專利名稱：一種檢測禽流感病毒不同亞型cDNA的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測禽流感病毒的方法，尤其涉及一種利用基因芯片技術(shù)檢測禽流感病毒不同亞型cDNA的方法，屬于基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
流感病毒是屬于正粘病毒科的RNA病毒，只有A型流感病毒可以在自然條件下感染鳥類。A型流感病毒基因組含有8個單股負鏈RNA病毒節(jié)段，從禽類中分離到15個血凝素、9個神經(jīng)氨酸酶亞型。A型流感病毒感染家禽后根據(jù)致病力不同可以分為高致病力和低致病力病毒，高致病力毒株對禽有高度致死力，死亡率可高達100％，這些高致病力毒株均屬于H5和H7亞型，但不是所有的H5和H7亞型流感都是高致病力的毒株。低致病力毒株大多數(shù)屬于H9N2亞型，在全世界范圍引起廣泛的疾病綜合癥，H9N2病毒引起的病癥比H5和H7禽流感引起的病癥要溫和得多，主要局限于呼吸道癥狀，但是在其它疾病病原合并感染或環(huán)境因素的協(xié)同下，臨床癥狀可能嚴重得多。
基因芯片是指將大量的核酸分子以大規(guī)模陣列形式排布在很小的載玻片等載體上，通過與標記的樣品進行雜交，檢測雜交信號的強弱進而判斷樣品中被檢分子的數(shù)量。包被在固相載體上的核酸分子有序排列成微點陣(microarray)。目標是用于DNA序列的測定、基因表達譜鑒定、基因突變體的檢測分析，以及基因組的功能研究等。自DNA芯片首次報道以后，芯片技術(shù)對不同生物體的基因表達譜研究進行了改革，通過原位合成低聚核苷酸或者合成后自動點樣技術(shù)制成芯片，可以大規(guī)模分析基因的表達情況，最近還廣泛用于藥物篩選，突變的檢測，遺傳進化分析和基因組繪圖。由于芯片技術(shù)允許同時掃描成百上千的核苷酸序列，也顯示了作為一種診斷方法的巨大潛能(Gary vernet.DNA-chip technology and infectious diseases.VirusResearch，2002，8265-71；Kawaguchi K，Kaneko S，Honda M，Kawai H F，Shirota Y，Kobayashi K.Detection of hepatitis B virus DNA in sera from patientswith chronic hepatitis B virus infection by DNA microarray method.Journal ofClinical Microbiology，2003，41(4)1701-1704.)。
禽流感的診斷可以根據(jù)臨床癥狀、剖檢變化等做出初步診斷，實驗室確診需要依靠下述方法(1)病原分離和鑒定；(2)血清學方法檢測感染雞的抗體，常用的檢測抗體的技術(shù)包括血凝(HA)和血凝抑制(HI)試驗、瓊脂擴散試驗(AGP)、病毒中和試驗、神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(NI)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)等；(3)RT-PCR快速診斷技術(shù)。上述技術(shù)由于受到其自身特點限制，都不能實現(xiàn)快速、高通量處理樣品的要求，不適應(yīng)大規(guī)模檢疫、預(yù)報預(yù)測急性、烈性傳染病的需要。20世紀90年代興起的基因芯片技術(shù)則具備可以對成百上千、甚至上萬個基因進行同時檢測的優(yōu)勢，具有高通量和并行化特點。該技術(shù)一經(jīng)誕生就被廣泛應(yīng)用于基因表達、疾病診斷、基因多態(tài)性分析、發(fā)現(xiàn)新基因及藥物篩選等研究范疇，特別是在疾病診斷方面已獲得許多成功。應(yīng)用基因芯片技術(shù)可以在基因水平同時確定多個病原遺傳物質(zhì)的存在，提供一種處理一次樣品診斷鑒別流感病毒多種亞型的新方法。
目前國際上已有兩篇關(guān)于基因芯片技術(shù)在流感亞型鑒別上應(yīng)用的報道。(LiJ P，Chen S，David H.Evans.Typing and Subtyping Influenza Virus Using DNAMicroarrays.Journal of Clinical Microbiology，2001696-704；Sengupta S，Onodera K，Lai A，Melcher U.Molecular detection and identification of influenzaviruses by oligonucleotide microarray hybridization.Journal of ClinicalMicrobiology，2003，41(10)4542-4550.)。Jiping Li等應(yīng)用DNA芯片技術(shù)建立了一種模型，可以用來鑒別人流感的A、B型病毒和亞型。用RT-PCR方法制備500bp左右的流感病毒基因片斷，克隆，測序，重復(fù)擴增，點到玻片表面上做芯片。這些捕捉DNA包括血凝素(HA)、神經(jīng)氨酸酶(NA)和膜蛋白基因(M)的多個片段，Cy3-或Cy5-標記熒光樣品，與捕捉DNA雜交，掃描芯片，檢測探針結(jié)合位點。這種雜交模式中，捕捉DNA是固定位置的，信噪比為5～30，由于不同樣品DNA之間互補序列的限定，沒有檢測到非特異性雜交。有效雜交反應(yīng)條件要求至少100至150bp的同源性。Cy3-、Cy5-標記的DNAs可以進一步鑒別混合體系中擴增到的DNA。在其進一步的試驗中，借助若干針對A、B型流感的復(fù)合PCR引物，在芯片上可以鑒別以前未測序的流感分離株型和亞型。Sengupta S收集了476個代表流感病毒特異性的寡核苷酸點到玻璃載體上作為捕捉DNA，在RT-PCR過程中用熒光染料標記PCR產(chǎn)物，這個方法可正確鑒定型和血凝素亞型，并有可能同時檢測病毒混合體，但不能正確檢測NA基因亞型。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能夠準確檢測禽流感病毒不同亞型cDNA的高通量方法。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)途徑來實現(xiàn)的一種檢測禽流感病毒不同亞型cDNA的方法，主要包括以下步驟1)分別制備覆蓋禽流感病毒H5、H7、H9亞型及膜蛋白基因(M基因)的DNA片段，將所制備的DNA片段分別點到載體上制備成基因芯片備用，2)通過RT-PCR的方式將被檢禽流感病毒樣品的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，同時用熒光染料標記cDNA，3)將用熒光染料標記的被檢樣品cDNA與基因芯片雜交，根據(jù)雜交信號即可判定被檢禽流感病毒樣品的亞型。
上述制備方法中，將H5、H7、H9亞型血凝素(HA)全基因分為500bp左右的3個片段，經(jīng)過克隆測序，擴增，做為制備芯片的探針，并將探針的濃度調(diào)整在0.97～1.305μg·μl-1之間；所述的載體為氨基化玻璃載體；所述的標記被檢cDNA樣品的熒光染料為Cy5。
流感病毒8個基因節(jié)段3′端都有一個非常保守的12個核苷酸區(qū)域，本發(fā)明利用這一基序作為反轉(zhuǎn)錄引物，可以在一個反轉(zhuǎn)錄體系中同時得到這8個基因的cDNA混合產(chǎn)物，在芯片上固定區(qū)域點上流感病毒保守基因(M基因)、HA基因、NA基因，通過一次雜交反應(yīng)，能夠確定樣品中是否有流感病毒核酸以及病毒的亞型，芯片技術(shù)可以直接作為一種有效的流感診斷和亞型鑒別的方法。
本發(fā)明方法的一個重要改進之處是熒光標記的禽流感病毒被檢樣品cDNA不需要進行PCR擴增就直接與基因芯片雜交?，F(xiàn)有技術(shù)都是先對禽流感病毒RNA進行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA，接著需要利用特定引物通過PCR方法擴增cDNA，在PCR過程中標記，然后與芯片雜交，通過分析雜交信號，判定被檢材料中是否存在流感病毒核酸(Li J P，Chen S，David H.Evans.Typingand Subtyping Influenza Virus Using DNA Microarrays.Journal of ClinicalMicrobiology，2001696-704；Sengupta S，Onodera K，Lai A，Melcher U.Molecular detection and identification of influenza viruses by oligonucleotidemicroarray hybridization.Journal of Clinical Microbiology，2003，41(10)4542-4550.)。一般情況下，用特定引物擴增后，普遍用凝膠電泳分析PCR結(jié)果是否陽性，這時候再進行芯片雜交，根據(jù)芯片掃描信號判定PCR結(jié)果，與電泳分析相比，雖然可以提高準確率，但是要費很多時間，增加試驗消耗，并且不能體現(xiàn)芯片試驗的優(yōu)勢。本發(fā)明主要優(yōu)勢是利用cDNA直接與芯片雜交，減少了試驗環(huán)節(jié)，前面已經(jīng)提到流感病毒8個基因節(jié)段3′端都有一個非常保守的12個核苷酸區(qū)域，利用這一基序作為反轉(zhuǎn)錄引物，可以在一個反轉(zhuǎn)錄體系中同時得到包含流感病毒全部信息的cDNA混合產(chǎn)物，通過一次雜交反應(yīng)，確定樣品中是否有流感病毒以及病毒的亞型。如果采用PCR擴增后再進行芯片雜交的話，首先需要假定樣品中包含哪個亞型，例如H5亞型，用相對應(yīng)H5亞型特異引物擴增，擴增后，一般通過電泳判定結(jié)果，這時候如果進行芯片雜交分析PCR產(chǎn)物就比較繁瑣，體現(xiàn)不出芯片試驗的優(yōu)勢。PCR產(chǎn)物與芯片雜交方法的另一個缺點是，如果特異性引物擴增后出現(xiàn)目的片段，則可以繼續(xù)做芯片雜交，如果不出目的片段，則需要再換其他亞型引物，對于劃分為15個HA，9個NA亞型的流感病毒，需要至少做24次試驗，才能夠完成亞型鑒定工作。本發(fā)明則徹底改變這一設(shè)計，在一個反轉(zhuǎn)錄體系中同時得到包含流感病毒全部信息的cDNA混合產(chǎn)物，通過一次雜交反應(yīng)，確定樣品中是否有流感病毒以及病毒的亞型，節(jié)省時間和試驗消耗。
本發(fā)明選擇M基因捕捉A型流感的保守核酸，將H5、H7、H9亞型HA全基因分為500bp左右的3個片段，經(jīng)過克隆測序，擴增，做為制備芯片的探針，用來分析樣品的亞型。同時設(shè)NDV、IBDV、IBV為判斷基因芯片特異性的對照基因，設(shè)pUC18空載體作為系統(tǒng)的陰性對照。雜交后發(fā)現(xiàn)，H5、H7樣品的掃描圖像與預(yù)期結(jié)果完全一致；H9樣品雜交后，H7第一段500bp左右的探針出現(xiàn)假陽性熒光信號，這是由于這一區(qū)域內(nèi)兩段序列的同源性較高造成的，利用DNASIS 4.0軟件分析，7H1、9H1兩段的同源性為46.7％，然而，反過來用H7樣品與9H1雜交則沒有出現(xiàn)這種現(xiàn)象，通過改變雜交或洗片條件完全可以消除這種假陽性熒光信號。
試驗結(jié)果表明，本發(fā)明成功提供了一種在基因芯片上直接檢測流感病毒亞型的cDNA的方法，可以作為流感病毒亞型鑒別的一種新途徑，并且，還為流感、新城疫、傳染性法氏囊、傳染性支氣管炎等多種疾病的鑒別診斷提供可能。


圖1靶基因在芯片上的點樣位置。
1號為A型流感病毒M基因；2、3、4號為覆蓋H5亞型HA基因的cDNA片段；5、6、7號覆蓋H7亞型HA基因的cDNA片段；8、9、10號為覆蓋H9亞型HA基因；11、12、13號分別為新城疫、法氏囊、傳染性支氣管炎對照基因；14號為陰性對照pUC18片段。
圖2雜交后熒光掃描結(jié)果。
A.H5樣品；B.H7樣品；C.H9樣品。
以下通過實施例來進一步描述本發(fā)明的有益效果，應(yīng)該理解的是，這些實施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護范圍。
具體實施例方式一、材料和方法1、試驗材料
1.1病霉本研究中所使用的毒株由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動物流感重點開放實驗室提供[僅用于說明本發(fā)明的實施原理，可以選用其它任何流感病毒株替代，這些病毒可以從感染禽體內(nèi)自行分離(分離方法參考以下文獻唐秀英，田國斌，趙傳刪，周金法，于康震.中國禽流感流行株的分離鑒定.中國畜禽傳染病，1998年20卷第1期，1-5；余衍亮，孫秀明，李國民，雷億群，童青華，張惠敏，吉慶平.3種分離流感病毒方法的比較分析.海軍醫(yī)高專學報，1999第21卷第2期82-83)，或通過商業(yè)途徑購買(中國科學院武漢病毒所病毒保藏號6.0007，6.0008，6.0009)或者向從事該研究工作國內(nèi)外科研人員申請贈送(參考以下文獻陳化蘭，于康震，田國斌，唐秀英，盧景良.禽流感病毒血凝素基因的克隆及其DNA疫苗的免疫原性.中國獸醫(yī)學報，1997年17卷第6期555-558)]在10日齡SPF雞胚上增殖，病毒序列在GeneBank中的相關(guān)序列號見表1表1本發(fā)明中使用的禽流感病毒

1)__表示在GenBank中沒有登錄2引物制備捕捉DNA的寡核苷酸引物用Oligo，version 4.1設(shè)計，并在GenBank中分析序列的匹配情況。設(shè)計好的引物由寶生物技術(shù)有限公司(大連)合成，未進一步純化，見表2。
表2本發(fā)明所用引物

2、試驗方法2.1RNA的提取按說明書進行。250μl病毒液，加入750μl TRIzol，震蕩，混合，室溫放置5min，繼續(xù)加入200μl氯仿，震蕩，混合，室溫放置1～2min，12000r/min離心15min，把上清液移入另一個1.5ml離心管中，繼續(xù)加入500μl異丙醇，室溫下沉淀15～30min，12000r/min離心15min，棄上清，用75％酒精洗沉淀，抽真空干燥，加入20μl DEPC處理水溶解，-70℃保存，備用。
2.2RT-PCR取5μl RNA，加1μl反轉(zhuǎn)錄引物，70℃解鏈5min，取出后放置冰上，繼續(xù)加入5×First Buffer 4μl、0.1mol·L-1DTT 2μl、dNTPs 2μl、M-MLV 1μl、RNasin 1μl、DEPC水4μl，37℃水浴1h，合成cDNA鏈。PCR為50μl體系，包括反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μl、上下游引物各0.5μl、10×Buffer 5μl、dNTPs 2μl、Taq酶0.5μl、水39.5μl，循環(huán)參數(shù)為95℃ 5min，94℃ 1min，52℃ 1min，72℃ 1min，循環(huán)35次，72℃延伸6min結(jié)束。1％瓊脂凝膠電泳分析。
2.3用于點樣DNA的制備分別擴增用于檢測A型流感病毒M基因的1號，覆蓋H5亞型HA基因的2、3、4號，覆蓋H7亞型HA基因的5、6、7號，覆蓋H9亞型HA基因的8、9、10號，新城疫、法氏囊、傳染性支氣管炎對照基因11、12、13號，以及陰性對照pUC18片段14號，回收，連接，轉(zhuǎn)化，鑒定后獲得陽性質(zhì)粒。通過質(zhì)粒PCR，無水乙醇沉淀，獲得高濃度捕捉DNA，調(diào)整捕捉DNA濃度在1μg·μl-1左右，本試驗中靶DNA濃度在0.97～1.305μg·μl-1之間(見表3)，預(yù)備用于芯片制備。
表3用于制備芯片的DNA濃度

2.4制備芯片將捕捉DNA點到玻璃芯片上，獲得基因芯片，捕捉DNA在芯片上的排列如圖1所示。
2.5被檢樣品處理和雜交用已知的A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)、A/African starling/983/79(H7N1)和A/Turkey/Wisconsin/1/66(H9N2)雞胚尿囊液為樣品，TRIzol試劑盒法提取病毒RNA，經(jīng)測定其濃度分別為2.12、1.72、1.88μg·μl-1(表4)。
表4樣品RNA濃度

以通用引物Uni12為反轉(zhuǎn)錄引物，在反轉(zhuǎn)錄過程中用Cy5熒光染料標記樣品cDNA，通過純化去除未標記的dUTP-Cy5分子，將純化后帶有熒光標記的cDNA置于芯片上，42℃雜交箱內(nèi)雜交過夜(16～18h)，洗片，掃描圖像分析試驗結(jié)果。
二、試驗結(jié)果將H5樣品提取RNA，反轉(zhuǎn)錄并用Cy-5熒光染料標記，與試驗芯片雜交后，結(jié)果見圖2。M(1號)、5H1(2號)、5H2(3號)、5H3(4號)基因的探針位置出現(xiàn)陽性熒光信號(圖2-A)，與預(yù)期結(jié)果完全一致；H7樣品的Cy-5熒光標記反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與實驗芯片雜交后，M(1號)、7H1(5號)、7H2(6號)、7H3(7號)基因的探針位置出現(xiàn)陽性熒光信號(圖2-B)，與預(yù)期結(jié)果完全一致；H9樣品的Cy-5熒光標記反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與實驗芯片雜交后，M(1號)、7H1(5號)、9H1(8號)、9H2(9號)、9H3(10號)基因的探針位置出現(xiàn)陽性熒光信號(圖2-C)，與預(yù)期結(jié)果不完全一致，7H1位置出現(xiàn)假陽性信號，這是由于這一區(qū)域內(nèi)兩段序列的同源性較高造成的，利用DNASIS 4.0軟件分析，7H1、9H1兩段的同源性為46.7％，然而，反過來用H7樣品與9H1雜交則沒有出現(xiàn)這種現(xiàn)象，通過改變雜交或洗片條件完全可以消除這種假陽性熒光信號。
權(quán)利要求
1.一種檢測禽流感病毒不同亞型cDNA的方法，主要包括以下步驟1)分別制備覆蓋禽流感病毒H5、H7、H9亞型及M基因的DNA片段，將所制備的DNA片段點到載體上制備成基因芯片備用，2)通過反轉(zhuǎn)錄方式將被禽流感病毒檢病毒樣品的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并用熒光染料標記cDNA，3)將用熒光染料標記的禽流感病毒被檢樣品cDNA片段與基因芯片雜交，根據(jù)雜交信號結(jié)果即可判定被檢禽流感病毒樣品的亞型。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征是步驟1)中將H5、H7、H9亞型HA全基因分為500bp左右的3個片段，經(jīng)過克隆測序，擴增，做為制備芯片的探針。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征是步驟3)中熒光標記的禽流感病毒被檢樣品cDNA直接與基因芯片雜交，不需要進行PCR擴增。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新的檢測禽流感病毒不同亞型cDNA的方法，步驟如下分別制備覆蓋禽流感病毒H5、H7、H9亞型及M基因的DNA片段，將所制備的DNA片段點到氨基包被的玻璃載體上制備成基因芯片備用；通過反轉(zhuǎn)錄將被檢病毒樣品的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，在這個過程中用熒光染料標記cDNA；將用熒光染料標記的被檢樣品cDNA片段與基因芯片雜交，根據(jù)雜交信號結(jié)果即可判定被檢禽流感病毒樣品的亞型。本發(fā)明成功提供了一種在基因芯片上直接檢測流感病毒亞型cDNA的方法，該方法中熒光標記的禽流感病毒被檢樣品cDNA直接與基因芯片雜交，不需要進行PCR擴增，具有步驟簡捷、準確率高等優(yōu)點，可以作為流感病毒亞型鑒別的一種新途徑。
文檔編號C12Q1/68GK1796575SQ20041010293
公開日2006年7月5日 申請日期2004年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月30日
發(fā)明者王秀榮, 于康震, 陳華蘭, 鄧國華, 劉麗玲, 孔憲剛, 喬傳玲, 姜永萍 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所