專利名稱：持久力增強(qiáng)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及針對(duì)包括運(yùn)動(dòng)和勞動(dòng)在內(nèi)的廣義運(yùn)動(dòng)的持久力增強(qiáng)劑、抗疲勞劑。
背景技術(shù)：
在進(jìn)行以需要持久力的運(yùn)動(dòng)或需要肌肉反復(fù)做功的勞動(dòng)等為代表的廣義運(yùn)動(dòng)時(shí)，強(qiáng)烈需要增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)或勞動(dòng)中的持久力并抑制疲勞。
為此，人們對(duì)具有增強(qiáng)持久力、抑制疲勞的作用的成分進(jìn)行了各種探索。例如，已知有將靈芝成分(專利文獻(xiàn)1)或野山楂提取物(Crataegus cuneata Sieb.et Zucc.)(專利文獻(xiàn)2)等用作增強(qiáng)持久力的成分的方案。還有將生物素(專利文獻(xiàn)3)、某種氨基酸組合物(專利文獻(xiàn)4)、2-氧代戊二酸(專利文獻(xiàn)5)等用作抗疲勞劑的方案。
此外，有報(bào)告表明，綠茶、葡萄、可可豆等中所含的兒茶素類具有抑制膽固醇上升的作用(專利文獻(xiàn)6)、抑制α-淀粉酶活性的作用(專利文獻(xiàn)7)、抑制血糖升高的作用(專利文獻(xiàn)8)、預(yù)防動(dòng)脈硬化的作用(專利文獻(xiàn)9)、抗氧化作用(專利文獻(xiàn)10)、抗菌作用(專利文獻(xiàn)11)、抑制血壓升高及抑制酶活性的作用(專利文獻(xiàn)12)、抗?jié)冏饔?專利文獻(xiàn)13)以及抑制突變的作用等生理益處。但人們并不知曉兒茶素類在運(yùn)動(dòng)時(shí)的持久力、疲勞方面有何種影響。
專利文獻(xiàn)1日本特開平5-123135號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2日本特開平8-47381號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3日本特開平6-305963號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)4日本特開平7-25838號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)5日本特開平10-175855號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)6日本特開昭60-156614號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)7日本特開平3-133928號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)8日本特開平4-253918號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)9日本特開平4-352726號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)10日本特公平1-44234號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)11日本特開平2-276562號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)12日本特開平3-133928號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)13日本特開昭63-277628號(hào)公報(bào)發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及以兒茶素類為有效成分的持久力增強(qiáng)劑和抗疲勞劑。
本發(fā)明還涉及兒茶素類在制備持久力增強(qiáng)劑和抗疲勞劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及服用有效劑量的兒茶素類增強(qiáng)持久力的方法和緩解疲勞的方法。
本發(fā)明還涉及以兒茶素類為有效成分的AMPK活化劑。
本發(fā)明還涉及兒茶素類在制備AMPK活化劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及服用有效劑量的兒茶素類的AMPK活化方法。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人在研究?jī)翰杷仡惖纳碜饔脮r(shí)，意外發(fā)現(xiàn)其具有優(yōu)異的持久力增強(qiáng)作用和抗疲勞作用，以及AMPK(AMP-activated proteinkinase活化蛋白激酶)的活化作用。
本發(fā)明提供藥物及食品，其對(duì)以需要持久力的運(yùn)動(dòng)或需要肌肉反復(fù)做功的勞動(dòng)為代表的廣義運(yùn)動(dòng)具有增強(qiáng)持久力的作用、抑制疲勞的作用、AMPK活化的作用，作為瘦蛋白(leptin)、脂聯(lián)素(adiponectin)的替代物起作用。
通常，兒茶素類是指兒茶素、沒食子兒茶素(gallocatechin)、沒食子酸兒茶素(catechingallate)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(gallocatechingallate)、表兒茶素、表沒食子兒茶素、表沒食子酸兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯的總稱。在本發(fā)明中，可含有上述化合物中的一種或兩種以上。
本發(fā)明所用成分之一的兒茶素類可通過以取自Camellia屬——例如C.sinensis、C.assamica和藪北種或它們的雜種的茶葉經(jīng)制茶工藝而得的茶葉為原料，向其中添加水或熱水，以及根據(jù)情況而添加提取助劑等提取而得。上述精制茶包括(1)煎茶、番茶、玉露、甜茶、釜炒茶(roasted tea)等綠茶類；(2)總稱為烏龍茶的鐵觀音、色種、黃金桂、武夷巖茶等半發(fā)酵茶；(3)稱為紅茶的大吉嶺茶、烏沃(Ceylon Uva)茶、祁門紅茶(Chinese Keemun)等發(fā)酵茶。提取茶的方法可采用攪拌提取等現(xiàn)有方法。還可預(yù)先在提取時(shí)的水中添加抗壞血酸鈉等有機(jī)酸或有機(jī)酸鹽類。此外，也可同時(shí)采用在煮沸脫氣或通入氮?dú)獾炔换顫姎怏w以除去溶解氧等的情況下，即，在非氧化環(huán)境下進(jìn)行提取的方法。此外，也可不采用直接從茶葉中提取的方法，而是采用配合茶葉提取物的濃縮物或精制物的方法。
本發(fā)明的茶葉提取物的濃縮物是指，以茶葉為原料，將利用熱水或水溶性有機(jī)溶劑提取出的提取物濃縮而得的產(chǎn)物；茶提取物的精制物是指，采用溶劑或柱等精制而得的產(chǎn)物。例如，可舉出采用日本特開昭59-219384號(hào)、日本特開平4-20589號(hào)、日本特開平5-260907號(hào)、日本特開平5-306279號(hào)公報(bào)等舉例詳細(xì)說明的方法調(diào)制得到的產(chǎn)物。作為市售品可舉出Tokyo Food Techno Co.，Ltd.的“POLYPHENON”ItoEN，LTD.的“TEAFURAN”、Taiyo Kagaku Co.，Ltd.的“SUNPHENON”、Suntory Limited的“SUN OOLONG”等。此外，還可使用來自例如葡萄、葡萄酒、葡萄汁等以葡萄為原料的加工制品；來自可可豆及以此為原料的加工制品等來自其它原料的兒茶素類，甚至也可使用化學(xué)合成品。茶提取物的濃縮物及茶提取物的精制物的形態(tài)可舉出固體、水溶液、漿料等各種形態(tài)。用于溶解、稀釋茶提取物的濃縮物或茶提取物的精制物的液體可舉出水、碳酸水、被提取出的普通茶類提取液等。
作為兒茶素類，通常可使用茶提取物的濃縮物或茶提取物的精制物，但特別優(yōu)選使用綠茶提取物的濃縮物或綠茶提取物的精制物。
兒茶素類如后述實(shí)施例所述，具有例如延長(zhǎng)極限行進(jìn)時(shí)間(maximal running time)等持久力增強(qiáng)作用，因此，發(fā)揮著預(yù)防、緩解肌肉疲勞、肉體疲勞等效果。
此外，兒茶素類如后述實(shí)施例所示，具有優(yōu)異的AMPK活化作用。
AMPK在運(yùn)動(dòng)等細(xì)胞內(nèi)ATP水平降低之類的情況下，活性增強(qiáng)，結(jié)果就發(fā)揮出促進(jìn)代謝、促進(jìn)ATP合成的“代謝傳感器”(metabolicsensor)的功能。
已知，AMPK通過控制乙酰輔酶A羧化酶(ACC)的活性來影響線粒體中的脂肪酸氧化。將長(zhǎng)鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)入線粒體內(nèi)的肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(CPT-1)不僅是線粒體中的脂肪酸氧化的限速酶，而且受到作為ACC產(chǎn)物的丙二酸單酰輔酶A很強(qiáng)的抑制。發(fā)明人認(rèn)為，由此使AMPK通過對(duì)ACC施加磷酸化作用(Ser79)來抑制ACC的活性，降低丙二酸單酰輔酶A的含量，結(jié)果就使得CPT-1的活性亢進(jìn)，促進(jìn)脂肪酸氧化。這樣，AMPK不僅在細(xì)胞內(nèi)能量不足時(shí)被活性化，且在生物體的能量代謝及營(yíng)養(yǎng)代謝方面也發(fā)揮重要作用。
根據(jù)最近的研究，有報(bào)告表明AMPK也可被瘦蛋白(Nature，Vol.415，pp339-343，2002)或脂聯(lián)素等來自脂肪細(xì)胞的激素(Nature，Vol.423，pp762-769，2003)等活化，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，也嘗試通過服用這些蛋白質(zhì)來治療各種疾病。
此外，由于AMPK的活性化促進(jìn)能量產(chǎn)生，在運(yùn)動(dòng)時(shí)等需要能量的情況下，或在日常生活中，當(dāng)攝取本發(fā)明的兒茶素類時(shí)，就能通過促進(jìn)能量的產(chǎn)生而提高運(yùn)動(dòng)能力、減輕疲勞。
因此，作為AMPK活化劑、持久力增強(qiáng)劑、疲勞預(yù)防/緩解劑，兒茶素類可制成人類或動(dòng)物用食品或醫(yī)藥品的成分。
本發(fā)明的持久力增強(qiáng)劑等除用于人類或動(dòng)物服用之外，也可配合到各種飲食品、醫(yī)藥品、寵物飼料等中攝取?？蓱?yīng)用在針對(duì)持久力增強(qiáng)、預(yù)防及緩解疲勞等生理機(jī)能起作用的飲食品、患者用食品、特定保健用食品中。用作醫(yī)藥品時(shí)，可制成例如片劑、顆粒等口服固體制劑，以及內(nèi)服液體、糖漿等口服液體制劑。
另外，在調(diào)制口服固體制劑時(shí)，可在兒茶素類中添加賦形劑，以及根據(jù)需要添加粘合劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、著色劑、矯味劑、嗅覺矯正劑等，并利用常規(guī)方法制成片劑、糖衣片劑、顆粒劑、散劑、膠囊等。而在調(diào)制口服液體制劑時(shí)，可添加矯味劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑、正味劑等，利用常規(guī)方法制成內(nèi)服液體、糖漿、酏劑等。
上述各制劑中的兒茶素類配合量因其使用形態(tài)而異。在飲料食品、寵物飼料等中，通常優(yōu)選為0.01～5重量％、更優(yōu)選為0.05～5重量％、特別優(yōu)選為0.1～1重量％。而在上述之外的例如片劑、顆粒、膠囊等口服固體制劑，內(nèi)服液體、糖漿等口服液體制劑等醫(yī)藥品中，通常優(yōu)選為0.01～95重量％、更優(yōu)選為5～95重量％、特別優(yōu)選為10～95重量％。
本發(fā)明的持久力增強(qiáng)劑等的劑量(有效攝取量)，通常優(yōu)選為每天100～3000mg/60kg體重、更優(yōu)選為250～2000mg/60kg體重、特別優(yōu)選為250～1000mg/60kg體重。
實(shí)施例試驗(yàn)例1(兒茶素類對(duì)大鼠的持久力的增強(qiáng)作用和抗疲勞作用)兒茶素類使用由Tokyo Food Techno Co.，Ltd.購(gòu)得的普通市售品“POLYPHENON 70S”，用于實(shí)驗(yàn)。
用兩星期的時(shí)間訓(xùn)練大鼠(SD系，雄性，6周)習(xí)慣沿踏旋器行進(jìn)后，測(cè)定極限行進(jìn)時(shí)間。在使大鼠可安靜地呆在踏旋器內(nèi)，適應(yīng)了環(huán)境之后開始測(cè)定。以12m/min為傳送帶起始速度，在12、15、18m/min的速度下各運(yùn)轉(zhuǎn)10分鐘，然后在21m/min的速度下運(yùn)轉(zhuǎn)30分鐘、在22.5m/min的速度下運(yùn)轉(zhuǎn)1小時(shí)，此后在24m/min的速度下運(yùn)轉(zhuǎn)。以大鼠在踏旋器上再也走不動(dòng)的時(shí)刻為極限行進(jìn)時(shí)間，并記錄該時(shí)間。為避免極限行進(jìn)時(shí)間在不同組之間的差異，以10只大鼠為一組，分成兩組。用按照表1所示配方調(diào)制的餌料喂養(yǎng)。在喂養(yǎng)兩周后，測(cè)定各組的極限行進(jìn)時(shí)間。此時(shí)的大鼠極限行進(jìn)時(shí)間如表2所示。
表1餌料配方 (重量％)

表2 喂養(yǎng)兩星期前后的大鼠極限行進(jìn)時(shí)間

*實(shí)驗(yàn)餌料相對(duì)于對(duì)照餌料的統(tǒng)計(jì)差異顯著性(統(tǒng)計(jì)差異顯著性statistical significance of difference)由表2的結(jié)果可知，攝取了配有兒茶素類的餌料的大鼠與攝取了對(duì)照餌料的大鼠相比，可顯著延長(zhǎng)喂養(yǎng)兩周后的極限行進(jìn)時(shí)間，確認(rèn)存在持久力增強(qiáng)效果和疲勞抑制效果。
試驗(yàn)例2(兒茶素類對(duì)小鼠的持久力的增強(qiáng)作用和抗疲勞作用)兒茶素類使用由Tokyo Food Techno Co.，Ltd.購(gòu)得的普通市售品“POLYPHENON 70S”，用于試驗(yàn)。
用一星期的時(shí)間預(yù)備飼養(yǎng)小鼠(BALB/c系，雄性，6周)，然后測(cè)定兩次極限游泳時(shí)間。使小鼠在7L/min的流量下游泳，以其再也不能逆流游動(dòng)的時(shí)刻為極限游泳時(shí)間，記錄該時(shí)間。為避免極限游泳時(shí)間在不同組之間的差異，以10只小鼠為一組，分成兩組。用按照表1所示配方調(diào)制的餌料喂養(yǎng)。在喂養(yǎng)5周后，測(cè)定一次各組的極限游泳時(shí)間。此時(shí)的小鼠極限游泳時(shí)間如表3所示。
表3喂養(yǎng)四周前后的小鼠極限游泳時(shí)間

*實(shí)驗(yàn)餌料相對(duì)于對(duì)照餌料的統(tǒng)計(jì)差異顯著性由表3的結(jié)果可知，攝取了配有兒茶素類的餌料的小鼠與攝取了對(duì)照餌料的小鼠相比，喂養(yǎng)四周后，可顯著延長(zhǎng)極限游泳時(shí)間，確認(rèn)存在持久力增強(qiáng)效果和抗疲勞效果。
試驗(yàn)例3(兒茶素類的AMPK活化效果)AMPK的活化使用小鼠肝細(xì)胞株(Hepal-6)，以AMPK及ACC(乙酰輔酶A羧化酶，acetyl-CoA carboxylase)的磷酸化為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。
將小鼠肝細(xì)胞株(Hepal-6)撒在25cm2燒瓶?jī)?nèi)，在DMEM(+10％FBS，+抗菌劑)中，在37℃下培養(yǎng)1～2天。在未融合的狀態(tài)(whenthe culture become subconfluen)，除去培養(yǎng)液，然后用PBS(-)洗凈，然后更換為DMEM(-FBS)再培養(yǎng)一天。在除去培養(yǎng)液后，添加含有規(guī)定濃度兒茶素類或茶提取物的DMEM(-FBS)并培養(yǎng)60分鐘。然后，除去培養(yǎng)液，用PBS(-)洗凈，再添加200μL細(xì)胞溶解液(10mMTris(三羧甲基氨基甲烷)(pH7.4)，50mM NaCl，30mM焦磷酸鈉，0.5％Triton X-100，蛋白酶抑制劑混合物(SIGMA P2714)，磷酸酶抑制劑混合物-1(SIGMA P2850)，磷酸酶抑制劑混合物-2(SIGMA P5726))，使用細(xì)胞刮刀回收細(xì)胞溶解液。使回收所得細(xì)胞溶解液通過23G的帶針頭注射器三次，充分均化，然后在冰上放置30分鐘。在15000rpm、4℃下離心分離15分鐘，將其上清蛋白用于下述實(shí)驗(yàn)。
在測(cè)量了上清蛋白的濃度后，將樣品之間的蛋白濃度調(diào)至一定。加入為其四分之一量的SDS緩沖液(250mM Tris，12.5％SDS，20％甘油)，然后，再加入2-巰基乙醇及溴酚藍(lán)，在95℃下熱改性，在4℃下驟冷，調(diào)制電泳用樣品。
將一定量(約20～40μg)的上述電泳用樣品供給SDS-PAGE(4或12％的凝膠)，復(fù)制到膜上之后，將anti-phospho-AMPKα(Thr72)抗體(Cell Signaling公司制)、anti-phospho-AMPKβ(Ser108)抗體(CellSignaling公司制)或anti-phospho-ACC(Ser79)抗體(Cell Signaling公司制)用作一次抗體，將anti-rabbit-HRP抗體(AMERSHAM公司制)用作二次抗體，將phototope-HRP Western Detection System(CellSignaling公司制)用作檢測(cè)試劑，檢測(cè)出phospho-AMPKα、phospho-AMPKβ和phospho-ACC。AMPK的活性程度根據(jù)對(duì)檢測(cè)出的色帶的強(qiáng)度圖像分析(EDAS 290圖像分析系統(tǒng)KODAK)數(shù)值(像素)化，以對(duì)照品(未添加兒茶素類的組)為100，以相對(duì)其的值表示。此外，兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品使用SIGMA公司或和光純藥株式會(huì)社制產(chǎn)品。茶提取物(茶兒茶素)使用伊藤園株式會(huì)社制TEAFURAN 90S。
表4

表5

表6

由表4～6的結(jié)果可知，兒茶素類具有優(yōu)異的AMPK活化作用，特別是沒食子兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、沒食子兒茶素或表沒食子兒茶素具有優(yōu)異的AMPK活化效果。此外，還可知，含有兒茶素類的茶提取物也發(fā)揮出優(yōu)異的AMPK活化效果。
權(quán)利要求
1.一種持久力增強(qiáng)劑，其特征在于，以兒茶素類為有效成分。
2.一種抗疲勞劑，其特征在于，以兒茶素類為有效成分。
3.兒茶素類在制備持久力增強(qiáng)劑中的應(yīng)用。
4.兒茶素類在制備抗疲勞劑中的應(yīng)用。
5.一種持久力增強(qiáng)方法，其特征在于，服用有效劑量的兒茶素類。
6.一種緩解疲勞的方法，其特征在于，服用有效劑量的兒茶素類。
7.一種AMPK活化劑，其特征在于，以兒茶素類為有效成分。
8.兒茶素類在制備AMPK活化劑中的應(yīng)用。
9.一種AMPK的活化方法，其特征在于，服用有效劑量的兒茶素類。
全文摘要
本發(fā)明涉及可有效作用于以需要持久力的運(yùn)動(dòng)或需要肌肉反復(fù)做功的勞動(dòng)等為代表的廣義的運(yùn)動(dòng)的持久力增強(qiáng)劑和抗疲勞劑。本發(fā)明還涉及以兒茶素類為有效成分的持久力增強(qiáng)劑、抗疲勞劑和AMPK活化劑。
文檔編號(hào)A23L1/30GK1852904SQ20048002662
公開日2006年10月25日 申請(qǐng)日期2004年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月18日
發(fā)明者下豐留玲, 原水聰史, 原田潮, 村瀬孝利, 時(shí)光一郎 申請(qǐng)人:花王株式會(huì)社