專利名稱：核苷酸生物合成有關化合物作為冷凍保護劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及冷凍或冷凍干燥微生物培養(yǎng)物及核苷酸生物合成有關化合物作為冷凍保護劑地技術領域。更為顯著地，本發(fā)明涉及通過使用此類冷凍保護劑獲得的培養(yǎng)物，此類冷凍保護劑除具有冷凍保護活性外，當將培養(yǎng)物接種于培養(yǎng)基中進行發(fā)酵或轉化時還可以使其代謝活性增加。這些冷凍或冷凍干燥微生物培養(yǎng)物用于許多食品及飼料產(chǎn)品的制造。
背景技術：
微生物涉及食品及飼料產(chǎn)品(包括大多數(shù)乳制品)的制造。細菌培養(yǎng)物，尤其是通常作為乳酸菌分類的細菌培養(yǎng)物是所有發(fā)酵乳制品、乳酪及奶油制造中所必需的。然而，某些非細菌微生物，如某些酵母和真菌的培養(yǎng)物用于加工食品及飼料產(chǎn)品。這些微生物培養(yǎng)物常被稱作發(fā)酵劑，通過發(fā)揮多種功能而使各種乳制品具有特有的特點。發(fā)酵劑在多種工業(yè)中具有廣泛的應用，例如乳品工業(yè)、酒類制造工業(yè)、飲料制造工業(yè)及肉類加工工業(yè)。
微生物培養(yǎng)物在糧食的生物防腐中也具有重要的作用(Andersen等，1997)。
商業(yè)乳品發(fā)酵劑通常由乳糖和檸檬酸發(fā)酵細菌組成。乳酸菌是一群革蘭氏陽性、不運動、微需氧或厭氧性細菌，可以發(fā)酵糖類產(chǎn)生包括乳酸的酸類。工業(yè)上一些最有用的乳酸菌包括乳酸乳球菌、鏈球菌、腸球菌、乳桿菌、明串珠菌及片球菌。
通常使用的乳酸菌乳品發(fā)酵劑一般分為嗜溫型(最適生長溫度約為30℃)和嗜熱型(最適生長溫度約為35-45℃)。屬于嗜溫型的乳酸菌包括乳酸乳球菌乳亞種、乳酸乳球菌乳脂亞種、腸膜樣明串珠菌乳脂亞種、戊糖片球菌、乳酸乳球菌乳亞種二乙酰乳酸(diacetylactis)變型及副酪乳桿菌副酪亞種。嗜熱乳酸菌包括嗜熱鏈球菌、屎腸球菌、德氏乳桿菌乳亞種、瑞士乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種及嗜酸乳桿菌。
對于乳品發(fā)酵劑還根據(jù)其具體的菌種組分和優(yōu)選的工業(yè)使用進行分類。單一發(fā)酵劑僅由單一菌種組成，而混合發(fā)酵劑由兩種或多種不同菌種組成。常根據(jù)發(fā)酵劑的最適生長溫度或最大酶活性對其進行分類。嗜溫型發(fā)酵劑最適生長溫度約為30℃，而嗜熱發(fā)酵劑最適生長溫度約為35-45℃(Nielsen和Ullum，1999)。商業(yè)型嗜溫混合發(fā)酵劑包括
O型發(fā)酵劑由乳酸乳球菌乳亞種和乳酸乳球菌乳脂亞種組成。
D型發(fā)酵劑由乳酸乳球菌乳亞種、乳酸乳球菌乳脂亞種及乳酸乳球菌乳亞種二乙酰乳酸(diacetylactis)變型組成。
L型發(fā)酵劑由乳酸乳球菌乳亞種、乳酸乳球菌乳脂亞種及明串珠菌組成。
LD型發(fā)酵劑由乳酸乳球菌乳亞種、乳酸乳球菌乳脂亞種、乳酸乳球菌乳亞種二乙酰乳酸(diacetylactis)變型及明串珠菌組成。
O型發(fā)酵劑用于制造無孔乳酪(Cheddar、Cheshire、Feta)。D型發(fā)酵劑用于制造奶油。L型發(fā)酵劑用于制造無小孔乳酪(如cottage乳酪)及低CO2生產(chǎn)的凝固乳制品。LD型發(fā)酵劑用于生產(chǎn)正常洞孔大小的乳酪、凝固乳制品(凝乳食品)及酸奶油。LD型發(fā)酵劑是目前商業(yè)上使用最多的混合發(fā)酵劑之一。
商業(yè)嗜熱型混合發(fā)酵劑包括
保加利亞酸乳發(fā)酵劑(由嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌保加利亞亞種組成)和嗜熱乳酪發(fā)酵劑(由嗜熱鏈球菌和瑞士乳桿菌組成)。
保加利亞酸乳發(fā)酵劑用于制造保加利亞乳酪及特殊的意大利乳酪。嗜熱乳酪發(fā)酵劑用于制造Emmentaler乳酪及特殊的意大利乳酪。
另外，丙酸桿菌常用作乳品發(fā)酵劑，尤其用于乳酪的制造。短桿菌屬及雙岐桿菌屬也通常用作食品發(fā)酵劑。
另一組微生物發(fā)酵劑是用于某些類型乳酪和飲料制造的真菌發(fā)酵劑，包括酵母菌及絲狀真菌，例如婁地青霉菌、念珠青霉菌、念珠地絲菌、克菲爾(圓)酵母、克菲爾圓酵母及釀酒酵母。
發(fā)酵劑還廣泛用于肉類加工工業(yè)，如各種香腸及意大利臘腸的制造。
商業(yè)發(fā)酵劑通常以冷凍培養(yǎng)物供應。在低溫下，冷凍培養(yǎng)物中細胞的大部分代謝活動停止，可以在此停滯但有活力的狀態(tài)長期保存。
濃縮冷凍發(fā)酵劑因可以直接被接種至生產(chǎn)容器中而在商業(yè)上引起人們極大的興趣。通過使用濃縮冷凍發(fā)酵劑，最終使用者避免了必須的、耗時的中間發(fā)酵步驟(在此期間發(fā)酵劑擴增)，而且最終使用者減少了嚴重污染的危險。濃縮冷凍發(fā)酵劑可以被稱作直投式酸奶發(fā)酵劑(DVSTM)。
作為濃縮冷凍發(fā)酵劑的選擇之一，濃縮冷凍干燥DVSTM發(fā)酵劑可以被制備。這些發(fā)酵劑另一個優(yōu)點是無需冷藏即可裝運。
一般而言，凍融對活細胞活力的可能損傷效應可歸因于凍存中細胞脫水及于細胞溶膠中冰晶的形成。
已發(fā)現(xiàn)許多凍存保護劑可以控制及最低限度損傷的方式影響細胞溶膠的濃縮，從而在凍存過程中防止細胞溶膠中冰晶形成或使其最小化。
F.J.Chavarri等的文章(生物技術通訊，第10卷，第1期，11-16(1988)，“Cryoprotective agents for frozen concentrated starters from non-bitter Streptococcus Lactisstrains”)描述了通過添加5％乳糖或5％蔗糖可以改善凍存單一乳鏈球菌發(fā)酵劑的保存活力，乳糖或蔗糖被用作凍存保護劑。乳鏈球菌是乳酸乳球菌乳亞種的曾用名。
類似地，R.Cárcoba等的文章(Eur Food Res Technol(2000)211，433-437，“Influence of cryoprotectants on the viability and acidifying activity of frozen andfreeze-dried cells of the novel starter strain Lactococcus lactis subsp.lactis CECT 5180”)描述了冷凍單一乳酸乳球菌乳亞種發(fā)酵劑的保存活力可通過添加不同的凍存保護劑如糖類(乳糖、蔗糖及海藻糖)、谷氨酸及明膠而改善。
冷凍干燥發(fā)酵劑的活力也可通過使用凍存保護劑而改善。例如EP259739描述了多種用于冷凍干燥發(fā)酵劑的不同冷凍保護劑。
有多種提供凍存保護的方法如碳水化合物、蛋白質(zhì)及某些表面活性劑。
一般而言，為獲得冷凍保護效果需要相對大量的冷凍保護劑。雖然在某些情況是無關緊要的問題，但對食品加工業(yè)來說是重要的，因為由冷凍保護劑導致發(fā)酵或加工制品即使很小的非期望味道偏差都是不利的。我們沒有意識到含有大量凍存保護劑的商業(yè)用濃縮冷凍發(fā)酵劑。
除碳水化合物、蛋白質(zhì)及某些表面活性劑以外的介質(zhì)已用于改善低溫下發(fā)酵劑的穩(wěn)定性。
WO 00/39281描述了IMP及DNA生物合成有關化合物用于穩(wěn)定液體發(fā)酵劑的代謝活性(非冷凍或冷凍干燥發(fā)酵劑的穩(wěn)定性)。
WO 00/19817描述了一種冷凍保護劑的組分，其中混合化合物而非單一組分用于冷凍保護?；旌衔锇ㄢ}通道阻滯劑、細胞營養(yǎng)基質(zhì)、水及腺苷。然而，藥物活性物質(zhì)如鈣通道阻滯劑不被食品工業(yè)應用所接受。
JP 05308956描述了亞硝酸細菌培養(yǎng)物的培養(yǎng)基含有高分子量多糖(其中一個單位包括1分子α-L-鼠李糖、1分子D-葡萄糖醛酸、2分子線性聚合D-葡萄糖)及ATP。于此培養(yǎng)基中培養(yǎng)的亞硝酸細菌可以被冷凍保存。未表明培養(yǎng)基組分于冷凍濃縮發(fā)酵劑之前添加其中可作為冷凍保護劑使用。
可添加于食品工業(yè)使用的濃縮發(fā)酵劑的有效的冷凍保護劑仍為需要。

發(fā)明內(nèi)容
過去認為對于商業(yè)相關的濃縮冷凍乳酸菌發(fā)酵劑不存在重要的保存穩(wěn)定性問題，現(xiàn)在盡管很好地認識到大多數(shù)活細胞要經(jīng)受冷凍及后來的融解，而對于商業(yè)相關的濃縮冷凍乳酸菌發(fā)酵劑其活力問題一般不受重視。因此，商業(yè)用濃縮冷凍發(fā)酵劑無大量的冷凍保護劑，這可能是因為一些商業(yè)發(fā)酵劑似乎對于凍融的損傷效應具有很強的抵抗力。
例如，對許多商業(yè)濃縮乳酸菌發(fā)酵劑(已凍存2-3個月)進行了穩(wěn)定性研究，2-3個月的冷凍發(fā)酵劑于低于-45℃的溫度下一年，培養(yǎng)活性無顯著降低。因此，認為商業(yè)相關發(fā)酵劑無重要的保存穩(wěn)定性問題。
本發(fā)明的發(fā)明者觀察到冷凍LD型發(fā)酵劑于最初1-3周的凍存中活力顯著喪失(如實施例1所述)。最初幾周之后，活力的進一步喪失相對不顯著，與上述已知結果一致。
本發(fā)明的發(fā)明者確定了幾種類型商業(yè)相關的濃縮冷凍乳酸菌發(fā)酵劑(如商業(yè)用冷凍LD型發(fā)酵劑)與冷凍及保存初期相關而未被認識到的穩(wěn)定性問題，尤其當發(fā)酵劑保存于現(xiàn)代工業(yè)致冷機提供的溫度(典型的-50℃左右)時。
本發(fā)明的發(fā)明者確定了新型冷凍保護劑，既解決了發(fā)酵劑的穩(wěn)定性問題而且提高其代謝活性。
本發(fā)明的一個實施方案涉及濃縮冷凍或冷凍干燥培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)物含有選自包括一種或多種核苷酸生物合成相關化合物或一種或多種任一此類化合物衍生物的組群的一種或多種冷凍保護劑。
優(yōu)選地，在冷凍或冷凍干燥活力細菌之前添加冷凍保護劑于其中。
本發(fā)明還提供了一種制備冷凍培養(yǎng)物或冷凍干燥培養(yǎng)物的方法，包括如下步驟于活菌中添加選自包括一種或多種核苷酸生物合成相關化合物或一種或多種任一此類化合物衍生物的組群的一種或多種冷凍保護劑；冷凍材料以獲得冷凍物，及以適當?shù)姆椒òb冷凍物(或冷凍干燥物)。至于制備冷凍干燥發(fā)酵劑的方法包括一個在包裝步驟之前水從冷凍物升華的步驟。
根據(jù)本發(fā)明，還提供了一種制備食品或飼料產(chǎn)品的方法，包括根據(jù)本發(fā)明發(fā)酵劑的使用。優(yōu)選地，食品選自奶制品，肉類產(chǎn)品，蔬菜類產(chǎn)品及飲料。
本發(fā)明描述的新型冷凍保護劑的另一個優(yōu)點是其可以維持復原細胞的活力及代謝活性且不以不利方式影響發(fā)酵或加工制品的味道。
定義
在討論本發(fā)明詳細實施方案之前，提供了與本發(fā)明各方面及實施方案有關的具體術語的定義。
本發(fā)明使用的術語“乳酸菌”(LAB)指革蘭氏染色陽性、微需氧或厭氧細菌，可以發(fā)酵糖類產(chǎn)生酸類物質(zhì)，包括乳酸(主要產(chǎn)生的酸類)、乙酸及丙酸。工業(yè)上最常使用的乳酸菌為乳酸乳球菌、鏈球菌、乳桿菌、明串珠菌、片球菌、短桿菌、腸球菌及丙酸桿菌。另外，屬于嚴格厭氧性細菌雙岐桿菌群的細菌，即常單獨或與乳酸菌聯(lián)合用作食品發(fā)酵劑的雙岐桿菌，通常被包括在乳酸菌群中。
術語“濃縮培養(yǎng)物”是指活細胞的濃度(菌落形成單位，CFUs)至少為108CFU/ml，更優(yōu)選地至少為109CFU/ml，更優(yōu)選地至少為1010CFU/ml，更優(yōu)選地至少為1011CFU/ml，或更優(yōu)選地至少為1012CFU/ml。如實施例中所示，濃縮培養(yǎng)物可以通過離心分離獲得。
術語“包裝”應該從廣義上理解。它是指以可提供與使用者的方式包裝冷凍或冷凍干燥培養(yǎng)物。可以瓶子、tetra-pack、袋子等進行包裝。
術語“冷凍保護劑”指能夠改善冷凍或冷凍干燥培養(yǎng)物冷凍及保存初期誘發(fā)的損傷效應抵抗力的物質(zhì)。本申請書上下文中，可以是單一的特定冷凍保護劑或是兩種或多種不同的介質(zhì)。因此，冷凍保護劑于培養(yǎng)物中的百分含量(w/w)應該理解為冷凍保護劑的總量。確定一種物質(zhì)是否為能夠改善冷凍培養(yǎng)物對冷凍及保存初期誘發(fā)的損傷效應抵抗力的冷凍保護劑的優(yōu)選方法是按本發(fā)明描述方法將培養(yǎng)物分成兩個樣品，添加特定量的的冷凍保護劑于其中之一，將二者均冷凍，于冷凍當天及冷凍保存定期監(jiān)測培養(yǎng)物于相關培養(yǎng)基(如牛奶)中的酸化活性。如果帶有冷凍保護劑的培養(yǎng)物在保存期間活性改善(如改善了的酸化牛奶活性)，此物質(zhì)為冷凍保護劑。酸化牛奶活性的適當測定方法在實施例中給出。
本發(fā)明的實施方案僅以實施例的方式描述如下。
本發(fā)明詳細內(nèi)容
如前所述，濃縮冷凍或冷凍干燥培養(yǎng)物被認為是穩(wěn)定的。然而，與本領域通常的看法相反，本發(fā)明的發(fā)明者另人吃驚地觀察了至今未被認識到的某些商業(yè)相關濃縮冷凍乳酸菌發(fā)酵劑(例如商業(yè)用冷凍LD型發(fā)酵劑，見下列實施例1)冷凍及保存初期相關的穩(wěn)定性問題。本發(fā)明考慮到當商業(yè)冷凍或冷凍干燥發(fā)酵劑被適當檢驗時此穩(wěn)定性問題將被廣泛發(fā)現(xiàn)。
對多種可能的介質(zhì)進行了測定以觀察其是否可以克服此問題。試驗介質(zhì)選自包括一種或多種核苷酸生物合成有關化合物的(先前由發(fā)明者揭示可改善非冷凍液體發(fā)酵劑的穩(wěn)定性)的組群。
WO 00/39281描述了使用IMP及DNA生物合成相關化合物穩(wěn)定液體發(fā)酵劑的代謝活性，但與在冷卻過程中仍為液體的發(fā)酵劑相比，冷凍的發(fā)酵劑經(jīng)受一些直接與冷凍過程有關的潛在損傷。
在冷凍溫度下，因培養(yǎng)物開始冷凍及細胞內(nèi)外形成冰而死亡和受到損傷。冰的形成使細胞遭受機械損傷，進一步產(chǎn)生細胞外高滲透壓，造成細胞脫水。由于冷凍，離子強度及水相pH值變化還破壞許多細胞成分及大分子(依賴這些因素維持其穩(wěn)定性)的結構與功能(Adams，2000)。
液體發(fā)酵劑與冷凍發(fā)酵劑穩(wěn)定性不同可以進一步由Mazur(1961)報道的實驗進行說明。在此實驗中，酵母細胞于-15℃浸浴。結果顯示當系統(tǒng)仍為液體時97％的細胞仍存活，但當外部培養(yǎng)基在-15℃凍結時，僅27％的細胞存活(Mazur 1961)。
因此，必須由有效冷凍保護劑提供的措施依據(jù)冷凍保護劑用于保護液體發(fā)酵劑還是冷凍發(fā)酵劑而有很大區(qū)別，作為液體發(fā)酵劑有效冷凍保護劑的添加劑對于冷凍發(fā)酵劑不一定有效。此添加劑例子之一是甲酸鈉。如WO 00/39281中所報道3％甲酸鈉對于增加液體乳酸菌發(fā)酵劑濃縮物的保存穩(wěn)定性是有效的。然而，如下述實施例15中所述，3％甲酸鈉降低冷凍乳酸菌發(fā)酵劑的保存穩(wěn)定性。
因此，當實驗顯示IMP及核苷酸生物合成有關化合物改善冷凍及冷凍干燥濃縮培養(yǎng)物的穩(wěn)定性時十分另人吃驚。
如下述實施例2中所顯示，添加一種此類化合物次黃嘌呤核苷-5′-一磷酸(IMP)，可以顯著改善冷凍及保存初期誘導的損傷效應的抵抗力。如下面的實施例9所述，添加IMP還可顯著改善冷凍干燥培養(yǎng)物的穩(wěn)定性。從下面的實施例10可以明確不僅IMP，而且選自構成核苷酸生物合成有關化合物的組群的較大范圍的介質(zhì)作為冷凍保護劑是有效的。
如實施例10所述，無論核苷酸還是核苷均可用作冷凍保護劑。因此，在優(yōu)選的實施方案中，用于改善發(fā)酵劑冷凍及保存初期誘導的損傷效應的抵抗力的冷凍保護劑是選自包括核苷酸生物合成相有關化合物的組群的化合物，包括嘌呤堿基、嘧啶堿基、核苷及核苷酸。這些化合物通過次黃嘌呤核苷-5′-一磷酸(IMP)、腺苷-5′-一磷酸(AMP)、鳥苷-5′-一磷酸(GMP)、尿苷-5′-一磷酸(UMP)、胞苷-5′-一磷酸(CMP)、腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌呤核苷、尿嘧啶核甙、胞苷、次黃嘌呤、黃嘌呤、乳清酸核苷、胸腺嘧啶脫氧核苷、次黃嘌呤核苷、及任一化合物的衍生物或其混合物來舉例說明。
如較早的WO 00/19817提供了鈣通道阻滯劑、細胞營養(yǎng)基質(zhì)、水及腺苷的混合物作為冷凍保護劑。但是，單一組分(如腺苷)可能的冷凍保護活性未予討論。然而，腺苷作為冷凍保護劑不一定有效，如實施例12及15所述，其中所述的腺苷可以降低細菌培養(yǎng)物的穩(wěn)定性。另外，Demetriou(WO 00/19817)使用2.7-3.6mM的腺苷。另外，我們的實驗顯示了次黃嘌呤核苷作為冷凍保護劑是非常有效的，腺苷及次黃嘌呤核苷均為嘌呤核苷酸。此觀察可以擴展至一磷酸。我們的實驗顯示作為冷凍保護劑，IMP而非AMP是有效的。這甚至更另人吃驚，因為在微生物中，IMP由AMP通過水解去氨基作用合成(White，1973)。因此，本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，一種或多種冷凍保護劑選自嘧啶核苷酸和次黃嘌呤核苷的組群。
本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施例中，一種或多種冷凍保護劑選自一磷酸核苷組群。在優(yōu)選的實施方案中至少一種或唯一的冷凍保護劑是IMP。
碳水化合物或蛋白酵素類冷凍保護劑一般不被描述可以增加融解或復原發(fā)酵劑的代謝活性。本發(fā)明的冷凍保護劑除其冷凍保護活性外，當將發(fā)酵劑接種于培養(yǎng)基中進行發(fā)酵、加工或轉化時還可使其代謝活性增加(增強效應)。
因此，本發(fā)明的一個實施方案是冷凍或冷凍干燥培養(yǎng)物，其中冷凍保護劑是單一或混合介質(zhì)，除冷凍保護活性外還具有增強效應。
術語“增強效應”用于描述當將融解或復原的發(fā)酵劑接種于培養(yǎng)基中進行發(fā)酵或轉化時，冷凍保護劑可以使其代謝活性增加(增強效應)的情況。活力與代謝活性并非同義概念。商業(yè)冷凍或冷凍干燥發(fā)酵劑可以保持其活力，但可喪失大部分代謝活性，例如即使于較短期時間保存，發(fā)酵劑也可以喪失其產(chǎn)酸(酸化)活性。因此活力及增強效應須通過不同測定方法進行評價。活力是通過活力測定實驗如測定菌落形成單位而評價，增強效應是通過融解或復原發(fā)酵劑的與培養(yǎng)活力相關的有關代謝活性進行定量而評價。下面描述的酸化活性測定是融解或復原培養(yǎng)物有關代謝活性定量測定的實施例。增強效應在實施例3中進一步說明。
盡管在本發(fā)明中舉例說明了產(chǎn)酸活性，本發(fā)明意于包括發(fā)酵劑任何類型代謝活性的穩(wěn)定性。因此，術語“代謝活性”是指發(fā)酵劑的脫氧活性，產(chǎn)酸活性(即如乳酸、乙酸、甲酸和/或丙酸的產(chǎn)生)，或其代謝產(chǎn)物產(chǎn)生活性，如芳香化合物(如乙醛、α-乙酰乳酸、乙偶姻、聯(lián)乙醯及2，3-丁二醇)的產(chǎn)生。
在本發(fā)明的實施方案中，凍存培養(yǎng)物含有大約0.2％-20％(以％w/w表示)的冷凍保護劑或其混合物。然而，優(yōu)選地添加冷凍保護劑或其混合物的量按重量計算大約為0.2％-15％，更優(yōu)選地為0.2％-10％，更優(yōu)選地為0.5％-7％，更優(yōu)選地為1％-6％，包括2％-5％(按重量計算以冷凍物的％w/w表示)。在優(yōu)選的實施方案中，培養(yǎng)物含有大約3％(按重量計算以％w/w表示)的冷凍保護劑或其混合物。優(yōu)選的約3％的冷凍保護劑的量對應濃度為100mM。必須認識到本發(fā)明實施方案的每一方面可以增大描述范圍。
術語“培養(yǎng)物材料”是指包括活力菌及冷凍保護劑的培養(yǎng)物有關物質(zhì)，可能的包裝不包括在內(nèi)，因此，培養(yǎng)物材料的重量不包括可能的包裝重量。
在培養(yǎng)物為冷凍干燥培養(yǎng)物的情況下，優(yōu)選地添加冷凍保護劑或其混合物的量(按重量計算)為0.8％-60％，或0.8％-55％，或1.3％-40％，或3％-30％，或6％-25％，包括10％-24％。在優(yōu)選的實施方案中，冷凍干燥培養(yǎng)物含有約16％冷凍保護劑或其混合物(按重量計算以冷凍干燥材料的％w/w表示)。
另外，冷凍或冷凍干燥培養(yǎng)物可含有其它傳統(tǒng)添加劑包括各種營養(yǎng)素如酵母提取物、糖類、抗氧化劑、惰性氣體及維生素等。根據(jù)本發(fā)明表面活性劑化合物(包括Tween)也可以用作培養(yǎng)物的其它添加劑。
根據(jù)本發(fā)明可添加至培養(yǎng)物的傳統(tǒng)添加劑的其它例子，還可選自蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)水解物、及氨基酸。優(yōu)選的合適的例子包括選自谷氨酸，、賴氨酸、谷氨酸鈉、酪蛋白酸鈉、麥芽浸膏、脫脂奶粉、乳清粉、酵母提取物、谷蛋白、膠原、明膠、彈力蛋白、角蛋白及白蛋白或其混合物構成的組群的添加劑。
更為優(yōu)選地，傳統(tǒng)的添加劑為碳水化合物，合適的例子為選自包括戊糖(如核糖、木糖)、己糖(如果糖、甘露糖、山梨糖)、二糖(如蔗糖、海藻糖、蜜二糖、乳果糖)、低聚糖(如蜜三糖)、低聚果糖(如Actilight、Fribroloses)、多糖(如糊精、黃單胞菌膠、果膠、藻酸鹽、維晶纖維素、右旋糖酐、聚乙二醇)及糖醇(山梨糖醇、Manitol及纖維醇)的組群的添加劑。
盡管本發(fā)明涉及任何濃縮冷凍或冷凍干燥培養(yǎng)物，但是特別針對于食品及飼料產(chǎn)品(包括大多數(shù)乳制品)相關的微生物培養(yǎng)物。本發(fā)明的優(yōu)選實施方案包括細菌培養(yǎng)物，尤其是通常作為乳酸菌分類，在所有發(fā)酵乳制品、乳酪及奶油制造中所必需的細菌培養(yǎng)物。這樣的細菌培養(yǎng)物常被稱為發(fā)酵劑，通過發(fā)揮多種功能而使各種乳制品具有特有的特點。然而，特別應用于某些類型乳酪及飲料的制造的真菌培養(yǎng)物(包括酵母菌及絲狀真菌培養(yǎng)物)組成的培養(yǎng)物也被稱為發(fā)酵劑。用于加工其它類型食品或飼料產(chǎn)品的培養(yǎng)物也被稱為發(fā)酵劑。用于青貯飼料制造的培養(yǎng)物也常被稱為發(fā)酵劑。
依據(jù)本發(fā)明，在食品或飼料工業(yè)(包括乳品工業(yè))有用的的任何發(fā)酵劑微生物均可使用。因此，發(fā)酵劑可以由選自包括乳酸菌、雙岐桿菌、短桿菌、丙酸桿菌或真菌(如圓酵母、青霉菌、隱球菌、德巴利酵母菌(Debraryomyces spp.)、柯里夫酵母菌(Klyveromyces spp.)及酵母菌)的組群的一種或多種微生物組成。乳酸菌(LAB)組群合適的培養(yǎng)物包括通常使用的乳酸乳球菌、鏈球菌、乳桿菌(包括嗜酸乳桿菌)、腸道球菌、片球菌、明串珠菌、酒球菌(Oenococcus spp.)、乳球菌(Lactococcus spp.)及廣泛使用的乳酸乳球菌(包括乳球菌乳酸乳球菌乳亞種及乳球菌乳酸乳球菌乳脂亞種，通常用于結構致密干酪如Cheddar干酪、Feta干酪及cottage干酪的制造)。
可以理解的是發(fā)酵劑微生物可以選自一種或多種上述乳酸菌株或任何其它發(fā)酵劑菌株的基因修飾菌株。本發(fā)明使用的術語“基因修飾細菌”以常規(guī)意義使用，即指通過使細菌菌株經(jīng)受任何常規(guī)使用的誘變處理(包括化學誘變劑如乙基乙烷磺酸酯(EMS)或N-甲基-N′-硝基-N-硝基胍(NTG)的處理)、紫外線或自發(fā)突變(包括經(jīng)典突變)而獲得的菌株。另外，可能提供隨機誘變接著自發(fā)突變選擇(即不使用重組DNA技術)的基因修飾細菌。另外，乳酸菌突變體及其它潛在有用的發(fā)酵劑微生物可以通過包括位點突變及PCR技術及其它特定DNA序列的體內(nèi)外修飾(一旦此序列被確定及分離)的技術方法提供。另外，還考慮到有用的發(fā)酵劑微生物可以通過使用重組DNA技術獲得。從食品管理角度通過特定微生物固有的DNA序列重組(即自我克隆)獲得有用的發(fā)酵劑微生物的可能性尤為引人注目。
通常在乳品工業(yè)中，發(fā)酵劑由菌株混合物組成，包括不同乳酸菌的菌株混合物，如嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌保加利亞亞種的混合物。
通常使用的乳品發(fā)酵劑一般分為嗜溫型(本申請書上下文中，最適生長溫度約為30℃的微生物)和嗜熱型(本申請書上下文中，最適生長溫度約為40-45℃的微生物)。
本發(fā)明發(fā)酵劑菌株的選擇依據(jù)所要制造的發(fā)酵食品或飼料產(chǎn)品的特定類型。例如，對于乳酪和奶油的制造，廣泛使用嗜溫型培養(yǎng)物乳酸乳球菌、明串珠菌及乳桿菌。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，發(fā)酵劑由一種或多種最適生長溫度為約為30℃的嗜溫菌組成。屬于這種嗜溫菌的典型生物包括乳酸乳球菌、乳酸乳球菌乳脂亞種、腸膜樣明串珠菌乳脂亞種、戊糖片球菌、乳酸乳球菌乳亞種diacetylactis變型、干酪乳桿菌及副酪乳桿菌副酪亞種。
根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，發(fā)酵劑由一種或多種最適生長溫度約為40℃-45℃的的嗜熱菌組成。嗜熱菌常用作生產(chǎn)保加利亞酸乳及其它發(fā)酵乳制品，某些乳酪，如Emmentaler乳酪及特殊的意大利乳酪也通過使用嗜熱型發(fā)酵劑生產(chǎn)。屬于這種嗜熱菌的典型微生物包括選自包括嗜熱鏈球菌、屎腸球菌、德氏乳桿菌乳亞種、瑞士乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種及嗜酸乳桿菌的組群的細菌。
特別地，乳酸菌發(fā)酵劑(LAB-發(fā)酵劑)已在商業(yè)上具有廣泛的應用。因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是LAB-發(fā)酵劑，由選自包括乳酸乳球菌、鏈球菌、腸球菌、乳桿菌、明串珠菌、片球菌及雙岐桿菌的組群的一種或多種微生物組成。
商業(yè)發(fā)酵劑常根據(jù)其用途進行分類。O型發(fā)酵劑用于制造無孔乳酪(Cheddar、Cheshire、Feta)，典型地由選自包括乳酸乳球菌乳亞種及乳酸乳球菌乳脂亞種的組群的一種或多種微生物組成。D型發(fā)酵劑用于制造奶油，典型地由一種或多種乳酸乳球菌(即乳酸乳球菌乳亞種、乳酸乳球菌乳脂亞種、乳酸乳球菌乳亞種二乙酰乳酸(diacetylactis)變型)組成。L型發(fā)酵劑可用于生產(chǎn)僅帶小孔的乳酪(cottage乳酪)及低CO2產(chǎn)量的凝固乳制品。L型發(fā)酵劑的典型微生物為乳酸乳球菌乳亞種、乳酸乳球菌乳脂亞種及明串珠菌。最后，LD型發(fā)酵劑用于制造正常孔洞大小的乳酪、凝固乳制品(凝乳食品)及酸奶油。商業(yè)上，LD型發(fā)酵劑是目前使用最多的混合發(fā)酵劑。LD型發(fā)酵劑典型地由選自包括乳酸乳球菌乳亞種、乳酸乳球菌乳脂亞種、乳酸乳球菌乳亞種二乙酰乳酸(diacetylactis)變型及明串珠菌的組群的一種或多種微生物組成。
如其它類型的混合發(fā)酵劑那樣，LD型發(fā)酵劑中單一菌種的具體數(shù)量可以根據(jù)具體使用需要而不同。專業(yè)人員應該知道這個而且能夠根據(jù)所需確定優(yōu)選的混合發(fā)酵劑組分。
例如，如需要香味，則應該優(yōu)選產(chǎn)香味細菌乳酸乳球菌乳亞種二乙酰乳酸(diacetylactis)變型及明串珠菌的最佳組分。
優(yōu)選的LD型發(fā)酵劑由下列成分組成
表1 LD型發(fā)酵劑組分
在上述范圍內(nèi)，優(yōu)選地明串珠菌為0.25-6％，乳酸乳球菌乳亞種二乙酰乳酸(diacetylactis)變型為7-30％。
當然，四種不同的LAB菌種的總百分比不能超過100％。然而，如果LD型發(fā)酵劑中存在除四種提到的細菌外其它的細菌，則總百分比可小于100％。實施例2提供了穩(wěn)定的LD型發(fā)酵劑的例子。
真菌培養(yǎng)物是根據(jù)本發(fā)明可以使用的另一組微生物發(fā)酵劑。真菌培養(yǎng)物，如酵母菌、絲狀真菌常用于某些類型乳酪及飲料的制造。目前使用的真菌培養(yǎng)物包括婁地青霉菌、念珠青霉菌、念珠地絲菌、克菲爾圓酵母、克菲爾酵母菌及釀酒酵母。
本發(fā)明特有的優(yōu)選實施方案是由嗜酸乳桿菌組成的發(fā)酵劑。
另一方面，本發(fā)明提供了制備冷凍培養(yǎng)物的方法，包括以下步驟1)于濃縮的活菌培養(yǎng)物中添加選自包括一種或多種核苷酸生物合成相關化合物或一種或多種任一化合物衍生物的組群的冷凍保護劑；2)對材料進行冷凍以獲得冷凍物；及3)以適當?shù)姆椒òb冷凍物。
應該理解冷凍及包裝步驟可以采用多種方法進行。
冷凍步驟應該最優(yōu)化以確保細胞的存活。某些細胞(如大多數(shù)LAB)可以直接冷凍，即可直接使其接觸處于冷凍保存溫度的介質(zhì)。直接冷凍方法包括直接將細胞滴落、噴霧、注入或灌人“低溫”液體如液氮、液態(tài)CO2或液態(tài)氦中。本發(fā)明上下文中低溫是指低于-50℃的溫度，優(yōu)選地低于-150℃(123°K)的溫度。細胞也可以直接接觸冷凍固體，例如液氮冷凍的鋼塊。低溫液體還可以被直接傾注至細胞包裝物上，直接方法還包括在低溫下以氣體(包括空氣)接觸細胞，氮氣或氦氣的低溫氣流可直接被吹至或冒泡至細胞懸液。間接方法為以包裝物包裝細胞，在低溫下以固體、液體或氣體接觸包裝物。間接冷凍方法的包裝物不一定要對氣體或液體無滲透性。例如，塑料袋或Tetra-Pak是合適的。
在一個優(yōu)選的實施方案中，通過離心或超濾方法濃縮培養(yǎng)物，添加冷凍保護劑至培養(yǎng)物中，接著將培養(yǎng)物滴入液氮中形成冷凍培養(yǎng)物小顆粒。冷凍的培養(yǎng)物小顆?？梢云孔?、Tetra-Pak、袋子或其它合適的包裝物進行包裝。冷凍及包裝的培養(yǎng)物小顆粒在確保其用于接種培養(yǎng)基以發(fā)酵或加工之前保持冷凍狀態(tài)的溫度下以典型方法保存及供應。
另一方面，本發(fā)明提供了制備冷凍干燥培養(yǎng)物的方法，包括以下步驟1)于活菌中添加選自包括一種或多種核苷酸生物合成相關化合物或一種或多種任一化合物衍生物的組群的冷凍保護劑；2)對材料進行冷凍以獲得冷凍物；3)水自冷凍物升華；及4)以適當?shù)姆椒òb冷凍干燥物。冷凍保護劑的添加、可選擇的濃縮步驟、冷凍(或冷凍干燥)及包裝步驟可以按所述進行
冷凍培養(yǎng)物需要在低溫下裝運及保存，冷凍干燥或冷凍脫水培養(yǎng)物只要保持在干燥條件下，可以無需長期冷藏裝運及保存。然而，即使是冷凍干燥培養(yǎng)物，也建議在0℃以下保存。
根據(jù)本發(fā)明冷凍及冷凍干燥培養(yǎng)物以商業(yè)DVS發(fā)酵劑或Redi-Set發(fā)酵劑提供。DVS發(fā)酵劑的一個優(yōu)點是可以冷凍或冷凍干燥細胞形式直接添加至含培養(yǎng)基的生產(chǎn)發(fā)酵罐或容器中。這導致活細胞幾乎同時再生。商業(yè)上的許多發(fā)酵劑為乳酸菌培養(yǎng)物，因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施例是如前述所獲得的冷凍或冷凍干燥乳酸菌(LAB)培養(yǎng)物。
另一方面，本發(fā)明涉及制備食品或飼料產(chǎn)品的方法，根據(jù)本發(fā)明所述方法包括使用冷凍或冷凍干燥培養(yǎng)物。
在具體的實施方案中，食品為乳制品，如乳酪、保加利亞酸乳、奶油，或液體發(fā)酵乳制品，如酪乳、Ymer、奶油或飲用保加利亞酸乳。在本發(fā)明的另一實施方案中，食品為乳酪，包括軟乳酪，包括但不限于Camenbert、Brie、Argentine Port Salut、Crezenza及Gorgonzola；Emmenthal乳酪，包括但不限于Emmenthal及Gruyère；Cottage乳酪，包括但不限于Cottage乳酪；Feta乳酪，包括但不限于Feta及White乳酪；Continental乳酪，包括但不限于Gouda、Edam、Maasdam、Samsoe、Saint Paulin、Raclette、Manchego及Prato；Pasta Filata乳酪，包括但不限于Mozzarella、Pizza乳酪、Provolone及Kaskawal；Cheddar乳酪，包括但不限于Cheddar、Territorials、American Cheddar、Monterey Jack及Colby；及Grana乳酪，包括但不限于Grana、Parmesan及Sbrinz。
另外，食品可以選自肉類制品、蔬菜類制品及飲料，如葡萄酒及啤酒。
根據(jù)本發(fā)明方法的另一重要應用是被稱作益生菌劑的液體發(fā)酵劑的使用。術語“益生菌劑”在本申請上下文中被理解為一種被人或動物以活細胞形式攝取可以改善健康狀況的微生物培養(yǎng)物，例如，通過抑制胃腸道內(nèi)有害微生物，增強免疫系統(tǒng)或促進營養(yǎng)消化。此益生活性制品的典型例子是“甜酸乳”。
在另一實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法用于生產(chǎn)動物飼料如青貯飼料(如草、谷類、豌豆、苜?；蛱鸩巳~)，接種細菌培養(yǎng)物于待青貯的飼料中以獲得防腐作用，或接種于蛋白豐富的動物廢棄物如屠宰廢棄物及魚廢棄物中，也是為了保存動物飼料用廢棄物。
本發(fā)明在下面的非限制性實施例及圖表中進一步說明。


圖1顯示了商業(yè)冷凍濃縮發(fā)酵劑F-DVSTM Fl-Da N(Chr.Hansen A/S Item.No.501691)-50℃保存初期的穩(wěn)定性。發(fā)酵劑的活性通過使用0.01％ w/v的接種物進行酸化活性測定來確定。于牛奶中30℃培養(yǎng)6小時后測定pH值。注較高的pH值表示發(fā)酵劑的酸化活性較低(即代謝活性較低)。
圖2顯示冷凍濃縮發(fā)酵劑F-DVSTM CH-N 14(Chr.Hansen A/S產(chǎn)品號No.200118)添加及未添加3％ w/w IMP以酸化活性表示的保存穩(wěn)定性。注縱座標表示在30℃培養(yǎng)6小時后測得的pH值，接種物的量為0.01％ w/v。較高的pH值表示發(fā)酵劑的酸化活性較低(即代謝活性較低)?？招恼叫伪硎咎砑覫MP的培養(yǎng)物，而菱形表示未添加IMP的培養(yǎng)物。
圖3顯示F-DVSTM CH-N 14發(fā)酵劑(Chr.Hansen A/S Item.No.200118)添加及未添加IMP的酸化活性，于-50℃保存2個月后對培養(yǎng)物進行發(fā)酵，按照表2的Danbo溫度變化曲線以低溫巴氏消毒的全奶檢測發(fā)酵作用。添加的發(fā)酵劑量以％(w/v)給出。注縱座標表示在30℃培養(yǎng)6小時后測得的pH值，較高的pH值表示培養(yǎng)物的酸化活性較低(即代謝活性較低)。
圖4說明F-DVSTM CH-N 19(Chr.Hansen A/S產(chǎn)品號No.501593)在冷凍期間活性的喪失。檢測發(fā)酵劑的活性同于發(fā)酵劑的生產(chǎn)(在第0天)。誤差棒表示標準差。注縱座標表示在30℃培養(yǎng)6小時后測得的pH值，接種物的量為0.01％ w/v，較高的pH值表示發(fā)酵劑的酸化活性較低(即代謝活性較低)。
圖5顯示F-DVSTM Fl-Da N發(fā)酵劑(Chr.Hansen A/S Item.No.501691)添加一定量IMP酸化活性的喪失。濃縮物在冷凍之前以液體保存于8℃5小時。誤差棒表示標準差。注縱座標表示在30℃培養(yǎng)6小時后測得的pH值，接種物的量為0.01％ w/v，較高的pH值表示發(fā)酵劑的酸化活性較低(即代謝活性較低)。
圖6顯示添加及未添加3％ w/w IMP的冷凍干燥濃縮發(fā)酵劑DVSTM Fl-Da N以酸化活性表示的保存穩(wěn)定性，于-50℃保存7天后檢測發(fā)酵劑的活性。誤差棒表示標準差。注縱座標表示在30℃培養(yǎng)6小時后測得的pH值，接種物的量為0.01％ w/v，較高的pH值表示發(fā)酵劑的酸化活性較低(即代謝活性較低)。
圖7顯示冷凍濃縮發(fā)酵劑F-DVSTM Fl-Da N(Chr.Hansen A/S產(chǎn)品號No.501691)于保存初期添加或未添加3％ w/w IMP、GMP、次黃嘌呤核苷或未添加任何化合物以酸化活性表示的保存穩(wěn)定性。注縱座標表示在30℃培養(yǎng)6小時后測得的pH值，接種物的量為0.01％ w/v，較高的pH值表示培養(yǎng)物的酸化活性較低(即代謝活性較低)。實心菱形表示添加3％ w/w IMP，灰正方形表示添加3％ w/w GMP，實心三角表示添加3％ w/w次黃嘌呤核苷，圓形表示未添加冷凍保護劑。
圖8顯示冷凍濃縮發(fā)酵劑(F-DVSTM Fl-Da N，Chr.Hansen A/S Item.No.501691)于保存期間添加或不添加3％ w/w IMP、GMP、次黃嘌呤核苷或不添加任何化合物以酸化活性表示的保存穩(wěn)定性。注縱座標表示在30℃培養(yǎng)6小時后測得的pH值，接種物的量為0.01％ w/v，較高的pH值表示培養(yǎng)物的酸化活性較低(即代謝活性較低)。實心菱形表示添加3％ w/w IMP，實心正方形表示添加3％ w/w GMP，實心三角形表示添加3％ w/w次黃嘌呤核苷，十字形表示未添加冷凍保護劑。
圖9顯示冷凍干燥濃縮發(fā)酵劑Fl-Da N培養(yǎng)物添加及未添加各種添加劑于-50℃保存1日后以酸化活性表示的保存穩(wěn)定性。注縱座標表示在30℃培養(yǎng)6小時后測得的pH值，接種物的量為0.05％ w/v，較高的pH值表示培養(yǎng)物的酸化活性較低(即代謝活性較低)。酸化分析結果表示每一種添加劑。大多數(shù)添加劑是嘌呤堿基、嘧啶堿基、核苷及核苷酸。IMP是次黃嘌呤核苷-5′-一磷酸的簡寫形式，AMP是腺苷-5′-一磷酸的簡寫形式，UMP是尿苷-5′-一磷酸的簡寫形式，CMP是胞苷-5′-一磷酸的簡寫形式，MSG是谷氨酸單鈉的簡寫形式。添加劑的百分比是指添加至濃縮培養(yǎng)物的添加劑的％ w/w。未顯示％值的地方表示添加3％w/w的量。
圖10顯示冷凍干燥濃縮發(fā)酵劑Fl-Da N培養(yǎng)物添加及未添加各種添加劑于-50℃保存2個月后以酸化活性表示的保存穩(wěn)定性。具體內(nèi)容見圖9的說明。
圖11顯示添加及未添加添加劑(3％IMP+2％次黃嘌呤核苷)的冷凍保加利亞乳酸菌的活力，冷凍速度為1℃/min左右，滿條表示于冷凍之前添加保護劑的培養(yǎng)物，酸化分析以0.02％ w/w接種物為基礎且于40℃進行5小時。較高的pH值表示培養(yǎng)物的酸化活性較低(即代謝活性較低)。
圖12顯示對快速冷凍的嬰兒雙岐桿菌培養(yǎng)物(A)活力的影響(與兩組緩慢冷凍的嬰兒雙岐桿菌培養(yǎng)物(B及C)進行比較)。3％ w/w IMP及2％w/w次黃嘌呤核苷作為冷凍保護劑添加入培養(yǎng)物C中。培養(yǎng)物B及C的冷凍速度為1℃/min左右，而培養(yǎng)物A通過滴注于液態(tài)氮中冷凍。
圖13顯示添加及未添加各種添加劑的快速冷凍濃縮發(fā)酵劑CH-N 19培養(yǎng)物于-50℃保存1日后以酸化活性表示的保存穩(wěn)定性。注縱座標表示在30℃培養(yǎng)6小時后測得的pH值，接種原料的量0.05％ w/v，較高的pH值表示培養(yǎng)物的酸化活性較低(即代謝活性較低)。酸化分析結果表明了每一種保護劑及其混合物的情況。
圖14顯示添加及未添加各種添加劑的快速冷凍濃縮發(fā)酵劑CH-N 19培養(yǎng)物于-50℃保存6日后以酸化活性表示的保存穩(wěn)定性。詳細內(nèi)容見圖13的說明。
實施例
材料與方法
培養(yǎng)物
下列使用的商業(yè)發(fā)酵劑為Fl DaN、CH N 14及CH N19，這三種發(fā)酵劑均為冷凍直投式發(fā)酵劑(F-DVSTM)形式的商業(yè)冷凍LD型發(fā)酵劑(來自丹麥的Chr.Hansen A/S公司)，分別為F-DVSTM Fl-Da N(Chr.Hansen A/S產(chǎn)品號No.501691)、F-DVSTM CH-N14(Chr.Hansen A/S產(chǎn)品號No.200118)、F-DVSTM CH-N 19(Chr.Hansen A/S產(chǎn)品號No.501593)。
發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件
LD型發(fā)酵劑培養(yǎng)基組分
LD型發(fā)酵劑在含如下組分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)酪蛋白水解產(chǎn)物(Oxoid，Basingstoke，英國，產(chǎn)品編號L41)，30g/l；Primatone(一種動物組織的可溶性消化物)，RL(Quest，Naarden，荷蘭，產(chǎn)品編號5X59051)，30g/l；大豆蛋白胨(Oxoid，Basingstoke，英國，產(chǎn)品編號L44)，30g/l；酵母提取物(Oxoid，Basingstoke，英國，產(chǎn)品編號L21)，15g/l；硫酸鎂(MgSO4)，1.5g/l；維生素C鈉，3g/l；及乳糖50g/l。
培養(yǎng)基以超高溫處理進行滅菌(143℃、8分鐘)。終培養(yǎng)基pH值為6.5。
LD型發(fā)酵劑的發(fā)酵條件
使用1％(w/w)上述作為接種物的發(fā)酵劑于100l發(fā)酵罐中30℃進行發(fā)酵，采用頂部空間為氮氣及頂部空間壓力約0.2bar進行厭氧發(fā)酵，使培養(yǎng)物酸化至pH值6.0。隨后通過控制性添加13.4N N NH4OH維持pH值在6.0。當未檢測到進一步的基質(zhì)消耗，將各培養(yǎng)物冷卻至約10℃。
LD型發(fā)酵劑的發(fā)酵后處理
冷卻后，通過離心將發(fā)酵液中的細菌濃縮10-20倍，添加添加劑，如無其它說明，隨后在一個大氣壓下于液氮內(nèi)以粒狀沉淀冷凍。除非另有說明，冷凍之后在不同的時間段測定粒狀沉淀的酸化活性，余下的粒狀沉淀保存在-50℃直至進行進一步的分析。
添加劑
添加劑的來源如下次黃嘌呤核苷-5′-一磷酸(IMP)(Alsiano A/S，Birkeroed，DK)，腺苷-5′-一磷酸(AMP)(Sigma A2252)，尿苷-5′-一磷酸(UMP)(Sigma U6375)，胞苷-5′-一磷酸(CMP)(Sigma C1006)，甲酸鈉(Kirsch PH值arma，Salzgitter，DE)，腺苷(Alsiano A/S，Birkeroed，DK)，鳥苷(Alsiano A/S，Birkeroed，DK)及次黃嘌呤核苷(AlsianoA/S，Birkeroed，DK)。
酸化活性測定及菌落形成單位(CFU)分析
以0.01％(w/w)水平接種冷凍發(fā)酵劑于200ml含9.5％(w/w)固體物質(zhì)及于99℃加熱30分鐘超高溫滅菌的復原脫脂牛奶(RSM)(LAB奶)中。于30℃培養(yǎng)RSM6小時，以使底物酸化。酸化活性根據(jù)實施例6(分析規(guī)程QAm-052，“酸化活性-超高溫”，Chr.Hansen A/S(丹麥))所述進行測定
DANBO溫度變化曲線后的模擬乳酪生產(chǎn)
根據(jù)反映溫度時程(給定的乳品(DANBO乳酪)生產(chǎn)中使用的培養(yǎng)物要遇到的)的溫度變化曲線進行酸化測定。
如表2所示在固定的時間測定pH值
表2 Danbo溫度變化曲線
根據(jù)實施例7所述測定酸化活性分析規(guī)程QAm-043，酸化活性-“程序溫度變化曲線”Chr.Hansen A/S(丹麥)。
如實施例8分析規(guī)程Q-AM-071，“微生物的計數(shù)”Chr-Hansen A/S(丹麥)所述評價與計算CFU分析結果。
實施例1Fl-Da N冷凍LD型發(fā)酵劑的穩(wěn)定性研究
在此實施例中，對通過商業(yè)生產(chǎn)的LD型發(fā)酵劑F-DVSTM FI-Da N F(Chr.HansenA/S產(chǎn)品號No.501691)酸化活性測定穩(wěn)定性6個月。如“材料及方法”部分中描述生產(chǎn)發(fā)酵劑并于-50℃保存。
與通常情況不同，此實施例中初次活性測定在培養(yǎng)物于液氮中以沉淀冷凍后立即進行，其后，于-50℃保存1天、2天、12天、20天及188天后再測定。
本實驗結果示于圖1。
在保存的最初幾天，酸化活性大幅度降低。保存僅一周之后，酸化活性降低0.26pH值單位，這一降低相當于保存僅一周酸化活性降低50％。保存兩周后培養(yǎng)物酸化活性喪失不顯著，在余下的保存期發(fā)酵劑的酸化活性僅輕度降低。
此實驗出人意料的結果使發(fā)明者認識到與某些類型商業(yè)濃縮冷凍乳酸菌發(fā)酵劑(如商業(yè)冷凍LD型發(fā)酵劑)冷凍及保存初期有關的重要、至今未認識到的穩(wěn)定性問題。
實施例2使用IMP作為冷凍保護劑的CH N14冷凍LD型發(fā)酵劑的穩(wěn)定性研究
本實施例描述以IMP作為冷凍保護劑的冷凍直投式發(fā)酵劑(F-DVSTM)CH N14穩(wěn)定性研究。在實驗中，IMP的濃度保持在每克濃縮菌3％ w/w。以30％ w/w無菌溶液添加IMP至濃縮菌中。
發(fā)酵之后，收獲細菌并通過離心F-DVSTM CH N 14發(fā)酵液進行濃縮。細胞濃縮物分成兩份，300g/份，于每份中添加IMP?；旌咸砑觿﹦┘皾饪s物30分鐘，在液氮中冷凍，-50℃保存。冷凍發(fā)酵劑活菌含量至少為每g冷凍物1010CFU，-50℃保存3天后測定牛奶(LAB奶)中的培養(yǎng)活性，定期檢測活性直至保存65天。
以酸化活性給出的F-DVSTM CH N 14穩(wěn)定性數(shù)據(jù)于圖2中概述。
很明顯無添加劑的F-DVSTM CH N 14喪失活性。F-DVSTM CH N 14于-50℃保存65天后其穩(wěn)定性降低0.25pH值單位。0.25pH值單位幾乎相當于酸化活性喪失50％(即穩(wěn)定培養(yǎng)物約為不穩(wěn)定培養(yǎng)物的2倍)。
實施例3使用IMP作為冷凍保護劑的CH N 14冷凍LD型發(fā)酵劑于溫度變化曲線之后的穩(wěn)定性研究
本實驗中，對實施例2所述的培養(yǎng)物樣品于-50℃保存約兩個月后進行檢測。根據(jù)模擬的“Danbo”溫度變化曲線(見表2)在培養(yǎng)期間的幾個時間點測定酸化活性。發(fā)酵培養(yǎng)基為低溫巴氏消毒全奶，與常規(guī)用于Danbo乳酪商業(yè)生產(chǎn)的牛奶相似。
對培養(yǎng)物冷凍之前添加及未添加IMP的發(fā)酵劑的酸化活性進行了比較。
于一組低溫巴氏消毒全奶瓶中接種未添加IMP的冷凍CH N 14發(fā)酵劑，發(fā)酵劑的添加量分別為0.01％、0.02％及0.03％(w/w％)。
于另一組低溫巴氏消毒全奶瓶中接種冷凍之前添加3％(w/w％)IMP的冷凍CH N 14培養(yǎng)物，培養(yǎng)物的添加量分別為0.01％(w/w％)。
從實施例2可以看出，未添加IMP的發(fā)酵劑酸化活性喪失約50％，相當于與未添加IMP相似量的相似培養(yǎng)物相比，添加IMP的培養(yǎng)物活性約為其2倍。
為說明IMP的增強效應，使用三個不同量的CH N 14發(fā)酵劑進行未添加IMP樣品的接種。從實施例1獲得的結果(即未添加IMP發(fā)酵劑于保存期間活性喪失稍低于50％)判斷，預期添加IMP的發(fā)酵劑的0.01％接種物其酸化活性介于未添加IMP的培養(yǎng)物0.01％與0.02％接種物酸化活性之間。
然而，如圖3所述，情況并非如此。0.01％添加IMP的發(fā)酵劑接種物酸化活性介于0.02％與0.03％未添加IMP的發(fā)酵劑接種物酸化活性之間。額外的活性規(guī)因于所添加IMP的增強效應。
本實驗顯示與相似量未添加IMP的相似培養(yǎng)物相比添加IMP于發(fā)酵劑導致活性增強2-2.5倍。
實施例2中的增強效應不明顯，因為實施例2中的牛奶經(jīng)受強熱力滅菌法程序，即LAB奶。在我們的實驗中，用于乳酪制造的牛奶中增強效應非常顯著，因為此牛奶為低溫巴氏消毒牛奶。
實施例4CH-N 19冷凍過程中活性的喪失
此實施例描述以IMP作為冷凍保護劑的CH-N 19發(fā)酵劑冷凍過程中活性喪失。實驗中，IMP的濃度保持在每g濃縮菌3％ w/w(以30％ w/w無菌溶液添加)。
發(fā)酵之后，收獲細菌并通過離心CH-N 19培養(yǎng)物發(fā)酵液進行濃縮。細胞濃縮物分成兩份，300g/份，于每份中添加IMP?；旌咸砑觿┘皾饪s物30分鐘，在液氮中每份冷凍150g。培養(yǎng)物活菌含量為每g冷凍物至少1010CFU，對添加及未添加IMP的冷凍及非冷凍發(fā)酵劑于其增長后測定酸化活性。測定于牛奶(熱力滅菌LAB奶)中的培養(yǎng)活性。
圖4的結果顯示如果發(fā)酵劑未添加IMP冷凍其酸化活性喪失0.06pH值單位。0.06pH值單位的喪失相當于酸化活性喪失5-10％。然而，如果于此培養(yǎng)物中添加IMP，則無明顯的活性喪失。0.01pH值單位的差異與圖中誤差棒顯示的標準差相同。
推斷IMP也可以作為冷凍保護劑，抵抗此類型培養(yǎng)物冷凍造成的影響。
實施例5使用IMP的F-DVSTM Fl-Da N發(fā)酵劑的劑量反應
本實施例描述以IMP作為冷凍保護劑的冷凍發(fā)酵劑Fl-Da-N(F-DVSTM)劑量反應研究。實驗中IMP的濃度為每g濃縮菌0％、0.1％、0.5％、1％、3％及6％ w/w。添加劑以30％無菌溶液添加于濃縮物中。
發(fā)酵之后，收獲細菌并通過離心Fl-DaN發(fā)酵液進行濃縮。細胞濃縮物分成6份，300g/份，于每份中添加IMP。為模擬與工業(yè)生產(chǎn)情形相似的情況，在冷凍過程中，混合添加劑與濃縮物，8℃保存5個小時，之后于液氮中冷凍，-50℃保存。因此此實施例不可與前述實施例進行比較。冷凍發(fā)酵劑活菌量為每g冷凍物至少1010CFU，于配制冷凍培養(yǎng)物當天測定于牛奶(LAB奶)中的培養(yǎng)活性。
結果示于圖5。
從這些結果可以看出未添加IMP冷凍的濃縮培養(yǎng)物，酸化活性喪失最大。添加3％(w/w％)IMP獲得了最佳結果(即酸化活性的降低最小)。
實施例6分析規(guī)程QAm-052，“酸化活性-超高溫”，Chr.Hansen A/S(丹麥)
應用
此方法用于確定酸化活性。
原理
對于F-DVSTM及FD-DVS
稀釋發(fā)酵劑，接種于牛奶中。于給定溫度、給定時間培養(yǎng)。培養(yǎng)后測定pH值。
對于冷凍Redi-Set(F-RS)及冷凍干燥Redi-SetFD-RS
對于這些制品，活性分析包括2個生長步驟。在牛奶中于給定時間和溫度增殖發(fā)酵劑制備生產(chǎn)用發(fā)酵劑，之后，于牛奶中接種生產(chǎn)用發(fā)酵劑，于新的增殖培養(yǎng)后測定pH值。
分析參數(shù)
可于實驗室咨詢管理系統(tǒng)(LIMS)中讀取制品分析參數(shù)說明。例如牛奶類型、第一次及第二次稱重時牛奶的溫度、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度、樣品的接種百分數(shù)及對照標準。
儀器及試劑
pH值計；pH值計電極；校準緩沖液；pH值7.00±0.01及pH值4.01±0.01；溫度調(diào)節(jié)水浴，精密度為±0.2℃；溫度傳感器；天平，精密度0.01g，最小兩位小數(shù)；旋轉儀；溫度計；手表；磁性攪拌器；磁體；燒杯，50ml。
操作程序
分析的準備
注所有燒瓶均為同一批(日期相同)。
在實驗開始之前至少16小時松開所有瓶子的封蓋。調(diào)節(jié)水浴至培養(yǎng)溫度。調(diào)節(jié)第一次稱重的瓶子至培養(yǎng)溫度(可以是冷或熱牛奶)。在校準pH值計之前，在培養(yǎng)溫度下置pH值4.01及pH值7.00緩沖液于水浴中至少30分鐘。
注例如，在培養(yǎng)之前置于4℃冰浴中，由計時器啟動水浴加熱。
分析前樣品的準備
冷凍培養(yǎng)物于第一次稱重之前將冷凍樣品/對照標準置于帶有干冰的泡沫盒中，保存至完成所有稱重。
使用之前融解冷凍培養(yǎng)物
對于使用完整紙盒的冷凍培養(yǎng)物，根據(jù)說明進行融解。融解之后，使用前保持樣品于4℃至多30分鐘。對于罐裝冷凍發(fā)酵劑，置罐于22℃水浴20分鐘以融解內(nèi)容物。融解之后，使用前保持培養(yǎng)物于4℃至多30分鐘。
冷凍干燥培養(yǎng)物
實驗之前，冷凍干燥樣品/對照標準在室溫適應至少15分鐘。
接種操作過程
第一次稱重/稀釋
將第一次稱重的瓶子置于天平上，調(diào)零。
制品/對照標準的稱重直接于牛奶中進行。
當于溫牛奶接種時，總把第一次稱重的時間記錄在內(nèi)，接種物的實際量(第一次稱重)以至少兩位小數(shù)記錄。
小心搖晃凍融的發(fā)酵劑至其散開或至多10次，之后瓶子直立大約50秒。
對于冷凍干燥發(fā)酵劑，使用旋轉儀(速度2)5分鐘或直至制品散開。
注對于嗜酸乳桿菌、雙岐桿菌或干酪樣乳桿菌的冷凍干燥發(fā)酵劑，所有接種均在凈化臺內(nèi)進行。
第二次稱重
將第二次稱重的瓶子置于天平上，調(diào)零。
對于凍融的發(fā)酵劑，在第二次稱重之前小心搖晃稀釋瓶。根據(jù)目前的質(zhì)量控制(Qc)規(guī)程進行以1分鐘的時間進行第二次稱重。
對于冷凍干燥發(fā)酵劑，根據(jù)目前的質(zhì)量控制(Qc)規(guī)程進行第二次稱重。
當接種為冷/溫時，記錄第二次稱重的時間。以至少兩位小數(shù)記錄接種物的實際量。
翻轉活性瓶，下一樣品/對照重復接種過程。
對于從相同的第一次稱重接種的活性瓶進行順序接種。
注混合發(fā)酵劑的稱重
首先，從每一對照標準/單一菌株進行第一次稱重，對相同的活性瓶進行第二次稱重，這將包含所有對照標準/單一菌株。
對于冷凍發(fā)酵劑，從第一次稱重至第二次稱重的時間最多為5分鐘，對于冷凍干燥發(fā)酵劑，從第一次稱重至第二次稱重的時間最多為10分鐘。
最后，將一未接種的牛奶瓶置于水浴中。
對于冷牛奶進行第一次稱重的發(fā)酵劑
Time(測量)＝Time第二次稱重+Time接種
對于熱牛奶進行第一次稱重的發(fā)酵劑
Time(測量)＝Time第一次稱重+Time接種
注對于另外進行長期酸化分析的發(fā)酵劑，可于酸化活性接種同時進行接種。
從用于酸化活性的第一次稱重，第二次稱重可以于冷活性牛奶中進行(在加熱至培養(yǎng)溫度的水浴中培養(yǎng)之前，將冷活性牛奶置于4℃)。此時，將瓶子培養(yǎng)多于給定培養(yǎng)時間半小時。
注對于樣品/對照標準進行培養(yǎng)及pH值測定的發(fā)酵劑，由于，在正常工作時間內(nèi)不可能長時間的酸化，可于冷牛奶中進行第一次和第二次稱重。
活性牛奶的接種之后，將瓶子置于水浴中冷卻。將接觸手表的溫度傳感器置于水浴中未接種的牛奶瓶中(置于水浴中)。連接接觸手表于給定時間開始水的加熱，當達到有關發(fā)酵劑所需溫度時培養(yǎng)時間開始。
注如有必要使用一個以上水浴，則必須于同一水浴中將對照標準與其連接的樣品一起培養(yǎng)。
pH值計電極的測量
根據(jù)當前有關電極校準及維護的說明書進行校準。
必須于測量時間(Time測量)測量樣品/對照標準的pH值，如果時間超過1分鐘，要作記錄。如果時間超過2分鐘，則放棄測量。于測量之前，翻轉瓶子180°。
pH值計的測量
pH值的測量于瓶子或注入帶磁力攪拌的50ml燒杯的樣品中進行。
pH值以兩位小數(shù)記錄。
記錄關于測量的可能評述。測量過程持續(xù)至所有樣品/對照標準及未接種的牛奶測量完畢。于接種的牛奶瓶中測量水浴溫度并記錄于記錄簿中。
最后，測量校準緩沖液的pH值
實施例7分析規(guī)程QAm-043，酸化活性-“程序溫度變化曲線”Chr.Hansen A/S(丹麥)
應用
此方法根據(jù)Pearce試驗用于測定酸化活性及其它根據(jù)溫度變化曲線(如Danbo變化曲線)進行酸化的情況。僅Pearce試驗被包括在國際奶業(yè)標準(IDF)中。
原則
根據(jù)反映溫度變化過程的溫度變化曲線(發(fā)酵劑用于乳業(yè)中進行給定乳制品的生產(chǎn)時將遇到)進行酸化。
對于Pearce試驗在Cheddar生產(chǎn)過程中此為干酪的制造溫度。
在固定時間測量pH值。
對于分析過程中未添加粗制凝乳酶的發(fā)酵劑，可以連續(xù)測量pH值。
分析參數(shù)
制品特有的分析參數(shù)于實驗室咨詢管理系統(tǒng)(LIMS)中給出。
溫度變化曲線的定義(對于未使用Pearce變化曲線的制品)。
使用的對照標準。
pH值測量的類型。
樣品及對照標準的培養(yǎng)百分比。
稀釋牛奶206.9g冷(4℃)LAB-牛奶(即含9.5％(w/w)固體物質(zhì)、于加熱99℃ 30分鐘的超高溫滅菌復原脫脂奶(RSM))。
活性牛奶200g冷(4℃)低溫巴氏消毒全奶(3.5％脂肪)。
粗制凝乳酶Naturén規(guī)格190，以水1∶40稀釋。
儀器與試劑
pH值計/半連續(xù)pH值測量pH值計eks.RadiometerPH值M92。
pH值計電極RadiometerPFC2401。
緩沖液pH值7.00±0.01及pH值4.01±0.01。
根據(jù)預定的溫度變化曲線±0.2℃加熱的溫度調(diào)節(jié)水浴。
溫度傳感器。
天平，精密度0.01g(最小兩位小數(shù))。
手表。
磁力攪拌器。
磁體。
燒杯，50ml。
小塑料杯。
旋轉儀。
操作程序
分析的準備
所有瓶子為同一批(即日期相同)。
調(diào)節(jié)水浴至使用的變化曲線溫度的起始溫度。
將稀釋(第一次稱重)及活性(第二次稱重)瓶子置于4℃直至使用。
在pH值計校準之前至少30分鐘，將pH值4.01及pH值7.00緩沖液置于具體測量溫度±0.2℃的水浴中。
分析之前樣品的準備
冷凍發(fā)酵劑
將冷凍樣品/對照標準于第一次稱重之前置于帶有干冰的泡沫盒中，并保存至所有稱重完畢。
使用前融解的冷凍發(fā)酵劑
對于使用完整紙盒的冷凍發(fā)酵劑，根據(jù)說明書進行融解。
融解后，于使用前將樣品保持在4℃至多30分鐘。
冷凍干燥發(fā)酵劑
在分析開始之前使冷凍干燥樣品及對照標準于室溫適應至少15分鐘。
如果樣品于日后用于再測定，則可保存于+8℃。
培養(yǎng)過程
樣品/對照標準的稱重直接于牛奶中進行。
接種物的實際量(第一次稱重)以至少兩位小數(shù)記錄。
小心翻轉凍融發(fā)酵劑4次，之后，直立瓶子約50秒。
對于冷凍干燥發(fā)酵劑必須使用旋轉儀?？焖龠\行5分鐘或至制品徹底溶解。通過將瓶子置于桌上片刻然后觀察瓶底檢查溶液進行控制。
注
如方便，于第二次稱重之前將第一次稱重的冷瓶子置于室溫至多15分鐘。
第二次稱重
第二次稱重之前翻轉稀釋瓶。
接種物的實際量(第二次稱重)以至少兩位小數(shù)記錄。
翻轉活性瓶，重復樣品/對照標準的接種過程。
對于同是第一次接種的活性瓶順序給予接種。
在第二次稱重之前或之后于每瓶添加2ml粗制凝乳酶。之后，翻轉瓶子以使粗制凝乳酶分散開。
粗制凝乳酶不被添加至Danbo變化曲線。
(非國際乳業(yè)(IDF)標準)
隨后如實施例6所述同時培養(yǎng)瓶子。
最后，將兩只未接種的牛奶瓶置于水浴。一只用于測量水浴溫度，一只用于測量pH值。
培養(yǎng)
注當需要更多水浴時，與樣品對應的對照標準必須在同一水浴中培養(yǎng)。
所有活性瓶在同一時間、變化曲線溫度的確定起始溫度下于預熱的水浴中進行培養(yǎng)。
在將瓶子置于水浴的同時開始溫度變化曲線。
此后，由依照溫度變化曲線的自動調(diào)溫器控制培養(yǎng)溫度，Pearce試驗見表3，Danbo試驗見表4。
水浴中的水位應高于牛奶水平至少2cm。
表3Pearce溫度變化曲線的溫度方案(依照IDF)
表4Danbo溫度變化曲線
注在3小時30分鐘時，打開冷卻水。
*06:00小時+/-2分鐘之后的pH值手動測量符合25.5℃+/-0.5℃的水浴溫度。
pH值計電極的校準
根據(jù)當前有關電極校準和維護的說明書在起始溫度進行校準。
pH值的測量
培養(yǎng)后充分振搖瓶子，測量pH值。
于瓶子或磁力攪拌下注入50ml燒杯的樣品中測量pH值。
以至少兩位小數(shù)記錄pH值。
記錄關于測量的可能評述。
測量過程持續(xù)至所有樣品/對照標準及未接種牛奶被測量完畢。
最后，測量緩沖液pH值并記錄。
連續(xù)的pH值測量。
從溫度變化曲線開始時，取樣測量pH值。培養(yǎng)完成后，記錄起始溫度時兩種緩沖液中所測得的pH值。
實施例8分析規(guī)程Q-AM-071，“微生物的計數(shù)”Chr-Hansen A/S(丹麥)
應用領域
此方法用于各種發(fā)酵劑中乳酸菌的計數(shù)及交叉污染的計數(shù)。根據(jù)當前質(zhì)量控制(Qc)規(guī)程此方法僅可與有關培養(yǎng)物分析程序一同應用，因為本發(fā)明中必須給予分析參數(shù)的參照。
原則
此方法為定量方法，結果以CFU/g報告。
已知量的樣品以稀釋劑同質(zhì)加工處理并進行十進位稀釋。稀釋液與Leesment瓊脂混合或散布于表面。培養(yǎng)之后，計數(shù)所有菌落數(shù)量。
取樣
根據(jù)已建立的微生物學操作規(guī)范取樣，以使樣品盡可能代表待測制品。儀器與玻璃器皿
250ml瓶子
20ml帶帽試管
高壓滅菌器(±1℃)
pH值計(靈敏度為±0.2)
天平(±0.01g)
漩渦攪拌器
Stomacher
無菌Stomacher袋，400ml
細菌培養(yǎng)箱(±1℃)
水浴(±1℃)
無菌移液管
Petri培養(yǎng)皿(9cm)
無菌Drigalski接種勺
培養(yǎng)基
表5 稀釋劑液，內(nèi)容物
制備
將成分懸浮于1000ml蒸餾水中，快速攪拌下加熱至沸點。分裝稀釋液至瓶子或試管內(nèi)，121℃高壓滅菌15分鐘。
高壓滅菌之后pH值為7.0±0.2。
高壓滅菌之后瓶中內(nèi)容物為99.0±1.0ml。
高壓滅菌之后試管中內(nèi)容物為9.00±0.05ml。
如果稀釋液(表5)被立即使用，則冷卻至20℃或更低。
貯存
制備好的稀釋液(表5)5℃下于暗處保存6個月。
表6 Leesment瓊脂，內(nèi)容物
制備
將成分懸浮于1000ml蒸餾水中，快速攪拌加熱至沸點至完全溶解。將培養(yǎng)基分裝至瓶子內(nèi)，121℃高壓滅菌15分鐘，高壓滅菌之后pH值為6.8±0.2。
如果培養(yǎng)基被立即使用，于水浴中將其冷卻至約47℃。使用前于200ml用于所有CR-發(fā)酵劑的Leesment瓊脂(表6)中添加2ml 50％葡萄糖溶液。
如果培養(yǎng)基用于平板涂布，傾倒12-15ml熔化的培養(yǎng)基至Petri培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)基置于凈化臺中干燥30分鐘。
葡萄糖溶液
于100ml蒸餾水中融解2.0g葡萄糖，溶液以0.20nM過濾器過濾除菌。
Leesment葡萄糖瓊脂
在使用之前于200ml Element瓊脂中添加50％葡萄糖溶液2ml。(表6)
貯存
制備好的Leesment瓊脂可于暗處5℃保存6個月。
塑料袋裝傾注平皿可于暗處5℃保存10日。
操作程序
從稱量完畢樣品至傾倒平板或涂布平板的過程不超過30分鐘。
于微生物學檢查開始之前，于沸水浴或通過于高壓滅菌器中煮沸熔化培養(yǎng)基，然后在水浴中冷卻至47±1℃。
注如果使用預先傾倒的培養(yǎng)皿，則于培養(yǎng)之前培養(yǎng)基表面必須保持干燥。
在有關制品的分析程序或質(zhì)量標準中給出以下參數(shù)
a)第一次稀釋(D1)使用的克數(shù)(X)
b)于Stomacher中的分鐘數(shù)(M)
c)適當?shù)南♂?D2)
d)待接種量(Aml)
e)培養(yǎng)參數(shù)
f)平皿培養(yǎng)法
稀釋液的制備
稱量X克制品于無菌Stomacher袋內(nèi)，稱量足量的無菌稀釋液進行第一次稀釋(D1)，將袋子放入Stomacher，處理(M)分鐘。如方便，將袋子內(nèi)容物傾入空的無菌瓶中，使用無菌移液管從最低稀釋度溶液中取0.1ml或1.0ml轉移至裝有無菌稀釋液的瓶子或試管內(nèi)，進行第二次稀釋(此時為最低)。
30°角度振搖瓶子7秒20-25次以混合瓶子內(nèi)容物，于漩渦攪拌器上以最大速度3×1秒混合試管內(nèi)容物。
使泡沫沉降，重復4-5點至達到適當?shù)南♂?D2)。
傾注平皿
使用無菌移液管轉移Aml適當?shù)南♂屢?D2)至Petri培養(yǎng)皿中。于每一Petri培養(yǎng)皿中傾倒10-12ml不超過47±1℃熔化的培養(yǎng)基，與樣品充分混合。傾倒10-12ml熔化培養(yǎng)基于一空Petri培養(yǎng)皿中作為無菌對照。將培養(yǎng)皿置于一清潔水平面至培養(yǎng)基凝固。將培養(yǎng)皿倒置，根據(jù)有關制品質(zhì)量控制(Qc)進行培養(yǎng)。
平板涂布
使用無菌移液管轉移Aml適當?shù)南♂屢?D2)至培養(yǎng)基表面，使用無菌Drigalski接種勺涂布整個培養(yǎng)基。使用未接種帶培養(yǎng)基的Petri培養(yǎng)皿作為無菌對照。倒置培養(yǎng)皿之前使樣品被培養(yǎng)基吸收，根據(jù)有關制品質(zhì)量控制(Qc)進行培養(yǎng)。
菌落計數(shù)
對于總體活細胞計數(shù)，選擇含30-300菌落的Petri培養(yǎng)皿。計數(shù)所有菌落數(shù)。
對于交叉污染的計數(shù)，選擇含不超過300菌落的Petri培養(yǎng)皿。計數(shù)所有菌落數(shù)。
注對于交叉污染的計數(shù)，待分析制品(于背景中將產(chǎn)生云片狀)可產(chǎn)生針尖狀菌落。因此，僅計數(shù)云片中大于針尖狀菌落的菌落。
計算
根據(jù)標準統(tǒng)計學規(guī)程，計數(shù)后對于平板計數(shù)必須進行χ2檢驗。
注當此方法用于交叉污染的計數(shù)時不進行χ2檢驗。
如果χ2檢驗不被接受，則必須放棄實驗結果，重復分析。
如果χ2檢驗被接受，則根據(jù)下列公式計算CFU/g的平均數(shù)(N)。
N＝(∑c)/((n1+0.1n2)d)
其中
∑c是所有Petri培養(yǎng)皿的菌落數(shù)；
n1第一次稀釋Petri培養(yǎng)皿的數(shù)量；
n2第二次稀釋Petri培養(yǎng)皿的數(shù)量；
d與第一次稀釋相對應的稀釋系數(shù)。
分析結果報告
計數(shù)的計算可以按上述實施例報告或以帶兩個有效數(shù)字的約整數(shù)報告。
外部報告的結果必須四舍五入。
例
19184四舍五入成19000，報告為1.9×104。
294×108四舍五入成290×108，報告為2.9×104。
對于三個數(shù)字的數(shù)，使第三位數(shù)四舍五入為零如果第三位數(shù)是5，前面的數(shù)是偶數(shù)，則舍去，如果前面的數(shù)字為奇數(shù)，則舍入。
例28500四舍五入為28000及
11500四舍五入為12000。
實施例9Fl-Da N冷凍干燥LD發(fā)酵劑的穩(wěn)定性研究
此實施例中，對于Fl-Da-N冷凍干燥發(fā)酵劑(FD-DVS)制造過程中添加及未添加IMP作為冷凍保護劑的不同作一比較。實驗中IMP的濃度為每g濃縮菌0％及3％ w/w，冷凍添加劑以30％無菌溶液添加至濃縮菌中。
發(fā)酵之后，由Fl-Da N發(fā)酵液收獲細菌并通過離心進行濃縮。將細菌濃縮物分成兩份，每份300g，于每份中添加IMP。為在冷凍過程中模擬工業(yè)生產(chǎn)情形，混合添加劑與濃縮物，于8℃保存5小時，接著在液態(tài)氮中冷凍，冷凍干燥之前于-50℃保存1天。冷凍干燥完畢之后，于-50℃保存發(fā)酵劑直至分析。冷凍發(fā)酵劑活菌含量至少為每g冷凍物1010CFU。-50℃保存7天之后檢測于牛奶(LAB奶)中的培養(yǎng)活性。
結果示于圖6。
很明顯未添加IMP的冷凍干燥DVS Fl-Dn N喪失大部分活性。Fl-Dn N于-50℃保存7天后穩(wěn)定性降低0.25pH值單位，0.25pH值單位相當于酸化活性喪失50％。
實施例10F-DVSTM FI-DaN冷凍LD型發(fā)酵劑使用不同核苷酸生物合成有關化合物作為冷凍保護劑的穩(wěn)定性研究
此實施例描述添加核苷酸(IMP或GMP)或核苷(次黃嘌呤核苷)作為冷凍保護劑的冷凍直投式發(fā)酵劑F-DVSTM FI-Da N(Chr.Hansen A/S產(chǎn)品號No.501691)的穩(wěn)定性研究。實驗中，IMP、GMP或次黃嘌呤核苷濃度保持在每g濃縮菌3％w/w。IMP及GMP以25％ w/w無菌水溶液添加至濃縮菌中。而次黃嘌呤核苷以干粉添加。對于次黃嘌呤核苷，于發(fā)酵劑中添加的水量與IMP或GMP相等。
發(fā)酵之后，由F-DVSTM FI-Da N發(fā)酵液收獲細菌并通過離心進行濃縮。將細菌濃縮物分成四份，每份300g，于每份中添加IMP、GMP、次黃嘌呤核苷或不添加任何化合物?；旌咸砑觿┡c濃縮物30分鐘，在液態(tài)氮中冷凍，-50℃保存。冷凍發(fā)酵劑活菌含量至少為每g冷凍物1010CFU。于發(fā)酵劑冷凍當天檢測牛奶(LAB奶)中的培養(yǎng)活性并直至冷凍13天內(nèi)定期進行檢測。
以酸化活性給出的F-DVSTM FI-Da N的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)概括于圖7。
很明顯未添加添加劑的F-DVSTM FI-Da N喪失活性。F-DVSTM FI-Da N于-50℃保存13天后，與次黃嘌呤核苷穩(wěn)定的發(fā)酵劑相比，未添加次黃嘌呤核苷的發(fā)酵劑穩(wěn)定性降低0.41pH值單位。0.41pH值單位相當于酸化活性喪失60％。同樣，添加或未添加GMP的F-DVSTM FI-Da N發(fā)酵劑之間穩(wěn)定性差異為0.31pH值單位，相當于酸化活性喪失50％。
實施例11F-DVSTM FI-Da N冷凍LD型發(fā)酵劑使用不同核苷酸生物合成有關化合物作為冷凍保護劑的長期穩(wěn)定性研究
此實施例描述添加核苷酸(IMP或GMP)或核苷(次黃嘌呤核苷)作為冷凍保護劑的冷凍直投式發(fā)酵劑F-DVSTM FI-Da N(Chr.Hansen A/S產(chǎn)品號No.501691)的長期穩(wěn)定性研究。實驗內(nèi)容如實施例10所述，除活性監(jiān)測時間延長。
F-DVSTM FI-DaN穩(wěn)定性數(shù)據(jù)(以酸化活性給出)概括于圖8。
所報告的F-DVSTM FI-Da N保存初期的趨勢可以延長至21或甚至49天。在長期保存期間，作為F-DVSTM FI-Da N的冷凍保護劑，次黃嘌呤核苷似乎優(yōu)于GMP，而GMP又優(yōu)于IMP。另外，本實驗表明在保存初期使用次黃嘌呤核苷作為冷凍保護劑的優(yōu)點也可以擴展至長期保存情況。因此，使用次黃嘌呤核苷作為冷凍保護劑預期可使制品酸化活性即使是長期保存之后也可增強大于兩倍。此為一重要結果，因為商業(yè)冷凍發(fā)酵劑的平均保存期為1年。
實施例12不同添加劑對Fl-Da N冷凍干燥LD型發(fā)酵劑的穩(wěn)定性的影響
本實施例描述添加及未添加不同添加劑(可作為冷凍保護劑)的Fl-DaN冷凍干燥LD型發(fā)酵劑(FD-DVS)的穩(wěn)定性，除非圖中另有說明，實驗中各種添加劑的濃度為每g濃縮菌3％ w/w。
發(fā)酵之后，如“材料與方法”部分所述，由FI-Da N發(fā)酵液收獲細菌并通過離心進行濃縮。細菌濃縮物將細菌濃縮物分成幾份，于每份中添加添加劑。為在冷凍過程中模擬工業(yè)生產(chǎn)情形，混合添加劑與濃縮物，于8℃保存5小時，接著在液態(tài)氮中冷凍，冷凍干燥之前于-50℃保存1天。冷凍干燥完畢之后，于-50℃保存發(fā)酵劑直至分析。冷凍干燥發(fā)酵劑活菌含量至少為每g冷凍干燥物1010CFU。-50℃保存1天及2個月之后通過酸化活性測定檢測于牛奶(LAB奶)中的培養(yǎng)活性。
實驗結果示于圖9及圖10。
從本實驗可以看出，不同的添加劑對冷凍干燥DVS-Da N培養(yǎng)物穩(wěn)定性的影響不同。另外，本實驗顯示，在保存初期表現(xiàn)最佳的添加劑在長期保存期間不一定是最佳。這通過于發(fā)酵劑中添加3％ w/w次黃嘌呤核苷或腺苷的作用來說明。-50℃保存僅1天后的檢測顯示3％ w/w次黃嘌呤核苷及3％ w/w腺苷均對確保發(fā)酵劑的穩(wěn)定性高度有效，但-50℃保存2個月后顯示3％ w/w的CMP、UMP或IMP為優(yōu)選。另人吃驚的是，-50℃保存2個月的穩(wěn)定性實驗結果(圖10)表明腺苷對發(fā)酵劑有害。為進行對照將已知的冷凍保護劑谷氨酸鈉(MSG)(Font de Valdez，1983)并入本實驗中。另外，應該注意到甲酸鈉的濃度為％ w/w(因3％w/w對冷凍發(fā)酵劑有害)，見下面的實施例15。
實施例13添加劑組合物對冷凍保加利亞乳桿菌發(fā)酵劑(冷凍速度為1℃/min)穩(wěn)定性的影響
本實施例描述添加兩種可能的冷凍保護劑(IMP及次黃嘌呤核苷)組合物對冷凍保加利亞乳桿菌發(fā)酵劑制造中的活性的影響。本實施例中對添加及未添加此組合物的培養(yǎng)物活性進行了比較。
于MRS培養(yǎng)基(Difco)40℃培養(yǎng)保加利亞乳桿菌培養(yǎng)物12小時。將培養(yǎng)物冷卻至12℃并調(diào)節(jié)其pH值至6.0。冷卻之后，通過離心濃縮發(fā)酵液細菌10-20倍，添入添加劑，接著于冷凍機內(nèi)緩控制冷卻緩慢冷凍，保證冷卻速度約1℃/分鐘，直至達-50℃。酸化試驗之前將發(fā)酵劑于-50℃保存至第二天(約18小時)。酸化試驗按照“材料與方法”部分所述進行，本試驗接種物濃度為0.02％ w/w，40℃下進行5小時。
本實驗中添加3％ w/w IMP及2％ w/w作為冷凍保護劑，w/w是指每g濃縮菌添加劑的重量，IMP及次黃嘌呤核苷以水溶液添加至濃縮菌中，至培養(yǎng)物的體積增加13％。此增加在圖11的數(shù)據(jù)中有所說明。因此，冷凍保護效果甚至比圖中顯示的要大。
本實驗顯示根據(jù)本發(fā)明兩種添加劑(3％ w/w IMP及2％ w/w次黃嘌呤核苷)的組合物使發(fā)酵劑更加穩(wěn)定。對于-50℃保存一天的保加利亞乳桿菌，穩(wěn)定性差異等于0.26pH值單位。0.26pH值單位約相當于酸化活性的50％差異(即穩(wěn)定的發(fā)酵劑約為未穩(wěn)定發(fā)酵劑活性的2倍。本實驗進一步顯示IMP及次黃嘌呤核苷的冷凍保護效果可以擴大到包括緩慢冷凍的發(fā)酵劑。
實施例14添加劑組合物對冷凍嬰兒雙岐桿菌活力的影響
本實施例探索了3％ w/w IMP及2％ w/w次黃嘌呤核苷組合物對緩慢冷凍的嬰兒雙岐桿菌穩(wěn)定性的影響。
于MRS培養(yǎng)基(Difco)中培養(yǎng)嬰兒雙岐桿菌培養(yǎng)物，將發(fā)酵劑冷卻至12℃并調(diào)節(jié)其pH值至6.0。冷卻后，通過離心濃縮發(fā)酵液細菌10-20倍，添入添加劑，之后通過滴注濃縮培養(yǎng)物至液態(tài)氮快速冷凍(A培養(yǎng)物)或于冷凍機控制冷卻確保冷卻速度約1℃/分鐘至達到-50℃而緩慢冷凍(B培養(yǎng)物及C培養(yǎng)物)。在如“材料與方法”部分所述進行活力測定(CFU測定)之前，于-50℃保存培養(yǎng)物至次日(約18小時)。本實驗顯示與嬰兒雙岐桿菌快速冷凍培養(yǎng)物(A培養(yǎng)物)相比，緩慢冷凍培養(yǎng)物(B培養(yǎng)物)的活力顯著下降。重要的是，本實驗進一步表明根據(jù)本發(fā)明冷凍(C培養(yǎng)物)之前添加兩種添加劑(3％ w/w IMP及2％ w/w次黃嘌呤核苷)的組合物，緩慢冷凍培養(yǎng)物的CFU數(shù)與快速冷凍培養(yǎng)物幾乎相等。
我們推斷對于緩慢冷凍的嬰兒雙岐桿菌3％ w/w IMP及2％ w/w次黃嘌呤核苷的組合物作為冷凍保護劑是有效的。
實施例15不同添加劑對冷凍發(fā)酵劑F-DVSTM CH-N 19穩(wěn)定性的影響
本實施例描述了添加及未添加不同添加劑(可作為冷凍保護劑)的CH-N 19培養(yǎng)物的冷凍直投式發(fā)酵劑(F-DVSTM)的穩(wěn)定性。
發(fā)酵之后，由F-DVSTM CH-N 19發(fā)酵液收獲細菌并通過離心進行濃縮。將細菌濃縮物分成幾份，如圖中所示添加各種發(fā)酵劑。圖中各種發(fā)酵劑的濃度以每g濃縮菌％w/w給出。
將添加劑與細菌濃縮物混合30分鐘，于液態(tài)氮內(nèi)滴加冷凍，于-50℃保存。
于-50℃保存1天(圖13)及6天(圖14)后以酸化活性測定在牛奶(LAB奶)中的培養(yǎng)活性?；钚詼y定以0，005％ w/v接種物為基礎，30℃培養(yǎng)6小時。
如實施例12所示，本實驗還顯示不同的添加劑對冷凍發(fā)酵劑的穩(wěn)定性具有不同的影響作用。有趣的是，本實驗顯示腺苷及腺苷-5′-一磷酸對發(fā)酵劑的活性有害。本實驗還證明3％ w/w甲酸鈉對冷凍發(fā)酵劑的活性是有害的。
實施例16添加IMP及次黃嘌呤核苷(實施例15)的CH-N 19TM用于Gouda 45+乳酪生產(chǎn)的試驗
Gouda 45+乳酪于150g乳酪槽中的生產(chǎn)
1.牛奶
全脂牛奶來自Borup Dairy(丹麥)，已于72℃巴氏消毒15秒(有機奶，76-78℃消毒15秒)并冷卻至5℃。蛋白含量為3.4-3.7％(正常)。所接收的牛奶于Milkoscanner(Foss Electric A/S，Hillerd，丹麥)分析脂肪及蛋白百分含量(％)。測量牛奶溫度，取樣進行微生物學分析。至使用前牛奶保存于冷室。
2.標準化
Gouda 45+生產(chǎn)用牛奶脂肪含量應為3.00％(蛋白含量為3.4％)，終乳酪干品中脂肪含量將為45％。使用本領域標準方法計算脂肪蛋白比例。乳酪牛奶通過添加計算量的奶油或脫脂乳進行標準化。標準化之后，于熱交換器內(nèi)預熱牛奶至32℃的預熟化溫度，倒入乳酪槽內(nèi)。持續(xù)緩慢攪動(235rpm)至牛奶中的粗制凝乳酶分散開。
3.CaCl2及硝酸鉀
硝酸鉀添加濃度為0.020％，即每150kg牛奶30g。CaCl2于牛奶中的添加量為每150kg牛奶0-20g(如需要可以34％溶液添加)。
4.發(fā)酵劑
本實驗中，生產(chǎn)4批并進行對比。第一組批中，每一批接種冷凍前添加IMP及次黃嘌呤核苷的0.005％ F-DVS CH-N 19(1B批)。對照批接種未添加IMP及次黃嘌呤核苷的0.01％ F-DVS CH-N 19(1A批)。第二組批接種冷凍前添加IMP及次黃嘌呤核苷的0.005％ F-DVS CH-N 19(2B批)。對照批接種未添加IMP及次黃嘌呤核苷的0.01％F-DVS CH-N 19(2A批)。在添加粗制凝乳酶之前，使發(fā)酵劑于32℃生長35分鐘。
5.粗制凝乳酶
以0.022％ w/w(每150kg30.0g)添加粗制凝乳酶CHY-MAX Plus(200IMCU/mL)。粗制凝乳酶于使用前以清潔冷自來水稀釋達3倍體積。添加粗制凝乳酶之后持續(xù)攪拌(235rpm)不超過1分鐘，將攪拌器從槽內(nèi)移除。添加粗制凝乳酶35分鐘后可以看到牛奶已經(jīng)凝固。
Gouda 45+的制造
牛奶的凝固正常情況下需要30-45分鐘。由繩線之間為5mm的切割器切凝塊，在乳酪槽內(nèi)首先水平運行切割器，接著垂直運行切割器。然后沿槽邊垂直切割凝塊三次，直至得到5mm的立方塊。此時小心處理凝塊，以使乳清的損失最小化。將攪拌器置于槽內(nèi)，預先緩慢攪拌(350rpm)凝塊15-20分鐘，之后，排出45kg乳清，然后調(diào)整攪拌器至較快攪拌水平(415rpm)20分鐘。于20分鐘內(nèi)將第一組批的溫度提高至38℃開始燙熱，第二組批溫度提高至40℃開始熱燙。需要緩慢、平穩(wěn)及控制性的溫度增加。達到38℃或40℃之后，進行攪拌，總攪拌時間共85分鐘(即38℃或40℃時為35-45分鐘)。
6.壓榨
攪拌95分鐘之后，移除攪拌器，將凝塊置于槽內(nèi)。使用預壓板預壓使對凝塊的作用壓力達2.5bar30分鐘。預壓之后，將凝塊切成兩塊。將干酪塊放于合適的模具(30×30cm)中，邊向與預壓過程相同。將模具置于壓榨機械中，以2bar壓榨20分鐘，后以4-6bar壓榨1-2小時。壓制結束后，測量干酪的高度，稱重，鑒定及測量pH值。最后，保存干酪于模具中至pH值達5.7，之后直接于鹽水中加鹽。
7.加鹽
于20％ NaCl+0.25％ CaCl2的鹽水10-12℃加鹽20-24小時，使最終干酪的含鹽量為1.7％。重要的是在鹽水加鹽過程中適當分離干酪并沒于鹽水中以獲得所需的鹽濃度。加鹽之后，包裝前使干酪干燥1-2小時。
8.包裝
包裝前，以游霉素(300ppm水溶液)噴灑干酪，然后以Cryovac塑料袋(BK1L)真空包裝，放入硬塑料盒(30×30cm)內(nèi)。包裝之后，塑料盒于14℃貯存4周，之后于5-8℃貯存。
發(fā)酵條件
第1組批
A.)添加IMP及次黃嘌呤核苷的F-DVS CH-N 19實驗發(fā)酵劑
熱燙溫度38℃、接種0.005％
于水中 16:00
于鹽水中17:15鹽水21％ NaCl，pH值5.2，溫度11.5℃ 5.48
出鹽水 15:45 22.5h
預壓2.5bar 30分鐘
30小時后的pH值 5.21
B.)未添加IMP及次黃嘌呤核苷的F-DVS CH-N 19對照發(fā)酵劑熱燙溫度38℃、接種0.01％
于水中 15:30
于鹽水中16:45鹽水21％ NaCl，pH值5.2，溫度11.5℃ 5.70
出鹽水 15:15 22.5h
預壓2.5bar 30分鐘
30小時后的pH值 5.20
第2組批
A.)添加IMP及次黃嘌呤核苷的F-DVS CH-N 19實驗發(fā)酵劑熱燙溫度40℃、接種0.005％
于水中 16:00
于鹽水中19:00 5.60
出鹽水 17:30 22.5h
預壓2.5 bar 30分鐘
30小時后的pH值 5.22
B.)未添加IMP及次黃嘌呤核苷的F-DVS CH-N 19對照發(fā)酵劑熱燙溫度40℃、接種0.01％
于水中 15:30
于鹽水中19:00 鹽水21％ NaCl，pH值5.2，溫度11.5℃ 5.84
出鹽水 17:30 22.5h
預壓2.5bar 30分鐘
30小時后的pH值5.32
結果
8周以后對干酪進行評價。確定化學分析以確保處于此類干酪4周需要量的范圍內(nèi)(含水量、含鹽量、脂肪含量)。還進行干酪的感官評價以確保其具有合適的眼孔形狀、結構及香味。
對于干酪制品進一步進行下列缺陷分析
1.)外部缺陷(形狀、表皮、顏色、香味)
2.)內(nèi)部缺陷(顏色、結構、一致性)
3.)香味及味道缺陷
對各批制品進行評分(使用數(shù)字0、3、6、8、9、10、11、12或13)。最佳為13。
第一組批
1A.)熱燙溫度38℃的對照槽406F-DVS CHN-19
·眼孔形狀好，11分。
·香味好、純凈，11分。
·味道為Gouda，非常好，11分(奶油味、微酸咸、質(zhì)硬)。
1A.)407槽添加IMP及次黃嘌呤核苷的F-DVS CHN-19，熱燙溫度為38℃
·眼孔形狀好，11分。
·香味好、純凈，11分。
·味道為Gouda，非常好，11分(奶油味、微酸咸、質(zhì)硬)。
·與現(xiàn)有的發(fā)酵劑無差異并檢測到試驗發(fā)酵劑。
第二組批
2A.)對照槽404F-DVS CHN-19，熱燙溫度40℃
·眼孔形狀不太理想，眼孔太小，9分。
·香味好、純凈，11分。
·味道為Gouda，非常好，11分(奶油味、稍咸但很好)，11分。
2B.)405槽添加IMP及次黃嘌呤核苷的F-DVS CHN-19，熱燙溫度為38℃
·眼孔形狀稍優(yōu)于其它幾批，但仍期望較大的洞孔，11分。
·香味好、純凈，11分。
·味道為Gouda，稍咸但非常好，11分。
·與現(xiàn)有的發(fā)酵劑無差異并檢測到試驗發(fā)酵劑。
實施例17于F-DVS R-604添加IMP及次黃嘌呤核苷用于Cheddar干酪生產(chǎn)的試驗于150kg干酪槽生產(chǎn)Cheddar干酪的標準說明
Cheddar是生產(chǎn)最為廣泛的干酪，最初僅于英國制造，但現(xiàn)在遍布全世界，主要于澳大利亞、加拿大、愛爾蘭、紐西蘭及美國。Cheddar干酪制造基本原則在所有國家仍為相同，變更很少。
其顏色范圍為淡黃色至深黃色。某些情況下添加胭脂樹紅以產(chǎn)生橙色/紅色。結構堅固、致密，切割時不碎。大多數(shù)Cheddar成熟3-5月時售出且味道很清淡。好的Cheddar干酪咬入口中時具有堅果樣風味，9-12之后成熟最佳。
本操作程序描述傳統(tǒng)Cheddar制造過程，用于確定添加IMP及次黃嘌呤核苷對發(fā)酵劑接種物的冷凍保護作用。
3.牛奶
牛奶從Borup Dairy(丹麥)訂購，為全脂牛奶，約72℃(162°F)巴氏消毒15秒，然后冷卻至約30-32℃。要制造有色Cheddar時于每50001牛奶中添加475-600ml Chr.Hansen’s Annatto A320WS。制備同批次的發(fā)酵劑以比較添加IMP及次黃嘌呤核苷對F-DVS R-604的冷凍保護作用。
4.發(fā)酵劑
未添加IMP及次黃嘌呤核苷冷凍保存的F-DVS R-604對照發(fā)酵劑(第1批)作為接種物，濃度為750g/5000升發(fā)酵劑。添加IMP及次黃嘌呤核苷冷凍保存的F-DVS R-604試驗發(fā)酵劑(第2批)作為接種物，濃度為500g/5000升發(fā)酵劑。
5.粗制凝乳酶
于每一批添加粗制凝乳酶CHY-MAX Powder Extra，添加量為每100l牛奶2.5-3g。添加粗制凝乳酶之后，30-45分鐘內(nèi)形成凝膠。
6.Cheddar干酪的制造
下列操作程序對于檢測的每一批盡可能相近。將凝塊切成5×5mm大小的立方體。40-50分鐘提高溫度至約38-40℃，依據(jù)所需的含水量攪拌凝塊與乳清30-50分鐘。
7.Cheddaring
分離凝塊與乳清，使凝塊融化，然后將凝塊“Cheddared”，將融化的凝塊切成小塊，每10-15分鐘翻轉一次，當小塊的乳清酸度達pH值5.5-5.6時，磨碎凝塊，將大的干酪塊切成手指大小的碎塊。
8.加鹽
于凝塊添加約2％的鹽，使干酪中最終的鹽濃度為1.6-1.8％(含水量為4.5-5％)。
9.包裝
成型與壓榨在部分真空下以快速機械壓榨方式于塔式裝置內(nèi)進行，干酪形成20kg的塊狀，真空包裝于塑料袋內(nèi)。根據(jù)所需風味的強度(即清淡或濃郁)，于7-10℃成熟3-12個月。
結論
對于每批所生產(chǎn)的Cheddar干酪將比較其味道、結構及其它特征以確定以IMP及次黃嘌呤核苷冷凍保護的接種物對最終的Cheddar干酪制品有無影響。含IMP及次黃嘌呤核苷混合物的接種物生產(chǎn)的干酪其特征實際上與無IMP及次黃嘌呤核苷混合物的接種物生產(chǎn)的干酪相同。本發(fā)明另一個優(yōu)點是如果濃縮接種物含有IMP及次黃嘌呤核苷混合物則其使用量可以減少。
實施例18于F-DVS ST-M3添加IMP及次黃嘌呤核苷用于Cottage干酪生產(chǎn)的試驗于150kg干酪槽生產(chǎn)Cottage干酪的標準說明
Cottage干酪在注重體重的英國及美國是非常受歡迎的低脂軟干酪。純Cottage干酪非常清淡，所以通常添加細香蔥、洋蔥等使制品具有風味。使用了Cottage干酪制造的兩種方法短設定方法和長設定方法，提供了兩種方法的內(nèi)容。短設定方法馬上描述，接著于第五部分描述長設定方法。
1.牛奶
牛奶從Borup Dairy(丹麥)訂購，為全脂牛奶，經(jīng)約72℃(162°F)巴氏消毒15秒，然后冷卻至約34℃
2.發(fā)酵劑
對于短設定方法，未添加IMP及次黃嘌呤核苷冷凍保存的F-DVS ST-M3對照發(fā)酵劑(第1批)作為接種物，濃度為2500g/5000升發(fā)酵劑。添加IMP及次黃嘌呤核苷冷凍保存的F-DVS ST-M3試驗發(fā)酵劑(第2批)作為接種物，濃度為2000g/5000升發(fā)酵劑。
3.粗制凝乳酶
于每一批添加粗制凝乳酶CHY-MAX Powder Extra，添加量為每5000l牛奶0.2-0.5g。
4.Cottage干酪的制造
下列操作程序對于檢測的每一批盡可能相近。培養(yǎng)牛奶4.5-5小時至pH值達到4.65-4.8，將凝塊切成約12mm大小相等的立方體，靜置10-15分鐘，輕輕攪拌凝塊，60-75分鐘內(nèi)達到55-58℃開始熱燙。當凝塊足夠堅硬時，排出乳清。凝塊如下清洗及排放三次
首先，以13-15℃水清洗以降低凝塊溫度至29-32℃。其次，以13-15℃水清洗以降低凝塊溫度至18℃。最后，以2-5℃水清洗以降低凝塊溫度至2-5℃。最終排放之后，以甜味或發(fā)酵調(diào)味品調(diào)和凝塊，調(diào)味品以各種奶油、牛奶及脫脂奶粉制品制造。
5.長設定方法
除發(fā)酵劑接種濃度，培養(yǎng)溫度及培養(yǎng)時間外，程序與短設定方法相似。對于長設定方法，未添加IMP及次黃嘌呤核苷冷凍保存的F-DVS ST-M3對照發(fā)酵劑(第1批)作為接種物，濃度為500g/5000升發(fā)酵劑。添加IMP及次黃嘌呤核苷冷凍保存的F-DVS ST-M3試驗發(fā)酵劑(第2批)作為接種物，濃度為300g/5000升發(fā)酵劑。較低的接種濃度及20-22℃培養(yǎng)溫度將導致達到預期終點pH值所需培養(yǎng)時間較長(正常情況下需要14-18小時)。
結論
對于每一批所生產(chǎn)的Cottage干酪將比較其味道、結構及其它特征以確定以IMP及次黃嘌呤核苷冷凍保護的接種物對最終的Cottage干酪制品有無影響。含IMP及次黃嘌呤核苷混合物的接種物生產(chǎn)的干酪其特征實際上與無IMP及次黃嘌呤核苷混合物的接種物生產(chǎn)的干酪相同。本發(fā)明另一個優(yōu)點是如果濃縮接種物含有IMP及次黃嘌呤核苷混合物則其使用量可以減少。
實施例19于F-DVS ST-M3添加IMP及次黃嘌呤核苷用于MozzareHa/Pizza干酪生產(chǎn)的試驗
于150kg干酪槽生產(chǎn)MozzareHa/Pizza干酪的標準說明
此類型Mozzarella主要用作Pizza干酪。由于較松軟Mozzarella干酪堅硬，所以較容易磨碎。不同類型的Mozzarella干物中水及脂肪含量不同。部分脫脂、低含水量Mozzarella常用作Pizza干酪。在凝塊與熱水混合及拉伸之前常將其發(fā)酵至pH值5.0-5.2。發(fā)酵劑的選擇對Pizza干酪的特性(即拉伸、褐色、熔化及脫油)影響較大。
1.牛奶
牛奶從Borup Dairy(丹麥)訂購，為全脂牛奶，約72℃(162°F)巴氏消毒15秒，然后冷卻至約36-38℃。
2.發(fā)酵劑
未添加IMP及次黃嘌呤核苷冷凍保存的F-DVS ST-M3對照發(fā)酵劑(第1批)作為接種物，濃度為750g/5000升發(fā)酵劑。添加IMP及次黃嘌呤核苷冷凍保存的F-DVSST-M3試驗發(fā)酵劑(第2批)作為接種物，濃度為500g/5000升發(fā)酵劑。發(fā)酵劑于35-38℃培養(yǎng)30-45分鐘。
3.粗制凝乳酶
于每一批添加粗制凝乳酶CHY-MAX Powder Extra，添加量為每1001牛奶1-3g。
4.Mozzarella干酪的制造
下列操作程序對于檢測的每一批盡可能相近。將凝塊切成5-8mm大小的立方體并復原5分鐘。然后攪拌下提高溫度至約40-43℃15-20分鐘，然后使用Cheddar凝塊制作方法處理干酪，排出所有乳清，將凝塊切成小塊，發(fā)酵過程中翻動干酪塊。于pH值5-5.25磨碎凝塊。當達到預期pH值時，將干酪放入拉伸機械中，以75-80℃熱水混合。此過程約需10-15分鐘，凝塊溫度至約58-65℃。將拉伸干酪成型并立即以冷水冷卻至5-10℃，以中止進一步的酸化。使用10℃或更低溫度的飽和鹽水浸沒干酪。
對于每批所生產(chǎn)的Mozzarella/Pizza干酪將比較其味道、結構及其它特征以確定以IMP及次黃嘌呤核苷冷凍保護的接種物對最終的Mozzarella/Pizza干酪制品有無影響。含IMP及次黃嘌呤核苷混合物接種物生產(chǎn)的干酪其特征實際上與無IMP及次黃嘌呤核苷混合物的接種物生產(chǎn)的干酪相同。本發(fā)明另一個優(yōu)點是如果濃縮接種物含有IMP及次黃嘌呤核苷混合物則其使用量可以減少。
實施例20于F-DVS CH-N 11添加IMP及次黃嘌呤核苷用于Maasdammer干酪生產(chǎn)的試驗
于150kg干酪槽生產(chǎn)Maasdammer干酪的標準說明
Maasdammer為一種瑞士干酪，以荷蘭的Maas河命名。此干酪具有較大的眼孔形狀，由于添加丙酸桿菌味道清淡及呈堅果味。
1.牛奶
牛奶從Borup Dairy(丹麥)訂購，為全脂牛奶，約72℃(162°F)巴氏消毒15秒或65-70℃熱處理20秒，然后冷卻至約30-32℃。
2.發(fā)酵劑
未添加IMP及次黃嘌呤核苷冷凍保存的F-DVS CH-N 11對照發(fā)酵劑(第1批)作為接種物，濃度為750g/5000升發(fā)酵劑。添加IMP及次黃嘌呤核苷冷凍保存的F-DVSCH-N 11試驗發(fā)酵劑(第2批)作為接種物，濃度為500g/5000升發(fā)酵劑。發(fā)酵劑于32℃培養(yǎng)10-40分鐘。
3.粗制凝乳酶
于每一批添加粗制凝乳酶CHY-MAX Powder Extra，添加量為每1001牛奶1-3g。
4.Maasdammer干酪的制造
約30-45分鐘形成凝膠。將凝塊切成5-7mm大小的立方體，緩慢攪拌15-25分鐘，約排出35-45％乳清，輕輕攪拌凝塊15分鐘。添加約60℃15-20％(起始體積)熱水，凝塊溫度約35-38℃，攪拌30-45分鐘。排出大部分乳清，于2-4kg/cm2輕壓凝塊15-30分鐘以排放剩余的乳清，將凝塊切成適于模具合適大小的小塊，輕壓模具20分鐘，接著4-6kg/cm2按壓1-2小時，將凝塊直接堆入pH值為5.6-5.7的冷鹽水，干酪的目標鹽濃度為1-1.5％。
對于每批所生產(chǎn)的Maasdammer干酪將比較其味道、結構及其它特征以確定以IMP及次黃嘌呤核苷冷凍保護的接種物對最終的Maasdammer干酪制品有無影響。含IMP及次黃嘌呤核苷混合物的接種物生產(chǎn)的干酪其特征實際上與無IMP及次黃嘌呤核苷混合物的接種物生產(chǎn)的干酪相同。本發(fā)明另一個優(yōu)點是如果濃縮接種物含有IMP及次黃嘌呤核苷混合物則其使用量可以減少。
實施例21于F-DVS CHN-12添加IMP及次黃嘌呤核苷用于Brie/Camembert干酪生產(chǎn)的試驗
于150kg干酪槽生產(chǎn)Brie/Camembert干酪的標準說明
穩(wěn)定的Brie/Camembert干酪不同于傳統(tǒng)的Brie/Camembert干酪，因為在凝塊制造末，其pH值最小值為4.9-5.4，而傳統(tǒng)Brie/Camembert干酪pH值最小值為4.6-4.8，干酪心的軟化不具有時間依賴性。使用白色模具以使干酪具有其特性、白色外皮及其味道。有兩種穩(wěn)定干酪pH值的主要方法
1.)穩(wěn)定-清洗凝塊，即去除乳糖，從而減少轉化為乳酸的糖量，這有助于達到預期的高pH值，對于穩(wěn)定的Brie/Camembert干酪，嗜溫型發(fā)酵劑和嗜熱型發(fā)酵劑均被使用(正常情況下嗜溫型發(fā)酵劑為30％，嗜熱型發(fā)酵劑為70％)。
2.)溶解-當pH值接近預期水平時，如通過加鹽或冷卻抑制發(fā)酵劑，此類型僅使用嗜熱型發(fā)酵劑制備，因與嗜溫型發(fā)酵劑相比嗜熱型發(fā)酵劑對低溫更為敏感。
1.牛奶
牛奶從Borup Dairy(丹麥)訂購，為全脂牛奶，約72℃(162°F)巴氏消毒15秒，然后冷卻至約35-37℃。
2.發(fā)酵劑
未添加IMP及次黃嘌呤核苷冷凍保存的F-DVS CH-N 12對照發(fā)酵劑(第1批)作為接種物，濃度為250g/5000升發(fā)酵劑。添加IMP及次黃嘌呤核苷冷凍保存的F-DVSCH-N 12試驗發(fā)酵劑(第2批)作為接種物，濃度為200g/5000升發(fā)酵劑。模具中每1000升引入3-5u的液體PCa 1、PCa 3或PCa FD，及0.5-1u的GEO CD1。
3.粗制凝乳酶
于每一批添加粗制凝乳酶CHY-MAX Powder Extra，添加量為每1001牛奶2.5-3g。
4.Brie/Camembert干酪的制造
約30-45分鐘形成凝膠。將凝塊切成10mm大小的立方體，排出40％的乳清，于40-45℃添加相同體積的水，靜置凝塊30-50分鐘，偶爾輕輕攪拌。從槽中舀取凝塊放入模具內(nèi)，1小時后第一次翻轉，3小時后第二次翻轉，8小時后第三次翻轉，從模具移除凝塊，浸沒于18％鹽水中。以每100公斤干酪1-2u的PCa 1、PCa 3或PCa FD噴灑干酪。于14-15℃及85％的相對濕度成熟1天，然后12℃及95％的相對濕度成熟8-10天。當霉菌生長滿意，干燥干酪表面，包裝，4℃保存。每一干酪以不透油的紙包裝，放于卡紙板盒或粗紙板盒中。
對于每批所生產(chǎn)的Brie/Camembert干酪將比較其味道、結構及其它特征以確定以IMP及次黃嘌呤核苷冷凍保護的接種物對最終的Brie/Camembert干酪制品有無影響。含IMP及次黃嘌呤核苷混合物接種物生產(chǎn)的干酪其特征實際上與無IMP及次黃嘌呤核苷混合物的接種物生產(chǎn)的干酪相同。本發(fā)明另一個優(yōu)點是如果濃縮接種物含有IMP及次黃嘌呤核苷混合物則其使用量可以減少。
實施例22于DVSTM FD-N添加IMP及次黃嘌呤核苷用于3升級發(fā)酵酪乳生產(chǎn)的試驗
發(fā)酵酪乳
建議配方
預處理
含0.5％脂肪的高品質(zhì)、標準化勻脂牛奶于槽中通過90℃巴氏消毒20分鐘進行預處理。
3％ w/w IMP及2％次黃嘌呤核苷作為穩(wěn)定劑添加至DVS FD-N濃縮培養(yǎng)物中，然后冷凍混合物。冷凍制品名稱現(xiàn)為F-DVSTM FD-N。
F-DVSTM FD-N培養(yǎng)物不添加IMP及次黃嘌呤核苷進行冷凍作為對照。所有F-DVSTM培養(yǎng)物使用前于-50℃保存2個月。
含IMP及次黃嘌呤核苷的DVS FD-N濃縮培養(yǎng)物用于接種牛奶，濃度為0.005％，25℃培養(yǎng)牛奶至3升發(fā)酵罐內(nèi)pH值約為4.5。未添加IMP及次黃嘌呤核苷冷凍的DVSTMFD-N的對照培養(yǎng)物以0.01％用于接種牛奶，25℃培養(yǎng)牛奶至3升發(fā)酵罐內(nèi)pH值約為4.5。
試驗號 培養(yǎng)物 接種量發(fā)酵時間至pH值
1 添加IMP及次黃嘌呤0.005％ 154.51
核苷的FD-N
2 未添加IMP及次黃嘌0.01％154.51
呤核苷的FD-N
后處理
當pH值達4.51，先于槽中用手工攪拌器攪拌制品，然后Ystral混和器55伏攪拌1分鐘。攪拌之后，將槽置于冷水浴中并以手工攪拌器定時攪拌下冷卻至18℃，然后將制品倒入瓶中，8℃保存。
結果
于第1天及第8天測定發(fā)酵酪乳的合適風味
第1天
添加IMP及次黃嘌呤核苷的FD-N新鮮、低CO2、香味好
未添加IMP及次黃嘌呤核苷的FD-N新鮮、低CO2、香味好
第8天
添加IMP及次黃嘌呤核苷的FD-N新鮮、低CO2、香味好
未添加IMP及次黃嘌呤核苷的FD-N高口感、新鮮、低CO2、香味好
對于添加IMP及次黃嘌呤核苷0.005％ F-DVS FD-N接種物，使用同樣的發(fā)酵時間和pH值以與未添加IMP及次黃嘌呤核苷的0.01％ F-DVS對比。添加IMP及次黃嘌呤核苷不會產(chǎn)生發(fā)酵酪乳的粘性或香味/風味的改變。
結果顯示如果接種物添加有IMP及次黃嘌呤核苷混合物，與未添加IMP及次黃嘌呤核苷的接種物相比，其量可以減半。無論使用實驗接種物還是對照接種物，所生產(chǎn)的干酪味道及結構方面的特征相似。
參考文獻
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權利要求
1.含有選自包括一種或多種核苷酸生物合成有關化合物或一種或多種任何此類化合物衍生物的組群的一種或多種冷凍保護劑的冷凍或冷凍干燥培養(yǎng)物。
2.根據(jù)權利要求1的培養(yǎng)物，其中所述的一種或多種冷凍保護劑選自包括嘌呤堿基、嘧啶堿基、核苷及核苷酸的組群。
3.根據(jù)權利要求1的培養(yǎng)物，其中所述的一種或多種冷凍保護劑為核苷或其衍生物。
4.根據(jù)權利要求3的培養(yǎng)物，其中所述的核苷為選自包括IMP、GMP及AMP的組群的核苷一磷酸。
5.根據(jù)權利要求3的培養(yǎng)物，其中所述的冷凍保護劑為IMP。
6.根據(jù)權利要求1、2或5的培養(yǎng)物，其中所述的一種或多種冷凍保護劑為除冷凍保護活性外還具有增強效應的一種介質(zhì)或介質(zhì)混合物。
7.根據(jù)權利要求1、2或5的培養(yǎng)物，其中所述的培養(yǎng)物含有約0.1％-20％(以冷凍物的％w/w表示)的冷凍保護劑或其混合物。
8.根據(jù)權利要求7的培養(yǎng)物，其中所述的培養(yǎng)物含有約2％-5％(以冷凍物的％w/w表示)的冷凍保護劑或其混合物。
9.根據(jù)權利要求1、2或5的培養(yǎng)物，其中所述的培養(yǎng)物由包括雙岐桿菌、短桿菌、丙酸桿菌、乳球菌、乳桿菌、鏈球菌、腸球菌、片球菌、明串珠菌、酒球菌(Oenococcusspp.)或真菌的組群的一種或多種微生物組成。
10.根據(jù)權利要求9的培養(yǎng)物，其中所述的培養(yǎng)物由一種或多種最適生長溫度約30℃的嗜熱菌組成。
11.根據(jù)權利要求10的培養(yǎng)物，其中所述的培養(yǎng)物由包括乳酸乳球菌、乳酸乳球菌乳脂亞種、腸膜樣明串珠菌乳脂亞種、戊糖片球菌、乳酸乳球菌乳亞種二乙酰乳酸(diacetylactis)變型、干酪乳桿菌干酪亞種及副酪乳桿菌副酪亞種的組群的一種或多種微生物組成。
12.根據(jù)權利要求1、2或5的培養(yǎng)物，其中所述的培養(yǎng)物由最適生長溫度約35℃-45℃的嗜熱菌組成。
13.根據(jù)權利要求12的培養(yǎng)物，其中所述的培養(yǎng)物由選自包括嗜熱鏈球菌、屎腸球菌、德氏乳桿菌乳亞種、瑞士乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種及嗜酸乳桿菌的組群的一種或多種嗜熱菌組成。
14.一種制備冷凍培養(yǎng)物的方法，包括如下步驟
i.于包括雙岐桿菌、短桿菌、丙酸桿菌、乳球、乳桿菌、鏈球菌、腸球菌、片球菌、明串珠菌、酒球菌(Oenococcus spp)或真菌的一種或多種活菌中添加冷凍保護劑，
ii.或真菌的一種或多種活菌中添加冷凍保護劑，
iii.冷凍含冷凍保護劑及一種或多種活菌的混合物以獲得冷凍物，及
iv.包裝冷凍物。
15.一種制備冷凍干燥培養(yǎng)物的方法，包括如下步驟
v.于包括雙岐桿菌、短桿菌、丙酸桿菌、乳球、乳桿菌、鏈球菌、腸球菌、片球菌、明串珠菌、酒球菌(Oenococcus spp)或真菌的一種或多種活菌中添加冷凍保護劑，
i.或真菌的一種或多種活菌中添加冷凍保護劑，
ii.冷凍含冷凍保護劑及一種或多種活菌的混合物以獲得冷凍物，
iii.從冷凍物中升華水以冷凍干燥材料，及
iv.包裝冷凍干燥物。
16.根據(jù)權利要求9的方法，其中所述的微生物為乳酸乳球菌，包括一種或多種乳酸乳球菌乳亞種及乳酸乳球菌乳脂亞種。
17.根據(jù)權利要求9的方法，其中所述的微生物為乳桿菌，包括嗜酸乳桿菌。
18.根據(jù)權利要求9的方法，其中所述的微生物為真菌，包括包括一種或多種青霉菌、隱球菌、德巴利酵母菌(Debraryomyces spp.)、柯里夫酵母菌(Klyveromyces spp.)及酵母菌。
19.根據(jù)權利要求14的方法，其中所述的微生物為乳酸乳球菌，包括一種或多種乳酸乳球菌乳亞種及乳酸乳球菌乳脂亞種。
20.根據(jù)權利要求14的方法，其中所述的微生物為乳桿菌，包括嗜酸乳桿菌。
21.根據(jù)權利要求14的方法，其中所述的微生物為真菌，包括一種或多種青霉菌、隱球菌、德巴利酵母菌(Debraryomyces spp.)、柯里夫酵母菌(Klyveromyces spp.)及酵母菌。
22.根據(jù)權利要求15的方法，其中所述的微生物為乳酸乳球菌，包括一種或多種乳酸乳球菌乳亞種及乳酸乳球菌乳脂亞種。
23.根據(jù)權利要求15的方法，其中所述的微生物為乳桿菌，包括嗜酸乳桿菌。
24.根據(jù)權利要求15的方法，其中所述的微生物為真菌，包括一種或多種青霉菌、隱球菌、德巴利酵母菌(Debraryomyces spp.)、柯里夫酵母菌(Klyveromyces spp.)及酵母菌。
25.一種生產(chǎn)發(fā)酵食品的方法，包括以權利要求1的培養(yǎng)物發(fā)酵前身物質(zhì)并獲得發(fā)酵食品。
26.根據(jù)權利要求25的方法，其中所述的發(fā)酵食品由乳類前身物質(zhì)生產(chǎn)。
27.根據(jù)權利要求26的方法，其中所述的發(fā)酵食品為酪乳。
28.根據(jù)權利要求26的方法，其中所述的發(fā)酵食品為選自Cheddar、Gouda、Cottage、Emmental、Grana、Mozzarella/Pizza、Maasdammer及硬Brie或硬Camembert的干酪。
29.根據(jù)權利要求2的培養(yǎng)物，其中所述的一種或多種核苷酸冷凍保護劑為次黃嘌呤核苷或其衍生物。
30.根據(jù)權利要求2的培養(yǎng)物，其中所述的一種或多種冷凍保護劑為核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種有助于保護冷凍或冷凍干燥微生物培養(yǎng)物穩(wěn)定性及代謝活性的新型冷凍保護劑，該冷凍保護劑由核苷酸生物合成有關化合物組成。本發(fā)明提供了微生物培養(yǎng)物的制備及使用方法。這些微生物培養(yǎng)物作為發(fā)酵劑用于食品及飼料產(chǎn)品的制造。本發(fā)明中的發(fā)酵劑包括乳酸菌(如乳酸乳球菌)及其它菌種的培養(yǎng)物。
文檔編號A23C19/00GK1816616SQ200480018890
公開日2006年8月9日 申請日期2004年7月2日 優(yōu)先權日2003年7月2日
發(fā)明者羅格·溫德爾·克林格拉姆, 尼爾斯·馬丁·索羅森, 彼德·索羅森 申請人:科·漢森有限公司