專利名稱：小麥TaGI1基因及其克隆與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及小麥中TaGI1基因的克隆、重組、功能分析及其應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
植物由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段向生殖生長(zhǎng)階段的轉(zhuǎn)變，即成花轉(zhuǎn)變，是植物完成整個(gè)生活周期的關(guān)鍵步驟。植物開(kāi)花時(shí)間受內(nèi)在發(fā)育信號(hào)和外部的環(huán)境信號(hào)共同控制。近些年來(lái)的研究表明，主要有四條途徑控制開(kāi)花，分別為光周期促進(jìn)途徑、自主促進(jìn)途徑、春化促進(jìn)途徑和GA促進(jìn)途徑。以擬南芥和水稻等模式植物為對(duì)象，參與光周期促進(jìn)途徑的一些重要基因，如GI、CO，相繼被克隆出來(lái)。擬南芥GI基因突變后導(dǎo)致了其突變體在長(zhǎng)日照條件下延遲開(kāi)花(Koomneef et al.，Mol.Gen.Genet.1991，22957-66)。Curtis等人將擬南芥GI基因的片斷反向轉(zhuǎn)入蘿卜中，結(jié)果造成了轉(zhuǎn)基因蘿卜抽苔和開(kāi)花均延遲(Curtis et al.，Transgenic Res.2002，11249-256)。水稻的GI基因(OsGI)轉(zhuǎn)入水稻中過(guò)量表達(dá)以后使轉(zhuǎn)基因水稻無(wú)論在長(zhǎng)日照條件下還是在短日照條件下都晚開(kāi)花(Hayama et al.Nature 2003，422719-22)。研究證明，GI基因在植物體內(nèi)的表達(dá)水平直接影響著植物的開(kāi)花時(shí)間，進(jìn)而影響植物的生育周期。因此，可以利用植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)來(lái)調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育周期。
長(zhǎng)日照植物小麥?zhǔn)鞘澜缟现匾募Z食作物之一。傳統(tǒng)的主要育種手段之一是引種，也就是把外地或外國(guó)優(yōu)良的作物品種引入當(dāng)?shù)?，作為推廣品種或是育種材料應(yīng)用。但是小麥要完成從種子到種子的一個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育周期，必須通過(guò)春化階段和光照階段，否則就不能正常結(jié)實(shí)獲取產(chǎn)量。但是由于全球各地的光照、溫度等氣候條件差異很大，所以引種工作受到很大的限制。如果能夠利用生物技術(shù)手段調(diào)節(jié)小麥的生長(zhǎng)發(fā)育周期，那么引種的范圍就能夠極大的擴(kuò)大。
鑒于以上所述，本發(fā)明利用反轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)從小麥中分離出三個(gè)GI基因的同源基因。進(jìn)一步構(gòu)建TaGI1的正義表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥，轉(zhuǎn)基因植株較野生型對(duì)照開(kāi)花時(shí)間提前一周左右。該基因可以用于植物遺傳轉(zhuǎn)化，調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育周期。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首次從小麥中分離出三個(gè)TaGI基因的全長(zhǎng)cDNA，分別命名為TaGI1、TaGI2、TaGI3，并將TaGI1全長(zhǎng)cDNA連接到表達(dá)載體上，利用農(nóng)桿菌浸染轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得的轉(zhuǎn)基因植株的開(kāi)花時(shí)間比野生型對(duì)照提前一周左右。
小麥TaGI1(AF543844)基因的開(kāi)放閱讀框架為3465bp，編碼1155aa。將這個(gè)基因編碼的氨基酸序列在GeneBank里進(jìn)行檢索發(fā)現(xiàn)，這個(gè)基因與GI(擬南芥，AY682088)和OsGIP(水稻，AJ133787)有較高的同源性(見(jiàn)附圖1)，其數(shù)值為63％和87％的氨基酸同源性。該結(jié)果表明這個(gè)基因?yàn)閿M南芥GI基因在小麥中的同源基因。該基因序列如下序列表
(1)SEQ ID NO.1的信息(a)序列特征*長(zhǎng)度4012堿基對(duì)*類型核酸*鏈型雙鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型cDNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來(lái)源小麥(f)序列描述SEQ ID NO.11 ctccgtattg gagcgctcct gaccgagaga cgttaagcgc ctatggttgg aactggttga 6061 tatgatatct ggtcacattg tgggatgcaa tcccccctta gtggggggtg attgaagaag 120121 tcaacaatag gaggacttgc atcttgctga agttttctgc ttctgagttt cttgagcagg 180181 ctcttaaact accaagtatg tcagtgtcaa atgggaagtg gattgatggg ctccagttct 240241 catcactgtt ctggcccccg ccacacgatg tgcagcagaa acaggcacaa attttagcct 300301 atgtcgagta ctttgggcag ttcacatctg acagcgagca attcccggag gatgtagctc 360361 agctaattca aagttgctat ccatcaaaag aaaagcggtt ggtagatgaa gtattagcaa 420421 cttttgttct ccatcaccct gaacatggtc atgcagttgt acatccaatt ctttcacgca 480481 tcatagatgg gacactgagt tatgatagtc atggttcccc attcaattcc ttcatctctt 540541 tatttaccca aagttctgag aaagagtact cagagcagtg ggccttggcc tgtggagaaa 600601 ttcttagagt tctaactcac tacaacaggc caatctttaa agttgcagac tgtaaccacc 660661 agatcagacc aggccacagc aagttgtttt gcacagagaa agcaattact cttccaggaa 720721 atgaacccga agggaagcca ttgaggccat tatctccttg gatcacagat attgtgctaa 780781 ctgcaccttt gggcattaga agcgactatt ttagatggtg tggtggagtt atgggaaaat 840841 acgcagctgg tggagaattg aagcctccaa caactgctta cagccgagga gctggcaagc 900901 acccacaact catgccatcc accccaagat gggctgttgc caatggagct ggagttattt 960961 taagtgtctg tgatgaggaa gtagctcgtt atgagacagc aaacttaacc gcggcagctg 10201021 ttcccgccct tctgctacct ccaccgacaa cacccttgga tgagcatttg gtggcagggc 10801081 taccccctct cgaaccatac gctcgcttgt ttcatagata ctacgcaatt gccacaccaa 11401141 gtgctacgca aagattgctt tttggtcttc ttgaagcacc accgtcatgg gctccagatg 12001201 cacttgatgc agcagttcag cttgttgaac tccttcgggc agctgaagat tatgctactg 12601261 gcatgcggct tccaaaaaat tggttgcatc ttcatttctt gcgtgcgatt ggaactgcaa 13201321 tgtctatgag ggctggtatt gctgctgata cagctgctgc gttgcttttt cgcatactat 1380
1381 cccaaccaat gttgcttttt cctccactaa ggcatgctga aggagttgaa gtgcaacatg 14401441 aaccactggg tggctatgta tcatcataca aaagacagct ggaagttcct gcatctgaaa 15001501 ccacaattga tgccactgca caaggcattg cttccttgct gtgtgctcat ggtcctgatg 15601561 ttgagtggag aatatgtacc atctgggaag ctgcctatgg tttgttacct ctgaattcat 16201621 cagcagttga tttacccgaa atcgttgtag ctgctccgct tcagccacct actttgtcat 16801681 ggagcctata cttgccactg ttgaaagtat ttgagtatct acctcgtgga agtccatctg 17401741 aagcatgcct tatgagaata tttgtggcaa cagttgaagc tatactcaga agaactttcc 18001801 cttcggaaac ctctgaatca tctaaaagac caagaagtca atccaagaac cttgctgttg 18601861 ctgaactccg tacgatgata cattcactct ttgttgaatc atgtgcttca atgaaccttg 19201921 cttcccggtt gttgtttgta gtattaactg tttgcgtcag tcatcaagct ttgccagggg 19801981 gcagcaaaag accaactggt agtgaaaacc attcttctga ggaggccact gaggacccaa 20402041 gattaaccaa tggaagaaat agggtcaaga agaaacaagg gcctgttggt acatttgact 21002101 cgtatgtgct ggccgctgtt tgtgccttat cttgcgagct tcagctgttc cctatccttt 21602161 gcaagagcgc aacaaactca aatgtaaaag actctataaa gatcctgaag cctggaaaaa 22202221 acaatgggat cagtaatgag ctacagaaca gcattagctc agcaattctc catactcgta 22802281 gaattcttgg catcctggaa gctcttttct ccttgaagcc atcatcagtt ggtacctcct 23402341 ggaactatag ttcaaatgag atagttgcag cggctatggt tgccgctcat gcttctgagt 24002401 tatttcgccg gtcgaaggca tgcctaaatg cactatcttc cctgaagcga tgtaagtggg 24602461 atgctgagat ttctaccagg gcatcatccc tctaccattt gatcgacttg catggtaaaa 25202521 ctgtgtcctc catcgtgaac aaagctgagc ctctagaagc tcacctgact tttacatcag 25802581 taaagagaga tgatgaacaa cacattgagg aaaatggcac cagctcatcg ggtagtggca 26402641 acttggaaaa gaagaatggt tcagcctcac acatgaaaaa tggtttgtca agaccactct 27002701 tgaaatgctc agaagaggct aggcgaaatg gtaatgttgc aagtacatcc gggaaagttc 27602761 ctgcaacttt acaggctgaa gcttctgatt tggcgaactt ccttaccatg gataggaatg 28202821 gcggttatcg aggctctcag actctcctaa gatctgttat ctcagaaaaa caggaactaa 28802881 gcttctctgt tgtctcattg ctctggcata agcttattgc atctcctgaa acgcagatgt 29402941 ctgcagaaag tacatcagct catcaaggtt ggagaaaggt tgtagatgct ctttgtgatg 30003001 ttgtttcagc ctcaccagcc aaggcttcaa ctgctattgt tctgcaggct gagaaggacc 30603061 tacagccctg gattgctcga gatgatgagg aaggtcagaa gatgtggaga gtcaaccagc 31203121 gaatagttaa actgatagct gagcttatga ggaaccatga tagcccagaa gcattgataa 31803181 ttcttgctag tgcttcagac cttctgcttc gtgctacaga tgggatgctt gttgatggtg 32403241 aagcttgtac cttgcctcag ttagagctcc tggaagtaac tgctagagct attcatctca 33003301 tcgttgaatg gggagaccca ggtgtagcag ttgctgatgg cctctcaaat ctgttaaagt 33603361 gccgtctatc gcctaccatc cgctgcctct cccacgctag cgcacacgta cgtgcgctca 34203421 gcatgtccgt cctccgtgac atcttgaaca gtggaccact aggttccact aagatcattc 34803481 aaggcgagca acggaatggc atccaaagcc cgacctacca atgcgcggca gcaaacacgg 35403541 tgaactggca agcggatgtc gagagatgta tagactggga agcccgcagc cgccgcgcca 36003601 ccgggatgac cctcgccttc ctcaccgctg cggctaacga gctcggctgc ccccttcctt 36603661 gctgacaagg ccatatttgg agctgacaat cagcgacact tgacagttgg cgcgagcagt 37203721 tgctgcatgg tcagcgagca ggatggctaa ttaatccctt gctcaaggat ggcttcccag 37803781 tctgccctgc ccccatgatg tgattcaaaa ctgatgtata ttagctgatg ttcccaatca 38403841 tacggagctt tgctcccccg gtgtgatttt aacttgcaat ctgacgttag atgttcaagc 39003901 atattgaaac tgcttgtgct gtaacttgta ttcatgatgt aaccgaaaga tgtccgctat 39603961 ggtaaatgaa gacatgtcat ttttcgttct ccaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 4012
(2)SEQ ID NO.2的信息(a)序列特征*長(zhǎng)度1155氨基酸*類型氨基酸*鏈型單鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型蛋白質(zhì)(c)序列描述0001 MSVSNGKWID GLQFSSLFWP PPHDVQQKQA QILAYVEYFG QFTSDSEQFP EDVAQLIQSC 600061 YPSKEKRLVD EVLATFVLHH PEHGHAVVHP ILSRIIDGTL SYDSHGSPFN SFISLFTQSS 1200121 EKEYSEQWAL ACGEILRVLT HYNRPIFKVA DCNHQIRPGH SKLFCTEKAI TLPGNEPEGK 1800181 PLRPLSPWIT DIVLTAPLGI RSDYFRWCGG VMGKYAAGGE LKPPTTAYSR GAGKHPQLMP 2400241 STPRWAVANG AGVILSVCDE EVARYETANL TAAAVPALLL PPPTTPLDEH LVAGLPPLEP 3000301 YARLFHRYYA IATPSATQRL LFGLLEAPPS WAPDALDAAV QLVELLRAAE DYATGMRLPK 3600361 NWLHLHFLRA IGTAMSMRAG IAADTAAALL FRILSQPMLL FPPLRHAEGV EVQHEPLGGY 4200421 VSSYKRQLEV PASETTIDAT AQGIASLLCA HGPDVEWRIC TIWEAAYGLL PLNSSAVDLP 4800481 EIVVAAPLQP PTLSWSLYLP LLKVFEYLPR GSPSEACLMR IFVATVEAIL RRTFPSETSE 5400541 SSKRPRSQSK NLAVAELRTM IHSLFVESCA SMNLASRLLF VVLTVCVSHQ ALPGGSKRPT 6000601 GSENHSSEEA TEDPRLTNGR NRVKKKQGPV GTFDSYVLAA VCALSCELQL FPILCKSATN 6600661 SNVKDSIKIL KPGKNNGISN ELQNSISSAI LHTRRILGIL EALFSLKPSS VGTSWNYSSN 7200721 EIVAAAMVAA HASELFRRSK ACLNALSSLK RCKWDAEIST RASSLYHLID LHGKTVSSIV 7800781 NKAEPLEAHL TFTSVKRDDE QHIEENGTSS SGSGNLEKKN GSASHMKNGL SRPLLKCSEE 8400841 ARRNGNVAST SGKVPATLQA EASDLANFLT MDRNGGYRGS QTLLRSVISE KQELSFSVVS 9000901 LLWHKLIASP ETQMSAESTS AHQGWRKVVD ALCDVVSASP AKASTAIVLQ AEKDLQPWIA 9600961 RDDEEGQKMW RVNQRIVKLI AELMRNHDSP EALIILASAS DLLLRATDGM LVDGEACTLP10201021 QLELLEVTAR AIHLIVEWGD PGVAVADGLS NLLKCRLSPT IRCLSHASAH VRALSMSVLR10801081 DILNSGPLGS TKIIQGEQRN GIQSPTYQCA AANTVNWQAD VERCIDWEAR SRRATGMTLA11401141 FLTAAANELG CPLPC 1155從小麥幼葉中提取基因組DNA，然后分別用不同的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，以TaGI1的一段序列為模板合成探針進(jìn)行Southern雜交分析。結(jié)果顯示在小麥基因組中存在三個(gè)GI基因的同源基因，這三個(gè)基因也就是TaGI1、TaGI2和TaGI3(附圖3)。另外，通過(guò)對(duì)于不同的小麥組織器官進(jìn)行的Northen雜交分析表明，TaGI1基因在除胚乳外的各個(gè)組織器官中均有表達(dá)(見(jiàn)附圖2) 。
利用滲透法轉(zhuǎn)化擬南芥，收獲的種子在含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上篩選，將篩選出的抗性苗在GM培養(yǎng)基上與野生型共同培養(yǎng)。結(jié)果表明，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因植株在長(zhǎng)日照和短日照條件下均提早開(kāi)花(見(jiàn)附圖4)。
根據(jù)上述技術(shù)，從小麥中分離到了TaGI1、TaGI2、TaGI3基因，TaGI1基因的過(guò)量表達(dá)能導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因擬南芥提前一周左右開(kāi)花。小麥?zhǔn)鞘澜缧缘闹匾Z食作物，將該基因轉(zhuǎn)入小麥?zhǔn)蛊浔磉_(dá)能夠調(diào)節(jié)小麥的生長(zhǎng)發(fā)育周期和開(kāi)花時(shí)間，具有非常重要的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。


圖1小麥中TaGI1、TaGI2、TaGI3與擬南芥中GI和水稻中OsGIP的氨基酸同源性比較。
圖2TaGI1基因在不同組織器官中的Northern雜交。R(根)，S(莖)，L(葉)，SP(小穗原基)，Spi(小穗)，Em(胚)，En(胚乳)。
圖3TaGI基因Southem雜交。X，Xba I；B，BamH I；N，NdeI。
圖4轉(zhuǎn)基因擬南芥在長(zhǎng)日照和短日照條件下均提早開(kāi)花。
(五)具體發(fā)明實(shí)施方式實(shí)施方式1小麥TaGI1基因的克隆方法(1)RNA的提取采用一步法或RNAkit提取總RNA(2)A第一條鏈的合成取2μg總RNA，加入5×反應(yīng)緩沖液4μl，10mM脫氧核糖核酸(dNTP)2μl，核糖核酸酶抑制劑(40-200u/μl)0.5μl，引物oligodT(1μg/μl)1μl，反轉(zhuǎn)錄酶(10u/μl)2μl，42℃反應(yīng)60分鐘，85℃放置10分鐘終止反應(yīng)，稀釋至200μl。
(3)PCR反應(yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)試劑與條件為首先將下列試劑混在一起10×反應(yīng)緩沖液5μl脫氧核苷酸混合物(dNTP) 4μl正向引物(5μM)4μl反向引物(5μM)4μl模板cDNA 4μlTaqDNA聚合酶 0.5μl總體積50μlPCR反應(yīng)條件為94℃3分鐘；然后進(jìn)入下列循環(huán)94℃1分鐘，56℃1分鐘，72℃1分鐘，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。
(4)基因克隆取2μlPCR產(chǎn)物與pGEM-T載體進(jìn)行連接，操作步驟按Promega公司產(chǎn)品pGEM-T and pGEM-T easy Vector system說(shuō)明書進(jìn)行。然后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株，在表面涂5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和X-gal的含氨芐青霉素(100μg/ml)的LB平板上生長(zhǎng)過(guò)夜。挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜。
(5)質(zhì)粒DNA的提取堿法提取質(zhì)粒DNA。
(6)序列測(cè)定本工作在大連寶生物工程公司進(jìn)行。
(7)5′序列的分離按Clontech公司的SMAR TRACE cDNA AmplificationKit說(shuō)明書進(jìn)行(8)同源檢索利用BLAST軟件將分離出的序列與基因銀行中的序列進(jìn)行比較。
實(shí)施方式2小麥TaGI1基因的核苷酸序列和氨基酸序列分別見(jiàn)“發(fā)明內(nèi)容”部分。
實(shí)施方式3表達(dá)載體的構(gòu)建(1)根據(jù)分離出的TaGI1基因的核苷酸序列，設(shè)計(jì)引物正向引物5′-TATTCTAGACGAGGTGGCGACCGGCATGG-3′反向引物5′-GACGAGCTCCTTAACTACGGTCTTCTGC-3′以根的總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng).
(2)取2μl PCR與pGEM-T載體進(jìn)行連接，操作步驟按Promega公司產(chǎn)品pGEM-T and pGEM-T easy Vector system說(shuō)明書進(jìn)行。然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株，在表面涂5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和X-gal的含氨芐青霉素(100μg/ml)的LB平板上生長(zhǎng)過(guò)夜。挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜。堿法提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行序列測(cè)定。
(3)用BamH1限制性內(nèi)切酶將該基因從pGEM-T載體上切下，與相同酶酶切的pROK II連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)胞，然后在含氨芐青霉素的LB固體平板上培養(yǎng)，對(duì)菌落進(jìn)行PCR鑒定和質(zhì)粒DNA的酶切分析。
(4)將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。
實(shí)施方式4基因功能分析(1)種植擬南芥。
(2)挑取鑒定好的農(nóng)桿菌單克隆于含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)。
(3)離心收集菌體，沉淀用滲透培養(yǎng)基(5％蔗糖，0.1M MgCl2，0.5％SilwetL-77)懸浮，菌液OD600在0.8左右。
(4)將擬南芥花序浸入滲透液中，浸泡5分鐘。
(5)收獲的種子在篩選培養(yǎng)基(1×MS鹽，1％蔗糖，pH5.7，0.8％瓊脂，卡那霉素30μg/ml)篩選，得到抗性植株。
(6)將T3代純合株系種子種于GM培養(yǎng)基上培養(yǎng)，同時(shí)種野生型作對(duì)照，植株抽花序時(shí)統(tǒng)計(jì)蓮座葉的數(shù)目以測(cè)量開(kāi)花時(shí)間。結(jié)果見(jiàn)附圖4。
序列表<110>山東農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>小麥TaGI1基因及其克隆與應(yīng)用<160>1<170>patent In 3.1<210>1<211>4012<212>cDNA<213>小麥(Triticum aestivum L.)<221>1-4012<400>11 CTCCGTATTG GAGCGCTCCT GACCGAGAGA CGTTAAGCGC CTATGGTTGG AACTGGTTGA 6061 TATGATATCT GGTCACATTG TGGGATGCAA TCCCCCCTTA GTGGGGGGTG ATTGAAGAAG 120121 TCAACAATAG GAGGACTTGC ATCTTGCTGA AGTTTTCTGC TTCTGAGTTT CTTGAGCAGG 180181 CTCTTAAACT ACCAAGTATG TCAGTGTCAA ATGGGAAGTG GATTGATGGG CTCCAGTTCT 240241 CATCACTGTT CTGGCCCCCG CCACACGATG TGCAGCAGAA ACAGGCACAA ATTTTAGCCT 300301 ATGTCGAGTA CTTTGGGCAG TTCACATCTG ACAGCGAGCA ATTCCCGGAG GATGTAGCTC 360361 AGCTAATTCA AAGTTGCTAT CCATCAAAAG AAAAGCGGTT GGTAGATGAA GTATTAGCAA 420421 CTTTTGTTCT CCATCACCCT GAACATGGTC ATGCAGTTGT ACATCCAATT CTTTCACGCA 480481 TCATAGATGG GACACTGAGT TATGATAGTC ATGGTTCCCC ATTCAATTCC TTCATCTCTT 540541 TATTTACCCA AAGTTCTGAG AAAGAGTACT CAGAGCAGTG GGCCTTGGCC TGTGGAGAAA 600601 TTCTTAGAGT TCTAACTCAC TACAACAGGC CAATCTTTAA AGTTGCAGAC TGTAACCACC 660661 AGATCAGACC AGGCCACAGC AAGTTGTTTT GCACAGAGAA AGCAATTACT CTTCCAGGAA 720721 ATGAACCCGA AGGGAAGCCA TTGAGGCCAT TATCTCCTTG GATCACAGAT ATTGTGCTAA 780781 CTGCACCTTT GGGCATTAGA AGCGACTATT TTAGATGGTG TGGTGGAGTT ATGGGAAAAT 840841 ACGCAGCTGG TGGAGAATTG AAGCCTCCAA CAACTGCTTA CAGCCGAGGA GCTGGCAAGC 900901 ACCCACAACT CATGCCATCC ACCCCAAGAT GGGCTGTTGC CAATGGAGCT GGAGTTATTT 960961 TAAGTGTCTG TGATGAGGAA GTAGCTCGTT ATGAGACAGC AAACTTAACC GCGGCAGCTG 10201021 TTCCCGCCCT TCTGCTACCT CCACCGACAA CACCCTTGGA TGAGCATTTG GTGGCAGGGC 10801081 TACCCCCTCT CGAACCATAC GCTCGCTTGT TTCATAGATA CTACGCAATT GCCACACCAA 11401141 GTGCTACGCA AAGATTGCTT TTTGGTCTTC TTGAAGCACC ACCGTCATGG GCTCCAGATG 12001201 CACTTGATGC AGCAGTTCAG CTTGTTGAAC TCCTTCGGGC AGCTGAAGAT TATGCTACTG 12601261 GCATGCGGCT TCCAAAAAAT TGGTTGCATC TTCATTTCTT GCGTGCGATT GGAACTGCAA 13201321 TGTCTATGAG GGCTGGTATT GCTGCTGATA CAGCTGCTGC GTTGCTTTTT CGCATACTAT 13801381 CCCAACCAAT GTTGCTTTTT CCTCCACTAA GGCATGCTGA AGGAGTTGAA GTGCAACATG 14401441 AACCACTGGG TGGCTATGTA TCATCATACA AAAGACAGCT GGAAGTTCCT GCATCTGAAA 15001501 CCACAATTGA TGCCACTGCA CAAGGCATTG CTTCCTTGCT GTGTGCTCAT GGTCCTGATG 15601561 TTGAGTGGAG AATATGTACC ATCTGGGAAG CTGCCTATGG TTTGTTACCT CTGAATTCAT 16201621 CAGCAGTTGA TTTACCCGAA ATCGTTGTAG CTGCTCCGCT TCAGCCACCT ACTTTGTCAT 16801681 GGAGCCTATA CTTGCCACTG TTGAAAGTAT TTGAGTATCT ACCTCGTGGA AGTCCATCTG 17401741 AAGCATGCCT TATGAGAATA TTTGTGGCAA CAGTTGAAGC TATACTCAGA AGAACTTTCC 18001801 CTTCGGAAAC CTCTGAATCA TCTAAAAGAC CAAGAAGTCA ATCCAAGAAC CTTGCTGTTG 18601861 CTGAACTCCG TACGATGATA CATTCACTCT TTGTTGAATC ATGTGCTTCA ATGAACCTTG 19201921 CTTCCCGGTT GTTGTTTGTA GTATTAACTG TTTGCGTCAG TCATCAAGCT TTGCCAGGGG 1980
1981 GCAGCAAAAG ACCAACTGGT AGTGAAAACC ATTCTTCTGA GGAGGCCACT GAGGACCCAA 20402041 GATTAACCAA TGGAAGAAAT AGGGTCAAGA AGAAACAAGG GCCTGTTGGT ACATTTGACT 21002101 CGTATGTGCT GGCCGCTGTT TGTGCCTTAT CTTGCGAGCT TCAGCTGTTC CCTATCCTTT 21602161 GCAAGAGCGC AACAAACTCA AATGTAAAAG ACTCTATAAA GATCCTGAAG CCTGGAAAAA 22202221 ACAATGGGAT CAGTAATGAG CTACAGAACA GCATTAGCTC AGCAATTCTC CATACTCGTA 22802281 GAATTCTTGG CATCCTGGAA GCTCTTTTCT CCTTGAAGCC ATCATCAGTT GGTACCTCCT 23402341 GGAACTATAG TTCAAATGAG ATAGTTGCAG CGGCTATGGT TGCCGCTCAT GCTTCTGAGT 24002401 TATTTCGCCG GTCGAAGGCA TGCCTAAATG CACTATCTTC CCTGAAGCGA TGTAAGTGGG 24602461 ATGCTGAGAT TTCTACCAGG GCATCATCCC TCTACCATTT GATCGACTTG CATGGTAAAA 25202521 CTGTGTCCTC CATCGTGAAC AAAGCTGAGC CTCTAGAAGC TCACCTGACT TTTACATCAG 25802581 TAAAGAGAGA TGATGAACAA CACATTGAGG AAAATGGCAC CAGCTCATCG GGTAGTGGCA 26402641 ACTTGGAAAA GAAGAATGGT TCAGCCTCAC ACATGAAAAA TGGTTTGTCA AGACCACTCT 27002701 TGAAATGCTC AGAAGAGGCT AGGCGAAATG GTAATGTTGC AAGTACATCC GGGAAAGTTC 27602761 CTGCAACTTT ACAGGCTGAA GCTTCTGATT TGGCGAACTT CCTTACCATG GATAGGAATG 28202821 GCGGTTATCG AGGCTCTCAG ACTCTCCTAA GATCTGTTAT CTCAGAAAAA CAGGAACTAA 28802881 GCTTCTCTGT TGTCTCATTG CTCTGGCATA AGCTTATTGC ATCTCCTGAA ACGCAGATGT 29402941 CTGCAGAAAG TACATCAGCT CATCAAGGTT GGAGAAAGGT TGTAGATGCT CTTTGTGATG 30003001 TTGTTTCAGC CTCACCAGCC AAGGCTTCAA CTGCTATTGT TCTGCAGGCT GAGAAGGACC 30603061 TACAGCCCTG GATTGCTCGA GATGATGAGG AAGGTCAGAA GATGTGGAGA GTCAACCAGC 31203121 GAATAGTTAA ACTGATAGCT GAGCTTATGA GGAACCATGA TAGCCCAGAA GCATTGATAA 31803181 TTCTTGCTAG TGCTTCAGAC CTTCTGCTTC GTGCTACAGA TGGGATGCTT GTTGATGGTG 32403241 AAGCTTGTAC CTTGCCTCAG TTAGAGCTCC TGGAAGTAAC TGCTAGAGCT ATTCATCTCA 33003301 TCGTTGAATG GGGAGACCCA GGTGTAGCAG TTGCTGATGG CCTCTCAAAT CTGTTAAAGT 33603361 GCCGTCTATC GCCTACCATC CGCTGCCTCT CCCACGCTAG CGCACACGTA CGTGCGCTCA 34203421 GCATGTCCGT CCTCCGTGAC ATCTTGAACA GTGGACCACT AGGTTCCACT AAGATCATTC 34803481 AAGGCGAGCA ACGGAATGGC ATCCAAAGCC CGACCTACCA ATGCGCGGCA GCAAACACGG 35403541 TGAACTGGCA AGCGGATGTC GAGAGATGTA TAGACTGGGA AGCCCGCAGC CGCCGCGCCA 36003601 CCGGGATGAC CCTCGCCTTC CTCACCGCTG CGGCTAACGA GCTCGGCTGC CCCCTTCCTT 36603661 GCTGACAAGG CCATATTTGG AGCTGACAAT CAGCGACACT TGACAGTTGG CGCGAGCAGT 37203721 TGCTGCATGG TCAGCGAGCA GGATGGCTAA TTAATCCCTT GCTCAAGGAT GGCTTCCCAG 37803781 TCTGCCCTGC CCCCATGATG TGATTCAAAA CTGATGTATA TTAGCTGATG TTCCCAATCA 38403841 TACGGAGCTT TGCTCCCCCG GTGTGATTTT AACTTGCAAT CTGACGTTAG ATGTTCAAGC 39003901 ATATTGAAAC TGCTTGTGCT GTAACTTGTA TTCATGATGT AACCGAAAGA TGTCCGCTAT 39603961 GGTAAATGAA GACATGTCAT TTTTCGTTCT CCAAAAAAAA AAAAAAAAAA AA 401權(quán)利要求
1.一種克隆的控制小麥花發(fā)育的基因TaGI1，其特征在于它具有下述所示的序列01 CTCCGTATTG GAGCGCTCCT GACCGAGAGA CGTTAAGCGC CTATGGTTGG AACTGGTTGA 6061 TATGATATCT GGTCACATTG TGGGATGCAA TCCCCCCTTA GTGGGGGGTG ATTGAAGAAG 120121 TCAACAATAG GAGGACTTGC ATCTTGCTGA AGTTTTCTGC TTCTGAGTTT CTTGAGCAGG 180181 CTCTTAAACT ACCAAGTATG TCAGTGTCAA ATGGGAAGTG GATTGATGGG CTCCAGTTCT 240241 CATCACTGTT CTGGCCCCCG CCACACGATG TGCAGCAGAA ACAGGCACAA ATTTTAGCCT 300301 ATGTCGAGTA CTTTGGGCAG TTCACATCTG ACAGCGAGCA ATTCCCGGAG GATGTAGCTC 360361 AGCTAATTCA AAGTTGCTAT CCATCAAAAG AAAAGCGGTT GGTAGATGAA GTATTAGCAA 420421 CTTTTGTTCT CCATCACCCT GAACATGGTC ATGCAGTTGT ACATCCAATT CTTTCACGCA 480481 TCATAGATGG GACACTGAGT TATGATAGTC ATGGTTCCCC ATTCAATTCC TTCATCTCTT 540541 TATTTACCCA AAGTTCTGAG AAAGAGTACT CAGAGCAGTG GGCCTTGGCC TGTGGAGAAA 600601 TTCTTAGAGT TCTAACTCAC TACAACAGGC CAATCTTTAA AGTTGCAGAC TGTAACCACC 660661 AGATCAGACC AGGCCACAGC AAGTTGTTTT GCACAGAGAA AGCAATTACT CTTCCAGGAA 720721 ATGAACCCGA AGGGAAGCCA TTGAGGCCAT TATCTCCTTG GATCACAGAT ATTGTGCTAA 780781 CTGCACCTTT GGGCATTAGA AGCGACTATT TTAGATGGTG TGGTGGAGTT ATGGGAAAAT 840841 ACGCAGCTGG TGGAGAATTG AAGCCTCCAA CAACTGCTTA CAGCCGAGGA GCTGGCAAGC 900901 ACCCACAACT CATGCCATCC ACCCCAAGAT GGGCTGTTGC CAATGGAGCT GGAGTTATTT 960961 TAAGTGTCTG TGATGAGGAA GTAGCTCGTT ATGAGACAGC AAACTTAACC GCGGCAGCTG 10201021 TTCCCGCCCT TCTGCTACCT CCACCGACAA CACCCTTGGA TGAGCATTTG GTGGCAGGGC 10801081 TACCCCCTCT CGAACCATAC GCTCGCTTGT TTCATAGATA CTACGCAATT GCCACACCAA 11401141 GTGCTACGCA AAGATTGCTT TTTGGTCTTC TTGAAGCACC ACCGTCATGG GCTCCAGATG 12001201 CACTTGATGC AGCAGTTCAG CTTGTTGAAC TCCTTCGGGC AGCTGAAGAT TATGCTACTG 12601261 GCATGCGGCT TCCAAAAAAT TGGTTGCATC TTCATTTCTT GCGTGCGATT GGAACTGCAA 13201321 TGTCTATGAG GGCTGGTATT GCTGCTGATA CAGCTGCTGC GTTGCTTTTT CGCATACTAT 13801381 CCCAACCAAT GTTGCTTTTT CCTCCACTAA GGCATGCTGA AGGAGTTGAA GTGCAACATG 14401441 AACCACTGGG TGGCTATGTA TCATCATACA AAAGACAGCT GGAAGTTCCT GCATCTGAAA 15001501 CCACAATTGA TGCCACTGCA CAAGGCATTG CTTCCTTGCT GTGTGCTCAT GGTCCTGATG 15601561 TTGAGTGGAG AATATGTACC ATCTGGGAAG CTGCCTATGG TTTGTTACCT CTGAATTCAT 16201621 CAGCAGTTGA TTTACCCGAA ATCGTTGTAG CTGCTCCGCT TCAGCCACCT ACTTTGTCAT 16801681 GGAGCCTATA CTTGCCACTG TTGAAAGTAT TTGAGTATCT ACCTCGTGGA AGTCCATCTG 17401741 AAGCATGCCT TATGAGAATA TTTGTGGCAA CAGTTGAAGC TATACTCAGA AGAACTTTCC 18001801 CTTCGGAAAC CTCTGAATCA TCTAAAAGAC CAAGAAGTCA ATCCAAGAAC CTTGCTGTTG 18601861 CTGAACTCCG TACGATGATA CATTCACTCT TTGTTGAATC ATGTGCTTCA ATGAACCTTG 19201921 CTTCCCGGTT GTTGTTTGTA GTATTAACTG TTTGCGTCAG TCATCAAGCT TTGCCAGGGG 19801981 GCAGCAAAAG ACCAACTGGT AGTGAAAACC ATTCTTCTGA GGAGGCCACT GAGGACCCAA 20402041 GATTAACCAA TGGAAGAAAT AGGGTCAAGA AGAAACAAGG GCCTGTTGGT ACATTTGACT 21002101 CGTATGTGCT GGCCGCTGTT TGTGCCTTAT CTTGCGAGCT TCAGCTGTTC CCTATCCTTT 21602161 GCAAGAGCGC AACAAACTCA AATGTAAAAG ACTCTATAAA GATCCTGAAG CCTGGAAAAA 22202221 ACAATGGGAT CAGTAATGAG CTACAGAACA GCATTAGCTC AGCAATTCTC CATACTCGTA 22802281 GAATTCTTGG CATCCTGGAA GCTCTTTTCT CCTTGAAGCC ATCATCAGTT GGTACCTCCT 23402341 GGAACTATAG TTCAAATGAG ATAGTTGCAG CGGCTATGGT TGCCGCTCAT GCTTCTGAGT 24002401 TATTTCGCCG GTCGAAGGCA TGCCTAAATG CACTATCTTC CCTGAAGCGA TGTAAGTGGG 24602461 ATGCTGAGAT TTCTACCAGG GCATCATCCC TCTACCATTT GATCGACTTG CATGGTAAAA 25202521 CTGTGTCCTC CATCGTGAAC AAAGCTGAGC CTCTAGAAGC TCACCTGACT TTTACATCAG 25802581 TAAAGAGAGA TGATGAACAA CACATTGAGG AAAATGGCAC CAGCTCATCG GGTAGTGGCA 26402641 ACTTGGAAAA GAAGAATGGT TCAGCCTCAC ACATGAAAAA TGGTTTGTCA AGACCACTCT 27002701 TGAAATGCTC AGAAGAGGCT AGGCGAAATG GTAATGTTGC AAGTACATCC GGGAAAGTTC 27602761 CTGCAACTTT ACAGGCTGAA GCTTCTGATT TGGCGAACTT CCTTACCATG GATAGGAATG 28202821 GCGGTTATCG AGGCTCTCAG ACTCTCCTAA GATCTGTTAT CTCAGAAAAA CAGGAACTAA 28802881 GCTTCTCTGT TGTCTCATTG CTCTGGCATA AGCTTATTGC ATCTCCTGAA ACGCAGATGT 29402941 CTGCAGAAAG TACATCAGCT CATCAAGGTT GGAGAAAGGT TGTAGATGCT CTTTGTGATG 30003001 TTGTTTCAGC CTCACCAGCC AAGGCTTCAA CTGCTATTGT TCTGCAGGCT GAGAAGGACC 30603061 TACAGCCCTG GATTGCTCGA GATGATGAGG AAGGTCAGAA GATGTGGAGA GTCAACCAGC 31203121 GAATAGTTAA ACTGATAGCT GAGCTTATGA GGAACCATGA TAGCCCAGAA GCATTGATAA 31803181 TTCTTGCTAG TGCTTCAGAC CTTCTGCTTC GTGCTACAGA TGGGATGCTT GTTGATGGTG 32403241 AAGCTTGTAC CTTGCCTCAG TTAGAGCTCC TGGAAGTAAC TGCTAGAGCT ATTCATCTCA 33003301 TCGTTGAATG GGGAGACCCA GGTGTAGCAG TTGCTGATGG CCTCTCAAAT CTGTTAAAGT 33603361 GCCGTCTATC GCCTACCATC CGCTGCCTCT CCCACGCTAG CGCACACGTA CGTGCGCTCA 34203421 GCATGTCCGT CCTCCGTGAC ATCTTGAACA GTGGACCACT AGGTTCCACT AAGATCATTC 34803481 AAGGCGAGCA ACGGAATGGC ATCCAAAGCC CGACCTACCA ATGCGCGGCA GCAAACACGG 35403541 TGAACTGGCA AGCGGATGTC GAGAGATGTA TAGACTGGGA AGCCCGCAGC CGCCGCGCCA 36003601 CCGGGATGAC CCTCGCCTTC CTCACCGCTG CGGCTAACGA GCTCGGCTGC CCCCTTCCTT 36603661 GCTGACAAGG CCATATTTGG AGCTGACAAT CAGCGACACT TGACAGTTGG CGCGAGCAGT 37203721 TGCTGCATGG TCAGCGAGCA GGATGGCTAA TTAATCCCTT GCTCAAGGAT GGCTTCCCAG 37803781 TCTGCCCTGC CCCCATGATG TGATTCAAAA CTGATGTATA TTAGCTGATG TTCCCAATCA 38403841 TACGGAGCTT TGCTCCCCCG GTGTGATTTT AACTTGCAAT CTGACGTTAG ATGTTCAAGC 39003901 ATATTGAAAC TGCTTGTGCT GTAACTTGTA TTCATGATGT AACCGAAAGA TGTCCGCTAT 39603961 GGTAAATGAA GACATGTCAT TTTTCGTTCT CCAAAAAAAA AAAAAAAAAA AA 4012
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種小麥TaGI1基因的功能，其特征在于該基因在擬南芥中過(guò)量表達(dá)，能促進(jìn)轉(zhuǎn)基因擬南芥提早開(kāi)花。
全文摘要
本發(fā)明涉及小麥中TaGI1基因的克隆、重組及功能分析與應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域。從小麥的小穗中提取總RNA，然后將2微克總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)GI(擬南芥)和OsGI(水稻)中保守的核苷酸序列，設(shè)計(jì)一對(duì)兼并引物，進(jìn)行常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，PCR產(chǎn)物連接到pGEM－T載體上，轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)胞，進(jìn)行序列測(cè)定。然后進(jìn)行3′和5′末端快速擴(kuò)增獲得全長(zhǎng)的cDNA。測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增出三條同源性很高的序列，分別命名為TaGI1、TaGI2和TaGI3。進(jìn)一步利用TaGI1全長(zhǎng)cDNA構(gòu)建正義表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化擬南芥。轉(zhuǎn)基因擬南芥比對(duì)照野生型擬南芥提早一周左右開(kāi)花。因此，該基因轉(zhuǎn)化小麥、水稻等作物，將會(huì)調(diào)節(jié)其生長(zhǎng)發(fā)育周期，對(duì)其產(chǎn)量和育種能夠產(chǎn)生重大影響，具有非常重要的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
文檔編號(hào)C12N15/29GK1648252SQ20041003591
公開(kāi)日2005年8月3日 申請(qǐng)日期2004年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月13日
發(fā)明者張憲省, 趙翔宇, 李祥 申請(qǐng)人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)