專利名稱：羊胚胎體外培養(yǎng)液及其配制方法和羊胚胎體外培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了一種含鹿茸提取物的羊胚胎體外培養(yǎng)液及其配制方法，屬家畜胚胎培養(yǎng)方法技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
胚胎移植是一種應(yīng)用于哺乳動物的繁殖新技術(shù)，是胚胎工程的重要組成部分，目前已成為一項(xiàng)比較成熟的生物技術(shù)通過胚胎移植可使優(yōu)秀母畜最大限度地發(fā)揮在品種改良和育種工作中的良好作用。而胚胎的體外培養(yǎng)通常是成功進(jìn)行胚胎移植的前序程序，如通過對胚胎的體外培養(yǎng)可以促進(jìn)胚胎的發(fā)育以及尋求合適的移植培養(yǎng)液。胚胎切割是胚胎移植常用的輔助技術(shù)，通過對早期胚胎的切割，一方面可以增多胚胎數(shù)目，另一方面可以為胚胎早期性別鑒定提供材料。但胚胎切割對胚胎損傷較大，這些受損的胚胎需要在胚胎專用培養(yǎng)液中培養(yǎng)一段時(shí)間得到恢復(fù)，才能保證正常的發(fā)育。無論是全胚還是切割后的半胚(通常，對未經(jīng)切割的完整胚胎稱為全胚，對經(jīng)切割而受損的非完整胚胎稱為半胚)，在胚胎移植時(shí)都需要胚胎移植液。在實(shí)際應(yīng)用中，國內(nèi)使用的胚胎培養(yǎng)液及胚胎移植液大多依賴進(jìn)口，且培養(yǎng)液與移植液采用不同的配方，移植成功率不高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首先要解決的技術(shù)問題和提出的技術(shù)任務(wù)是克服利用現(xiàn)有胚胎培養(yǎng)液移植成功率不高的缺陷，提供一種可以兼做移植液的羊胚胎體外培養(yǎng)液；其次是提供這種羊胚胎體外培養(yǎng)液的配制方法；再次是提供一種羊胚胎體外培養(yǎng)的方法。為此，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案一種羊胚胎體外培養(yǎng)液，是以常規(guī)胚胎培養(yǎng)液為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，其特征是其內(nèi)還含有10～30μg/mL的鹿茸提取物以及體積百分含量為8％～20％的血清。
所述鹿茸提取物的含量為15μg/mL；所述血清的體積百分含量為10％。
一種羊胚胎體外培養(yǎng)液的配制方法，是以常規(guī)胚胎培養(yǎng)液為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，其特征是向其內(nèi)溶入10～30μg/mL的鹿茸提取物以及體積百分含量為8％～20％的血清。
所述的鹿茸提取物是將鹿茸粉碎后經(jīng)水煮、過濾、棄沉淀、上清液冷凍烘干并在～2～～6℃保存所得的凍干粉。
一種羊胚胎體外培養(yǎng)方法，其特征是以常規(guī)胚胎培養(yǎng)液為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，再加入10～30μg/mL的鹿茸提取物和體積百分含量為8％～20％的血清作為培養(yǎng)液并做成培養(yǎng)小滴在38～39℃環(huán)境中預(yù)熱；獲取懷孕5～6天的母羊桑葚期胚胎，用常規(guī)胚胎培養(yǎng)液沖洗后將胚胎放入培養(yǎng)小滴，在38～39℃、5％CO2的環(huán)境內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，至囊胚期用以胚胎移植。
獲取的桑葚期胚胎為全胚胎，培養(yǎng)1～3天，觀察胚胎發(fā)育情況，記錄發(fā)育到囊胚期胚胎的數(shù)目并進(jìn)行胚胎移植。通過對全胚胎的培養(yǎng)，檢驗(yàn)培養(yǎng)液對胚胎的適用性，進(jìn)一步用于胚胎移植。
對獲取的桑葚期胚胎進(jìn)行切割成為半胚胎，于培養(yǎng)的第1天觀察半胚恢復(fù)情況，記錄恢復(fù)胚胎的數(shù)目；第2～3天，觀察并統(tǒng)計(jì)發(fā)育到囊胚期胚胎的數(shù)目。以在具有全胚胎培養(yǎng)的目的外，經(jīng)切割進(jìn)行分別培養(yǎng)用于鑒定性別以確定移植的必要性。
于培養(yǎng)前兩小時(shí)，在6cm培養(yǎng)皿中，用上述含鹿茸提取物的培養(yǎng)液做成50～100μL的培養(yǎng)小滴。
前述的常規(guī)胚胎培養(yǎng)液為磷酸鹽緩沖液；所述的血清為小牛血清、胎牛血清或者新生牛血清。
鹿茸為梅花鹿或馬鹿的尚未骨化的幼角。幾千年來，鹿茸都被認(rèn)為是一種名貴的滋補(bǔ)品，本草綱目記載鹿茸“生精補(bǔ)髓，養(yǎng)血益陽，強(qiáng)筋健骨，治一切虛損”。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明，鹿茸的藥理作用非常廣泛，對神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、性功能、血液等方面的疾病都有良好的治療作用。另外，鹿茸中有些有效成分具有抗衰老作用、抗氧化作用、增強(qiáng)胃腸蠕動和促進(jìn)分泌功能、增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能等。
鹿茸的化學(xué)成分比較復(fù)雜，含下列5大類物質(zhì)①骨質(zhì)，膠質(zhì)，磷酸鈣；②蛋白質(zhì)，多肽，氨基酸；③卵磷脂.腦磷脂，亞油酸等脂類物質(zhì)；④RNA，DNA，ATP等核酸及其降解產(chǎn)物；⑤鈣、磷、鐵、鋅等二十多種礦物元素。
本發(fā)明將中藥中常用的鹿茸提取物應(yīng)用到羊胚胎體外培養(yǎng)領(lǐng)域，解決了目前羊全胚體外發(fā)育率、胚胎移植懷孕率、切割后的胚胎體外發(fā)育率較低的問題。其經(jīng)濟(jì)成本較低，便于在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。本發(fā)明以鹿茸提取物作為培養(yǎng)液的組成成份，可使波爾山羊全胚體外發(fā)育率提高7％，移植受體妊娠率提高10％；山羊切割后胚胎發(fā)育率提高8％。湖羊全胚體外發(fā)育率提高9％，移植受體妊娠率提高13％；湖羊切割后胚胎發(fā)育率提高9％；大大提高山羊全胚胚胎移植產(chǎn)羔率和切割后半胚體外發(fā)育率。
以下通過具體實(shí)施方式
對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1(1)提取鹿茸提取物將梅花鹿茸去垢除血，用電燒水鍋沸水炸煮鹿茸，遠(yuǎn)紅外烤箱50～60℃烘烤鹿茸2～6小時(shí)。用半自動切片機(jī)切成0.35～0.50毫米厚的片狀，加入到粉碎機(jī)使鹿茸粉碎成400目大小的顆粒，水煮2～4小時(shí)，過濾，棄沉淀，上清液用冷凍干燥儀干燥10～25小時(shí)，制成凍干粉，稱重、分裝。
(2)制作含鹿茸的培養(yǎng)液將鹿茸凍干粉1毫克、小牛血清(FCS)8毫升加入量筒，再向量筒內(nèi)緩慢加入磷酸鹽緩沖液(PBS)至100毫升，其間令鹿茸凍干粉、小牛血清充分溶入磷酸鹽緩沖液，即配成含鹿茸提取物10μg/mL、小牛血清8％(體積百分含量)的胚胎培養(yǎng)液。(備注磷酸鹽緩沖液為胚胎工程常用溶液其配方為1000ml中含34.0g無水磷酸二氫鉀和35.5g無水磷酸氫二鈉，PH值為6.85。)(3)山羊全胚及半胚體外培養(yǎng)全胚培養(yǎng)培養(yǎng)前兩小時(shí)，在6cm培養(yǎng)皿中，用100μl的移液器將上述含鹿茸提取物10μg/mL、含血清8％的培養(yǎng)液做成50～100μL的培養(yǎng)小滴，置入38～39℃培養(yǎng)箱中預(yù)熱。對懷孕5～6天的波爾山羊，手術(shù)法獲取桑葚期胚胎200枚，用含8％FCS的PBS沖洗三遍后，其中100枚放入含鹿茸提取物的培養(yǎng)滴中，另100枚放入對照組僅含10％血清的培養(yǎng)滴中，每滴培養(yǎng)液放胚胎10～20枚，在38～39℃、5％CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，1～3天后，觀察胚胎發(fā)育情況，記錄對照組和試驗(yàn)組發(fā)育到囊胚期胚胎的數(shù)目分別為65，72。并用上述含鹿茸提取物10μg/mL、含小牛血清8％的培養(yǎng)液作為移植液進(jìn)行胚胎移植，兩組受體妊娠頭數(shù)分別為68和78。
半胚培養(yǎng)培養(yǎng)前兩小時(shí)，在6cm培養(yǎng)皿中，用100μl的移液器將上述含鹿茸提取物10μg/mL、含血清8％的培養(yǎng)液做成50～100μL的培養(yǎng)小滴，置入38～39℃培養(yǎng)箱中預(yù)熱。將桑葚期切割后的波爾山羊胚胎200枚，用含10％FCS的PBS沖洗三遍后，其中100枚放入含鹿茸培養(yǎng)滴中，另100枚放入對照組含10％血清的培養(yǎng)滴中，每滴培養(yǎng)液放胚胎10～20枚，38～39℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～3天，于培養(yǎng)的第2～3天觀察并統(tǒng)計(jì)對照組及試驗(yàn)組發(fā)育到囊胚期胚胎的數(shù)目分別為63和71。并用上述含鹿茸提取物10μg/mL、含小牛血清8％的培養(yǎng)液作為移植液進(jìn)行胚胎移植，兩組受體妊娠頭數(shù)分別為42和51。
(4)湖羊全胚及半胚體外培養(yǎng)全胚培養(yǎng)培養(yǎng)前兩小時(shí)，用上述含鹿茸提取物10μg/mL、含小牛血清8％的培養(yǎng)液作為移植液做成50～100μL的培養(yǎng)小滴，置38～39℃培養(yǎng)箱中預(yù)熱。對懷孕5～6天的湖羊，手術(shù)法獲取桑葚期胚胎200枚，用含8％FCS的PBS沖洗三遍后，其中100枚放入含鹿茸培養(yǎng)滴中，另100枚放入對照組含8％血清的培養(yǎng)滴中，每滴培養(yǎng)液放胚胎10～20枚，38～39℃、5％CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，1～3天后，觀察胚胎發(fā)育情況，記錄對照組和試驗(yàn)組發(fā)育到囊胚期胚胎的數(shù)目分別為63和72，并用上述含鹿茸提取物10μg/mL、含小牛血清8％的培養(yǎng)液作為移植液進(jìn)行胚胎移植，受體妊娠頭數(shù)分別為68和81。
半胚培養(yǎng)培養(yǎng)前兩小時(shí)，用上述含鹿茸提取物10μg/mL的培養(yǎng)液和含10％血清的對照組培養(yǎng)液做成50～100μL的培養(yǎng)小滴，置38～39℃培養(yǎng)箱中預(yù)熱。將桑葚期切割后的湖羊胚胎用含10％FCS的PBS沖洗三遍后，其中100枚放入含鹿茸培養(yǎng)滴中，另100枚放入對照組含10％血清的培養(yǎng)滴中，每滴培養(yǎng)液放胚胎10～20枚，38～39℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～3天，于培養(yǎng)的第2～3天，觀察并統(tǒng)計(jì)對照組和試驗(yàn)組發(fā)育到囊胚期胚胎的數(shù)目分別為61和70。并用上述含鹿茸提取物10μg/mL、含小牛血清8％的培養(yǎng)液作為移植液進(jìn)行胚胎移植，受體妊娠頭數(shù)分別為39和52。
(5)檢測結(jié)果經(jīng)上述在產(chǎn)業(yè)中試水平上進(jìn)行的具體實(shí)施，對其結(jié)果進(jìn)行綜合檢測，其結(jié)果如下對100枚波爾山羊全胚、100枚波爾山羊切割后的半胚、100枚湖羊全胚、100枚湖羊半胚進(jìn)行處理，另各選100枚波爾山羊及湖羊胚胎為對照。在波爾山羊方面，對照組全胚體外發(fā)育率為65％，胚胎移植受體妊娠率68％，半胚體外發(fā)育率為63％，半胚移植受體妊娠率為42％；而實(shí)驗(yàn)組全胚體外發(fā)育率為72％，比對照組提高7％，胚胎移植受體妊娠率78％，比對照組提高10％，半胚體外發(fā)育率為71％，比對照組提高8％，半胚移植受體妊娠率為51％，比對照組提高9％。在湖羊方面，對照組全胚體外發(fā)育率為63％，胚胎移植受體妊娠率68％，半胚體外發(fā)育率為61％，半胚移植受體妊娠率為39％；而實(shí)驗(yàn)組全胚體外發(fā)育率為72％，比對照組提高9％，胚胎移植受體妊娠率81％，比對照組提高13％，半胚體外發(fā)育率為70％，半胚移植受體妊娠率為52％，比對照組提高13％。
實(shí)施例2(1)提取鹿茸提取物將梅花鹿茸去垢除血，用電燒水鍋炸煮鹿茸，遠(yuǎn)紅外烤箱50～60℃烘烤鹿茸2～6小時(shí)。用半自動切片機(jī)切成0.35～0.50毫米厚的片狀，加入到粉碎機(jī)使鹿茸粉碎成400目大小的顆粒，水煮2～4小時(shí)，過濾，棄沉淀，上清液用冷凍干燥儀干燥10～25小時(shí)，制成凍干粉，稱重、分裝。
(2)制作含鹿茸的培養(yǎng)液將鹿茸凍干粉3毫克、小牛血清(FCS)8毫升加入量筒，再向量筒內(nèi)緩慢加入磷酸鹽緩沖液(PBS)至100毫升，其間令鹿茸凍干粉、小牛血清充分溶入磷酸鹽緩沖液，即配成含鹿茸提取物30μg/mL、小牛血清8％(體積百分含量)的胚胎培養(yǎng)液。
(3)山羊全胚及半胚體外培養(yǎng)全胚培養(yǎng)培養(yǎng)前兩小時(shí)，在6cm培養(yǎng)皿中，用100μl的移液器將上述含鹿茸提取物30μg/mL、含血清8％的培養(yǎng)液做成50～100μL的培養(yǎng)小滴，置入38～39℃培養(yǎng)箱中預(yù)熱。對懷孕5～6天的波爾山羊，手術(shù)法獲取桑葚期胚胎200枚，用含8％FCS的PBS沖洗三遍后，其中100枚放入含鹿茸培養(yǎng)滴中，另100枚放入對照組含8％血清的培養(yǎng)滴中，每滴培養(yǎng)液放胚胎10～20枚，在38～39℃、5％CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，1～3天后，觀察胚胎發(fā)育情況，記錄對照組和試驗(yàn)組發(fā)育到囊胚期胚胎的數(shù)目分別為65和72。并用上述含鹿茸提取物30μg/mL、含小牛血清8％的培養(yǎng)液作為移植液進(jìn)行胚胎移植，兩組受體妊娠頭數(shù)分別為68和78。
半胚培養(yǎng)培養(yǎng)前兩小時(shí)，在6cm培養(yǎng)皿中，用100μl的移液器將上述含鹿茸提取物30μg/mL、含血清8％的培養(yǎng)液做成50～100μL的培養(yǎng)小滴，置入38～39℃培養(yǎng)箱中預(yù)熱。將桑葚期切割后的波爾山羊胚胎200枚，用含8％FCS的PBS沖洗三遍后，其中100枚放入含鹿茸培養(yǎng)滴中，另100枚放入對照組含8％血清的培養(yǎng)滴中，每滴培養(yǎng)液放胚胎10～20枚，38～39℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～3天，于培養(yǎng)的第2～3天觀察并統(tǒng)計(jì)對照組及試驗(yàn)組發(fā)育到囊胚期胚胎的數(shù)目分別為63和71。并用上述含鹿茸提取物30μg/mL、含小牛血清8％的培養(yǎng)液作為移植液進(jìn)行胚胎移植，兩組受體妊娠頭數(shù)分別為42和51。
(4)湖羊全胚及半胚體外培養(yǎng)全胚培養(yǎng)培養(yǎng)前兩小時(shí)，在6cm培養(yǎng)皿中，用100μl的移液器將上述含鹿茸提取物30μg/mL、含血清8％的培養(yǎng)液做成50～100μL的培養(yǎng)小滴，置入38～39℃培養(yǎng)箱中預(yù)熱。對懷孕5～6天的湖羊，手術(shù)法獲取桑葚期胚胎200枚，用含8％FCS的PBS沖洗三遍后，其中100枚放入含鹿茸培養(yǎng)滴中，另100枚放入對照組含8％血清的培養(yǎng)滴中，每滴培養(yǎng)液放胚胎10～20枚，38～39℃、5％CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，1～3天后，觀察胚胎發(fā)育情況，記錄對照組和試驗(yàn)組發(fā)育到囊胚期胚胎的數(shù)目分別為63和72，并用上述含鹿茸提取物30μg/mL、含小牛血清8％的培養(yǎng)液作為移植液進(jìn)行胚胎移植，受體妊娠頭數(shù)分別為68和81。
半胚培養(yǎng)培養(yǎng)前兩小時(shí)，在6cm培養(yǎng)皿中，用100μl的移液器將上述含鹿茸提取物30μg/mL、含血清8％的培養(yǎng)液做成50～100μL的培養(yǎng)小滴，置入38～39℃培養(yǎng)箱中預(yù)熱。將桑葚期切割后的湖羊胚胎用含8％FCS的PBS沖洗三遍后，其中100枚放入含鹿茸培養(yǎng)滴中，另100枚放入對照組含8％血清的培養(yǎng)滴中，每滴培養(yǎng)液放胚胎10～20枚，38～39℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1-3天，于培養(yǎng)的第2-3天，觀察并統(tǒng)計(jì)對照組和試驗(yàn)組發(fā)育到囊胚期胚胎的數(shù)目分別為61和70。并用上述含鹿茸提取物30μg/mL、含小牛血清8％的培養(yǎng)液作為移植液進(jìn)行胚胎移植，兩組受體妊娠頭數(shù)分別為39和52。
其檢測結(jié)果同實(shí)施例1。
(5)檢測結(jié)果經(jīng)上述在產(chǎn)業(yè)中試水平上進(jìn)行的具體實(shí)施，對其結(jié)果進(jìn)行綜合檢測，其結(jié)果如下對100枚波爾山羊全胚、100枚波爾山羊切割后的半胚、100枚湖羊全胚、100枚湖羊半胚進(jìn)行處理，另各選100枚波爾山羊及湖羊胚胎為對照。在波爾山羊方面，對照組全胚體外發(fā)育率為65％，胚胎移植受體妊娠率68％，半胚體外發(fā)育率為63％，半胚移植受體妊娠率為42％；而實(shí)驗(yàn)組全胚體外發(fā)育率為72％，比對照組提高7％，胚胎移植受體妊娠率78％，比對照組提高10％，半胚體外發(fā)育率為71％，比對照組提高8％，半胚移植受體妊娠率為51％，比對照組提高9％。在湖羊方面，對照組全胚體外發(fā)育率為63％，胚胎移植受體妊娠率68％，半胚體外發(fā)育率為61％，半胚移植受體妊娠率為39％；而實(shí)驗(yàn)組全胚體外發(fā)育率為72％，比對照組提高9％，胚胎移植受體妊娠率81％，比對照組提高13％，半胚體外發(fā)育率為70％，比對照組提高9％，半胚移植受體妊娠率為52％，比對照組提高13％。
實(shí)施例3(1)提取鹿茸提取物同實(shí)施例一。
(2)制作含鹿茸的培養(yǎng)液將鹿茸凍干粉1毫克、小牛血清(FCS)20毫升加入量筒，再向量筒內(nèi)緩慢加入磷酸鹽緩沖液(PBS)至100毫升，其間令鹿茸凍干粉、小牛血清充分溶入磷酸鹽緩沖液，即配成含鹿茸提取物10μg/mL、小牛血清20％(體積百分含量)的胚胎培養(yǎng)液。
(3)山羊全胚及半胚體外培養(yǎng)全胚培養(yǎng)培養(yǎng)前兩小時(shí)，在6cm培養(yǎng)皿中，用100μl的移液器將上述含鹿茸提取物10μg/mL、小牛血清20％(體積百分含量)的胚胎培養(yǎng)液做成50～100μL的培養(yǎng)小滴，置38～39℃培養(yǎng)箱中預(yù)熱。對懷孕5～6天的波爾山羊，手術(shù)法獲取桑葚期胚胎200枚，用含20％FCS的PBS沖洗三遍后，其中100枚放入含鹿茸培養(yǎng)滴中，另100枚放入對照組含20％血清的培養(yǎng)滴中，每滴培養(yǎng)液放胚胎10～20枚，在38～39℃、5％CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，1～3天后，觀察胚胎發(fā)育情況，記錄對照組和試驗(yàn)組發(fā)育到囊胚期胚胎的數(shù)目分別為65，72。并用上述含鹿茸提取物10μg/mL、含小牛血清20％的培養(yǎng)液作為移植液進(jìn)行胚胎移植，兩組受體妊娠頭數(shù)分別為68和78。
半胚培養(yǎng)培養(yǎng)前兩小時(shí)，在6cm培養(yǎng)皿中，用100μl的移液器將上述含鹿茸提取物10μg/mL、小牛血清20％(體積百分含量)的胚胎培養(yǎng)液做成50～100μL的培養(yǎng)小滴，置38～39℃培養(yǎng)箱中預(yù)熱。將桑葚期切割后的波爾山羊胚胎200枚，用含10％FCS的PBS沖洗三遍后，其中100枚放入含鹿茸培養(yǎng)滴中，另100枚放入對照組含20％血清的培養(yǎng)滴中，每滴培養(yǎng)液放胚胎10～20枚，38～39℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～3天，于培養(yǎng)的第2～3天觀察并統(tǒng)計(jì)對照組及試驗(yàn)組發(fā)育到囊胚期胚胎的數(shù)目分別為63和71。并用上述含鹿茸提取物10μg/mL、含小牛血清20％的培養(yǎng)液作為移植液進(jìn)行胚胎移植，兩組受體妊娠頭數(shù)分別為42和51。
(4)湖羊全胚及半胚體外培養(yǎng)全胚培養(yǎng)培養(yǎng)前兩小時(shí)，在6cm培養(yǎng)皿中，用100μl的移液器將上述含鹿茸提取物10μg/mL、小牛血清20％(體積百分含量)的胚胎培養(yǎng)液做成50～100μL的培養(yǎng)小滴，置38～39℃培養(yǎng)箱中預(yù)熱。對懷孕5～6天的湖羊，手術(shù)法獲取桑葚期胚胎200枚，用含20％FCS的PBS沖洗三遍后，其中100枚放入含鹿茸培養(yǎng)滴中，另100枚放入對照組含10％血清的培養(yǎng)滴中，每滴培養(yǎng)液放胚胎10～20枚，38～39℃、5％CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，1～3天后，觀察胚胎發(fā)育情況，記錄對照組和試驗(yàn)組發(fā)育到囊胚期胚胎的數(shù)目分別為63和72，并用上述含鹿茸提取物10μg/mL、含小牛血清20％的培養(yǎng)液作為移植液進(jìn)行胚胎移植，受體妊娠頭數(shù)分別為68和81。
半胚培養(yǎng)培養(yǎng)前兩小時(shí)，在6cm培養(yǎng)皿中，用100μl的移液器將上述含鹿茸提取物10μg/mL、小牛血清20％(體積百分含量)的胚胎培養(yǎng)液做成50～100μL的培養(yǎng)小滴，置38～39℃培養(yǎng)箱中預(yù)熱。將桑葚期切割后的湖羊胚胎用含10％FCS的PBS沖洗三遍后，其中100枚放入含鹿茸培養(yǎng)滴中，另100枚放入對照組含20％血清的培養(yǎng)滴中，每滴培養(yǎng)液放胚胎10～20枚，38～39℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～3天，于培養(yǎng)的第2～3天，觀察并統(tǒng)計(jì)對照組和試驗(yàn)組發(fā)育到囊胚期胚胎的數(shù)目分別為61和70。并用上述含鹿茸提取物10μg/mL、含小牛血清20％的培養(yǎng)液作為移植液進(jìn)行胚胎移植，兩組受體妊娠頭數(shù)分別為39和52。
(5)檢測結(jié)果經(jīng)上述在產(chǎn)業(yè)中試水平上進(jìn)行的具體實(shí)施，對其結(jié)果進(jìn)行綜合檢測，其結(jié)果如下對100枚波爾山羊全胚、100枚波爾山羊切割后的半胚、100枚湖羊全胚、100枚湖羊半胚進(jìn)行處理，另各選100枚波爾山羊及湖羊胚胎為對照。在波爾山羊方面，對照組全胚體外發(fā)育率為65％，胚胎移植受體妊娠率68％，半胚體外發(fā)育率為63％，半胚移植受體妊娠率為42％；而實(shí)驗(yàn)組全胚體外發(fā)育率為72％，比對照組提高7％，胚胎移植受體妊娠率78％，比對照組提高10％，半胚體外發(fā)育率為71％，比對照組提高8％，半胚移植受體妊娠率為51％，比對照組提高9％。在湖羊方面，對照組全胚體外發(fā)育率為63％，胚胎移植受體妊娠率68％，半胚體外發(fā)育率為61％，半胚移植受體妊娠率為39％；而實(shí)驗(yàn)組全胚體外發(fā)育率為72％，比對照組提高9％，胚胎移植受體妊娠率81％，比對照組提高13％，半胚體外發(fā)育率為70％，半胚移植受體妊娠率為52％，比對照組提高13％。
實(shí)施例4(1)提取鹿茸提取物同實(shí)施例一。
(2)制作含鹿茸的培養(yǎng)液將鹿茸凍干粉3毫克、小牛血清(FCS)20毫升加入量筒，再向量筒內(nèi)緩慢加入磷酸鹽緩沖液(PBS)至100毫升，其間令鹿茸凍干粉、小牛血清充分溶入磷酸鹽緩沖液，即配成含鹿茸提取物30μg/mL、小牛血清20％(體積百分含量)的胚胎培養(yǎng)液。
(3)山羊全胚及半胚體外培養(yǎng)全胚培養(yǎng)培養(yǎng)前兩小時(shí)，在6cm培養(yǎng)皿中，用100μl的移液器將上述含鹿茸提取物30μg/mL、小牛血清20％(體積百分含量)的胚胎培養(yǎng)液做成50～100μL的培養(yǎng)小滴，置38～39℃培養(yǎng)箱中預(yù)熱。對懷孕5～6天的波爾山羊，手術(shù)法獲取桑葚期胚胎200枚，用含20％FCS的PBS沖洗三遍后，其中100枚放入含鹿茸培養(yǎng)滴中，另100枚放入對照組含20％血清的培養(yǎng)滴中，每滴培養(yǎng)液放胚胎10～20枚，在38～39℃、5％CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，1～3天后，觀察胚胎發(fā)育情況，記錄對照組和試驗(yàn)組發(fā)育到囊胚期胚胎的數(shù)目分別為65，72。并用上述含鹿茸提取物30μg/mL、含小牛血清20％的培養(yǎng)液作為移植液進(jìn)行胚胎移植，兩組受體妊娠頭數(shù)分別為66和78。
半胚培養(yǎng)培養(yǎng)前兩小時(shí)，在6cm培養(yǎng)皿中，用100μl的移液器將上述含鹿茸提取物30μg/mL、小牛血清20％(體積百分含量)的胚胎培養(yǎng)液做成50～100μL的培養(yǎng)小滴，置38～39℃培養(yǎng)箱中預(yù)熱。將桑葚期切割后的波爾山羊胚胎200枚，用含20％FCS的PBS沖洗三遍后，其中100枚放入含鹿茸培養(yǎng)滴中，另100枚放入對照組含20％血清的培養(yǎng)滴中，每滴培養(yǎng)液放胚胎10～20枚，38～39℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～3天，于培養(yǎng)的第2～3天觀察并統(tǒng)計(jì)對照組及試驗(yàn)組發(fā)育到囊胚期胚胎的數(shù)目分別為63和72。并用上述含鹿茸提取物30μg/mL、含小牛血清20％的培養(yǎng)液作為移植液進(jìn)行胚胎移植，兩組受體妊娠頭數(shù)分別為42和51。
(4)湖羊全胚及半胚體外培養(yǎng)全胚培養(yǎng)培養(yǎng)前兩小時(shí)，在6cm培養(yǎng)皿中，用100μl的移液器將上述含鹿茸提取物30μg/mL、小牛血清20％(體積百分含量)的胚胎培養(yǎng)液做成50～100μL的培養(yǎng)小滴，置38～39℃培養(yǎng)箱中預(yù)熱。對懷孕5～6天的湖羊，手術(shù)法獲取桑葚期胚胎200枚，用含20％FCS的PBS沖洗三遍后，其中100枚放入含鹿茸培養(yǎng)滴中，另100枚放入對照組含20％血清的培養(yǎng)滴中，每滴培養(yǎng)液放胚胎10～20枚，38～39℃、5％CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，1～3天后，觀察胚胎發(fā)育情況，記錄對照組和試驗(yàn)組發(fā)育到囊胚期胚胎的數(shù)目分別為63和72，并用上述含鹿茸提取物30μg/mL、含小牛血清20％的培養(yǎng)液作為移植液進(jìn)行胚胎移植，受體妊娠頭數(shù)分別為67和80。
半胚培養(yǎng)培養(yǎng)前兩小時(shí)，在6cm培養(yǎng)皿中，用100μl的移液器將上述含鹿茸提取物30μg/mL、小牛血清20％(體積百分含量)的胚胎培養(yǎng)液做成50～100μL的培養(yǎng)小滴，置38～39℃培養(yǎng)箱中預(yù)熱。將桑葚期切割后的湖羊胚胎用含20％FCS的PBS沖洗三遍后，其中100枚放入含鹿茸培養(yǎng)滴中，另100枚放入對照組含20％血清的培養(yǎng)滴中，每滴培養(yǎng)液放胚胎10～20枚，38～39℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～3天，于培養(yǎng)的第2～3天，觀察并統(tǒng)計(jì)對照組和試驗(yàn)組發(fā)育到囊胚期胚胎的數(shù)目分別為61和70。并用上述含鹿茸提取物30μg/mL、含小牛血清20％的培養(yǎng)液作為移植液進(jìn)行胚胎移植，兩組受體妊娠頭數(shù)分別為39和52。
(5)檢測結(jié)果經(jīng)上述在產(chǎn)業(yè)中試水平上進(jìn)行的具體實(shí)施，對其結(jié)果進(jìn)行綜合檢測，其結(jié)果如下對100枚波爾山羊全胚、100枚波爾山羊切割后的半胚、100枚湖羊全胚、100枚湖羊半胚進(jìn)行處理，另各選100枚波爾山羊及湖羊胚胎為對照。在波爾山羊方面，對照組全胚體外發(fā)育率為65％，胚胎移植受體妊娠率68％，半胚體外發(fā)育率為63％，半胚移植受體妊娠率為42％；而實(shí)驗(yàn)組全胚體外發(fā)育率為72％，比對照組提高7％，胚胎移植受體妊娠率78％，比對照組提高10％，半胚體外發(fā)育率為71％，比對照組提高8％，半胚移植受體妊娠率為51％，比對照組提高9％。在湖羊方面，對照組全胚體外發(fā)育率為63％，胚胎移植受體妊娠率68％，半胚體外發(fā)育率為61％，半胚移植受體妊娠率為39％；而實(shí)驗(yàn)組全胚體外發(fā)育率為72％，比對照組提高9％，胚胎移植受體妊娠率81％，比對照組提高13％，半胚體外發(fā)育率為70％，半胚移植受體妊娠率為52％，比對照組提高13％。
實(shí)施例5(1)提取鹿茸提取物同實(shí)施例一。
(2)制作含鹿茸的培養(yǎng)液將鹿茸凍干粉2毫克、小牛血清(FCS)10毫升加入量筒，再向量筒內(nèi)緩慢加入磷酸鹽緩沖液(PBS)至100毫升，其間令鹿茸凍干粉、小牛血清充分溶入磷酸鹽緩沖液，即配成含鹿茸提取物20μg/mL、小牛血清10％(體積百分含量)的胚胎培養(yǎng)液。
(3)山羊全胚及半胚體外培養(yǎng)全胚培養(yǎng)培養(yǎng)前兩小時(shí)，在6cm培養(yǎng)皿中，用100μl的移液器將上述含鹿茸提取物20μg/mL、小牛血清10％(體積百分含量)的胚胎培養(yǎng)液做成50～100μL的培養(yǎng)小滴，置38～39℃培養(yǎng)箱中預(yù)熱。對懷孕5～6天的波爾山羊，手術(shù)法獲取桑葚期胚胎200枚，用含10％FCS的PBS沖洗三遍后，其中100枚放入含鹿茸培養(yǎng)滴中，另100枚放入對照組含10％血清的培養(yǎng)滴中，每滴培養(yǎng)液放胚胎10～20枚，在38～39℃、5％CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，1～3天后，觀察胚胎發(fā)育情況，記錄對照組和試驗(yàn)組發(fā)育到囊胚期胚胎的數(shù)目分別為65，72。并用上述含鹿茸提取物20μg/mL、含小牛血清10％的培養(yǎng)液作為移植液進(jìn)行胚胎移植，兩組受體妊娠頭數(shù)分別為68和78。
半胚培養(yǎng)培養(yǎng)前兩小時(shí)，在6cm培養(yǎng)皿中，用100μl的移液器將上述含鹿茸提取物20μg/mL、小牛血清10％(體積百分含量)的胚胎培養(yǎng)液做成50～100μL的培養(yǎng)小滴，置38～39℃培養(yǎng)箱中預(yù)熱。將桑葚期切割后的波爾山羊胚胎200枚，用含10％FCS的PBS沖洗三遍后，其中100枚放入含鹿茸培養(yǎng)滴中，另100枚放入對照組含10％血清的培養(yǎng)滴中，每滴培養(yǎng)液放胚胎10～20枚，38～39℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～3天，于培養(yǎng)的第2～3天觀察并統(tǒng)計(jì)對照組及試驗(yàn)組發(fā)育到囊胚期胚胎的數(shù)目分別為63和71。并用上述含鹿茸提取物20μg/mL、含小牛血清10％的培養(yǎng)液作為移植液進(jìn)行胚胎移植，兩組受體妊娠頭數(shù)分別為42和51。
(4)湖羊全胚及半胚體外培養(yǎng)全胚培養(yǎng)培養(yǎng)前兩小時(shí)，在6cm培養(yǎng)皿中，用100μl的移液器將上述含鹿茸提取物20μg/mL、小牛血清10％(體積百分含量)的胚胎培養(yǎng)液做成50～100μL的培養(yǎng)小滴，置38～39℃培養(yǎng)箱中預(yù)熱。對懷孕5～6天的湖羊，手術(shù)法獲取桑葚期胚胎200枚，用含10％FCS的PBS沖洗三遍后，其中100枚放入含鹿茸培養(yǎng)滴中，另100枚放入對照組含10％血清的培養(yǎng)滴中，每滴培養(yǎng)液放胚胎10～20枚，38～39℃、5％CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，1～3天后，觀察胚胎發(fā)育情況，記錄對照組和試驗(yàn)組發(fā)育到囊胚期胚胎的數(shù)目分別為63和72，并用上述含鹿茸提取物20μg/mL、含小牛血清10％的培養(yǎng)液作為移植液進(jìn)行胚胎移植，受體妊娠頭數(shù)分別為68和81。
半胚培養(yǎng)培養(yǎng)前兩小時(shí)，在6cm培養(yǎng)皿中，用100μl的移液器將上述含鹿茸提取物20μg/mL、小牛血清10％(體積百分含量)的胚胎培養(yǎng)液做成50～100μL的培養(yǎng)小滴，置38～39℃培養(yǎng)箱中預(yù)熱。將桑葚期切割后的湖羊胚胎用含10％FCS的PBS沖洗三遍后，其中100枚放入含鹿茸培養(yǎng)滴中，另100枚放入對照組含10％血清的培養(yǎng)滴中，每滴培養(yǎng)液放胚胎10～20枚，38～39℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～3天，于培養(yǎng)的第2～3天，觀察并統(tǒng)計(jì)對照組和試驗(yàn)組發(fā)育到囊胚期胚胎的數(shù)目分別為61和70。并用上述含鹿茸提取物20μg/mL、含小牛血清10％的培養(yǎng)液作為移植液進(jìn)行胚胎移植，兩組受體妊娠頭數(shù)分別為39和52。
(5)檢測結(jié)果經(jīng)上述在產(chǎn)業(yè)中試水平上進(jìn)行的具體實(shí)施，對其結(jié)果進(jìn)行綜合檢測，其結(jié)果如下對100枚波爾山羊全胚、100枚波爾山羊切割后的半胚、100枚湖羊全胚、100枚湖羊半胚進(jìn)行處理，另各選100枚波爾山羊及湖羊胚胎為對照。在波爾山羊方面，對照組全胚體外發(fā)育率為65％，胚胎移植受體妊娠率68％，半胚體外發(fā)育率為63％，半胚移植受體妊娠率為42％；而實(shí)驗(yàn)組全胚體外發(fā)育率為72％，比對照組提高7％，胚胎移植受體妊娠率78％，比對照組提高10％，半胚體外發(fā)育率為71％，比對照組提高8％，半胚移植受體妊娠率為51％，比對照組提高9％。在湖羊方面，對照組全胚體外發(fā)育率為63％，胚胎移植受體妊娠率68％，半胚體外發(fā)育率為61％，半胚移植受體妊娠率為39％；而實(shí)驗(yàn)組全胚體外發(fā)育率為72％，比對照組提高9％，胚胎移植受體妊娠率81％，比對照組提高13％，半胚體外發(fā)育率為70％，半胚移植受體妊娠率為52％，比對照組提高13％。
權(quán)利要求
1.一種羊胚胎體外培養(yǎng)液，是以常規(guī)胚胎培養(yǎng)液為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，其特征是其內(nèi)還含有10～30μg/mL的鹿茸提取物以及體積百分含量為8％～20％的血清。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的羊胚胎體外培養(yǎng)液，其特征是所述的常規(guī)胚胎培養(yǎng)液為磷酸鹽緩沖液；所述的血清為小牛血清、胎牛血清或者新生牛血清。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的羊胚胎體外培養(yǎng)液，其特征是所述鹿茸提取物的含量為15μg/mL；所述血清的體積百分含量為10％。
4.一種羊胚胎體外培養(yǎng)液的配制方法，是以常規(guī)胚胎培養(yǎng)液為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，其特征是向其內(nèi)溶入10～30μg/mL的鹿茸提取物以及體積百分含量為8％～20％的血清。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的羊胚胎體外培養(yǎng)液的配制方法，其特征是所述的常規(guī)胚胎培養(yǎng)液為磷酸鹽緩沖液；所述的血清為小牛血清、胎牛血清或者新生牛血清。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的羊胚胎體外培養(yǎng)液的配制方法，其特征是所述的鹿茸提取物是將鹿茸粉碎后經(jīng)水煮、過濾、棄沉淀、上清液冷凍烘干并在～2～～6℃保存所得的凍干粉。
7.一種羊胚胎體外培養(yǎng)方法，其特征是以常規(guī)胚胎培養(yǎng)液為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，再加入10～30μg/mL的鹿茸提取物和體積百分含量為8％～20％的血清作為培養(yǎng)液并做成培養(yǎng)小滴在38～39℃環(huán)境中預(yù)熱；獲取懷孕5～6天的母羊桑葚期胚胎，用常規(guī)胚胎培養(yǎng)液沖洗后將胚胎放入培養(yǎng)小滴，在38～39℃、5％CO2的環(huán)境內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，至囊胚期用以胚胎移植。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的羊胚胎體外培養(yǎng)方法，其特征是獲取的桑葚期胚胎為全胚胎，培養(yǎng)1～3天，觀察胚胎發(fā)育情況，記錄發(fā)育到囊胚期胚胎的數(shù)目并進(jìn)行胚胎移植。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的羊胚胎體外培養(yǎng)方法，其特征是對獲取的桑葚期胚胎進(jìn)行切割成為半胚胎，于培養(yǎng)的第1天觀察半胚恢復(fù)情況，記錄恢復(fù)胚胎的數(shù)目；第2～3天，觀察并統(tǒng)計(jì)發(fā)育到囊胚期胚胎的數(shù)目。
10.根據(jù)權(quán)利要求7、8或9所述的羊胚胎體外培養(yǎng)方法，其特征是于培養(yǎng)前兩小時(shí)，在6cm培養(yǎng)皿中，用上述含鹿茸提取物的培養(yǎng)液做成50～100μL的培養(yǎng)小滴。
全文摘要
本發(fā)明屬家畜胚胎培養(yǎng)方法技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種含鹿茸提取物的羊胚胎體外培養(yǎng)液及其配制方法和胚胎的體外培養(yǎng)方法，它主要是從鹿茸中提取鹿茸提取物，并加入常規(guī)胚胎培養(yǎng)液，進(jìn)行羊全胚及切割后的胚胎進(jìn)行體外培養(yǎng)，并利用該培養(yǎng)液進(jìn)行羊全胚移植。本發(fā)明將中藥中常用的鹿茸提取物應(yīng)用到羊胚胎體外培養(yǎng)領(lǐng)域，解決了目前羊全胚體外發(fā)育率、胚胎移植懷孕率、切割后的胚胎體外發(fā)育率較低的問題。其經(jīng)濟(jì)成本較低，便于在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。
文檔編號C12N5/073GK1978633SQ20051006175
公開日2007年6月13日 申請日期2005年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月1日
發(fā)明者徐雪明, 俞頌東, 王爭光, 王錫爐, 張銳 申請人:新昌縣大東種畜發(fā)展有限公司