專利名稱：利用三環(huán)葵烷-9-基-二硫代碳酸酯鉀鹽誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元分化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)細(xì)胞分化的方法，尤其涉及一種利用三環(huán)[5.2.1.02，6]葵烷-9-基-二硫代碳酸酯鉀鹽(D609)誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元分化的方法。
背景技術(shù)：
D609(tricyclodecane-9-yl-xanthogenate)是磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C(PC-PLC)的特異性抑制劑，它能專一高效地抑制PC-PLC的活性而不影響磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(PI-PLC)、磷脂酶D(PLD)的活性，具有抗病毒，抗癌，抗炎和抗凋亡等一系列的生物學(xué)功能和活性，因而成為研究PC-PLC功能的良好工具。最近的研究表明D609作為黃酸鹽的衍生物，是一種強(qiáng)的電介質(zhì)，在溶液中很容易解離成為黃酸鹽陽離子和堿陰離子，這種黃酸鹽陽離子和質(zhì)子化了的黃酸包括一個自由的硫醇基部分，這部分基團(tuán)具有高度還原性，這一點(diǎn)暗示了D609可以作為潛在的抗氧化劑行使功能。實(shí)驗(yàn)也表明，D609是一種潛在的抗氧化劑，它可以抑制由離子輻射(IR)誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞氧壓，并能使受IR誘導(dǎo)瀕臨致死的實(shí)驗(yàn)動物免于死亡。
但是，在現(xiàn)有的諸項(xiàng)對D609的研究報道中，多是把D609作為一種研究PC-PLC的工具或者作為一種抗氧化劑進(jìn)行實(shí)用，而利用D609作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)細(xì)胞分化，特別是誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞專一定向分化成神經(jīng)元的研究，經(jīng)權(quán)威機(jī)構(gòu)檢索查新，目前國內(nèi)外尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，創(chuàng)立一種利用D609作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)細(xì)胞分化的新用途，提出一種利用D609誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元分化的新方法。
本發(fā)明的利用D609誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元分化的方法，由以下步驟組成1)選取處于對數(shù)生長期的骨髓基質(zhì)細(xì)胞，接種于培養(yǎng)板各孔中的蓋玻片上，置于飽和濕度、5％的CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)，在含有20％小牛血清的M199培養(yǎng)液中培養(yǎng)，至細(xì)胞生長達(dá)到蓋玻片面積的80％～90％；2)用無血清培養(yǎng)液將上述培養(yǎng)板各孔中的細(xì)胞清洗1～2次，然后對培養(yǎng)板各孔中的細(xì)胞進(jìn)行分組，確定對照組和誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組，每組不少于4孔；3)對照組的骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液采用去除血清的M199培養(yǎng)基，誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞培養(yǎng)液除使用對照組培養(yǎng)液外還添加了濃度為2mg/L～12mg/L的D609；4)分別調(diào)整上述對照組和誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組骨髓基質(zhì)細(xì)胞的pH值，使pH為7.2，置于飽和濕度、5％的CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)20～30分鐘；5)將步驟4)中對照組和誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組骨髓基質(zhì)細(xì)胞pH調(diào)為7.4-7.8，置于飽和濕度、5％的CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，誘導(dǎo)2～8小時，檢測誘導(dǎo)結(jié)果。
上述培養(yǎng)板為24孔培養(yǎng)板。
上述誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組的培養(yǎng)液中，各孔添加D609的濃度依次為2mg/L、4mg/L、6mg/L、8mg/L、10mg/L、12mg/L。
上述誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組的培養(yǎng)液中，各孔添加D609的濃度為4mg/L、6mg/L、8mg/L。
上述誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組的培養(yǎng)液中，各孔添加D609的濃度為6mg/L。
上述步驟5)中對照組和誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組骨髓基質(zhì)細(xì)胞pH調(diào)為7.4-7.5，培養(yǎng)誘導(dǎo)時間為3～5小時。
上述步驟5)中對照組和誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組經(jīng)培養(yǎng)誘導(dǎo)完畢的細(xì)胞，還可再分別去除其培養(yǎng)液，用無血清的M199培養(yǎng)液沖洗1～2次，向?qū)φ战M加入含有20μg/L堿性成纖維生長因子(bFGF)的無血清M199培養(yǎng)液，向誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組加入含有20μg/L bFGF和2mg/L～12mg/L濃度D609的無血清M199培養(yǎng)液，pH調(diào)為7.4-7.5，置于飽和濕度、5％的CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，維持誘導(dǎo)3天，檢測誘導(dǎo)結(jié)果。
其中，誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組中加入的D609濃度為4mg/L～8mg/L。
其中，誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組中加入的D609濃度為6mg/L。
為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面以具體的誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)，來說明D609作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)細(xì)胞分化的新用途以及本發(fā)明實(shí)驗(yàn)方法的有效性。
骨髓基質(zhì)細(xì)胞的制備無菌條件下，用12號骨髓穿刺針自健康成人髖骨粗隆部穿刺得骨髓2mL，混合于加有肝素鈉的5ml生理鹽水中，反復(fù)抽吸吹打制成單細(xì)胞懸液后，防止骨髓凝固，取骨髓液3～4ml緩慢注入預(yù)先加入4ml淋巴細(xì)胞分離液的試管內(nèi)，進(jìn)行密度離心，2500r/min離心30min，去除上層脂肪及部分上清，吸取中間的單核細(xì)胞界面層，用無血清的M199(Hyclone)洗滌、1000r/min離心5min，去上清，重復(fù)洗滌1次。加入4mL含有20％小牛血清(Hyclone)的M199(Hyclone)培養(yǎng)液中，種于塑料培養(yǎng)皿中，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為105個/mL，置于37℃、5％CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3天后開始換液，清除未貼壁的細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)每隔3-4天更換一次培養(yǎng)液。待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿底面后， 用含有0.02％EDTA和0.05％的胰酶的消化液進(jìn)行消化、傳代培養(yǎng)。選取生長狀態(tài)良好的、且處于對數(shù)生長期的骨髓基質(zhì)細(xì)胞備用。
選取上述處于對數(shù)生長期的骨髓基質(zhì)細(xì)胞，接種于24孔培養(yǎng)板各孔中的蓋玻片上，置于飽和濕度、5％的CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)，在含有20％小牛血清的M199培養(yǎng)液中培養(yǎng)，至細(xì)胞生長達(dá)到蓋玻片面積的80％～90％；用無血清培養(yǎng)液將上述培養(yǎng)板各孔中的細(xì)胞清洗1次，然后對培養(yǎng)板各孔中的細(xì)胞進(jìn)行分組，確定對照組和誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組，每組不少于4孔；對照組的骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液采用去除血清的M199培養(yǎng)基，誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞培養(yǎng)液除使用對照組培養(yǎng)液外，各孔還依次添加了濃度為2mg/L、4mg/L、6mg/L、8mg/L、10mg/L、12mg/L的D609；分別調(diào)整上述對照組和誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組骨髓基質(zhì)細(xì)胞的pH值，使pH為7.2，置于飽和濕度、5％的CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)20～30分鐘；之后，將對照組和誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組骨髓基質(zhì)細(xì)胞pH調(diào)為7.4，置于飽和濕度、5％的CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，誘導(dǎo)2～8小時，檢測誘導(dǎo)結(jié)果。
對于上述對照組和誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組經(jīng)培養(yǎng)誘導(dǎo)完畢的細(xì)胞，還可再分別去除其培養(yǎng)液，用無血清的M199培養(yǎng)液沖洗2次，向?qū)φ战M加入含有20μg/L bFGF的無血清M199培養(yǎng)液，向誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組加入含有20μg/L bFGF和各孔依次濃度為4mg/L、6mg/L、8mg/L的D609的無血清M199培養(yǎng)液，pH調(diào)為7.4，置于飽和濕度、5％的CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，維持誘導(dǎo)3天，檢測誘導(dǎo)結(jié)果。
上述同樣實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次，綜合分析、統(tǒng)計和匯總結(jié)果。
倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化對照組骨髓基質(zhì)細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上并沒有發(fā)生改變，基本保持原來的形態(tài)；而D609處理組在改用含D609的誘導(dǎo)液培養(yǎng)后2小時即可見細(xì)胞形態(tài)開始發(fā)生變化；3小時，細(xì)胞胞體變圓，變透亮，并有突起長出，隨后一些細(xì)胞突起變多、變長，突起數(shù)目由開始的2個雙極狀，發(fā)展到3～5個不等的多級狀，有些細(xì)胞間突起互相連接，形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出神經(jīng)細(xì)胞樣的形態(tài)。(見圖1)免疫細(xì)胞化學(xué)染色采用間接免疫熒光法，取對照組和誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，經(jīng)純丙酮固定后，使用SABC-AP法鑒定細(xì)胞成分(一抗分別為兔抗人神經(jīng)元特異性烯醇化酶NSE、兔抗人膠質(zhì)纖維酸性蛋白GFAP)，二抗為生物素化羊抗兔IgG，具體操作方法按試劑盒內(nèi)說明書進(jìn)行)，以確定D609誘導(dǎo)分化的細(xì)胞是否為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，5-溴-4-氟-3-吲哚磷酸/氮藍(lán)四唑(BCIP/NBT)顯色法顯色，著棕色的細(xì)胞判斷為陽性。陽性對照為星形細(xì)胞瘤和神經(jīng)元腫瘤(公司提供)，陰性對照孔是將-抗換用磷酸緩沖液(PBS)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組細(xì)胞NSE和GFAP表達(dá)為陰性，而在D609處理組中，NSE有大量表達(dá)，而GFAP表達(dá)結(jié)果呈陰性(見圖2)。NSE是神經(jīng)元的特異性標(biāo)志物，GFAP是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物。說明骨髓基質(zhì)細(xì)胞可以被D609誘導(dǎo)分化成神經(jīng)元，而不是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。
統(tǒng)計處理相差顯微鏡下觀察照相，每孔采用雙人雙盲法隨機(jī)記數(shù)至少100個細(xì)胞，計算陽性細(xì)胞百分比例。結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)約有85％的細(xì)胞NSE染色呈陽性，說明有大約85％的骨髓基質(zhì)細(xì)胞分化為神經(jīng)元細(xì)胞，分化率很高。
D609處理細(xì)胞隨時間NSE表達(dá)的陽性細(xì)胞率時間/h 分化率/％0 03 4.8±2.06 85.6±1.29 86.3±2.172 83.8±1.4蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)收集各組細(xì)胞，用冷的磷酸緩沖液(PBS)清洗3次，在細(xì)胞裂解液[50mmol/L 乙二胺四乙酸，2％十二烷基硫酸鈉(SDS)，5mmol/L二硫蘇糖醇，0.5mmol/L苯甲基磺酰氟化物]100μl中裂解15min后，沸水浴變性5～10min，15000r/min離心20min，收集上清蛋白質(zhì)樣本，測定蛋白質(zhì)含量。取50～100μg蛋白在15％SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，之后將蛋白質(zhì)在電轉(zhuǎn)移電泳槽中轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜。取出膜后用正常山羊血清室溫下封閉3小時，然后置于雜交袋中，加入一抗(GFAP、NSE、神經(jīng)巢蛋白nestin)，4℃孵育過夜，羊抗小鼠-堿性磷酸酶(1∶1000)，37℃孵育60～120分鐘，BCIP/NBT顯色，記錄結(jié)果。誘導(dǎo)前NSE、nestin均無表達(dá)，而誘導(dǎo)后6小時nestin有表達(dá)，誘導(dǎo)3天后，nestin表達(dá)消失，NSE表達(dá)增強(qiáng)；GFAP誘導(dǎo)前后無表達(dá)。說明在整個誘導(dǎo)分化過程中，各種標(biāo)記物表達(dá)順序與神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育分化過程相同，即先表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物nestin；然后出現(xiàn)早期的神經(jīng)標(biāo)記物NSE，而在我們的實(shí)驗(yàn)中，GFAP始終沒有表達(dá)，說明D609能夠?qū)Ｒ恍缘恼T導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞分化為神經(jīng)元，并不向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化。
逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)使用Trizol試劑(GIBCOCRL公司)進(jìn)行誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞總RNA抽提，RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件參照試劑盒操作說明，反應(yīng)體系為50μl，逆轉(zhuǎn)錄與PCR一步完成，擴(kuò)增產(chǎn)物用15％瓊脂糖凝膠電泳后，使用紫外透射儀進(jìn)行觀察。人nestin引物其上游序列為5’-CAGGCTTCTCTTGGCTTTCTGG-3’，下游序列為5’-TGGTGAGGGTTGAGGTTTGT-3’。結(jié)果發(fā)現(xiàn)D609誘導(dǎo)組誘導(dǎo)6小時，nestin出現(xiàn)表達(dá)，誘導(dǎo)3天時，表達(dá)消失。這一結(jié)果與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，說明由骨髓基質(zhì)細(xì)胞分化的細(xì)胞先表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物nestin，具有神經(jīng)細(xì)胞的特征。
在其分化后的第三天，我們應(yīng)用膜片鉗技術(shù)初步檢測了分化的神經(jīng)元的電生理特征，這一結(jié)論得到了進(jìn)一步的證明。
膜片鉗技術(shù)應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄單細(xì)胞離子電流。所用微電極用兩步法拉制而成，制成的微電極充灌電極液后電阻在2～3MΩ之間。為將準(zhǔn)備好的微電極連于膜片鉗儀的探頭上。將含有分化的神經(jīng)元的蓋玻片置于浴槽中，選擇那些具有錐體狀胞體及明顯軸突和樹突、細(xì)胞體積較大的細(xì)胞進(jìn)行記錄。經(jīng)免疫組化證實(shí)這些細(xì)胞均為NSE陽性的神經(jīng)元。用正常臺氏液以3ml/min恒速灌流沖洗細(xì)胞表面，形成高阻封接(＞10GΩ)后，用脈沖式抽吸打破細(xì)胞膜，形成全細(xì)胞構(gòu)型，用電壓鉗和電流鉗模式進(jìn)行刺激，電極液和細(xì)胞外液之間的液接電位10～11mV，實(shí)驗(yàn)室溫19～22℃，信號輸入經(jīng)過1kHz的濾波，數(shù)據(jù)存于計算機(jī)，實(shí)驗(yàn)過程由計算機(jī)軟件pCLAMP6.04控制，數(shù)—模轉(zhuǎn)換器完成刺激信號的產(chǎn)生、反饋信號的采集以及數(shù)據(jù)分析。
我們發(fā)現(xiàn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞分化的神經(jīng)元的電生理特征得到了初步證實(shí)，可誘發(fā)出動作電位，并可記錄到外向的鉀電流。這些說明骨髓基質(zhì)細(xì)胞分化的神經(jīng)元具有初步的電生理特征，進(jìn)一步證明了誘導(dǎo)后的分化細(xì)胞是神經(jīng)細(xì)胞。
通過上述實(shí)驗(yàn)方法和綜合分析、統(tǒng)計結(jié)果表明，NSE蛋白的表達(dá)暗示了由D609誘導(dǎo)的分化細(xì)胞具有神經(jīng)元的特征。而且，本實(shí)驗(yàn)方法還發(fā)現(xiàn)D609誘導(dǎo)的細(xì)胞基本不表達(dá)GFAP等膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物，說明D609誘導(dǎo)具有定向性，主要朝神經(jīng)元方向分化，而不是向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化。并且我們獲得了很高的分化率，NSE陽性率可以達(dá)到85％，這是別的誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)所不能達(dá)到的。
本發(fā)明使用的這種誘導(dǎo)方法，在誘導(dǎo)細(xì)胞分化方面具有重要意義，本發(fā)明創(chuàng)立的利用D609作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)細(xì)胞分化的新用途，為干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化和其臨床應(yīng)用提供了新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。


圖1是相差顯微鏡下所示骨髓基質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。
其中A為去除血清的對照組，B為用含有6mg/L濃度的D609處理的骨髓基質(zhì)細(xì)胞組。
圖2是用D609處理的骨髓基質(zhì)細(xì)胞的NSE和GFAP的表達(dá)其中A為骨髓基質(zhì)細(xì)胞的NSE表達(dá)陽性，B為骨髓基質(zhì)細(xì)胞的GFAP表達(dá)陰性。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1無菌條件下，用12號骨髓穿刺針自健康成人髖骨粗隆部穿刺得骨髓2mL，混合于加有肝素鈉的5ml生理鹽水中，反復(fù)抽吸吹打制成單細(xì)胞懸液后，防止骨髓凝固，取骨髓液3～4ml緩慢注入預(yù)先加入4ml淋巴細(xì)胞分離液的試管內(nèi)，進(jìn)行密度離心，2500r/min離心30min，去除上層脂肪及部分上清，吸取中間的單核細(xì)胞界面層，用無血清的M199(Hyclone)洗滌、1000r/min離心5min，去上清，重復(fù)洗滌1次。加入4mL含有20％小牛血清(Hyclone)的M199(Hyclone)培養(yǎng)液中，種于塑料培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿底面后，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。選取生長狀態(tài)良好的、且處于對數(shù)生長期的骨髓基質(zhì)細(xì)胞備用。將骨髓基質(zhì)細(xì)胞種于24孔培養(yǎng)板各孔中的蓋玻片上，待細(xì)胞生長達(dá)到蓋玻片面積的80％～90％后，進(jìn)行誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞經(jīng)無血清培養(yǎng)液清洗一次后進(jìn)行分組，分為對照組、4mg/L(培養(yǎng)液)D609組、每組6孔；對照組培養(yǎng)液使用去除血清的M199培養(yǎng)基，D609處理組細(xì)胞加入了含4mg/LD609的無血清M199培養(yǎng)液，分別調(diào)整上述對照組和誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組骨髓基質(zhì)細(xì)胞的pH值，使pH為7.2，置于飽和濕度、5％的CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)30分鐘；之后，將對照組和誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組骨髓基質(zhì)細(xì)胞pH調(diào)為7.4，置于飽和濕度、5％的CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，誘導(dǎo)4.5小時，每隔1.5小時，在倒置顯微鏡下觀察一次細(xì)胞的變化，然后用移液管分別吸去對照組和D609處理組的培養(yǎng)液，用無血清的M199培養(yǎng)液清洗一次，對照組加入含有20μg/L bFGF的無血清的M199培養(yǎng)液，D609處理組加入20μg/L bFGF和4mg/L D609的無血清M199培養(yǎng)液，維持誘導(dǎo)3天。采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色的方法檢測神經(jīng)元的特異性標(biāo)記物NSE和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)記物GFAP的表達(dá)情況，結(jié)果表明NSE的表達(dá)呈陽性，而GFAP的表達(dá)呈陰性。并計算分化為神經(jīng)元的百分率為80％。說明4mg/L D609可以誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞分化為神經(jīng)元，而且，本研究發(fā)現(xiàn)D609誘導(dǎo)的細(xì)胞基本不表達(dá)GFAP等膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物，說明D609誘導(dǎo)具有定向性，主要朝神經(jīng)元方向分化，而不是膠質(zhì)細(xì)胞。
實(shí)施例2將骨髓基質(zhì)細(xì)胞種于24孔的細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞生長達(dá)到80％～90％融合后，進(jìn)行誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞經(jīng)無血清培養(yǎng)液清洗2次后進(jìn)行分組，分為對照組、6mg/L(培養(yǎng)液)D609組、每組6孔；對照組培養(yǎng)液使用去除血清的M199培養(yǎng)基，D609處理組細(xì)胞加入了含6mg/L D609的無血清M199培養(yǎng)液，分別調(diào)整上述對照組和誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組骨髓基質(zhì)細(xì)胞的pH值，使pH為7.2，置于飽和濕度、5％的CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)20分鐘；之后，將對照組和誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組骨髓基質(zhì)細(xì)胞pH調(diào)為7.4，置于飽和濕度、5％的CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，誘導(dǎo)6小時，在倒置顯微鏡下每2小時觀察一次細(xì)胞的變化，然后用移液管分別吸去對照組和D609處理組的培養(yǎng)液，用無血清的M199培養(yǎng)液清洗一次，對照組加入含有20μg/L bFGF的無血清M199培養(yǎng)液，D609處理組加入20μg/L bFGF和6mg/L D609的無血清M199培養(yǎng)液，維持誘導(dǎo)3天。然后使用蛋白質(zhì)印跡法檢測了GFAP，NSE，nestin的表達(dá)，結(jié)果并沒有發(fā)現(xiàn)GFAP有表達(dá)，而NSE、nestin都有表達(dá)。使用逆轉(zhuǎn)錄PCR的方法檢測了nestin的mRNA的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)nestin mRNA出現(xiàn)表達(dá)。說明通過該種實(shí)驗(yàn)方法，D609能誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元分化，并且其分化率很高可以達(dá)到85％，并維持3天的狀態(tài)。
實(shí)施例3將骨髓基質(zhì)細(xì)胞種于24孔的細(xì)胞培養(yǎng)板各孔中的蓋玻片上，待細(xì)胞生長達(dá)到蓋玻片面積的80％～90％后，進(jìn)行誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞經(jīng)無血清培養(yǎng)液清洗一次后進(jìn)行分組，分為對照組、8mg/L(培養(yǎng)液)D609組、每組6孔；對照組培養(yǎng)液使用去除血清的M199培養(yǎng)基，D609處理組細(xì)胞加入了含8mg/L D609的無血清M199培養(yǎng)液，分別調(diào)整上述對照組和誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組骨髓基質(zhì)細(xì)胞的pH值，使pH為7.2，置于飽和濕度、5％的CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)25分鐘；之后，將對照組和誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組骨髓基質(zhì)細(xì)胞pH調(diào)為7.4，置于飽和濕度、5％的CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，誘導(dǎo)8小時，在倒置顯微鏡下每2小時觀察一次細(xì)胞的變化。然后，取出24孔培養(yǎng)板各孔中長滿細(xì)胞的蓋玻片，用純丙酮固定，0.01MPBS徹底沖洗后，采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色的方法檢測神經(jīng)元的特異性標(biāo)記物NSE和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)記物GFAP的表達(dá)情況，結(jié)果表明NSE的表達(dá)呈陽性，而GFAP的表達(dá)呈陰性。說明D609可以誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元分化。同時，應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄單細(xì)胞離子電流，初步檢測了分化的神經(jīng)元的電生理特征，選擇那些具有錐體狀胞體及明顯軸突和樹突、細(xì)胞體積較大的細(xì)胞進(jìn)行記錄，發(fā)現(xiàn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞分化的神經(jīng)元細(xì)胞，可被誘發(fā)出動作電位，并可記錄到外向的鉀電流。這些說明骨髓基質(zhì)細(xì)胞分化的神經(jīng)元具有初步的電生理特征，并且，可進(jìn)一步證明誘導(dǎo)后的分化細(xì)胞是神經(jīng)細(xì)胞。
權(quán)利要求
1.一種利用D609誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元分化的方法，由以下步驟組成1)選取處于對數(shù)生長期的骨髓基質(zhì)細(xì)胞，接種于培養(yǎng)板各孔中的蓋玻片上，置于飽和濕度、5％的CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)，在含有20％小牛血清的M199培養(yǎng)液中培養(yǎng)，至細(xì)胞生長達(dá)到蓋玻片面積的80％～90％；2)用無血清培養(yǎng)液將上述培養(yǎng)板各孔中的細(xì)胞清洗1～2次，然后對培養(yǎng)板各孔中的細(xì)胞進(jìn)行分組，確定對照組和誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組，每組不少于4孔；3)對照組的骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液采用去除血清的M199培養(yǎng)基，誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞培養(yǎng)液除使用對照組培養(yǎng)液外還添加了濃度為2mg/L～12mg/L的D609；4)分別調(diào)整上述對照組和誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組骨髓基質(zhì)細(xì)胞的pH值，使pH為7.2，置于飽和濕度、5％的CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)20～30分鐘；5)將步驟4)中對照組和誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組骨髓基質(zhì)細(xì)胞pH調(diào)為7.4-7.8，置于飽和濕度、5％的CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，誘導(dǎo)2～8小時，檢測誘導(dǎo)結(jié)果。
2.如權(quán)利要求1所述的利用D609誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元分化的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)板為24孔培養(yǎng)板。
3.如權(quán)利要求1所述的利用D609誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元分化的方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組的培養(yǎng)液中，各孔添加D609的濃度依次為2mg/L、4mg/L、6mg/L、8mg/L、10mg/L、12mg/L。
4.如權(quán)利要求3所述的利用D609誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元分化的方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組的培養(yǎng)液中，各孔添加D609的濃度為4mg/L、6mg/L、8mg/L。
5.如權(quán)利要求4所述的利用D609誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元分化的方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組的培養(yǎng)液中，各孔添加D609的濃度為6mg/L。
6.如權(quán)利要求1所述的利用D609誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元分化的方法，其特征在于，所述步驟5)中，對照組和誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組骨髓基質(zhì)細(xì)胞pH調(diào)為7.4-7.5，培養(yǎng)誘導(dǎo)時間為3～5小時。
7.如權(quán)利要求1所述的利用D609誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元分化的方法，其特征在于，所述步驟5)中，對照組和誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組經(jīng)培養(yǎng)誘導(dǎo)完畢的細(xì)胞，還可再分別去除其培養(yǎng)液，用無血清的M199培養(yǎng)液沖洗1～2次，向?qū)φ战M加入含有20μg/L bFGF的無血清M199培養(yǎng)液，向誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組加入含有20μg/L bFGF和2mg/L～12mg/L濃度D609的無血清M199培養(yǎng)液，pH調(diào)為7.4-7.5，置于飽和濕度、5％的CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，維持誘導(dǎo)3天，檢測誘導(dǎo)結(jié)果。
8.如權(quán)利要求7所述的利用D609誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元分化的方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組中加入的D609濃度為4mg/L～8mg/L。
9.如權(quán)利要求8所述的利用D609誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元分化的方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組中加入的D609濃度為6mg/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用D609誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元分化的方法，該方法由骨髓基質(zhì)細(xì)胞接種培養(yǎng)；無血清培養(yǎng)液清洗；對照組和誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組骨髓基質(zhì)細(xì)胞在pH為7.2條件下預(yù)誘導(dǎo)；在濃度為2mg/L～12mg/L的D609，pH 7.4－7.8，飽和濕度、5％的CO
文檔編號C12N5/08GK1560237SQ20041002349
公開日2005年1月5日 申請日期2004年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月25日
發(fā)明者苗俊英, 張尚立, 王楠 申請人:山東大學(xué)