專利名稱：一種精液果糖測(cè)定新方法及用于該方法的葡萄糖異構(gòu)酶突變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域與遺傳工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種新的精液果糖測(cè)定方法；一系列葡萄糖異構(gòu)酶突變體及這些酶的工程與制備方法。
背景技術(shù)：
葡萄糖異構(gòu)酶(Glucose isomerase，簡(jiǎn)稱GI；E.C.5.3.1.5)，又稱木糖異構(gòu)酶(Xylose isomerase，簡(jiǎn)稱XI；E.C.5.3.1.5)催化葡萄糖轉(zhuǎn)化為果糖，因此，葡萄糖異構(gòu)酶在工業(yè)上可用于生產(chǎn)果葡糖漿；葡萄糖異構(gòu)酶還可催化木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖，是將木聚糖轉(zhuǎn)化為乙醇途徑中的關(guān)鍵酶。因此，葡萄糖異構(gòu)酶在工業(yè)上又可用于生產(chǎn)酒精。葡萄糖異構(gòu)酶還可催化果糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖。利用這一特性，本發(fā)明首次將葡萄糖異構(gòu)酶用在醫(yī)學(xué)上，用來(lái)測(cè)定精液中果糖的含量。但是，現(xiàn)有的葡萄糖異構(gòu)酶由于活性低、穩(wěn)定性不夠好而難以用來(lái)測(cè)定精液中果糖的含量。本發(fā)明經(jīng)基因與蛋白工程技術(shù)產(chǎn)生了一系列高活性及穩(wěn)定性好的葡萄糖異構(gòu)酶突變體，這些突變體能夠有效用于測(cè)定精液中果糖的含量。
精液中的果糖由精囊腺分泌，它是供精子利用的主要糖類物質(zhì)。正常人體精液中果糖的含量為9.11-17.67毫摩爾/升。測(cè)定精漿中果糖含量，其目的在于①衡量精囊腺的功能，精囊腺炎癥時(shí)，果糖含量下降；如果糖為零，應(yīng)考慮精囊腺缺如；②鑒別無(wú)精子癥的病因，目前主要用于鑒別單純性輸精管阻塞和輸精管、精囊腺缺如引起的無(wú)精子癥；③間接反映睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮的功能；④精漿中果糖是由血液中葡萄糖在精囊轉(zhuǎn)變而成的，如精漿中果糖含量明顯高于正常，則應(yīng)注意排除患者有無(wú)糖尿病。目前測(cè)定精液果糖的方法主要有色譜法、化學(xué)法及果糖脫氫酶法。色譜法受到儀器的限制，臨床實(shí)驗(yàn)室較少有高效液相色譜儀，也缺乏有關(guān)技術(shù)?；瘜W(xué)法是利用果糖和間苯二酚、吲哚或咔唑等化合物反應(yīng)產(chǎn)生顏色變化，然后通過(guò)比色測(cè)出果糖含量。但化學(xué)顯色反應(yīng)必須在強(qiáng)酸性介質(zhì)中進(jìn)行，不安全；此外，由于顯色產(chǎn)物不穩(wěn)定，因此顯色反應(yīng)重復(fù)性很差。脫氫酶法是雖然反應(yīng)條件較溫和，測(cè)定結(jié)果較準(zhǔn)確，但是，果糖脫氫酶本身及果糖脫氫酶反應(yīng)中使用的顯色劑不穩(wěn)定，兩者皆需在臨用前新鮮配制，因此很是費(fèi)時(shí)；而且，果糖脫氫酶試劑價(jià)格昂貴，因此其商業(yè)利用受到限制。故此，迄今尚沒(méi)有一種較理想而實(shí)用的精液果糖測(cè)定方法。
本發(fā)明從Thermoanaerobacterium sachcharolyticum B6A菌(ATCC 49915，USA)中分離到葡萄糖異構(gòu)酶(Lee Y.E.etal.，Journal of General Microbiology 1993，1391227-1234)，其核苷酸序列如序列表SEQ.ID NO.1，氨基酸序列為序列表SEQ.IDNO.2。然后，本發(fā)明通過(guò)基因與蛋白工程技術(shù)改良了本發(fā)明分離到的葡萄糖異構(gòu)酶，使其催化轉(zhuǎn)化果糖為葡萄糖之活性有了顯著提高，并且該葡萄糖異構(gòu)酶突變體之穩(wěn)定性及在大腸桿菌中的表達(dá)水平有了顯著提高。本發(fā)明之葡萄糖異構(gòu)酶突變體在測(cè)定精液中果糖含量方面較前述的色譜法、化學(xué)法及果糖脫氫酶具有如下特點(diǎn)(1)操作簡(jiǎn)便；(2)結(jié)果準(zhǔn)確；(3)條件溫和；(4)成本低廉。
本發(fā)明的葡萄糖異構(gòu)酶突變體還可以用于人體內(nèi)、或體內(nèi)某一器官、或其它生物體精液果糖含量的測(cè)定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種精液果糖測(cè)定方法。本發(fā)明的目還在于提供一種高催化活性并耐熱的葡萄糖異構(gòu)酶突變體。本發(fā)明的目的還在于提供使用本發(fā)明的高催化活性的葡萄糖異構(gòu)酶突變體有效測(cè)定精液中的果糖含量。本發(fā)明的目的還在于提供使用本發(fā)明所述的葡萄糖異構(gòu)酶突變體測(cè)定人體內(nèi)其它器官、或其它生物體精液果糖含量。
本發(fā)明從Thermoanaerobacterium sachcharolyticum B6A菌中分離到葡萄糖異構(gòu)酶(Lee Y.E.etal.，Journal of General Microbiology 1993，1391227-1234)。然后，本發(fā)明依據(jù)分離到的葡萄糖異構(gòu)酶之二級(jí)結(jié)構(gòu)及模擬三級(jí)結(jié)構(gòu)之特性，通過(guò)基因與蛋白工程技術(shù)改良了該葡萄糖異構(gòu)酶，使其催化轉(zhuǎn)化果糖為葡萄糖之活性有了顯著提高，并且該葡萄糖異構(gòu)酶突變體之穩(wěn)定性及在大腸桿菌中的表達(dá)水平有了顯著提高。
本發(fā)明一方面提供一種精液果糖測(cè)定方法，該方法包括以下步驟1)將人體(或其它生物體，如牛、羊、馬、狗)精液樣品于80℃處理30分鐘，室溫下離心，再將上清液轉(zhuǎn)入一潔凈試管中；
2)加入Chelex 100樹脂(BIO-RAD，USA)，去除精液中對(duì)本發(fā)明提供的葡萄糖異構(gòu)酶有干擾的物質(zhì)，室溫下離心，收集上清液；3)取上清液，加CoCl2和MgCl2，再加入一種本發(fā)明提供的葡萄糖異構(gòu)酶突變體，于80℃反應(yīng)10分鐘；4)反應(yīng)產(chǎn)物D-葡萄糖由D-葡萄糖氧化酶法測(cè)定；5)根據(jù)果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，求算出精液中果糖含量。
本發(fā)明另一方面提供編碼一系列耐高溫葡萄糖異構(gòu)酶突變體的核苷酸序列，所述的核苷酸序列具有序列表SEQ.ID NO.3、或SEQ.ID NO.5、或SEQ.ID NO.7、或SEQ.ID NO.9的核苷酸序列或所述核苷酸序列的突變形式(≥75％的同源性)，所述的突變包括缺失、無(wú)義、插入、錯(cuò)義，所述的突變不包括公知的密碼子簡(jiǎn)并性變化。
本發(fā)明進(jìn)一步提供由序列表SEQ.ID NO.3、或SEQ.ID NO.5、或SEQ.ID NO.7、或SEQ.IDNO.9的核苷酸序列編碼的相應(yīng)的序列表SEQ.ID NO.4、或SEQ.ID NO.5、或SEQ.IDNO.6、或SEQ.ID NO.10氨基酸序列的多肽或所述多肽的修飾形式(≥90％的同源性)，該修飾形式功能上相當(dāng)或與高活性葡萄糖異構(gòu)酶相關(guān)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供耐高溫葡萄糖異構(gòu)酶突變體的工程方法，該方法包括以下步驟1)根據(jù)基因庫(kù)(L09699)基因序列設(shè)計(jì)引物TF5′AGCCTAGGTTAATTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAATAAATATTTTGAGAA 3′和TR5′ATAAGCTCAGCGGCGCGCCTTATTCTGCAAACAAATACT 3′，利用引物對(duì)TF和TR及常規(guī)PCR技犬從Thermoanaerobacterium saccharolyticum(購(gòu)自ATCC 49915，USA)中擴(kuò)增出親本葡萄糖異構(gòu)酶基因(TS-F)；2)分析親本葡萄糖異構(gòu)酶之二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)，選擇位點(diǎn)R81、W139、R182、V186、Q59及T299六位點(diǎn)進(jìn)行單個(gè)位點(diǎn)或/和多位點(diǎn)組合突變；3)通過(guò)PCR技術(shù)突變產(chǎn)生突變基因，將產(chǎn)生的突變基因與載體pGEMT-Easy(Promega，USA)連接，得含突變基因的質(zhì)粒；4)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)菌細(xì)胞HB101，在1％ MacConkey(DIFCO，USA)平板(含1％ D-木糖和50mg/L氨芐青霉素)上篩選出具葡萄糖異構(gòu)酶活性的克?。?)從克隆中提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)DNA測(cè)序確定引入的點(diǎn)突變無(wú)誤。
本發(fā)明進(jìn)一步提供耐高溫葡萄糖異構(gòu)酶突變體的制備方法，該方法包括以下步驟
1)將含葡萄糖異構(gòu)酶突變體基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌細(xì)胞HB101，涂在MacConkey(DIFCO，USA)平板(含1％D-木糖和50mg/L氨芐青霉素)上，37℃選擇培養(yǎng)36小時(shí)，產(chǎn)生具有葡萄糖異構(gòu)酶活性的克隆；2)接種單個(gè)克隆于液體LB培養(yǎng)基(含50mg/L氨芐青霉素)中培養(yǎng)；3)離心收集菌體，并懸于磷酸鈉緩沖液(pH 6.5)中，加CoCl2和MgCl2至終濃度分別為250μM和5mM。然后用超聲波裂解細(xì)菌細(xì)胞；4)離心并收集上清液；5)上清液經(jīng)80℃熱處理10分鐘后，離心并進(jìn)一步收集上清液。上清液即為部分純化的葡萄糖異構(gòu)酶。
在本發(fā)明制備耐高溫葡萄糖異構(gòu)酶突變體的方法中，所述的載體可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，包括但不限于原核表達(dá)載體pGEMT-Easy，pRSET和pET21。在生產(chǎn)本發(fā)明提供的耐高溫葡萄糖異構(gòu)酶時(shí)，可以將耐高溫葡萄糖異構(gòu)酶基因序列與表達(dá)調(diào)控序列相連，進(jìn)而形成耐高溫葡萄糖異構(gòu)酶表達(dá)載體。表達(dá)載體含有復(fù)制起始點(diǎn)和表達(dá)調(diào)控序列、啟動(dòng)子、或/和增強(qiáng)子、或/和必要的加工信息位點(diǎn)、或/和信號(hào)肽編碼序列。表達(dá)載體還必須含有可供選擇的標(biāo)記基因，如氨芐青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因。這些表達(dá)載體可以用本領(lǐng)域公知的重組DNA技術(shù)制備，可參考Sambrook，et al.，MolecularcloningA laboratory manual.New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。
在本發(fā)明制備葡萄糖異構(gòu)酶的方法中，所述的葡萄糖異構(gòu)酶可以在原核細(xì)胞(如HB101、BL21、DH5α)或真核細(xì)胞(如釀酒酵母、畢赤巴斯德酵母)內(nèi)表達(dá)，也可采用本領(lǐng)域已知的任何其它適當(dāng)方法實(shí)現(xiàn)在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞外表達(dá)。
附圖表說(shuō)明 下列附圖表用于說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明范圍。


圖1親本葡萄糖異構(gòu)酶TS-F之二級(jí)結(jié)構(gòu)。
圖2親本葡萄糖異構(gòu)酶TS-F之模擬三級(jí)結(jié)構(gòu)。
圖3葡萄糖異構(gòu)酶突變體GI-1聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。
圖4親本葡萄糖異構(gòu)酶TS-F與葡萄糖異構(gòu)酶突變體的比活性。
表1親本葡萄糖異構(gòu)酶TS-F與葡萄糖異構(gòu)酶突變體擴(kuò)增反應(yīng)之引物。
具體實(shí)施例方式
下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施實(shí)施例中未注明具體條件者，按常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。
實(shí)施例1親本基因(TS-F)的擴(kuò)增及其載體的構(gòu)建根據(jù)基因庫(kù)(L09699)基因序列設(shè)計(jì)引物TF和TR(見(jiàn)表1)。利用引物對(duì)TF和TR從T.saccharolyticum中擴(kuò)增葡萄糖異構(gòu)酶編碼親本基因(TS-F)。
擴(kuò)增反應(yīng)條件為20mM Tris-HCl，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％ Triton X-100，0.2mM dNTP，400nM引物TF和400nM引物TR，1.5UPfu(Promega，USA)DNA聚合酶，用接種環(huán)挑取少許T.saccharolyticum菌體，再用無(wú)菌水調(diào)反應(yīng)體積至50μl。
PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 3分鐘，40圈循環(huán)95℃ 30秒、50℃ 30秒和72℃ 3分鐘，最后72℃ 10分鐘。擴(kuò)增的基因連接至載體pGEMT-Easy(Promega，USA)上，得質(zhì)粒pGMT-TS-F。利用快速質(zhì)粒制備試劑盒(Marligen Bioscience，USA)提取質(zhì)粒pGMT-TS-F，經(jīng)DNA測(cè)序確定TS-F葡萄糖異構(gòu)酶的核苷酸序列為序列表SEQ.ID NO.1，相應(yīng)的氨基酸序列為序列表SEQ.ID NO.2。
實(shí)施例2葡萄糖異構(gòu)酶二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)分析利用PSIPRED軟件獲得親本基因編碼的葡萄糖異構(gòu)酶之二級(jí)結(jié)構(gòu)(參見(jiàn)McGufGIn L.J.etal.，Bioinformatics 2000，16404-405)。葡萄糖異構(gòu)酶二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果見(jiàn)圖1。利用SWISS-PROT軟件分析獲得親本基因編碼的葡萄糖異構(gòu)酶之模擬三級(jí)結(jié)構(gòu)(參見(jiàn)Reutrakul S.etal.，The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism2001，86(10)5039-5044)。葡萄糖異構(gòu)酶之模擬三級(jí)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2。利因BLAST軟件(見(jiàn)網(wǎng)址http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)將親本葡萄糖異構(gòu)酶基因與基因庫(kù)中其它葡萄糖異構(gòu)酶基因(特別是來(lái)源于耐熱菌的葡萄糖異構(gòu)酶基因，如基因庫(kù)號(hào)A72225、P45687和P29441的GI基因)進(jìn)行比較，獲得葡萄糖異構(gòu)酶基因的保守序列信息。再在親本GI二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，選擇位點(diǎn)R81、W139、R182、V186、Q59及T182四位點(diǎn)進(jìn)行單個(gè)位點(diǎn)和多位點(diǎn)組合突變(見(jiàn)實(shí)施例3、4和5)。
實(shí)施例3葡萄糖異構(gòu)酶之多位點(diǎn)組合突變GI-1定點(diǎn)突變技術(shù)參考HO S.N.etal.，Gene 1989，77(1)51-59一文之描述。以質(zhì)粒pGEMT-TS-F為模板，設(shè)計(jì)引物對(duì)81AF和81AR、139FF和139FR、182AF和182AR、186TF和186TR、以及299QF和299QR(見(jiàn)表1)。引物TF和TR見(jiàn)實(shí)施例1。用引物對(duì)TF和81AR，擴(kuò)增TFAR片段；引物對(duì)81AF和139FR，擴(kuò)增AFFR片段；引物對(duì)139FF和182AR，擴(kuò)增FFAR片段；引物對(duì)182AF和186TR，擴(kuò)增AFTR片段；引物對(duì)186TF和299QR，擴(kuò)增TFQR片段；引物對(duì)299QF和TR，擴(kuò)增QFTR片段。擴(kuò)增反應(yīng)條件為20mM Tris-HCl，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％ Triton X-100，0.2mM dNTP，400nM單個(gè)引物(來(lái)自一對(duì)引物)，1.5U Pfu DNA聚合酶，40ngpGMT-TS-F，再用無(wú)菌水調(diào)反應(yīng)體積至50ul。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 3分鐘，35圈循環(huán)95℃ 50秒、52℃ 30秒和72℃ 3分鐘，最后72℃ 5分鐘。經(jīng)1％瓊脂糖膠電泳分離并用試劑盒QIAquick DNA(QIAGEN，German)回收，分別得到TFAR片段、AFFR片段、FFAR片段、AFTR片段、TFQR和QFTR片段。然后擴(kuò)增全長(zhǎng)基因。擴(kuò)增反應(yīng)條件為20mM Tris-HCl，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％ Triton X-100，0.2mM dNTP，400nM引物TF和400nM TR，1.5U Pfu DNA聚合酶，40ng TFAR片段、40ng AFFR片段、40ng FFAR片段、40ng AFTR片段、40ng TFQR片段和40ng QFTR片段，再用無(wú)菌水調(diào)反應(yīng)體積至50μl。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 3分鐘，35圈循環(huán)95℃ 50秒、52℃ 30秒和72℃ 3分鐘，最后72℃ 5分鐘。經(jīng)1％瓊脂糖膠電泳分離并用試劑盒QIAquick DNA回收，得到全長(zhǎng)突變基因GI-1。將GI-1與載體pGEMT-Easy連接，得質(zhì)粒pGEMT-GI-1。將質(zhì)粒pGEMT-GI-1轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)菌細(xì)胞HB101，在1％MacConkey(DIFCO，USA)平板(含1％ D-木糖和50mg/L氨芐青霉素)上篩選出具葡萄糖異構(gòu)酶活性的克隆。從克隆中提取質(zhì)粒pGEMT-GI-1 DNA，經(jīng)DNA測(cè)序確定引入的點(diǎn)突變無(wú)誤。G1-1序列見(jiàn)序列表SEQ.ID NO.3-4。
實(shí)施例4葡萄糖異構(gòu)酶之多位點(diǎn)組合突變GI-2定點(diǎn)突變技術(shù)參考HO S.N.etal.，Gene 1989，77(1)51-59一文之描述。以質(zhì)粒pGEMT-TS-F為模板，設(shè)計(jì)引物對(duì)81AF和81AR、139FF和139FR、182AF和182AR、187SF和187SR、以及299IF和299IR(見(jiàn)表1)。引物TF和TR見(jiàn)實(shí)施例1。用引物對(duì)TF和81AR，擴(kuò)增TFAR片段；引物對(duì)81AF和139FR，擴(kuò)增AFFR片段；引物對(duì)139FF和182AR，擴(kuò)增FFAR片段；引物對(duì)182AF和187SR，擴(kuò)增AFSR片段；引物對(duì)187SF和299IR，擴(kuò)增SFIR片段；引物對(duì)299IF和TR，擴(kuò)增IFTR片段。擴(kuò)增反應(yīng)條件為20mM Tris-HCl，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％ Triton X-100，0.2mM dNTP，400nM單個(gè)引物(來(lái)自一對(duì)引物)，1.5U Pfu DNA聚合酶，20ngpGMT-TS-F，再用無(wú)菌水調(diào)反應(yīng)體積至50μl。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 3分鐘，35圈循環(huán)95℃ 50秒、52℃ 30秒和72℃ 3分鐘，最后72℃ 5分鐘。經(jīng)1％瓊脂糖膠電泳分離并用QIAquick DNA回收，分別得到TFAR片段、AFFR片段、FFAR片段、AFSR片段、SFIR和IFTR片段。然后擴(kuò)增全長(zhǎng)基因。擴(kuò)增反應(yīng)條件為20mM Tris-HCl，10mMKCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％ Triton X-100，0.2mM dNTP，400nM引物TF和400nM TR，1.5U Pfu DNA聚合酶，40ng TFAR片段、40ng AFFR片段、40ngFFAR片段、40ng AFSR片段、40ng SFIR片段和40ng IFTR片段，再用無(wú)菌水調(diào)反應(yīng)體積至50μl。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 3分鐘，35圈循環(huán)95℃ 50秒、52℃ 30秒和72℃ 3分鐘，最后72℃ 5分鐘。經(jīng)1％瓊脂糖膠電泳分離并用QIAquick DNA回收，得到全長(zhǎng)突變基因GI-2。將GI-2與載體pGEMT-Easy連接，得質(zhì)粒pGEMT-GI-2。將質(zhì)粒pGEMT-GI-2轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)菌細(xì)胞HB101，在1％ MacConkey(DIFCO，USA)平板(含1％D-木糖和50mg/L氨芐青霉素)上篩選出具葡萄糖異構(gòu)酶活性的克隆。從克隆中提取質(zhì)粒pGEMT-G1-2DNA，經(jīng)DNA測(cè)序確定引入的點(diǎn)突變無(wú)誤。GI-2序列見(jiàn)序列表SEQ.ID NO.5-6。
實(shí)施例5葡萄糖異構(gòu)酶之單一位點(diǎn)突變定點(diǎn)突變技術(shù)參考HO S.N.etal.，Gene 1989，77(1)51-59一文之描述。以質(zhì)粒pGEMT-GI-1(參見(jiàn)實(shí)施例3)為模板，設(shè)計(jì)引物對(duì)139DF和139DR(見(jiàn)表1)，將GI-1氨基酸序列中第139位點(diǎn)的Phe(F)突變?yōu)锳sp(D)，獲得突變體GI-F139D。引物TF和TR見(jiàn)實(shí)施例1。利用引物對(duì)TF和139DR，擴(kuò)增TFDR片段；引物對(duì)139DF和TR，擴(kuò)增DFTR片段。擴(kuò)增反應(yīng)條件為20mM Tris-HCl，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mMMgSO4，0.1％ Triton X-100，0.2mM dNTP，400nM單個(gè)引物(來(lái)自一對(duì)引物)，1.5U PfuDNA聚合酶，40ng pGEMT-GI-1，再用無(wú)菌水調(diào)反應(yīng)體積至50μl。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 3分鐘，35圈循環(huán)95℃ 50秒、52℃ 30秒和72℃ 3分鐘，最后72℃ 5分鐘。經(jīng)1％瓊脂糖膠電泳分離并用QIAquick DNA回收，得到TFDR片段和DFTR片段。然后擴(kuò)增全長(zhǎng)基因。擴(kuò)增反應(yīng)條件為20mM Tris-HCl，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％ Triton X-100，0.2mM dNTP，400nM引物TF和400nMTR，1.5U Pfu DNA聚合酶，40ng TFDR與40ng DFTR，再用無(wú)菌水調(diào)反應(yīng)體積至50μl。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 3分鐘，35圈循環(huán) 95℃ 50秒、52℃ 30秒和72℃ 3分鐘，最后72℃ 5分鐘。經(jīng)1％瓊脂糖膠電泳分離并用QIAquick DNA回收，得到全長(zhǎng)突變基因GI-F139D。將GI-F139D與載體pGEMT-Easy連接，得質(zhì)粒pGEMT-GI-F139D。將質(zhì)粒pGEMT-GI-F139D轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)菌細(xì)胞HB101，在1％ MacConkey(DIFCO，USA)平板(含1％ D-木糖和50mg/L氨芐青霉素)上篩選出具葡萄糖異構(gòu)酶活性的克隆。從克隆中提取質(zhì)粒pGEMT-GI-F139D DNA，經(jīng)DNA測(cè)序確定引入的點(diǎn)突變無(wú)誤。GI-F139D序列見(jiàn)序列表SEQ.ID NO.7-8。
按照類似步驟，以質(zhì)粒pGEMT-GI-1(參見(jiàn)實(shí)施例3)為模板，設(shè)計(jì)引物對(duì)299EF和299ER(見(jiàn)表1)，將GI-1氨基酸序列中第299位點(diǎn)的Gln(Q)突變?yōu)镚lu(E)，構(gòu)建突變體GI-Q299E，將突變體與載體pGEMT-Easy連接，得質(zhì)粒pGEMT-GI-Q299E。GI-Q299E序列見(jiàn)序列表SEQ.ID NO.9-10。
實(shí)施例6葡萄糖異構(gòu)酶TS-F的提取與純化葡萄糖異構(gòu)酶的提取與純化主要參考Lee Y.E.etal.，Journal of GeneralMicrobiology.1993，1391227-1234。
將含親本葡萄糖異構(gòu)酶基因的質(zhì)粒pGEMT-TS-F轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌細(xì)胞HB101，在MacConkey(DIFCO，USA)平板(含1％D-木糖和50mg/L氨芐青霉素)上，37℃選擇培養(yǎng)36小時(shí)。接種單個(gè)克隆在5ml LB液體培養(yǎng)基(含50mg/L氨芐青霉素)中培養(yǎng)16小時(shí)。離心收集菌體，并懸浮于1ml 20mM磷酸鈉緩沖液(pH 6.5)中，加CoCl2和MgCl2至終濃度分別為250μM和5mM。然后用超聲波裂解細(xì)菌細(xì)胞。離心(10℃，15,000 g，15分鐘)并收集上清液。上清液經(jīng)80℃熱處理10分鐘后，離心(10℃，15,000 g，15分鐘)并收集上清液。上清液即為部分純化的匍萄糖異構(gòu)酶，可用于酶活性的測(cè)定和精液果糖含量測(cè)定。
實(shí)施例7葡萄糖異構(gòu)酶突變體的提取與純化葡萄糖異構(gòu)酶突變體GI-1的提取與純化與實(shí)施例5同，只是所用質(zhì)粒為pGEMT-GI-1。純化的葡萄糖異構(gòu)酶見(jiàn)圖3。其它葡萄糖異構(gòu)酶突變體也照此所述提取與純化。
實(shí)施例8親本葡萄糖異構(gòu)酶TS-F活性的測(cè)定取10μl按實(shí)施例5制備的葡萄糖異構(gòu)酶，加入至90μl 1.0M的果糖和20mM磷酸鈉緩沖溶液中(pH 6.5)，并含CoCl2和MgCl2終濃度分別為250μM和5mM，反應(yīng)于80℃進(jìn)行10分鐘。將反應(yīng)物置冰上以終止反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物D-葡萄糖由D-葡萄糖氧化酶法測(cè)定，測(cè)定方法參見(jiàn)Trinder，P.Ann.Clin.Biochem.1981，1864-67，以及上海科華-東菱診斷同品有限公司的葡萄糖試劑盒使用說(shuō)明書。用CoomassiePlus Protein AssayReagent Kit(PIERCE，USA)測(cè)定酶蛋白濃度。一單位酶比活性定義為在上述條件下每分鐘轉(zhuǎn)化一微摩爾果糖為葡萄糖所需的酶量。圖4顯示親本TS-F葡萄糖異構(gòu)酶之比活性。
實(shí)施例9葡萄糖異構(gòu)酶突變體GI-1活性測(cè)定葡萄糖異構(gòu)酶突變體GI-1活性測(cè)定與實(shí)施例8同。其它葡萄糖異構(gòu)酶突變體的活性也照此所述測(cè)定。圖4顯示葡萄糖異構(gòu)酶突變體突變體與親本TS-F葡萄糖異構(gòu)酶比活性之差異。
實(shí)施例10用葡萄糖異構(gòu)酶突變體測(cè)定精液果糖含量將人體精液樣品于80℃處理30分鐘，室溫下離心(15,000g，20分鐘)，再將上清液轉(zhuǎn)入一潔凈試管中。加入Chelex 100樹脂(B1O-RAD，USA)至終濃度20％，于80℃反應(yīng)30分鐘，室溫下離心(15,000g 15分鐘)，收集上清液。取180μl上清液，加CoCl2和MgCl2至終濃度分別為250μM和5mM，加入20μl按實(shí)施例6提取并純化的葡萄糖異構(gòu)酶突變體，于80℃反應(yīng)10分鐘。反應(yīng)產(chǎn)物D-葡萄糖由D-葡萄糖氧化酶法并按實(shí)施例7測(cè)定。根據(jù)果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(由濃度為0mM、0.5mM、1.0mM、2mM、4mM、8mM和10mM的果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液并按實(shí)施例7制定)，求算出精液中果糖含量。按照類似步驟，測(cè)定其它生物體精漿中的果糖含量。
本發(fā)明不受上述具體文字描述的限制，本發(fā)明可在權(quán)利要求書所概括的范圍內(nèi)做各種改變。這些改變均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
表1親本葡萄糖異構(gòu)酶TS-F與葡萄糖異構(gòu)酶突變體PCR擴(kuò)增反應(yīng)之引物

序列表序列(SEQ.ID NO.)1(a)序列特征*長(zhǎng)度1320堿基對(duì)*類型核酸*鏈型雙鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型DNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來(lái)源Thermoanaerobacterium sachcharolyticum B6A。
1 atgaataaat attttgagaa cgtatctaaa ataaaatatg aaggaccaaa atcaaataat61 ccttattcct ttaaatttta caatccagag gaagtaatcg atggcaagac gatggaggag121 catctccgct tttctatagc ttattggcac acttttactg ctgatggaac agatcaattt181 ggcaaggcta ctatgcaaag accatggaac cactacacag atcctatgga tatagcgaaa241 cgaagggtag aagcagcatt tgagtttttt gataagataa atgcaccttt cttctgcttc301 catgataggg atattgcccc tgaaggagat actcttagag agacaaacaa aaacttagat361 acaatagttg ctatgataaa ggattactta aagaccagca agacaaaagt tttgtggggt421 accgcaaatc ttttctccaa tccgagattt gtacatggtg catcaacatc ctgcaatgct481 gacgtttttg catattctgc agcgcaagtc aaaaaagccc ttgagattac taaggagctt541 ggccgcgaaa actacgtatt ttggggtgga agagaagggt acgagacgct tctcaataca601 gatatggagt tagagcttga taactttgca agatttttgc acatggctgt tgactatgca661 aaggaaatcg gctttgaagg tcagttcttg attgagccga agccaaagga gcctacaaaa721 catcaatacg actttgacgt ggcaaatgta ttggcattct tgagaaaata cgaccttgac781 aaatatttca aagtaaatat cgaagcaaac catgcgacat tggcattcca cgacttccaa841 catgagctaa gatacgccag aataaacggt gtattaggat caattgacgc aaatacaggc901 gacatgcttt tgggatggga tacggaccag ttccctacag atatacgcat gacaacgctt961 gctatgtatg aagtcataaa gatgggtgga tttgacaaag gtggccttaa ctttgatgca1021 aaagtaagac gtgcttcatt tgagccagaa gatcttttct taggtcacat agcaggaatg1081 gatgcttttg caaaaggctt taaagttgct tacaagcttg tgaaagatgg cgtatttgac1141 aagttcatcg aagaaagata cgcaagctac aaagaaggca ttggcgctga tattgtaagc1201 ggtaaagctg acttcaagag ccttgaaaag tatgcattag agcacagcca gattgtaaac
1261 aaatcaggca gacaagagct attagaatca atcctaaatc agtatttgtt tgcagaataa序列(SEQ.ID NO.)2(a)序列特征*長(zhǎng)度440個(gè)氨基酸殘基*類型多肽*鏈型單鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型Protein(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來(lái)源Thermoanaerobacterium sachcharolyticum B6A。
mnkyfenvsk ikyegpksnn pysfkfynpe evidgktmee hlrfsiaywh tftadgtdqfgkatmqrpwn hytdpmdiak rrveaafeff dkinapffcf hdrdiapegd tlretnknldtivamikdyl ktsktkvlwg tanlfsnprf vhgastscna dvfaysaaqv kkaleitkelgrenyvfwgg regyetllnt dmeleldnfa rflhmavdya keigfegqfl iepkpkeptkhqydfdvanv laflrkydld kyfkvniean hatlafhdfq helryaring vlgsidantgdmllgwdtdq fptdirmttl amyevikmgg fdkgglnfda kvrrasfepe dlflghiagmdafakgfkva yklvkdgvfd kfieeryasy kegigadivs gkadfkslek yalehsqivnksgrqelles ilnqylfae序列(SEQ.ID NO.)3(a)序列特征*長(zhǎng)度1320堿基對(duì)*類型核酸*鏈型雙鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型DNA(c)假設(shè)否(d)反義否
(e)最初來(lái)源Thermoanaerobacterium sachcharolyticum B6A。
1 atgaataaat attttgagaa cgtatctaaa ataaaatatg aaggaccaaa atcaaataat61 ccttattcct ttaaatttta caatccagag gaagtaatcg atggcaagac gatggaggag121 catctccgct tttctatagc ttattggcac acttttactg ctgatggaac agatcaattt181 ggcaaggcta ctatgcaaag accatggaac cactacacag atcctatgga tatagcgaaa241 gcaagggtag aagcagcatt tgagtttttt gataagataa atgcaccttt cttctgcttc301 catgataggg atattgcccc tgaaggagat actcttagag agacaaacaa aaacttagat361 acaatagttg ctatgataaa ggattactta aagaccagca agacaaaagt tttgtttggt421 accgcaaatc ttttctccaa tccgagattt gtacatggtg catcaacatc ctgcaatgct481 gacgtttttg catattctgc agcgcaagtc aaaaaagccc ttgagattac taaggagctt541 ggcgcggaaa actacacatt ttggggtgga agagaagggt acgagacgct tctcaataca601 gatatggagt tagagcttga taactttgca agatttttgc acatggctgt tgactatgca661 aaggaaatcg gctttgaagg tcagttcttg attgagccga agccaaagga gcctacaaaa721 catcaatacg actttgacgt ggcaaatgta ttggcattct tgagaaaata cgaccttgac781 aaatatttca aagtaaatat cgaagcaaac catgcgacat tggcattcca cgacttccaa841 catgagctaa gatacgccag aataaacggt gtattaggat caattgacgc aaatcaaggc901 gacatgcttt tgggatggga tacggaccag ttccctacag atatacgcat gacaacgctt961 gctatgtatg aagtcataaa gatgggtgga tttgacaaag gtggccttaa ctttgatgca1021 aaagtaagac gtgcttcatt tgagccagaa gatcttttct taggtcacat agcaggaatg1081 gatgcttttg caaaaggctt taaagttgct tacaagcttg tgaaagatgg cgtatttgac1141 aagttcatcg aagaaagata cgcaagctac aaagaaggca ttggcgctga tattgtaagc1201 ggtaaagctg acttcaagag ccttgaaaag tatgcattag agcacagcca gattgtaaac1261 aaatcaggca gacaagagct attagaatca atcctaaatc agtatttgtt tgcagaataa序列(SEQ.ID NO.)4(a)序列特征*長(zhǎng)度440個(gè)氨基酸殘基*類型多肽*鏈型單鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型Protein(c)假設(shè)否
(d)反義否(e)最初來(lái)源Thermoanaerobacterium sachcharolyticum B6A。
MNKYFENVSKIKYEGPKSNNPYSFKFYNPEEVIDGKTMEEHLRFSIAYWHTFTADGTDQFGKATMQRPWNHYTDPMDIAKARVEAAFEFFDKINAPFFCFHDRDIAPEGDTLRETNKNLDTIVAMIKDYLKTSKTKVLFGTANLFSNPRFVHGASTSCNADVFAYSAAQVKKALEITKELGAENYTFWGGREGYETLLNTDMELELDNFARFLHMAVDYAKEIGFEGQFLIEPKPKEPTKHQYDFDVANVLAFLRKYDLDKYFKVNIEANHATLAFHDFQHELRYARINGVLGSIDANQGDMLLGWDTDQFPTDIRMTTLAMYEVIKMGGFDKGGLNFDAKVRRASFEPEDLFLGHIAGMDAFAKGFKVAYKLVKDGVFDKFIEERYASYKEGIGADIVSGKADFKSLEKYALEHSQIVNKSGRQELLESILNQYLFAE*序列(SEQ.ID NO.)5(a)序列特征*長(zhǎng)度1320堿基對(duì)*類型核酸*鏈型雙鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型DNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來(lái)源Thermoanaerobacterium sachcharolyticum B6A。
1 atgaataaat attttgagaa cgtatctaaa ataaaatatg aaggaccaaa atcaaataat61 ccttattcct ttaaatttta caatccagag gaagtaatcg atggcaagac gatggaggag121 catctccgct tttctatagc ttattggcac acttttactg ctgatggaac agatcaattt181 ggtaaggcta ctatgcaaag accatggaac cactacacag atcctatgga tatagcgaaa241 gcaagggtag aagcagcatt tgagtttttt gataagataa atgcaccttt cttctgcttc301 catgataggg atattgcccc tgaaggagat actcttagag agacaaacaa aaacttagat361 acaatagttg ctatgataaa ggattactta aagaccagca agacaaaagt tttgtttggt421 accgcaaatc ttttctccaa tccgagattt gtacatggtg catcaacatc ctgcaatgct481 gacgtttttg catattctgc agcgcaagtc aaaaaagccc ttgagattac taaggagctt541 ggcgcggaaa actacgtgag ctggggtgga agagaagggt acgagacgct tctcaataca601 gatatggagt tagagcttga taactttgca agatttttgc acatggctgt tgactatgca
661 aaggaaatcg gctttgaagg tcagttcttg attgagccga agccaaagga gcctacaaaa721 catcaatacg actttgacgt ggcaaatgta ttggcattct tgagaaaata cgaccttgac781 aaatatttca aagtaaatat cgaagcaaac catgcgacat tggcattcca cgacttccaa841 catgagctaa gatacgccag aataaacggt gtattaggat caattgacgc aaatattggc901 gacatgcttt tgggatggga tacggaccag ttccctacag atatacgcat gacaacgctt961 gctatgtatg aagtcataaa gatgggtgga tttgacaaag gtggccttaa ctttgatgca1021 aaagtaagac gtgcttcatt tgagccagaa gatcttttct taggtcacat agcaggaatg1081 gatgcttttg caaaaggctt taaagttgct tacaagcttg tgaaagatgg cgtatttgac1141 aagttcatcg aagaaagata cgcaagctac aaagaaggca ttggcgctga tattgtaagc1201 ggtaaagctg acttcaagag ccttgaaaag tatgcattag agcacagcca gattgtaaac1261 aaatcaggca gacaagagct attagaatca atcctaaatc agtatttgtt tgcagaataa序列(SEQ.ID NO.)6(a)序列特征*長(zhǎng)度440個(gè)氨基酸殘基*類型多肽*鏈型單鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型Protein(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來(lái)源Thermoanaerobacterium sachcharolyticum B6A。
MNKYFENVSKIKYEGPKSNNPYSFKFYNPEEVIDGKTMEEHLRFSIAYWHTFTADGTDQFGKATMQRPWNHYTDPMDIAKARVEAAFEFFDKINAPFFCFHDRDIAPEGDTLRETNKNLDTIVAMIKDYLKTSKTKVLFGTANLFSNPRFVHGASTSCNADVFAYSAAQVKKALEITKELGAENYVSWGGREGYETLLNTDMELELDNFARFLHMAVDYAKEIGFEGQFLIEPKPKEPTKHQYDFDVANVLAFLRKYDLDKYFKVNIEANHATLAFHDFQHELRYARINGVLGSIDANIGDMLLGWDTDQFPTDIRMTTLAMYEVIKMGGFDKGGLNFDAKVRRASFEPEDLFLGHIAGMDAFAKGFKVAYKLVKDGVFDKFIEERYASYKEGIGADIVSGKADFKSLEKYALEHSQIVNKSGRQELLESILNQYLFAE*
序列(SEQ.ID NO.)7(a)序列特征*長(zhǎng)度1320堿基對(duì)*類型核酸*鏈型雙鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型DNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來(lái)源Thermoanaerobacterium sachcharolyticum B6A。
1 atgaataaat attttgagaa cgtatctaaa ataaaatatg aaggaccaaa atcaaataat61 ccttattcct ttaaatttta caatccagag gaagtaatcg atggcaagac gatggaggag121 catctccgct tttctatagc ttattggcac acttttactg ctgatggaac agatcaattt181 ggcaaggcta ctatgcaaag accatggaac cactacacag atcctatgga tatagcgaaa241 gcaagggtag aagcagcatt tgagtttttt gataagataa atgcaccttt cttctgcttc301 catgataggg atattgcccc tgaaggagat actcttagag agacaaacaa aaacttagat361 acaatagttg ctatgataaa ggattactta aagaccagca agacaaaagt tttggatggt421 accgcaaatc ttttctccaa tccgagattt gtacatggtg catcaacatc ctgcaatgct481 gacgtttttg catattctgc agcgcaagtc aaaaaagccc ttgagattac taaggagctt541 ggcgcggaaa actacacatt ttggggtgga agagaagggt acgagacgct tctcaataca601 gatatggagt tagagcttga taactttgca agatttttgc acatggctgt tgactatgca661 aaggaaatcg gctttgaagg tcagttcttg attgagccga agccaaagga gcctacaaaa721 catcaatacg actttgacgt ggcaaatgta ttggcattct tgagaaaata cgaccttgac781 aaatatttca aagtaaatat cgaagcaaac catgcgacat tggcattcca cgacttccaa841 catgagctaa gatacgccag aataaacggt gtattaggat caattgacgc aaatcaaggc901 gacatgcttt tgggatggga tacggaccag ttccctacag atatacgcat gacaacgctt961 gctatgtatg aagtcataaa gatgggtgga tttgacaaag gtggccttaa ctttgatgca1021 aaagtaagac gtgcttcatt tgagccagaa gatcttttct taggtcacat agcaggaatg1081 gatgcttttg caaaaggctt taaagttgct tacaagcttg tgaaagatgg cgtatttgac1141 aagttcatcg aagaaagata cgcaagctac aaagaaggca ttggcgctga tattgtaagc1201 ggtaaagctg acttcaagag ccttgaaaag tatgcattag agcacagcca gattgtaaac
1261 aaatcaggca gacaagagct attagaatca atcctaaatc agtatttgtt tgcagaataa序列(SEQ.ID NO.)8(a)序列特征*長(zhǎng)度440個(gè)氨基酸殘基*類型多肽*鏈型單鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型Protein(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來(lái)源Thermoanaerobacterium sachcharolyticum B6A。
MNKYFENVSKIKYEGPKSNNPYSFKFYNPEEVIDGKTMEEHLRFSIAYWHTFTADGTDQFGKATMQRPWNHYTDPMDIAKARVEAAFEFFDKINAPFFCFHDRDIAPEGDTLRETNKNLDTIVAMIKDYLKTSKTKVLDGTANLFSNPRFVHGASTSCNADVFAYSAAQVKKALEITKELGAENYTFWGGREGYETLLNTDMELELDNFARFLHMAVDYAKEIGFEGQFLIEPKPKEPTKHQYDFDVANVLAFLRKYDLDKYFKVNIEANHATLAFHDFQHELRYARINGVLGSIDANQGDMLLGWDTDQFPTDIRMTTLAMYEVIKMGGFDKGGLNFDAKVRRASFEPEDLFLGHIAGMDAFAKGFKVAYKLVKDGVFDKFIEERYASYKEGIGADIVSGKADFKSLEKYALEHSQIVNKSGRQELLESILNQYLFAE*序列(SEQ.ID NO.)9(a)序列特征*長(zhǎng)度1320堿基對(duì)*類型核酸*鏈型雙鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型DNA(c)假設(shè)否(d)反義否
(e)最初來(lái)源Thermoanaerobacterium sachcharolyticum B6A。
1 atgaataaat attttgagaa cgtatctaaa ataaaatatg aaggaccaaa atcaaataat61 ccttattcct ttaaatttta caatccagag gaagtaatcg atggcaagac gatggaggag121 catctccgct tttctatagc ttattggcac acttttactg ctgatggaac agatcaattt181 ggcaaggcta ctatgcaaag accatggaac cactacacag atcctatgga tatagcgaaa241 gcaagggtag aagcagcatt tgagtttttt gataagataa atgcaccttt cttctgcttc301 catgataggg atattgcccc tgaaggagat actcttagag agacaaacaa aaacttagat361 acaatagttg ctatgataaa ggattactta aagaccagca agacaaaagt tttgtttggt421 accgcaaatc ttttctccaa tccgagattt gtacatggtg catcaacatc ctgcaatgct481 gacgtttttg catattctgc agcgcaagtc aaaaaagccc ttgagattac taaggagctt541 ggcgcggaaa actacacatt ttggggtgga agagaagggt acgagacgct tctcaataca601 gatatggagt tagagcttga taactttgca agatttttgc acatggctgt tgactatgca661 aaggaaatcg gctttgaagg tcagttcttg attgagccga agccaaagga gcctacaaaa721 catcaatacg actttgacgt ggcaaatgta ttggcattct tgagaaaata cgaccttgac781 aaatatttca aagtaaatat cgaagcaaac catgcgacat tggcattcca cgacttccaa841 catgagctAa gatacgccag aataaacggt gtattaggat caattgacgc aaatgaaggc901 gacatgcttt tgggatggga tacggaccag ttccctacag atatacgcat gacaacgctt961 gctatgtatg aagtcataaa gatgggtgga tttgacaaag gtggccttaa ctttgatgca1021 aaagtaagac gtgcttcatt tgagccagaa gatcttttct taggtcacat agcaggaatg1081 gatgcttttg caaaaggctt taaagttgct tacaagcttg tgaaagatgg cgtatttgac1141 aagttcatcg aagaaagata cgcaagctac aaagaaggca ttggcgctga tattgtaagc1201 ggtaaagctg acttcaagag ccttgaaaag tatgcattag agcacagcca gattgtaaac1261 aaatcaggca gacaagagct attagaatca atcctaaatc agtatttgtt tgcagaataa序列(SEQ.ID NO.)10(a)序列特征*長(zhǎng)度440個(gè)氨基酸殘基*類型多肽*鏈型單鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型Protein(c)假設(shè)否
(d)反義否(e)最初來(lái)源Thermoanaerobacterium sachcharolyticum B6A。
MNKYFENVSKIKYEGPKSNNPYSFKFYNPEEVIDGKTMEEHLRFSIAYWHTFTADGTDQFGKATMQRPWNHYTDPMDIAKARVEAAFEFFDKINAPFFCFHDRDIAPEGDTLRETNKNLDTIVAMIKDYLKTSKTKVLFGTANLFSNPRFVHGASTSCNADVFAYSAAQVKKALEITKELGAENYTFWGGREGYETLLNTDMELELDNFARFLHMAVDYAKEIGFEGQFLIEPKPKEPTKHQYDFDVANVLAFLRKYDLDKYFKVNIEANHATLAFHDFQHELRYARINGVLGSIDANEGDMLLGWDTDQFPTDIRMTTLAMYEVIKMGGFDKGGLNFDAKVRRASFEPEDLFLGHIAGMDAFAKGFKVAYKLVKDGVFDKFIEERYASYKEGIGADIVSGKADFKSLEKYALEHSQIVNKSGRQELLESILNQYLFAE*
權(quán)利要求
1.一種精液果糖測(cè)定新方法，其特征在于該方法使用了一種能高效催化果糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖的高活性葡萄糖異構(gòu)酶。
2.權(quán)利要求1項(xiàng)所述的測(cè)定方法，其特征還在于使用chelex 100樹脂或其類似物去除精液中葡萄糖異構(gòu)酶反應(yīng)干擾物質(zhì)。
3.一種分離的DNA分子，其特征在于它是編碼權(quán)利要求1項(xiàng)所述的高活性葡萄糖異構(gòu)酶的核苷酸序列。
4.權(quán)利要求3項(xiàng)所述的DNA分子，其特征在于所述的核苷酸序列具有序列表SEQ.IDNO.3的核苷酸序列或所述核苷酸序列的突變形式(具有≥75％同源性)，所述的突變包括缺失、無(wú)義、插入、錯(cuò)義。
5.權(quán)利要求4項(xiàng)所述的DNA分子，其特征在于所述的核苷酸序列編碼序列表SEQ.IDNO.4中的氨基酸序列的多肽或所述多肽的修飾形式(具有≥90％同源性)，該修飾形式功能上相當(dāng)或與高活性葡萄糖異構(gòu)酶相關(guān)。
6.權(quán)利要求3項(xiàng)所述的DNA分子，其特征還在于所述的核苷酸序列具有序列表SEQ.IDNO.5的核苷酸序列或所述核苷酸序列的突變形式(具有≥75％同源性)，所述的突變包括缺失、無(wú)義、插入、錯(cuò)義。
7.權(quán)利要求6項(xiàng)所述的DNA分子，其特征在于所述的核苷酸序列編碼序列表SEQ.IDNO.6中的氨基酸序列的多肽或所述多肽的修飾形式(具有≥90％同源性)，該修飾形式功能上相當(dāng)或與高活性葡萄糖異構(gòu)酶相關(guān)。
8.權(quán)利要求3項(xiàng)所述的DNA分子，其特征還在于所述的核苷酸序列具有序列表SEQ.IDNO.7的核苷酸序列或所述核苷酸序列的突變形式(具有≥75％同源性)，所述的突變包括缺失、無(wú)義、插入、錯(cuò)義。
9.權(quán)利要求8項(xiàng)所述的DNA分子，其特征在于所述的核苷酸序列編碼序列表SEQ.IDNO.8中的氨基酸序列的多肽或所述多肽的修飾形式(具有≥90％同源性)，該修飾形式功能上相當(dāng)或與高活性葡萄糖異構(gòu)酶相關(guān)。
10.權(quán)利要求3項(xiàng)所述的DNA分子，其特征還在于所述的核苷酸序列具有序列表SEQ.ID NO.9的核苷酸序列或所述核苷酸序列的突變形式(具有≥75％同源性)，所述的突變包括缺失、無(wú)義、插入、錯(cuò)義。
11.權(quán)利要求10項(xiàng)所述的DNA分子，其特征在于所述的核苷酸序列編碼序列表SEQ.ID NO.10中的氨基酸序列的多肽或所述多肽的修飾形式(具有≥90％同源性)，該修飾形式功能上相當(dāng)或與高活性葡萄糖異構(gòu)酶相關(guān)。
12.如權(quán)利要求1項(xiàng)所述的高活性葡萄糖異構(gòu)酶是部分純化或完全純化的酶。
13.如權(quán)利要求1項(xiàng)所述的高活性葡萄糖異構(gòu)酶是液相酶或固相酶。
14.如權(quán)利要求1項(xiàng)所述的高活性葡萄糖異構(gòu)酶可以是以固相細(xì)胞形式存在于大腸桿菌、酵母或其它原核或真核生物細(xì)胞中。
15.權(quán)利要求1項(xiàng)所述的精液果糖測(cè)定方法，可用于男性不育診斷。
16.權(quán)利要求1項(xiàng)所述的精液果糖測(cè)定方法，還可用在測(cè)定其它生物體精液的果糖含量。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種精液果糖測(cè)定新方法。本發(fā)明還公開(kāi)了一系列高活性葡萄糖異構(gòu)酶突變體的氨基酸序列及編碼該酶的核苷酸序列，以及獲得這些高活性葡萄糖異構(gòu)酶突變體的基因與蛋白工程技術(shù)及制備方法。利用本發(fā)明之高活性葡萄糖異構(gòu)酶可用于測(cè)定人體精液、人體內(nèi)其它器官、或其它生物體精漿中果糖的含量。
文檔編號(hào)C12Q1/533GK1693476SQ20041003744
公開(kāi)日2005年11月9日 申請(qǐng)日期2004年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月8日
發(fā)明者傅榮昭, 張琦, 劉喜元, 孫振元 申請(qǐng)人:張駿