專利名稱：：微藻培養(yǎng)生產(chǎn)同位素葡萄糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種利用微藻生物合成生產(chǎn)同位素葡萄糖的方法，包括培養(yǎng)基的配置，光生物反應(yīng)器的構(gòu)建，微藻的接種和擴(kuò)種以及微藻在光生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)等環(huán)節(jié)。
背景技術(shù)：
：同位素葡萄糖是指由碳或氫等元素的同位素構(gòu)成的葡萄糖。例如標(biāo)記有碳13，碳14，氘或氚等同位素的葡萄糖。同位素葡萄糖是生物技術(shù)研究用新型試劑，在生物工程和新醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)有特殊的應(yīng)用。一般的葡萄糖廣泛地用于生物工程和新醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)，幾乎是所有的數(shù)以萬計(jì)的生物過程的主要原材料。有了同位素葡萄糖，就可以非常容易地利用現(xiàn)有的成熟的生物工程工藝生產(chǎn)數(shù)以萬計(jì)的同位素生化分子。這些同位素生化分子在當(dāng)代生命科學(xué)產(chǎn)業(yè)中有著特殊的，甚至在某些情況下不可替代的應(yīng)用。例如用碳13葡萄糖制備的穩(wěn)定性同位素蛋白質(zhì)，核酸和多糖等大分子可以用于大分子結(jié)構(gòu)研究。同位素葡萄糖的制備有化學(xué)合成和生物合成兩種方法。同位素葡萄糖的生物合成一般用微藻培養(yǎng)的方法。在微藻培養(yǎng)基里提供無機(jī)同位素的碳或氫同位素，微藻通過進(jìn)行光合作用，合成淀粉，蛋白質(zhì)和脂肪等生物大分子。將這樣培養(yǎng)的微藻中的淀粉分離純化，再水解則可獲得同位素葡萄糖。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種生物合成同位素葡萄糖的方法。包括培養(yǎng)基的配置，光生物反應(yīng)器的構(gòu)建，微藻的接種和擴(kuò)種以及微藻在光生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)等環(huán)節(jié)。本發(fā)明的方法實(shí)現(xiàn)同位素100％的利用和高產(chǎn)率同位素葡萄糖的生產(chǎn)。本發(fā)明的方法具體步驟如下1.選擇藻種和配置同位素微藻培養(yǎng)基本發(fā)明采用螺旋藻作為藻種來生產(chǎn)同位素葡萄糖。本發(fā)明采用如下所述的兩種培養(yǎng)基，分別用于螺旋藻的擴(kuò)種和在光生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)。用于擴(kuò)種的培養(yǎng)基配方是13C碳酸氫鈉16.8g/L硝酸鈉2.5g/L硫酸鉀1.0g/L氯化鈉1.0g/L磷酸氫二鉀0.5g/L硫酸鎂0.2g/L氯化鈣0.04g/L硫酸亞鐵0.01g/L乙二胺四乙酸二鈉0.08g/L硼酸2.8×10-3g/L氯化錳1.8×10-3g/L硫酸鋅2.2×10-4g/L硫酸銅8.0×10-5g/L鉬酸鈉3.9×10-5g/L礬酸銨2.2×10-5g/L硫酸鉻鉀9.6×10-5g/L硫酸鎳4.8×10-5g/L鎢酸鈉1.7×10-5g/L硫酸鈦4.0×10-5g/L硝酸鈷4.4×10-5g/L用于光生物反應(yīng)器培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方是氫氧化鈉0.1g/L硝酸鈉0.5g/L硫酸鉀1.0g/L氯化鈉1.0g/L磷酸氫二鉀0.5g/L硫酸鎂0.2g/L氯化鈣0.04g/L硫酸亞鐵0.01g/L乙二胺四乙酸二鈉0.08g/L硼酸2.8×10-3g/L氯化錳1.8×10-3g/L硫酸鋅2.2×10-4g/L硫酸銅8.0×10-5g/L鉬酸鈉3.9×10-5g/L礬酸銨2.2×10-5g/L硫酸鉻鉀9.6×10-5g/L硫酸鎳4.8×10-5g/L鎢酸鈉1.7×10-5g/L硫酸鈦4.0×10-5g/L硝酸鈷4.4×10-5g/L2.構(gòu)建全封閉式光生物反應(yīng)器本發(fā)明采用特殊的全封閉式光生物反應(yīng)器來培養(yǎng)微藻。全封閉式光生物反應(yīng)器由以下裝置組成A、反應(yīng)器主單元，為20L塑料透明桶，開有3個(gè)可以傳輸氣體或液體的進(jìn)出口，還開有一個(gè)可以密封放置pH電極的開口。B、反應(yīng)器光源，為6盞25WT5日光燈，在反應(yīng)器主單元周圍均勻放置。C、氧氣吸收裝置，為10L容器內(nèi)置20g/L硫酸鈉溶液。D、真空氣泵，為10L/min的真空氣泵，從反應(yīng)器主單元吸取尾氣，將氣體通過氧氣吸收裝置再泵回反應(yīng)器主單元。E、pH控制系統(tǒng)，包括pH探頭，pH計(jì)，自控電磁閥和同位素二氧化碳供給裝置。F、溫控裝置，為一溫控水浴裝置，置于反應(yīng)器底部。請參見光生物反應(yīng)器的示意圖。3.微藻的接種和擴(kuò)種取5ml普通螺旋藻液加入到用于200ml擴(kuò)種的同位素培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一段時(shí)間，在螺旋藻濃度達(dá)到大約0.6g/L的時(shí)候，轉(zhuǎn)移到1L的用于擴(kuò)種的同位素培養(yǎng)基中，待螺旋藻濃度達(dá)到大約0.6g/L的時(shí)候，接種到光生物反應(yīng)器。4.微藻光生物反應(yīng)器的培養(yǎng)向微藻光生物反應(yīng)器中放19L的用于培養(yǎng)的微藻培養(yǎng)基，控制光照600-1000uE，控制溫度26-28度，控制通氣量0.4-0.6L/min，通過向培養(yǎng)基輸入同位素二氧化碳控制pH8.8-9.2。待系統(tǒng)平衡后，接種1L螺旋藻液到光生物反應(yīng)器。維持光生物反應(yīng)器的生長條件，大約8天，螺旋藻濃度會(huì)達(dá)到1.0-1.2g/L。這時(shí)停止光反應(yīng)器運(yùn)行，采收藻液，分析葡萄糖含量。附圖是本發(fā)明的光生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)示意圖。圖中1是反應(yīng)器主單元2是反應(yīng)器光源3是氧氣吸收裝置4是真空氣泵5是pH電極6是pH控制器7是同位素二氧化碳?xì)馄?是氣體導(dǎo)管9是亞硫酸鈉溶液10是微藻培養(yǎng)液具體實(shí)施方式1.配制擴(kuò)種用同位素微藻培養(yǎng)基向燒杯中倒入5L蒸餾水，向其中加入各種營養(yǎng)成分如下13C碳酸氫鈉84g硝酸鈉12.5g硫酸鉀5.0g氯化鈉5.0g磷酸氫二鉀2.5g硫酸鎂1.0g氯化鈣0.2g硫酸亞鐵0.05g乙二胺四乙酸二鈉0.4g硼酸14mg氯化錳9mg硫酸鋅1.1mg硫酸銅400ug鉬酸鈉200ug礬酸銨110ug硫酸鉻鉀480ug硫酸鎳240ug鎢酸鈉85ug硫酸鈦200ug硝酸鈷220ug2.配制培養(yǎng)用同位素微藻培養(yǎng)基向塑料桶中加入蒸餾水20L，向其中加入各種營養(yǎng)成分如下氫氧化鈉2g硝酸鈉10g硫酸鉀20g氯化鈉20g磷酸氫二鉀10g硫酸鎂4g氯化鈣0.8g硫酸亞鐵0.2g乙二胺四乙酸二鈉0.4g硼酸560mg氯化錳36mg硫酸鋅4.4mg硫酸銅1.6mg鉬酸鈉800ug礬酸銨440ug硫酸鉻鉀1.9mg硫酸鎳960ug鎢酸鈉340ug硫酸鈦800ug硝酸鈷880ug3.螺旋藻擴(kuò)種取5ml普通螺旋藻液加到裝有200ml擴(kuò)種用同位素微藻培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，放置日光燈下培養(yǎng)8天，測量藻液濃度為0.65g/L。將藻液轉(zhuǎn)移到有1000ml擴(kuò)種用同位素微藻培養(yǎng)基的2L三角瓶中，放置日光燈下培養(yǎng)4天，測量微藻濃度為0.68g/L.4.構(gòu)建光生物反應(yīng)器將反應(yīng)器主單元，反應(yīng)器光源，氧氣吸收裝置，真空氣泵，pH控制系統(tǒng)，和溫控裝置按示意圖所示組裝(標(biāo)點(diǎn))，加入19L培養(yǎng)用同位素微藻培養(yǎng)基，調(diào)整溫度控制設(shè)定為26-28度，pH控制為8.8-9.2，檢查氣泵的鼓氣量在0.4-0.6期間，調(diào)整日光燈和反應(yīng)器主單元的距離，使反應(yīng)器主單元表面的光量子通量為600-1000uE。5.微藻在光生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)將步驟3擴(kuò)大的螺旋藻液接種到光生物反應(yīng)器里，控制反應(yīng)條件不變，培養(yǎng)8天，觀察到螺旋藻顏色轉(zhuǎn)黃，取藻液測量微藻濃度為1.2g/L，測量淀粉濃度為0.8個(gè)/L，葡萄糖含量約68％。參考文獻(xiàn)1.ZviE.KahanaandAvivaLapidot.AdaptionofBiotechnologicalProcessesforPreparationofCompoundsLabeledwithStableIsotopes.SynthesisandApplicationofIsotopicallyLabeledCompounds1985.ProceedingsoftheSecondInternationalSymposium，KansasCity，MO，USA.，3-6September1985，R.R.Muccino(Ed.)，511-512.2.PaulW.Behrens，ValerieJ.SicotteandJacquesDelente.MicroalgaeasaSourceofStableIsotopicallyLabeledCompounds.JournalofAppliedPhycology6113-121，1994.3.RichardJ.RadmerandBruceC.Parker.CommercialApplicationofAlgaeOpportunitiesandConstraints.JournalofAppliesPhycology693-98，1994.4.XiaJinlan，NieZhenyang，andJ.M.Levert.Biosynthesisof13C-labeledAminoAcidandSugarsbySpirulina(Arthrospira)inaParallelepipedPhotobioreactor.ChineseJournalofChemicalEngineering10(5)592-596(2002)5.FranciscoG.AcienFernandez，CelesteBrindleyAlias，MariaC.Carcia-MaleaLopez，JoseM.FernandezSevilla，MariaJ.IbanezGonzalezRafaelNunezGomez，EmilioMolinaGrima.AssessmentoftheProductionof13C-labeledCompoundsfromPhototrophicMicroalgaeatLaboratoryScale.BiomolecularEngineering20(2003)149-162.6.HeinerKBerthold，DavidL.Hachey，PeterJ.ReedsP.Thomas，ScotHoeksemaandPeterD.Klein.Uniformly13C-labeledAlgalProteinUsedtoDetermineAminoAcidEssentialityinvivo.ProceedingsofNationalAcademyofSciencesUSA88(9)8091-80951991.7.GernaldineBrandner，VincentPhalip，EstherKellenbergerandCheng-caiZhang.OptimizationofaCyanobacterialCultureusedforProductionofIsotopes-labelledRecombinantProteins.BiotechnologyTechniques13177-180，19998.TakanoriKigawa，TakashiYabuhi，YasuhiloYoshida，MichioTsutsui，YutakaIto，TakehikoShibata，ShigeyukiYokoyama.Cell-freeProductionandStable-IsotopeLabelingofMilligramQuantitiesofProteins.FEBSLetters442(1999)15-199.ElizabethBoyle-Roden，J.B.German，andB.J.B.Wood.TheProductionofLipidsAlternativelyLabelledwithCarbon-13.BiomolecularEngineering20(2003)285-28910.Ross，W.Kessler，D.Krumme，U.Menge，J.Wissing，J.vandenHeuvel，andLFlohe.OptimizedFermentationStrategyfor13C/15NRecombinantProteinLabellingInEscherichiacoliforNMR-structureAnalysis.JournalofBiotechnology108(2004)31-39權(quán)利要求1.一種利用封閉式光生物反應(yīng)器微藻培養(yǎng)生產(chǎn)同位素葡萄糖的方法，包括以下步驟A、選擇微藻藻種和配置同位素微藻培養(yǎng)基選擇一種適宜的微藻作為生產(chǎn)用藻種，配置兩種培養(yǎng)基，分別用于微藻的擴(kuò)種和培養(yǎng)。B、光生物反應(yīng)器的構(gòu)建利用透明的細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備，加上人工光源、溫度控制、pH值控制、真空氣泵、氧氣吸收器等裝置，構(gòu)建用于培養(yǎng)微藻的全封閉式光生物反應(yīng)器。C、微藻的擴(kuò)種將微藻接種到用于擴(kuò)種的培養(yǎng)基里，用三角瓶擴(kuò)大培養(yǎng)微藻，使其達(dá)到一定的濃度和體積。D、藻的光生物反應(yīng)器培養(yǎng)將達(dá)到一定濃度和體積的微藻液接種到生物反應(yīng)器內(nèi)，在一定的光線溫度、pH值條件和鼓氣量的條件下，培養(yǎng)微藻，并在一定濃度下采收藻液。2.如權(quán)力要求1所述的一種微藻培養(yǎng)生產(chǎn)同位素葡萄糖的方法，其特征是采用螺旋藻作為生產(chǎn)藻種。3.如權(quán)力要求1所述的一種微藻培養(yǎng)生產(chǎn)同位素葡萄糖的方法，其特征是采用含有以下成分的培養(yǎng)基用于微藻的擴(kuò)種13C碳酸氫鈉16.8g/L硝酸鈉2.5g/L硫酸鉀1.0g/L氯化鈉1.0g/L磷酸氫二鉀0.5g/L硫酸鎂0.2g/L氯化鈣0.04g/L硫酸亞鐵0.01g/L乙二胺四乙酸二鈉0.08g/L硼酸2.8×10-3g/L氯化錳1.8×10-3g/L硫酸鋅2.2×10-4g/L硫酸銅8.0×10-5g/L鉬酸鈉3.9×10-5g/L礬酸銨2.2×10-5g/L硫酸鉻鉀9.6×10-5g/L硫酸鎳4.8×10-5g/L鎢酸鈉1.7×10-5g/L硫酸鈦4.0×10-5g/L硝酸鈷4.4×10-5g/L4.如權(quán)力要求1所述的一種微藻培養(yǎng)生產(chǎn)同位素葡萄糖的方法，其特征是采用含有以下成分的培養(yǎng)基用于微藻的培養(yǎng)氫氧化鈉0.1g/L硝酸鈉0.5g/L硫酸鉀1.0g/L氯化鈉1.0g/L磷酸氫二鉀0.5g/L硫酸鎂0.2g/L氯化鈣0.04g/L硫酸亞鐵0.01g/L乙二胺四乙酸二鈉0.08g/L硼酸2.8×10-3g/L氯化錳1.8×10-3g/L硫酸鋅2.2×10-4g/L硫酸銅8.0×10-5g/L鉬酸鈉3.9×10-5g/L礬酸銨2.2×10-5g/L硫酸鉻鉀9.6×10-5g/L硫酸鎳4.8×10-5g/L鎢酸鈉1.7×10-5g/L硫酸鈦4.0×10-5g/L硝酸鈷4.4×10-5g/L5.如權(quán)力要求1所述的一種微藻培養(yǎng)生產(chǎn)同位素葡萄糖的方法，其特征是采用特制的封閉的帶有氧氣吸收器的光生物反應(yīng)器，在控制的光照、溫度、pH值和鼓氣量的條件下培養(yǎng)微藻生產(chǎn)同位素葡萄糖。6.如權(quán)力要求1所述的一種微藻培養(yǎng)生產(chǎn)同位素葡萄糖的方法，其特征是采用如權(quán)力要求3所述的用于擴(kuò)種的培養(yǎng)基在三角瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)微藻，在濃度為0.6g/L細(xì)胞干重的情況下接種微藻細(xì)胞到如權(quán)利要求5所述的光生物反應(yīng)器中。7.如權(quán)利要求1所述的一種微藻培養(yǎng)生產(chǎn)同位素葡萄糖的方法，其特征是采用如權(quán)利要求5所述光反應(yīng)器進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，控制光照條件為600-1000uE。8.如權(quán)利要求1所述的一種微藻培養(yǎng)生產(chǎn)同位素葡萄糖的方法，其特征是采用如權(quán)利要求5所述光反應(yīng)器進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，控制溫度為26-28度。9.如權(quán)利要求1所述的一種微藻培養(yǎng)生產(chǎn)同位素葡萄糖的方法，其特征是采用如權(quán)利要求5所述的光反應(yīng)器進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，控制pH值為8.8-9.2。10.如權(quán)利要求1所述的一種微藻培養(yǎng)生產(chǎn)同位素葡萄糖的方法，其特征是采用如權(quán)利要求5所述的光反應(yīng)器進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，控制鼓氣量為0.4-0.6L/L。11.如權(quán)利要求1所述的一種微藻培養(yǎng)生產(chǎn)同位素葡萄糖的方法，其特征是采用如權(quán)利要求5所述的光生物反應(yīng)器進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，在微藻濃度為1.0-1.2g/L時(shí)進(jìn)行采收。全文摘要本發(fā)明公開了一種利用封閉式光生物反應(yīng)器微藻培養(yǎng)生產(chǎn)同位素葡萄糖的方法，包括封閉式光生物反應(yīng)器的構(gòu)造和微藻培養(yǎng)的生產(chǎn)工藝。采用封閉的真空氣泵循環(huán)使用同位素二氧化碳，避免了昂貴的同位素二氧化碳的流失，使同位素二氧化碳的利用率可達(dá)到100％。采用適宜的微藻品種和優(yōu)化的微藻培養(yǎng)基，提高了微藻葡萄糖含量，含量高達(dá)細(xì)胞干重的60－80％。文檔編號(hào)C12P19/00GK1810978SQ20051000669公開日2006年8月2日申請日期2005年1月27日優(yōu)先權(quán)日2005年1月27日發(fā)明者李健,毛延發(fā),劉小玲申請人:深圳市東西方生物技術(shù)有限公司