專利名稱：肽甲硫氨酸亞砜還原酶的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白酶的新用途，特別涉及肽甲硫氨酸亞砜還原酶的新用途。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中某些氨基酸的氧化和還原是生物體內(nèi)對(duì)蛋白功能的一種調(diào)控方式。甲硫氨酸(Met)被氧化則變?yōu)榧琢虬彼醽嗧?Met(O))，它可導(dǎo)致所在蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性降低或喪失。
肽甲硫氨酸亞砜還原酶(Peptide methionine sulfoxide reductase，MsrA)是一種高度保守的蛋白酶，它能夠催化多肽鏈中或細(xì)胞中自由的甲硫氨酸亞砜還原成甲硫氨酸，從而修復(fù)氧化損傷的蛋白。同時(shí)MsrA可以作為體內(nèi)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶，通過蛋白中甲硫氨酸的氧化還原來調(diào)節(jié)蛋白的生理活性；還可以作為抗氧化酶，通過體內(nèi)甲硫氨酸的氧化還原循環(huán)而清除活性氧。
蛋白錯(cuò)誤折疊能夠?qū)е掳柶澓Ｄ习Y、傳播性海綿狀腦病和肌萎縮性(脊髓)側(cè)索硬化等許多疾病。因此抑制蛋白錯(cuò)誤折疊，阻止蛋白聚集與變性是防止這些蛋白錯(cuò)誤折疊病的有效方法。
超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，簡(jiǎn)稱SOD)為氧自由基的天然清除劑，具有防止細(xì)胞過度氧化，延緩生命衰老的生理功能。SOD是一種金屬酶類，根據(jù)所含金屬輔基不同，分為Cu/Zn-SOD，F(xiàn)e-SOD，Mn-SOD和Ni-SOD四類。
在肌萎縮性(脊髓)側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis)患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量人Cu/Zn-SOD突變體。目前認(rèn)為這些突變蛋白在體內(nèi)形成蛋白聚集而產(chǎn)生的毒性是導(dǎo)致肌萎縮性(脊髓)側(cè)索硬化的主要原因。
檸檬酸合成酶是三羧酸循環(huán)中的一個(gè)關(guān)鍵酶，但該蛋白熱穩(wěn)定性極低。體外在43℃會(huì)很快變性聚集進(jìn)而沉淀。其聚集過程可以用光散射的變化反映出來。
酵母Sup35蛋白是導(dǎo)致瘋牛病朊病毒的模型蛋白，這類蛋白在動(dòng)物和人體內(nèi)能夠?qū)е翪reutzfeldt-Jacob疾病、牛海綿狀腦病、羊搔癢病。Sup35蛋白很容易錯(cuò)誤折疊而形成纖維，其纖維形成可以通過工熒光發(fā)射的變化來檢測(cè)。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供肽甲硫氨酸亞砜還原酶的新用途。
研究表明，甲硫氨酸亞砜還原酶具有防止蛋白質(zhì)聚集、蛋白質(zhì)變性以及蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊的功能。
其中，在防止蛋白質(zhì)變性中，所述變性可由物理因素和/或化學(xué)因素引起。所述物理因素包括熱，紫外線照射，高壓和表面張力等。所述化學(xué)因素包括有機(jī)溶劑，脲、胍，酸和堿等。
實(shí)驗(yàn)證明，MsrA在體內(nèi)能夠有效防止人Cu/Zn-SOD的聚集，因而阻止人Cu/Zn-SOD形成蛋白聚集、減少毒性產(chǎn)生，從而防止肌萎縮性(脊髓)側(cè)索硬化的發(fā)生；MsrA防止檸檬酸合成酶不被熱變性，減緩正常蛋白的熱變性過程，因而保護(hù)體內(nèi)蛋白正常生理功能的發(fā)揮；MsrA具有很強(qiáng)的抑制酵母Sup35蛋白纖維形成的能力，表明MsrA在防止和治療人瘋牛病中具有應(yīng)用前景。本發(fā)明為肽甲硫氨酸亞砜還原酶的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了更加廣闊的空間。


圖1為MsrA對(duì)人Cu/Zn-SOD聚集的抑制曲線圖2為不同濃度MsrA對(duì)人Cu/Zn-SOD聚集的抑制作用曲線圖3為MsrA對(duì)檸檬酸合成酶熱變性的抑制作用曲線圖4為不同濃度MsrA對(duì)檸檬酸合成酶熱變性的抑制作用柱狀5為MsrA對(duì)Sup35蛋白纖維形成的抑制作用柱狀圖具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、體外表達(dá)和純化MsrA通過常規(guī)PCR方法從含有MsrA基因的質(zhì)粒pQE30L/MsrA(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1997，949585-9589)中擴(kuò)增該基因。其中，所用的引物為上游引物為5’GTCGAATTCTCGTCGCTTATTTCAAAAACCA 3’(序列表中的序列1；帶下劃線部分的堿基為EcoRI酶切位點(diǎn))，下游引物為5’GGCGTCGACTTA CTA CATTTCT CTCAGATAAT GAGTA 3’(序列表中序列2；帶下劃線部分的堿基為SalI酶切位點(diǎn))。PCR體系為50μl，其中，質(zhì)粒模板10ng，兩種引物濃度為50pmol，95℃變性5分鐘后加入2.5U Taq PlusDNA聚合酶，95℃變性20秒，55℃退火30秒，72℃延伸40秒，30循環(huán)后于72延伸10分鐘。利用常規(guī)分子克隆方法，將得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用EcoRI和SalI雙酶切后連接入pGEX-4T-1原核表達(dá)載體中，得到重組表達(dá)載體pGEX-4T-1/MsrA。將該重組表達(dá)載體通過CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。取單菌落在LB培養(yǎng)基內(nèi)37℃培養(yǎng)12小時(shí)后，1∶100轉(zhuǎn)接至新鮮培養(yǎng)基放大培養(yǎng)，當(dāng)菌液在600nm下OD值為0.6-0.8時(shí)，加IPTG至終濃度0.25mM誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，繼續(xù)在25℃培養(yǎng)6-8小時(shí)，離心收集菌體，菌體用緩沖液A(10mM Tris-HCl，10mM β-巰基乙醇，pH7.4)重懸，并用超聲儀于冰上超聲裂解。裂解液于4℃下27,000×g離心20min，上清液以Glutathione Sepharose 4B柱純化。SDS-PAGE檢測(cè)純化的MsrA蛋白，結(jié)果表明得到純化的MsrA蛋白。蛋白濃度采用Edelhoch方法檢測(cè)(Biochemistry，1967，61948-1954)。
實(shí)施例2、MsrA體外防止人Cu/Zn-SOD的聚集在含有8-25％的TFE(Trifluroethanol)，25μM ThT(thioflavin T)，50mM Mes[2-(N-嗎啉代)乙磺酸]的pH5.4的醋酸緩沖液中，同時(shí)加入終濃度為0.2mg/ml的人Cu/Zn-SOD和終濃度為0.1、0.25、0.5和1μM的MsrA，并設(shè)不加MsrA的對(duì)照，立即檢測(cè)人Cu/Zn-SOD蛋白的聚集。蛋白聚集采用ThT熒光激發(fā)發(fā)射光譜來檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為440，發(fā)射波長(zhǎng)為482nm。結(jié)果如圖1和圖2所示，表明人Cu/Zn-SOD的聚集速度比對(duì)照減慢，在473nm處，加入0.5μM MsrA后，熒光強(qiáng)度只為對(duì)照的50％；且抑制效果隨著MsrA濃度的增加而增加，當(dāng)MsrA達(dá)到0.5μM其抑制率進(jìn)入平臺(tái)期。
實(shí)施例3、MsrA保護(hù)正常蛋白不被熱變性在40mM HEPES緩沖液中加入終濃度為0.15μM檸檬酸合成酶，于43℃加熱200秒內(nèi)就開始發(fā)生聚集，以熒光儀FL4500(日立公司)檢測(cè)到光散射信號(hào)的增加，在20分鐘內(nèi)增加達(dá)到13倍。熒光儀檢測(cè)參數(shù)為激發(fā)光波長(zhǎng)500nm，發(fā)射光波長(zhǎng)500nm。狹縫寬度2.5nm。
在40mM HEPES緩沖液中，同時(shí)加入終濃度為0.15μM檸檬酸合成酶和0、0.1、0.25和0.5μM MsrA后，以熒光儀FL4500(日立公司)檢測(cè)光散射信號(hào)。結(jié)果如圖3和圖4所示，表明熱變性聚集明顯變少；在反應(yīng)20分鐘時(shí)，蛋白聚集抑制率達(dá)35％；且抑制效果隨著MsrA濃度的增加而增加，在反應(yīng)至20分鐘時(shí)，當(dāng)MsrA濃度增加至0.25μM時(shí)抑制率增加至51.9％，當(dāng)MsrA濃度增加至0.5μM時(shí)抑制率增加到74.4％。
實(shí)施例4、MsrA防止蛋白質(zhì)形成纖維，于體外防止蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊酵母Sup35蛋白是導(dǎo)致人瘋牛病朊病毒的模型蛋白。將含有10μM Sup35蛋白和0、0.25、5μM MsrA的磷酸緩沖液(5mMKH2PO4，150mM NaCl，pH7.4)與等體積的25μM ThT(溶于50mM甘氨酸緩沖液，pH8.0)，在25℃下孵育120小時(shí)后，以日立FL-4500型熒光儀檢測(cè)熒光光譜信號(hào)，激發(fā)波長(zhǎng)442nm，發(fā)射波長(zhǎng)485nm。所得結(jié)果減去緩沖液中ThT和不同濃度的MsrA背景信號(hào)。結(jié)果如圖5所示，表明加入5μM MsrA體系的蛋白熒光相對(duì)強(qiáng)度較對(duì)照減少了63.8％。表明MsrA具有很強(qiáng)的抑制蛋白纖維形成的能力。
序列表<160>2<210>1<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1gtcgaattct cgtcgcttat ttcaaaaacc a 31<210>2<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2ggcgtcgact tactacattt ctctcagata atgagta 3權(quán)利要求
1.肽甲硫氨酸亞砜還原酶在防止蛋白質(zhì)聚集中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述蛋白質(zhì)為Cu/Zn-SOD及其突變體。
3.肽甲硫氨酸亞砜還原酶在防止蛋白質(zhì)變性中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述蛋白質(zhì)為檸檬酸合成酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的應(yīng)用，其特征在于所述變性由物理因素和/或化學(xué)因素引起。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述物理因素包括熱，紫外線照射，高壓和表面張力。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述化學(xué)因素包括有機(jī)溶劑，脲、胍，酸和堿。
8.肽甲硫氨酸亞砜還原酶在防止蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述蛋白質(zhì)為酵母Sup35蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了肽甲硫氨酸亞砜還原酶的新用途。本發(fā)明的研究表明，肽甲硫氨酸亞砜還原酶具有防止蛋白質(zhì)聚集、蛋白質(zhì)變性以及蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊的功能，為肽甲硫氨酸亞砜還原酶的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了更加廣闊的空間。
文檔編號(hào)C12N9/02GK1587397SQ20041005853
公開日2005年3月2日 申請(qǐng)日期2004年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月18日
發(fā)明者王義華, 羅永章 申請(qǐng)人:清華大學(xué)