專利名稱：用于固定化酶乙醇熒光毛細(xì)分析法的乙醇毛細(xì)生物反應(yīng)器及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于固定化酶乙醇熒光毛細(xì)分析法(IE-EFCA)的乙醇毛細(xì)生物反應(yīng)器(ECBR)及其制備方法，屬于生化分析領(lǐng)域。本發(fā)明適用于發(fā)酵食品、藥品、血液標(biāo)本、工業(yè)用試劑等各類多組分液體樣品中乙醇的快速檢測和分析。
背景技術(shù)：
目前，需要測定乙醇含量的有蒸餾酒、配制酒、葡萄酒、果酒、米酒、啤酒、各種水果醬、水果泥、果汁、蔬菜汁、罐頭、血清、藥物、洗潔精，香水等。蒸餾酒及配制酒中的乙醇測定主要按照GB/T5009.48-2003方法，用比重計(jì)法或氣相色譜法進(jìn)行；水果、蔬菜制品中乙醇的測定方法采用ISO2448-1973的重鉻酸鉀氧化滴定法；洗潔精，香水里酒精含量的測定方法是采用內(nèi)標(biāo)法的氣相色譜法；除此之外，乙醇測定方法還有液態(tài)乙醇氧化酶法(ALOD)、乙醇脫氫酶法(ADH)等。
重鉻酸鉀氧化滴定法是將樣品蒸餾分離得到的乙醇，在硫酸介質(zhì)中，用重鉻酸鉀氧化，然后在指示劑-菲繞啉亞鐵鹽的存在下，用硫酸亞鐵銨滴定過量的重鉻酸鉀。
ALOD比色法是在ALOD(1000U/L)催化作用下，乙醇被氧化成乙醛和H2O2，繼續(xù)在過氧化物酶(POD，5000U/L)催化作用下，H2O2和4-氨基安替比林及苯酚反應(yīng)，生成紅色的醌亞胺(500nm)，根據(jù)其吸光度定量樣品中乙醇含量。
ADH比色法是在ADH的催化作用下、乙醇和氧化型輔酶I(NAD+)反應(yīng)，生成還原型輔酶I(NADH)；在340nm處測定NADH吸光度來定量樣品中乙醇濃度。
現(xiàn)有技術(shù)存在的主要問題是比重計(jì)法的準(zhǔn)確度受蒸餾操作過程、水浴恒溫條件的影響很大，靈敏度低、重現(xiàn)性差、費(fèi)時費(fèi)力；比重計(jì)法和重鉻酸鉀氧化滴定法，在測定前都必須對樣品進(jìn)行前處理，即先用蒸餾方法將樣品中的乙醇分離出來，操作復(fù)雜；重鉻酸鉀氧化滴定法使用試劑種類多；氣相色譜法的儀器預(yù)熱和操作耗時長，不適合不連續(xù)的批量樣品測定和生產(chǎn)現(xiàn)場的監(jiān)測；ALOD比色法使用的試劑種類多、酶用量大，測定成本太高、特異性差，甲醇對測定干擾很大；中間產(chǎn)物易受被測液中其它共存物質(zhì)影響；ADH比色法使用的液態(tài)酶用量大、測定成本高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于固定化酶乙醇熒光毛細(xì)分析法(IE-EFCA)的乙醇毛細(xì)生物反應(yīng)器(ECBR)及其制備方法。使用ECBR可以解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，簡化操作過程、降低被測液用量、節(jié)約大量貴重的酶制劑，減少廢液，減少使用試劑種類，增強(qiáng)測定方法特異性，提高精度和靈敏度，實(shí)現(xiàn)微量樣品的微量分析，提高分析速度，實(shí)現(xiàn)固定化酶法和常規(guī)熒光分析法相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)不連續(xù)的批量樣品快速測定，可用于生產(chǎn)現(xiàn)場的監(jiān)測。
本發(fā)明的測定原理是在ADH的催化作用下，乙醇和NAD+反應(yīng)，生成NADH；在352nm的激發(fā)波長下NADH被激發(fā)，產(chǎn)生熒光(456nm)；根據(jù)此熒光強(qiáng)度來定量樣品中乙醇濃度。
本發(fā)明用于IE-EFCA的乙醇毛細(xì)生物反應(yīng)器如圖1所示，它包括毛細(xì)管、交聯(lián)劑、ADH和NAD+。使用時，用ECBR和一個固定座替代常規(guī)熒光分析中的試液槽，將其置于熒光分析儀光路中。
本發(fā)明的ECBR材質(zhì)可以是石英玻璃、光學(xué)玻璃或透明塑料，其長度為3～5cm，容量為2～10μL，內(nèi)徑為0.14～0.90mm，外徑為0.55～1.20mm，壁厚為0.10～0.25mm；它的內(nèi)孔可以是圓形、也可以是矩形，矩形時邊長為0.25～0.45mm，壁厚為0.10～0.25mm；固定化ADH濃度為1～20IU/L；固定化NAD+濃度為1～7mmol/L。
本發(fā)明ECBR中可單獨(dú)固定ADH，也可以同時固定ADH和NAD+。
本發(fā)明ECBR中ADH和NAD+可變成其它的酶制劑，形成不同用途的毛細(xì)生物反應(yīng)器，也可制成各種專用的熒光毛細(xì)生物測試盒。
本發(fā)明ECBR可直接用于目前已商品化的各種熒光分析儀，實(shí)施乙醇的測定及研究。
本發(fā)明ECBR的制備方法包括以下步驟1)毛細(xì)管的化學(xué)修飾利用毛細(xì)現(xiàn)象將2.5％戊二醛試劑吸入毛細(xì)管內(nèi)，在真空狀態(tài)下放置1h，使戊二醛共價結(jié)合在毛細(xì)管的內(nèi)壁上；2)毛細(xì)管中酶及試劑的固定化再用0.1mol/L磷酸緩沖液(pH7.0)洗掉未結(jié)合的戊二醛；然后，用毛細(xì)管吸入用0.1mol/L磷酸緩沖液(pH7.0)配制的ADH或ADH和NAD+混合溶液，在4℃下旋轉(zhuǎn)固定6～12h，使ADH的氨基與戊二醛的醛基共價結(jié)合；3)毛細(xì)管化學(xué)修飾基團(tuán)的封閉再將固定有ADH的毛細(xì)管浸泡在2％(m/v)的牛血清蛋白液中6-12h，封閉未結(jié)合的醛基，制成ECBR；最后，將ECBR保存在4℃的0.1mol/L磷酸緩沖液中(pH7.0)。
本發(fā)明的基本技術(shù)參數(shù)為乙醇的測定范圍在1.1～15.5g/L，檢出限為1.10g/L，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD＜2.0％，磷酸緩沖溶液濃度0.1mol/L，pH6.5～9.0，NAD+濃度3～6mmol/L，ADH固定化酶的濃度1～10U/L；酶催化反應(yīng)時間10～20min，反應(yīng)溫度20～40℃。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是1)用ECBR代替常規(guī)的試液槽，實(shí)現(xiàn)IE-EFCA法；2)酶在ECBR中固定化后可以重復(fù)使用，能節(jié)約大量的貴重酶試劑，降低實(shí)驗(yàn)成本；3)適用于試劑昂貴、樣品量少、濃度低、批量的樣品測定；便于攜帶、保存；4)無需對樣品進(jìn)行前處理，可以直接測定，操作簡便；5)使用試劑種類少，操作耗時短，適合生產(chǎn)現(xiàn)場的監(jiān)測；甲醇對測定不干擾；6)可用于食品、衛(wèi)生、工業(yè)、環(huán)境、醫(yī)學(xué)、藥物、生物、等樣品中乙醇的測定，能產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益。


圖1本發(fā)明乙醇毛細(xì)生物反應(yīng)器結(jié)構(gòu)示意中S樣品、1毛細(xì)管、2毛細(xì)管壁、3交聯(lián)劑、4ADH、5NAD+。
圖2實(shí)施例1優(yōu)選ECBR中固定化ADH濃度的曲線3實(shí)施例2是用本發(fā)明測定乙醇得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線4實(shí)施例4是考察ECBR中固定化酶和液態(tài)酶效果的曲線圖具體實(shí)施例結(jié)合附圖對本發(fā)明的實(shí)施例作進(jìn)一步描述實(shí)施例1本實(shí)施例是優(yōu)選ECBR中固定化ADH的濃度。先將5、10、20、30、40、80U/L的ADH酶分別固定在毛細(xì)管中，制成六個ECBR；然后，用這些ECBR分別吸入一系列不同濃度的乙醇標(biāo)準(zhǔn)液，分別與NAD+混合后進(jìn)行測定。實(shí)驗(yàn)條件激發(fā)波長352nm，發(fā)射波長456nm，室溫25℃，樣品用量為10μL，結(jié)果如圖2所示；酶的固定量在10U/L時，熒光強(qiáng)度最高；因此，ADH的固定化濃度選定為10U/L。
實(shí)施例2本實(shí)施例是用本發(fā)明ECBR測定乙醇。實(shí)驗(yàn)條件激發(fā)波長352nm，發(fā)射波長456nm，室溫40℃，被測液用量10μL。測定時，將固定座置于熒光儀的光路中；用ECBR分別吸入濃度為2、4、8、10、15g/L的乙醇標(biāo)準(zhǔn)液之后，將其插入固定座的插入孔內(nèi)，測定其熒光強(qiáng)度，結(jié)果如圖3所示。乙醇濃度在2.0-15.0g/L范圍內(nèi)和熒光強(qiáng)度有良好的線性關(guān)系。
實(shí)施例3本實(shí)施例是用ECBR測定樣品的回收率。四種酒樣中乙醇含量的測定結(jié)果如表1所示。測得的結(jié)果和樣品標(biāo)示濃度相符。為了檢驗(yàn)本發(fā)明的可靠性，用標(biāo)準(zhǔn)添加法進(jìn)行了回收率測定，結(jié)果如表2所示。四種酒測得的回收率均在101～103％，結(jié)果令人滿意。
表1

表2

實(shí)施例4本實(shí)施例是考察本發(fā)明ECBR的精密度。在測定乙醇的線性范圍內(nèi)，分別選用較低和較高濃度兩種乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行了重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)(n＝11)，結(jié)果如表3所示?？梢钥闯觯谳^低和較高兩種濃度下，RSD都在2％左右，可見使用ECBR測定乙醇時其精密度能完全滿足要求。
表3

實(shí)施例5本實(shí)施例是用本發(fā)明ECBR考察了固定化酶和液態(tài)酶的效果。實(shí)驗(yàn)條件激發(fā)波長352nm，發(fā)射波長456nm，實(shí)驗(yàn)溫度40℃，被測液用量10μL，ECBR中固定化ADH的濃度10U/L，液態(tài)ADH濃度30U/L，NAD+液態(tài)濃度5mmol/L，乙醇作為樣品；測定結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，ADH固定化后用于乙醇測定，其線性良好，靈敏度也遠(yuǎn)高于液態(tài)ADH。
權(quán)利要求
1.用于固定化酶乙醇熒光毛細(xì)分析法(IE-EFCA)的乙醇毛細(xì)生物反應(yīng)器(ECBR)(1)，其特征是它包括毛細(xì)管(2)、交聯(lián)劑(3)、乙醇脫氫酶(ADH)(4)及輔酶I(NAD+)(5)。
2.如權(quán)利要求1所述的ECBR，其特征是它(1)的材質(zhì)可以是石英玻璃、光學(xué)玻璃或透明塑料，長度為3～5cm，容量為2～10μL，內(nèi)徑為0.14～0.90mm，外徑為0.55～1.20mm，壁厚為0.10～0.25mm；它(1)的內(nèi)孔可以是圓形、也可以是矩形，矩形時邊長為0.25～0.45mm，壁厚為0.10～0.25mm；固定化ADH濃度為1～20IU/L；固定化NAD+濃度為1～7mmol/L。
3.如權(quán)利要求1所述的ECBR，其特征是可以在ECBR(1)中單獨(dú)固定ADH，也可以同時固定ADH和NAD+，或同時固定兩種以上的酶或試劑。
4.如權(quán)利要求1所述的ECBR，其特征是可將ECBR(1)中的ADH(4)和NAD+(5)變成其它的酶或試劑，制成不同用途的毛細(xì)生物反應(yīng)器和熒光毛細(xì)生物測試盒。
5.如權(quán)利要求1所述的ECBR，其特征在于可直接用于已商品化的各種熒光分析儀，實(shí)施乙醇的測定及研究。
6.如權(quán)利要求1所述的ECBR制備方法，其特征在于包括以下步驟1)毛細(xì)管的化學(xué)修飾利用毛細(xì)現(xiàn)象將2.5％戊二醛試劑吸入毛細(xì)管內(nèi)，在真空狀態(tài)下放置1h，使戊二醛共價結(jié)合在毛細(xì)管的內(nèi)壁上；2)毛細(xì)管中酶及試劑的固定化再用0.1mol/L磷酸緩沖液(pH 7.0)洗掉未結(jié)合的戊二醛；然后，用毛細(xì)管吸入用0.1mol/L磷酸緩沖液(pH 7.0)配制的ADH或ADH和NAD+混合溶液，在4℃下旋轉(zhuǎn)固定6～12h，使ADH的氨基與戊二醛的醛基共價結(jié)合；3)毛細(xì)管化學(xué)修飾基團(tuán)的封閉再將固定有ADH的毛細(xì)管浸泡在2％(m/v)的牛血清蛋白液中6～12h，封閉未結(jié)合的醛基，制成ECBR；最后，將ECBR保存在4℃的0.1mol/L磷酸緩沖液中(pH 7.0)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于固定化酶乙醇熒光毛細(xì)分析法(IE－EFCA)的乙醇毛細(xì)生物反應(yīng)器(ECBR)及其制備方法，屬于生化分析領(lǐng)域。它是用交聯(lián)劑將乙醇脫氫酶和輔酶I固定于毛細(xì)管內(nèi)壁制成；它包括毛細(xì)管、交聯(lián)劑、輔酶I、乙醇脫氫酶及酶活性保持液；它可重復(fù)使用。用它實(shí)現(xiàn)IE－EFCA。測定乙醇時，用ECBR吸入乙醇樣品液后置于熒光分析儀中，檢測其熒光強(qiáng)度。本發(fā)明重現(xiàn)性好、操作簡便，能節(jié)約貴重的酶試劑，實(shí)現(xiàn)乙醇的微量化、快速化測定；可制成熒光毛細(xì)乙醇測試盒，用于醫(yī)藥、衛(wèi)生、工業(yè)、食品和環(huán)境等含乙醇樣品的測定；改變毛細(xì)生物反應(yīng)器中酶或試劑種類，可以達(dá)到不同的測定目的。
文檔編號C12Q1/00GK1766578SQ20051002183
公開日2006年5月3日 申請日期2005年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月9日
發(fā)明者李永生, 高秀峰 申請人:四川大學(xué)