來自北京周邊地區(qū)屠宰場。
1.3主要試劑DMEM/F12粉末、DMEM粉末培養(yǎng)基、臺盼藍(lán)(trypan blue)、TCM199粉末，谷氨酰胺和G418為Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清為Hyclone公司產(chǎn)品；dNTP以及PCR引物購于上海生物工程公司；Taq酶購于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)實驗室；內(nèi)切酶SspI和BamHI為華美生物工程公司產(chǎn)品；IPTG、X-gal、氨芐青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)均購自華美生物公司；飽和酚為鼎國生物工程公司產(chǎn)品；胰蛋白酶、青霉素鏈霉素、EDTA、Hepes、FSH，LH，17β-E2，EGF，透明質(zhì)酸酶，HEPES，無脂肪酸BSA，細(xì)胞松弛素B，Hoechest33342，cycloheximide，A23187，6-DMAP，D-甘露醇，丙酮酸鈉，肝素鈉，礦物油和其它無機(jī)鹽均為Sigma公司產(chǎn)品。
1.4培養(yǎng)基的配制SOB培養(yǎng)基配置每升培養(yǎng)基，應(yīng)在950ml去離子水加入蛋白胨20g酵母提取物5g NaCl 0.5g.搖動容器室溶質(zhì)完全溶解，然后加入250mmol/L KCl溶液10ml， 用5mol/L NaOH調(diào)節(jié)到pH7.0。滅菌LB液體培養(yǎng)基蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，溶于800ml水中，調(diào)節(jié)PH值至7.5，定容制1000ml，高壓滅菌。
LR固體培養(yǎng)基蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，溶于800ml水中，加脂粉15g，調(diào)節(jié)pH值至7.5，定容至1000ml，高壓滅菌。
1.5試劑的配制DMEM培養(yǎng)液DMEM粉末13.4g，NaHCO33.7g，青霉素66mg，鏈霉素100mg，Mill-Q超純水定容到1升，PH 7.0-7.4，滲透壓為280-320mOsm/kg，用0.2μm濾膜過濾滅菌，4℃保存。使用時加10％的血清。
0.1％Trypsin/EDTA酶消化液Trypsin 0.1g，KCl 0.04g，NaHCO3，NaCl 0.8g，EDTA 0.02g，用滅菌的Mill-Q超純水溶解，定容至100ml，用0.2μm濾膜過濾滅菌，-20℃保存。
DPBS液DPBS粉末9.7g，Mill-Q超純水定容到1升，PH7.0-7.2，用0.2μm濾膜過濾滅菌，4℃保存。無鈣鎂PBS溶液KCl0.2g，KH2PO40.2g，NaCl 8.0g，Na2HPO412H2O 2.88g，Mill-Q超純水定容到1升，PH7.0-7.4，滲透壓為280-320mOsm/kg，用0.2μm濾膜過濾滅菌，4℃保存。
Gimsa母液Gimsa粉末0.5g，加少量甘油將Gimsa粉末在研缽中充分研磨。再加入甘油至總量為22ml，56℃保溫2h，然后再加入33ml甲醇，保存在棕色試劑瓶中，備用。
細(xì)胞裂解液10mM Tris.Cl(PH 8.0)，0.1M EDTA(PH8.0)，0.5％SDS。
蛋白酶K貯存液蛋白酶K100mg，溶于5mL滅菌水中，分裝，-20度保存。
TBS液NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Tris.Cl 3.0g，溶于1L重蒸水中，高壓滅菌。
G418貯液1gG418溶于1mL 1mol/mLHEPES溶液中(PH7.0-7.2)，加Mill-Q10mL，過濾滅菌，-20度保存。兩倍電擊緩沖液(2×HeBS)280mM Nacl、10mM Kcl、1.5mM Na2HPO4、12mM Glucose、50mM Hepes，PH7.0-7.4，過濾滅菌，1mL分裝，-20度保存。
1Mol/L Tris.Cl(pH8.0)121.1g Tris堿溶于800ml水中，用HCl調(diào)PH值至8.0，定容至1000ml，高壓滅菌。
0.5Mol/LEDTA(pH8.0)；126.1g乙二胺四乙酸二鈉加入到800ml水中，用NaOH調(diào)PH值至8.0，定容至1000ml，高壓滅菌。
RNase溶液將RNaseA溶于10mMol/L Tris.Cl(pH7.5)，5mMol/L NaCL中，配成10mg/ml的濃度，于100℃加熱15min，緩慢冷卻至室溫，分裝成小份保存于-20℃。
TE緩沖液10mMol/L NaCL，10mMol/L Tris.Cl(pH8.0)，1mMol/L EDTA(pH8.0)，高壓滅菌。
5mol/L LiCl30.2g氯化鋰二水(LiCl.2H2O)完全溶于80ml水后，定容至100ml高壓滅菌。
50×TAE242gTris堿，57.1ml冰乙酸，100ml 0.5Mol/L EDTA(pH8.0)，溶解后定容至1000ml。
氨芐青霉素(Amp)貯存液將氨芐青霉素鈉溶于滅菌水后用0.22μm的濾器過濾除菌，配制成100mg/ml，保存于-20℃。
3mol/L NaAc(pH5.2)24.604g無水乙酸鈉溶于80ml水中，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至5.2，定容至100ml，高壓滅菌。
1mol/L CaCl2在200ml水中溶解54gCaCl2.6H2O，過濾除菌，分裝成10ml每份，貯存于-20℃，制備感受態(tài)時取出一份稀釋至100ml，過濾除菌，預(yù)冷備用。
溴化乙錠貯存液在100ml水中加入1g溴化乙錠，溶解后于4℃棕色瓶內(nèi)保存。
DNA提取抽提緩沖液50mMol/L Tris.Cl(pH8.0)，100mMol/L EDTA(pH8.0)，100mMol/L NaCl，1％SDS。2×Cracking buffer0.2N NaOH，0.5％SDS，20％蔗糖。
酚∶仿(1∶1)等體積苯酚、氯仿混合，保存于4℃棕色瓶中。
蛋白酶K溶液用水配成20mg/ml，-20℃保存。
TCM199培養(yǎng)液稱TCM199粉末9.9g，NaHCO32.2g，丙酮酸鈉0.1375g，EDTA0.372g，用1L超純水定容，PH7.2-7.4，正壓過濾滅菌，4℃保存。培養(yǎng)用工作液中加入10％FCS。
操作液H199在含有25mM Hepes的TCM199中加入10％FCS。
沖卵液DPBS溶液中加入10％FCS。
透明質(zhì)酸酶透明質(zhì)酸酶0.2g，溶于10ml無鈣DPBS溶液中，過濾滅菌，-20℃貯存。
工作液用沖卵液稀釋10倍。
融合液0.3M甘露醇，0.1mM MgSO4，0.05mM CaCl2，0.5mMHEPES，0.05％BSA，調(diào)PH至7.2-7.4，過濾滅菌。
成熟培養(yǎng)液M199培養(yǎng)液中加入10％FBS，10u/ml FSH，100U/ml LH，lug/ml estradiol，100U/ml青霉素，100ug/ml鏈霉素。
CR1aa培養(yǎng)液成份 終濃度(mM) 加入量g/100mlNaCl 114.7 0.67KCl3.10.023NaHCO326.2 0.22Na Pyruvate20.4 0.002Phenol Red 1μl/ml100μl將上述成份加入90ml ddH2O中，待所有試劑徹底溶解后，加入0.055g Hemicalcium L-lactate(5mM)。調(diào)整pH為7.4，用ddH2O加到100ml，滲透壓為265-285mOsm之間。過濾滅菌。
1.6主要儀器設(shè)備1)CO2培養(yǎng)箱美國Forma Scientific Inc.
2)倒置顯微鏡和熒光顯微鏡日本Nikon公司3)培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、離心管和細(xì)胞凍存管Nunc公司4)電擊儀美國BTX公司(ECM 2001)5)電泳儀DYY-III2穩(wěn)壓電泳儀，北京六一儀器廠6)超凈工作臺北京凈化設(shè)備廠7)-80℃超低溫冰箱日本SANYO公司8)制冰機(jī)日本SANYO公司9)超純水儀美國MILLIPORE公司10)低溫離心機(jī)Eppendoff公司11)高速冷凍離心機(jī)BECKMAN公司12)凝膠成像系統(tǒng)ALPHA INNOTECH公司13)PHS-3C酸度計上海虹益儀器廠
14)自動滅菌鍋日本SANYO公司15)測序儀ABI 377型DNA sequencer，美國PERKIN ELMER公司16)恒溫水浴儀美國LIFESCIENCE公司17)9700型PCR儀美國PERKIN ELMER公司18)ABI 377 DNA測序儀美國PERKIN ELMER公司1.7分析工具軟件及網(wǎng)址同源性分析軟件DNAMANPCR引物設(shè)計軟件Oligo6.0DNA序列分析軟件ChromasDNA及蛋白序列數(shù)據(jù)庫NCBI/GenBank/Nucleotides，Protein2實驗方法2.1人乳清蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立2.1.1轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)GeneBank序列(X05153)設(shè)計引物F1(上游)5’GAGTGATGCTTCCATTTCAG 3’F2(下游)5’CAGAGATGTACAGGATCTGC 3’。擴(kuò)增人α-乳清蛋白基因5’端非編碼區(qū)與第一內(nèi)含子之間(包含第一外顯子)的790bp的片段，反應(yīng)條件94℃3min，94℃30sec，60℃30sec，72℃1min，30個循環(huán)，72℃7min。
利用這對引物從Clontech laboratories.Inc.公司粘粒文庫中篩選出含有人α-乳清蛋白基因的克隆(命名為phLal)。利用NotI和NdeI雙酶切陽性克隆，回收8.5kb的片段，與pGEM-5Zf載體相連，得亞克隆hLa2。將末端測序結(jié)果與已知序列比較分析，發(fā)現(xiàn)這個克隆缺少包括部分第二內(nèi)含子至第四外顯子在內(nèi)的大約1kb的片段。為獲得完整的α-乳清蛋白基因，以人基因組DNA為模板擴(kuò)增得到其3’端缺少的片段。設(shè)計引物F4-F5，同時在引物5’端分別添加一個酶切位點(F4 BglII，F(xiàn)5 NotI)和一個保護(hù)堿基T。F4(上游)5’-TAGATCTAGGGGTTAGGGGAACT-3’F5(下游)5’-TGCGGCCGCATTGAGTTGGTACAGACAGT-3’反應(yīng)條件94℃3min，94℃30sec，60℃30sec，72℃1min，30個循環(huán)，72℃7min。F4位于基因下游1375bp處，F(xiàn)5位于基因下游2521bp處，擴(kuò)增1146bp的片段。將人α-乳清蛋白基因3’端的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pGEM-T載體相連，得到克隆phLa3，用BglII和NotI酶切該克隆，回收1.1kb的片段，并將此片段與BamHI和NotI雙酶切過的phLa2片段相連，即得到人α-乳清蛋白全基因克隆phLa4，酶切及測序鑒定其正確性。我們所構(gòu)建的phla4載體含人α-乳清蛋白基因共9459bp，其中包括6.9kb的5’側(cè)翼區(qū)和159bp的3’側(cè)翼區(qū)。其結(jié)構(gòu)模式如圖1。
2.1.2轉(zhuǎn)基因小鼠制備及鑒定2.1.2.1顯微注射利用NdeI和NotI雙酶切phLa4質(zhì)?；厥?.5kb的DNA片段，透析純化并稀釋至2ng/μ的濃度注射受精卵的雄原核，然后移植于同期發(fā)情的假孕母鼠的輸卵管中。
2.1.2.2目的基因整合的鑒定取3周齡小鼠的尾巴組織樣，提取基因組DNA。兩對引物(F1-F2和F4-F5)做PCR檢測，對68只F0代小鼠進(jìn)行PCR檢測獲得到8只陽性小鼠(圖2與圖3)(其中11、24、28、50號為公鼠，37、46、57和58為母鼠)，整合率為11.7％；用EcoRI消化基因組，以(α32P)dCTP標(biāo)記的利用EcoRI單酶切hLa4質(zhì)粒所得α-乳清蛋白基因的1561bp片段做探針對PCR檢測的陽性個體進(jìn)行Southern雜交分析，進(jìn)一步確證基因整合情況并估算整合拷貝數(shù)。依據(jù)Southern雜交結(jié)果確定整合拷貝數(shù)，50號整合拷貝數(shù)為8，其余5只陽性個體均為單拷貝整合(如圖4)用EcoRI消化基因組，以(α32P)dCTP標(biāo)記的利用EcoRI單酶切hLa4質(zhì)粒所得1561bp片段做探針對PCR檢測的陽性個體進(jìn)行Southern印跡雜交分析。
2.1.2.3陽性轉(zhuǎn)基因小鼠傳代研究將陽性小鼠與正常的非轉(zhuǎn)基因小鼠配種獲得F1代小鼠，兩對引物(F1-F2和F4-F5)對后代小鼠做PCR檢測，傳代研究表明此結(jié)構(gòu)可以獲得較為穩(wěn)定的遺傳(表1)。
表1人α-乳清蛋白基因轉(zhuǎn)基因小鼠數(shù)據(jù)統(tǒng)計表表達(dá)量/拷貝DNA 陽性鼠號 性別 整合拷貝數(shù) 陽性后代數(shù)數(shù)(g/L) /后代總數(shù)11 - - -24 - - -28 1 - 1/1037♀ 1 0.621/11hLa4 50 8 - 0/346♀ 1 0.488/1157♀ 1 0.902/958♀ 1 3.212/1650-2 ♀ 1 1.032/32.1.2.4 α-乳清蛋白在轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中表達(dá)分析在陽性轉(zhuǎn)基因母鼠產(chǎn)后1周內(nèi)取乳樣。將50號轉(zhuǎn)基因公鼠的一個后代陽性母鼠(50-2)與正常的非轉(zhuǎn)基因小鼠配種，獲取乳樣，用以檢測目的基因在陽性公鼠后代中的表達(dá)。利用PAGE凝膠電泳分析全乳及乳清樣品，Western印跡法檢測人α-乳清蛋白在小鼠乳汁中表達(dá)，放射免疫測定法測定其含量。Western印跡分析進(jìn)一步證實了外源基因在四只F0代整合陽性母鼠乳樣中全部獲得高效表達(dá)(圖5)，放射免疫測定含量分別為0.62g/L、0.48g/L、0.56g/L、3.21g/L；同時放射免疫測定F0代50號公鼠的后代陽性母鼠50-2號乳汁中含量為1.03g/L，證明由原代轉(zhuǎn)基因公鼠遺傳給后代的人α-乳清蛋白基因獲得了穩(wěn)定的表達(dá)。
2.2phLa4-EGFP-NEO和phLa4-NEO表達(dá)載體構(gòu)建1).phLa4標(biāo)記表達(dá)載體的構(gòu)建策略為了便于篩選陽性細(xì)胞，我們首先構(gòu)建了含綠色熒光蛋白基因(EGFP)和新霉素基因雙選擇標(biāo)記載體(pEGFP-NEO)以及新霉素基因單選擇標(biāo)記載體(pNEO)，然后分別將兩個標(biāo)記載體與此前構(gòu)建的pBC-hLa載體連接構(gòu)建成phLa-EGFP-NEO和phLa-NEO表達(dá)載體。
2)pEGFP-NEO的構(gòu)建用NotI和SalI酶切pBC1回收約6kb的片斷，連接一個依次含SalI，BamHI以及NotI的Linker，構(gòu)建成pXM，用BamHI和NotI酶切pCMV-EGFP-IRES-NEO并回收4kb片斷EGFP-IRES-NEO，同時用BamHI和NotI酶切pXM，并與EGFP-IRES-NEO連接即構(gòu)成pEGFP-NEO，如圖6。
3)pNEO的構(gòu)建用NotI和SalI酶切pBC1回收約6kb的片斷，連接一個依次含SalI，BamHI以及NotI的Linker，構(gòu)建成pXM，用BamHI和NotI酶切pIRES-NEO并回收2kb片斷IRES-NEO，同時用BamHI和NotI酶切pXM，并與IRES-NEO連接即構(gòu)成pNEO，如圖7。
4)phLa4-EGFP-NEO表達(dá)載體構(gòu)建用NotI和SalI酶切phLa4和pEGFP-NEO，將兩者連接即構(gòu)成phLa4-EGFP-NEO，通過酶切及測序分析，確定phLa4-EGFP-NEO載體構(gòu)建成功，載體圖如下(圖8)5)phLa4-NEO表達(dá)載體構(gòu)建用NotI和SalI酶切phLa4和pNEO，將兩者連接即構(gòu)成phLa4-NEO，通過酶切及測序分析，確定phLa4-NEO載體構(gòu)建成功，載體圖如下(圖9)2.3細(xì)胞培養(yǎng)，基因轉(zhuǎn)染及陽性細(xì)胞篩選2.3.1胎兒成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)在超凈工作臺中將胎兒浸泡在70％酒精中30sec，用PBS漂洗幾遍，以消毒過的手術(shù)器械取下耳部及脊背部的數(shù)塊表皮組織于DMEM+10％FCS培養(yǎng)液里。
↓在直徑60mm平皿中將胎兒組織切碎成為1mm3大小的組織碎塊，再將組織碎塊轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000rpm下離心洗滌數(shù)次。
↓用消毒玻璃彎頭吸管將小組織碎塊吸至25cm2培養(yǎng)瓶中，通過玻璃吸管彎頭使組織塊均勻分布在瓶壁上。
↓小心翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶(防止組織塊落下)讓組織塊黏附于瓶壁上，置于37度，5％CO2培養(yǎng)箱中放置2～4h，待組織塊貼壁后，再正置培養(yǎng)瓶，補加適量培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
2.3.2胎兒成纖維細(xì)胞的傳代、冷凍、及復(fù)蘇待種植的原代細(xì)胞生長至80％匯合時，將細(xì)胞一部分冷凍，一部分傳代繼續(xù)培養(yǎng)。
2.3.2.1傳代用消毒玻璃彎頭吸管小心吸除培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，沿著細(xì)胞生長壁的對面瓶壁注入無鈣鎂PBS(37度溫育)沖洗細(xì)胞兩次，以祛除殘余血清及細(xì)胞代謝物。
↓用同樣方法加入0.05％胰蛋白酶/0.02％EDTA消化液，加入量為可覆蓋細(xì)胞單層即可(直徑100mm培養(yǎng)皿一般加入1ml消化液，35mm培養(yǎng)皿中加入200u L消化液)，放入培養(yǎng)箱中消化1-2min。在顯微鏡下觀察，待細(xì)胞開始變圓時，用手指敲打培養(yǎng)皿壁，使細(xì)胞徹底脫壁，然后加入培養(yǎng)液終止消化。
↓用消毒玻璃彎頭吸管反復(fù)吹打，細(xì)胞，使其分散成為單個細(xì)胞，1000rpm下離心5min收集細(xì)胞。用培養(yǎng)液按1∶2或1∶3比例稀釋并重新接種細(xì)胞至培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。
2.3.2.2冷凍貼壁細(xì)胞消化后，收集細(xì)胞于離心管中，在1000rpm下離心5min以去盡上清。
↓加4度預(yù)冷的冷凍液(DMEM+20％FCS+10％DMSO)重懸細(xì)胞沉淀，使細(xì)胞濃度約為107個細(xì)胞/ml，轉(zhuǎn)移細(xì)胞至凍存管中。
↓放入4度冰箱預(yù)冷30min，再把凍存管插于厚泡沫上后置于液氮液面熏蒸2h，然后迅速投入液氮保存。
2.3.2.3復(fù)蘇從液氮中取出凍存管，快速投入37度水浴中，開在水浴中不斷快速搖動凍存管以迅速解凍。
↓待冷凍液徹底解凍后，以新鮮培養(yǎng)液稀釋10倍并將溶解液轉(zhuǎn)移至離心管中，在1000rpm下離心5min去除DMSO以緩減冷凍液毒性。
↓用新鮮的培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞沉淀，將細(xì)胞稀釋至所需濃度，繼續(xù)培養(yǎng)。
2.3.3體細(xì)胞注射用DNA的準(zhǔn)備大提質(zhì)粒phLa4-EGFP-NEO和phLa4-NEO，以SalI酶切質(zhì)粒，酶切反應(yīng)如下質(zhì)粒DNA 約10-20μg10×反應(yīng)buffer 20μl限制性內(nèi)切酶10-20UddH2O 補足體系至200μl上述試劑加好后，混勻，37度水浴消化2h，取5μL酶切產(chǎn)物以0.7％瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切是否完全，若酶切完全，加酚、酚/氯仿各抽提一次，加2倍體積無水乙醇和0.1倍體積乙酸鈉(PH5.2)，混勻后置一20度過夜；12000rpm離心15min回收沉淀，70％乙醇洗滌一次，真空干燥，加TE溶解。
2.3.4牛胎兒成纖維細(xì)胞對G418毒性敏感性檢測細(xì)胞培養(yǎng)到第3代后用0.25％胰蛋白酶消化，按每孔0.5～1×105個細(xì)胞接種到13個直徑35mm培養(yǎng)皿中以使細(xì)胞盡量分散。次日在其中12孔中以100μg/ml的梯度依次加入終濃度從100μg/ml到1200μg/ml的G418，還有一孔中不加入G418作為對照。連續(xù)培養(yǎng)三周，每3～4天換液一次，同時補加G418。每天觀察細(xì)胞生長或死亡情況。
2.3.5電擊轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前將10～50μg 1.2.1純化回收的DNA融入500μl 2×HeBS中，補充滅菌超純水至1ml，冰浴預(yù)冷。
↓在轉(zhuǎn)染前2～3天，用0.25％胰蛋白酶溶液消化培養(yǎng)細(xì)胞。將1×106個細(xì)胞轉(zhuǎn)接于75cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入完全培養(yǎng)液，置37度、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
↓
轉(zhuǎn)染前，在倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)的細(xì)胞，確定細(xì)胞處于對數(shù)生長后期。用0.25％胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞，1000rpm離心5min沉淀細(xì)胞。
↓將細(xì)胞沉淀用冰浴預(yù)冷的l×HeBS離心洗滌1次，同時進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。
↓將一定數(shù)量的細(xì)胞重新懸浮于加有DNA的電極緩沖中，混合均勻后轉(zhuǎn)入電擊杯中，在電擊前冰浴10min。
↓當(dāng)細(xì)胞準(zhǔn)備好進(jìn)行電擊時，設(shè)置電場強度(E)和脈沖時間(t)，先試一下，確保產(chǎn)生了所需的脈沖。將電擊杯插入電擊槽中，按照選定的電場強度(E)和脈沖時間(t)，電擊細(xì)胞。
↓將經(jīng)電擊后的細(xì)胞冰浴10min后轉(zhuǎn)入75cm2的培養(yǎng)瓶中，加入含20％FCS的DMEM培養(yǎng)液中于37度、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
↓1-2天后待細(xì)胞生長狀態(tài)恢復(fù)，將細(xì)胞擴(kuò)大10倍培養(yǎng)，加入適量的G418進(jìn)行篩選。
↓每3～4天換液一次，同時補加G418。每天觀察細(xì)胞生長或死亡情況。6-10天后，挑選陽性克隆細(xì)胞。
2.3.6陽性細(xì)胞的單克隆培養(yǎng)在熒光顯微鏡下觀察上述方法所得細(xì)胞克隆的發(fā)光情況，用記號筆圈住分散良好(遠(yuǎn)離其它克隆)且細(xì)胞數(shù)量多的熒光克??；吸除培養(yǎng)液，用無鈣鎂PBS漂洗細(xì)胞二次，在高倍解剖鏡下，將30-50ul 0.25％胰蛋白酶消化液滴加在標(biāo)記好的細(xì)胞克隆上，待克隆的大多數(shù)細(xì)胞收縮脫壁后，不等細(xì)胞懸浮，快速吸取細(xì)胞克隆，但注意不要吸入附近其它克隆的細(xì)胞；轉(zhuǎn)移細(xì)胞到加有500μl培養(yǎng)液的四孔板中，吹打分散細(xì)胞團(tuán)塊；挑出的克隆繼續(xù)培養(yǎng)，降低G418濃度至300μg/ml維持篩選；待克隆細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)大后或匯合后，將一部分細(xì)胞轉(zhuǎn)移到35mm培養(yǎng)皿中繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，另一部分用于轉(zhuǎn)基因檢測，其它擴(kuò)大后的細(xì)胞盡早冷凍。
2.4轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆2.4.1卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)從屠宰廠收集成年牛的卵巢，置于30℃的生理鹽水在4h內(nèi)送到實驗室，37℃的PBS液中清洗三遍后，以直徑為0.7mm針頭抽取直徑為2～8mm的卵泡，回收形態(tài)均勻、結(jié)構(gòu)致密的卵丘-卵母細(xì)胞-復(fù)合體(COCs)，以成熟液(M199+10％FBS+0.01U/ml bFSH+0.01U/ml bLH+1μg/ml estradiol)洗滌兩遍，然后將卵丘-卵母細(xì)胞-復(fù)合體以50-60枚/孔放入含成熟液的四孔板，在38.5℃、5％CO2培養(yǎng)箱中成熟培養(yǎng)18～20h后，將成熟的卵母細(xì)胞放入0.1％透明質(zhì)酸酶的管內(nèi)振蕩2～3min后，再用玻璃管輕輕吹打，使卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞完全脫離，選擇形態(tài)完整，細(xì)胞質(zhì)均勻并排出第一極體的卵母細(xì)胞為體細(xì)胞核受體。
2.4.2卵母細(xì)胞的去核將帶有第一極體的卵母細(xì)胞移入含M199+10％FBS+7.5μg/ml細(xì)胞松馳素B的操作液中，在200倍顯微鏡下用一玻璃針于極體上方將透明帶切一小口，再用內(nèi)徑為20μm的玻璃管將第一極體以及其下方的卵母細(xì)胞內(nèi)的染色體一并吸除，再放入M199+20％FBS的溶液中洗三遍后，置于培養(yǎng)箱中備用。
2.4.3移核與融合將血清饑餓2～4d的供體細(xì)胞用0.25％trypsin消化2～4min，選擇直徑為10～12μm的體細(xì)胞用20μm直徑玻璃管將其移入去了核的卵母細(xì)胞透明帶內(nèi)，然后將其放入Zimmerman液[15]中平衡3～5min后放入融合槽內(nèi)，轉(zhuǎn)動卵細(xì)胞使供體細(xì)胞與卵母細(xì)胞接觸面與電場垂直，同時在直流脈沖的場強為2.5kV/cm、脈沖時間為10μs、脈沖次數(shù)為2次、脈沖間隔為1s的條件下融合(融合儀為BTX公司的ECM-2001)后，迅速將重構(gòu)胚移入M199+10％FBS液中，放置0.5h后觀察融合率，挑選融合胚進(jìn)行下一步激活處理。
2.4.4重構(gòu)胚的激活與培養(yǎng)將重構(gòu)胚放入5μmol/L Ionomycin(Sigma)液中，4min后換到1.9mmol/L 6-DMAP液中，4h后再移入CR1aa+5％FBS液中，在38.5℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d后觀察分裂率，7d后觀察囊胚發(fā)育率2.4.5胚胎移植與妊娠檢測將形態(tài)優(yōu)良的第7d的克隆囊胚移入已同期的受體母牛的子宮角內(nèi)。受體母牛選擇的都是經(jīng)產(chǎn)母牛，其中紅系冀南黃牛的克隆胚胎被移入Holstein奶牛，Holstein奶牛的克隆胚胎被移入魯西黃牛。在移植后的第60d進(jìn)行直腸檢測，以確定妊娠率.
2.5轉(zhuǎn)基因克隆的PCR和Southern鑒定2.5.1 PCR檢測為了確證phLa4-EGFP-NEO或phLa4-NEO轉(zhuǎn)入?；蚪M中，對于hLa4，我們設(shè)計了兩對引物，引物1序列為，上游5’GAG TGA TGC TTC CAT TTC AG 3’，下游5’CAGAGATGTACAGGATCTGC 3’；反應(yīng)條件為94℃3min，94℃30sec，60℃30sec，72℃1min，30個循環(huán)，72℃7min；產(chǎn)物長度為790bp；引物2序列為，上游5’-TAG ATC TAG GGG TTA GGG GAA CT-3’下游5’-TGC GGC CGC ATT GAGTTG GT ACA GAC AGT-3’反應(yīng)條件94℃ 3min，94℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 1min，30個循環(huán)，72℃7min；產(chǎn)物長度為1146b。
于EGFP基因，引物序列為上游5｀TGC AGT GCT TCA GCC GCT AC 3｀下游5｀CTC AGG TAG TGGTTG TCG GG 3｀。PCR條件94℃ 5min；94℃ 40sec，62℃ 40sec，72℃ 40sec，30cycles；72℃ 7min，4℃ 1∞，產(chǎn)物長度為380bp。
對于NEO基因，引物序列為上游5｀AGG ATC TCC TGT CAT CTCACC TTG CTC CTG 3｀下游5｀AAG AAC TCG TCA AGA AGG CGA TAG AAG GCG 3｀。PCR條件94℃ 5min；94℃ 40 sec，60℃ 40sec，72℃ 40sec，30cycles；72℃ 7min，4℃ 1∞，產(chǎn)物長度為490bp。
由于人α-乳清蛋白基因長約10kb，因此我們分別在其5’端和3’端設(shè)計一對引物，從圖10和圖11可以看出，克隆牛興娃、隆娃和會娃轉(zhuǎn)有完整的人α-乳清蛋白基因。從圖12和圖13則可以看出，這三頭克隆牛同時雙標(biāo)記選擇載體。
2.5.1 Southern檢測取PCR檢測為陽性的轉(zhuǎn)基因克隆牛DNA約10μg用EcoRI消化，低壓慢速電泳，轉(zhuǎn)膜后，進(jìn)行Southern雜交，雜交所用探針為α-P32dCTP同位素標(biāo)記的1.5kb的hLA基因片段。以phLa4-EGFP-NEO質(zhì)粒為陽性對照，以非轉(zhuǎn)基因克隆?；蚪M為陰性對照，雜交可得到1.5kb片段，如圖14所示進(jìn)一步確定了興娃和隆娃轉(zhuǎn)有人乳清蛋白基因，可以估計興娃和隆娃轉(zhuǎn)有1個拷貝的人α-乳清蛋白基因，根據(jù)轉(zhuǎn)基因小鼠結(jié)果，可以推測這兩頭轉(zhuǎn)基因牛將能在乳腺中高效表達(dá)人α-乳清蛋白。附1SEQ ID NO 1完整的人α-乳清蛋白基因序列，序列圖如下包括6.9kb的5’側(cè)翼區(qū)和159bp的3’側(cè)翼區(qū)，全長9459bp；四個外顯子及三個內(nèi)含子，其中6937-7185為第一外顯子，7743-7911為第二外顯子，8390-8465為第三外顯子，8965-9297為第四外顯子1 ATATGAACTT TAAAGTAGTT TTTTCCAATT CTGTGAAGAA AGTCATTGGT AGCTTGATGG61GGATGGCATT GAATCTATAA ATTACCTTGG GCAGTATGGC CATTTTCACG ATATTGATTC121 TTCCTACCCA TGAGCATGGA ATGTTCTTCC ATTTGTTTGT ATCCTCTTTT ATTTCATTGA181 GCAGTGGTTT GTAGTTCTCC TTGAAGAGGT CCTTCACGTC CCTTATAAGT TGGATTCCTA241 GGTATTTTAT TCTTTTTGAA GCAATTGTGA ATGGGAGTTC ACTCATGATT TGGCTCTCTG301 TTTGTCTGTT ATTGGTGTAT AAGAATGCTT GTGATTTTTG TACATTGATT TTGTATCCTG361 AGACTTTGCT GAAGTTGCTT ATCAGCTTAA GGAGATTTTG GGCTGAGACG ATGGGGTTTT421 CTAGATATAC ATTCATGTCG TCTGCAAAGA GGGACAATTT GACTTCCTCT TTTCCTAATT481 GAATACCCTT TATTTCCTTC TCCTGCCTAA TTGCCCTGGC TAGAACTTCC AACACTATGT541 TGAATAGGAG TGCTGAGAGA GGGCATCCCT GTCTTGTGCC AGTTTTCAAA GGGAATGCTT601 CCAGTTTTTG CCCATTCAGT ATGATATTGG CTGTGGGTTT GTCATAGATA GCTCTTATTA661 TTTTGAGATA CGTCTCATCA ATACCTAATT TATTGAGAGT TTTTAGCATG AAGGGTTGTT721 GAATTTTCTC AAAGGCCTTT TCTGCATCTA TTGAAATAAT CATGTGGTTT TTGTCTTTGG781 TTCTGTTTAT ATGCTGGATT ACATTTATTG ATTTGTGTAT ATTGAACCAG CCTTGCATCC841 CAGGGATGAA GCCCACTTGA TCATGGTGGA TAAGCTTTTT GATGTGCTGC TGGATTCGGT901 TTGCCAGTAT TTTACTGAGG ATTTTTGCAT CAATGTTCAT CAAGGATATT GGTCTAAAAT961 TGTCTTTTTT GGTTGTGTCT CTGCCAGGCT TTGGTATCAG GATGATGCTG GCCTCATAAA1021 ATGAGTTAGG GAGGATTCCC TCTTTTTCTA TTGATTGGAG TAGTTTCAGA AGGAATGGTA1081 CCAGTTCCTC CTTGTACCTC TGGTAGAATT TGGCTGTGAA TCCATCTGGT CCTGGACTCT1141 TTTTGGTTGG TAAGCTATTG ATTATTGCCA CAATTTCACA GACTGGCAAA TTGGATAAAG1201 AGTCAAGACC CGTCAGTGTG CTGTATTCAG GAAACCCATC TCATGTGCAG AGACACACAT1261 AGGCTCAAAA TAAAAGGATG GAGGAAGATC TACCAAGCAA ATGGAAAACA AAAAAAGGCA1321 GGGGTTGCAA TCCTAGTCTC TGATAAAACA GACTTTAAAC CAACAAAGAT CAAAAGAGAC1381 AAAGAAGGCC ATTACATAAT GGTAAAGGGA TCAATTCAAC AAGAGGAGCT AACTATCCTA1441 AGTATATATG CACCCAATAC AGGAGCACCC AAGTTCATAA AGCAAGTCCT GAGTGACCTA1501 CAAAGAGACT TAGACTCCCA CACAATAATA ATGGGAGACT TTAACACCCC ACTGTCAACA1561 TTAGACAGAT CAACGAGACA GAAAGTTAAC AAGGATACCC AGGAATTGAA CTCAGCTCTG1621 CACCAAGCAG ACCTAATAGA CATCTACAGA ACTCTCCACC CCAAATCAAC ACAATATACA1681 TTTTTTTTCA GCACCACACC ACACCTATTC CAAAATTGAC CACATAGTTG GAAGTAAAGC1741 TCTCCTCAGC AAATGTAAAA GATCAGAAAT TATAACAAAC TGTCTCTCAG ACCACGGTGC1801 AATCAAACTA CAACTCAGGA TAAAGAAACT CACTCAAAAC CGCTCAACTA CATGGAAACT1861 GAACAACCTG CTCCTGAATG ACTACTGGGT ACATAACGCA ATGAAGGCAG ACATAAAGAT1921 GTTCTTTGAA ACCAACGAGA ACAAAGACGC AACATACCAG AATCTCTGGG ACACATTCAA1981 AGCAGTGTGT AGAGGGAAAT TTATAGCACT AAATGCCCAC AAGAGAAAGC AGGAAAGATC2041 CAAAATTGAC ACCCTAACAT CACAATTAAA AGAACTAGAA AAGCAAGAGC AAACACATTC2101 AAAAGCTAGC AGAAAGCAAG AAATAACTAA AATCAGAGCA GAACTGAAGG AAATAGAGAC2161 ATAAAAAACC CTTCAAAAAT TAATGAATCC AGGAGCTGGT TTTTTTGAAA GGATCAACAA
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4981 TCCTGTCGTG TACCCTTGCA GTGCCTCTGG GTGGAATGCG GAGAAATGGA GTGGCTCCAC5041 TTCTGTTGTG TTTCTGAACA TGTATCTCTT GCTATCAGAA CTTTCTGCTC ATCCCTTCTG5101 GCACACCAAG ATCCTCCACA TTCCCTTCAC TCATGCCACT TCATATACTG GTTATCCATG5161 GTACAGAAGA CAGGATTTAA CTGAGAGGAC TTTTCCCTGA CTCTGAATAC ATGTAGGAGA5221 TAACGATATG GAAGACCTTC AGTATGTAAG TCTTAAATAG ATTGGTTGGG ATAAATGTTC5281 CCTGAAACAT AAGAAACAGC GCAGCGGCTC CTGTCTGTAA TCCTAGCACT TTGGGAGGCC5341 GAGGCCCAGG CAGGCAAATT GCCTGAGCTC AGAAGTTTGA GACCAGCCTG GCCAACATGC5401 AGAAACTCCG TCTCTACTAA AAATACATAA ATTAACCGGG CATGGTAACA CGTGCCTGTA5461 GTCCCAGCTA CTCGGGAGGC TGAGGCAGGA GAATCACTTG AGCCTGGGAG GCAGAGGTTG5521 CAGTGAGCCA AGATCGCGCC ACTGCATTCC AGCCTGGGCA ACAGAGTGAG ACTTGGTCAA5581 AAAAAAAAAA AAAAAAGGAA GAAGAAGAAG AAATCAGGTT TAGAGATGAG GACAAAGAAG5641 ACGAATGGTG GCATGAAGGA GCTAAGAGCT ACTTGTCACC ATGACATGAA GCTTCATGCC5701 AGCAAATTAA AGGAGCTATT CAGAACTAGT ATCCTCAACT CTACTTGCTC AGGGGCACTG5761 ACCTTATAGA GATTCCAGAC ATAAGCTTGT TCAGCCTTAA AGTCCAATCT TTCCACTGGC5821 TTGGGTCCTT CCCACTTTCT GTGGCCAACT CTGAGGTTGT CTACAAGTTA TTGGTCTTAG5881 ATTTATGTAA TGTCTCAATG CCAGTGTAGT ATTTGGTTAT TTACGGTAGG AGTGGTTAGG5941 GGTGGGGAAT CTGATAATAG CTCGTAGGAT AGCTAGATTC TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT6001 TAAAGATAGG GTCTCACTTT GTCTCCCAGG ATGGATGGAG TGCAGTGGAG TGAACATGGC6061 TCACTGCAGC CTCGACCTCC TGTGCTCAAG TGTTCCTCCT GCCTCAGCCC CTCAAGTAGC6121 TGGGACTACA GGCACATGTC ACCATGCCCA GCTAATTTTT TTTGTAGAGA TGGGATTTTA6181 CCATGTTGCC CAGGCTGGTC TCGAGCTCCT GGGCTCAAGT GATCCACCAG ACTCGGCCTC6241 CCAAAATGCC GGGATTACAG GTGTGAGCCA CTGTGCCTGG CCTAGATGCT TTCATACAGG6301 CTTTTCAATT ATGCATTTTC CTTAAGTAGG AAGTCTTAAG ATCCAAGTTA TATCGGATTG6361 TTGTAGTCTA CGTTCCCATA TTCTATTCCT ATTTCTGAGC CTTCAGTCAT GAGCTACCAT6421 ATTAAAGAAC TAATTCTGGG CCTTGTTACA TGGCTGGATT GGTTGGACAA GTGCCAGCTC6481 TGATCCTGGG ACTGTGGCAT GTGATGACAT ACACCCCCTC TCCACATTCT GCATGTCTCT6541 AGGGGGGAAG GGGGAAGCTC GGTATAGAAC TTTATTGTAT TTTCTGATTG CCTCACTTCT6601 TATATTGCCC CCATGCCCTT CTTTGTTCCT CAAGTAACCA GAGACAGTGC TTCCCAGAAC6661 CAACCCTACA AGAAACAAAG GGCTAAACAA AGCCAAATGG GAAGCAGGAT CATGGTTTGA6721 ACTCTTTCTG GCCAGAGAAC AATACCTGCT ATGGACTAGA TACTGGGAGA GGGAAAGGAA6781 AAGTAGGGTG AATTATGGAA GGAAGCTGGC AGGCTCAGCG TTTCTGTCTT GGCATGACCA6841 GTCTCTCTTC ATTCTCTTCC TAGATGTAGG GCTTGGTACC AGAGCCCCTG AGGCTTTCTG6901 CATGAATATA AATAAATGAA ACTGAGTGAT GCTTCCATTT CAGGTTCTTG GGGGTAGCCA6961 AAATGAGGTT CTTTGTCCCT CTGTTCCTGG TGGGCATCCT GTTCCCTGCC ATCCTGGCCA7021 AGCAATTCAC AAAATGTGAG CTGTCCCAGC TGCTGAAAGA CATAGATGGT TATGGAGGCA7081 TCGCTTTGCC TGAATGTGAG TTCCCTGCCT CTGTGTTTCA TCCATTCCTC ATACGCTTCT7141 CTCCTCCATC CCCTCTTTCT TCCACTTCGC CCCTCCACTT TTACTTAATT ATCTAATCAT7201 CCTCTTTTCT GCTCATTTGC ATACTCTTTT ATTTCATGTA TGTATATATG TATGTATTTA7261 TTTATTTTTG AGGTGGAGTT TCGCTCTTGT TGCCCAGACT GGAGTGCAAT GGTGTAATCT7321 CGGCTCACTG CAACCTCCGC CTCCTCGGTT CAAGTGATTC TCCTGCCTCA GCCTCCCAAG7381 TAGCTGGAAT TACAGGCACC CACCACCATG CCTGGCTAAT TTTGTATTTT TTGTAGAGAC7441 AGGGTTTCAC CATGTTGGCC AGGCTGGTCT CAAACTTCTG ACCTCAGGTG ATCCGCCCTC7501 CTCAGCCTCC CAAAGTGTTG GGATTACAAG CGTGAGCCAT CATGCCTGGC CCCATTTATT7561 TTCCTATCCT TTCTTTCTCT TATTGTCTGA TTTTTTTTTG GAATTCTCCA TCTCATCAAG7621 AAACTCTGAG CTTTGCCATC TTTGGAGATT GGCTGGAAAG CATTTTTGTC TGAGAATTAC7681 AGTTCCTCCT TTATGCAGAT CCTGTACATC TCTGTGGTAT CTCTTTCTCA TCTTTCCCTC
7741 AGTGATCTGT ACCATGTTTC ACACCAGTGG TTATGACACA CAAGCCATAG TTGAAAACAA7801 TGAAAGCACG GAATATGGAC TCTTCCAGAT CAGTAATAAG CTTTGGTGCA AGAGCAGCCA7861 GGTCCCTCAG TCAAGGAACA TCTGTGACAT CTCCTGTGAC AGTGAGTAGC CCCTATAACC7921 CTCTTTCTCT GTTTTTCTGA GGCCTGCCCT TGGGATAATC TCCTTTTTAG TGCCAAGCAG7981 ACCTCAGGCT TCATTGCCTT GGCTGGGCTC TATAAAAATT GTGGGACTTG AATTGGCAGT8041 ACTGAGTAAG AAGCTGTTTG GATTTTTCAT GGTCATCAAA TCCCCAGACA GTTCCTTGAG8101 GTTCAGTGGT AGACAATCGG AGCTGTCTGA GAGTCTTGGA ATCTGATTGT CTGCATTTTC8161 AGGGTAAGTC AGTTGATGAA GCTGATGATT CCTCCAGAGA TATCCCAGGG AAATGAAGGA8221 AGTCCCTACC CAGGGTTAGA CATTACCACA TTGGTCCTTT CATATAGAAA GACAACAGGC8281 ACAAGCCTTG AGTTTAGAGA ACCCACTGGA TCAGGGGTTA GGGGAACTCA GTGCCTTTCT8341 GGGTAATACT TGTCAGCTGT CTCAATCCTT TCCCTGTAAC TCCTGCCAGA GTTCCTGGAT8401 GATGACATTA CTGATGACAT AATGTGTGCC AAGAAGATCC TGGATATTAA AGGAATTGAC8461 TACTGGTGAA TCCTTATTCT ATTTTCTATT TCCCCATCCT CCTTCTCCTT ACCCCATTAG8521 CCCAGCACCC CTTTCCTCTT ACCCTATCTC TTGGTCATTT AATCTAGAAT ACAGTGTCTG8581 AAACAAAGCT TACCTAGAGA CTCAGGTTTC TGTTATTAAG CCTCTCTCGC TCCGCTCCTT8641 GGTAGCAATT TTCCTAATAA GGGGTTGCCT AATGGAGGGC TCAGACCCAG GCCTCCTTTC8701 ACTTAGACTT GGACATCTAA TTCCACTTGT TTAGTTCTAT GCCCTAAAGC AAGCTGTTGG8761 TAACATTGCA TCTCTTTTTT AACCCTACAA TTTTCTTGGA TATTTTTTAT GGACTGTATT8821 CCACTTGATG GCTTGTGTCG CTTGACATCA GGCCAGGAAT GTCTTTCTGT AATTCTCGTC8881 CACGCTCTTC CACTTCAGCC CTCCTGGGAA TGAATGTAAA GATTCAGTCA GCTAACTCAC8941 CTTGTCCCCC TTCTCCATTA TCAGGTTGGC CCATAAAGCC CTCTGCACTG AGAAGCTGGA9001 ACAGTGGCTT TGTGAGAAGT TGTGAGTGTC TGCTGTCCTT GGCACCCCTG CCCACTCCAC9061 ACTCCTGGAA TACCTCTTCC CTAATGCCAC CTCAGTTTGT TTCTTTCTGT TCCCCCAAAG9121 CTTATCTGTC TCTGAGCCTT GGGCCCTGTA GTGACATCAC CGAATTCTTG AAGACTATTT9181 TCCAGGGATG CCTGAGTGGT GCACTGAGCT CTAGACCCTT ACTCAGTGCC TTCGATGGCA9241 CTTTCACTAC AGCACAGATT TCACCTCTGT CTTGAATAAA GGTCCCACTT TGAAGTCACT9301 GGCTGTAATT TTTTTCCCCC TGGAGGGAAG GGGAAGAAAT AGGATGAGTA GGTGGACACT9361 GAAGCCATAG GTCATAGCCA CCTTCCATCT CTACTGAAGA AGAAGTAGGC TGAATTTACA9421 ATAGAAAGGT GAAGGTTACT GTCTGTACCA ACTCAATGC附2SEQ ID NO 2人α-乳清蛋白一級結(jié)構(gòu)即氨基酸序列，共142個氨基酸，其中前19個為信號肽序列，HLA氨基酸序列圖如下1MRFFVPLFLV GILFPAILAK QFTKCELSQL LKDIDGYGGI ALPELICTMF51 HTSGYDTQAI VENNESTEYG LFQISNKLWC KSSQVPQSRN ICDISCDKFL101 DDDITDDIMC AKKILDIKGI DYWLAHKALC TEKLEQWLCE KL
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)重組人α-乳清蛋白的動物乳腺生物反應(yīng)器——人α-乳清蛋白轉(zhuǎn)基因克隆大型家畜的方法，其操作步驟如下(1)利用完整的人α-乳清蛋白基因結(jié)構(gòu)構(gòu)建乳腺特異表達(dá)載體，(2)構(gòu)建雙標(biāo)記選擇載體和單標(biāo)記選擇載體，通過電擊方法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，獲得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，(3)利用轉(zhuǎn)基因細(xì)胞為核供體進(jìn)行體細(xì)胞克隆，獲得含有人α-乳清蛋白的轉(zhuǎn)基因克隆大型家畜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)重組人α-乳清蛋白的動物乳腺生物反應(yīng)器——人α-乳清蛋白轉(zhuǎn)基因克隆大型家畜的方法，其中所述完整的人α-乳清蛋白基因是含有6.9kb的5’側(cè)翼區(qū)和159bp的3’側(cè)翼區(qū)，1-4外顯子和1-3內(nèi)含子，全長9459bp。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)重組人α-乳清蛋白的動物乳腺生物反應(yīng)器——人α-乳清蛋白轉(zhuǎn)基因克隆大型家畜的方法，其中所述乳腺特異表達(dá)載體為phLa4，重組人α-乳清蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中表達(dá)的人α-乳清蛋白與天然人α-乳清蛋白大小一致，具有與天然人乳中乳清蛋白相同的免疫活性。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)重組人α-乳清蛋白的動物乳腺生物反應(yīng)器——人α-乳清蛋白轉(zhuǎn)基因克隆大型家畜的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因小鼠的人α-乳清蛋白基因表達(dá)量達(dá)0.48-3.21g/l。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)重組人α-乳清蛋白的動物乳腺生物反應(yīng)器——人α-乳清蛋白轉(zhuǎn)基因克隆大型家畜的方法，其中所述雙標(biāo)記選擇載體為phLa4-EGFP-NEO，所述單標(biāo)記選擇載體為phLa4-NEO。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)重組人α-乳清蛋白的動物乳腺生物反應(yīng)器——人α-乳清蛋白轉(zhuǎn)基因克隆大型家畜的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞是通過G418進(jìn)行篩選獲得的陽性細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的任一生產(chǎn)重組人α-乳清蛋白的動物乳腺生物反應(yīng)器——人α-乳清蛋白轉(zhuǎn)基因克隆大型家畜的方法，其中所述大型家畜為牛、山羊、綿羊、豬或兔。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的生產(chǎn)重組人α-乳清蛋白的動物乳腺生物反應(yīng)器——人α-乳清蛋白轉(zhuǎn)基因克隆大型家畜的方法，其中所述大型家畜為牛。
全文摘要
本發(fā)明涉及生產(chǎn)重組人α－乳清蛋白的動物乳腺生物反應(yīng)器——人α－乳清蛋白轉(zhuǎn)基因克隆大型家畜的方法，其操作步驟如下(1)利用完整的人α－乳清蛋白基因結(jié)構(gòu)構(gòu)建乳腺特異表達(dá)載體，(2)構(gòu)建雙標(biāo)記選擇載體和單標(biāo)記選擇載體，通過電擊方法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，獲得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，(3)利用轉(zhuǎn)基因細(xì)胞為核供體進(jìn)行體細(xì)胞克隆，獲得含有人α－乳清蛋白的轉(zhuǎn)基因克隆大型家畜。轉(zhuǎn)基因乳腺特異表達(dá)的重組人α－乳清蛋白可以開發(fā)成保健品和藥品，含重組人α－乳清蛋白的牛奶也可直接開發(fā)成高附加值的保健牛奶及奶制品。這樣，轉(zhuǎn)基因克隆動物就成為了“制藥工廠”，為醫(yī)用蛋白和蛋白保健品的開發(fā)和生產(chǎn)開辟了廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/85GK1687426SQ200510066118
公開日2005年10月26日 申請日期2005年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月21日
發(fā)明者湯波, 戴蘊平, 龔國春, 曹更生, 于舒洋, 張磊, 李寧 申請人:李寧