專(zhuān)利名稱(chēng)：一種細(xì)胞培養(yǎng)試劑及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及一種培養(yǎng)試劑及其用途，更具體地說(shuō)涉及一種細(xì)胞培養(yǎng)試劑及其用途。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞是一種未分化細(xì)胞，有兩個(gè)基本特性，一是具有自我復(fù)制能力，二是能分化成一種以上的功能細(xì)胞。根據(jù)分化潛能的大小，干細(xì)胞一般分成三類(lèi)。第一類(lèi)是全能干細(xì)胞(totipotent stem cell)，即受精卵在受精后的第1小時(shí)內(nèi)，能分裂為功能一致的全能細(xì)胞，將其中的任一細(xì)胞置于女性子宮內(nèi)均可發(fā)育為胎兒；第二類(lèi)是胚胎干細(xì)胞(Embryonic stemcell)，它具有廣泛的分化潛能，能生成除胎盤(pán)外的機(jī)體所有的組織細(xì)胞；第三類(lèi)是成體干細(xì)胞(adult stem cells)，是一種具有終生自我復(fù)制(identical copies)或自我更新(self-renewal)能力的未分化細(xì)胞，它分布于不同的組織，并可演變成為各種類(lèi)型的組織細(xì)胞。
干細(xì)胞的培養(yǎng)分離方法可分為三種①有明確定位的干細(xì)胞，往往具有獨(dú)特的生長(zhǎng)方式，可以直接取其用于研究，或取其聚集區(qū)在培養(yǎng)試劑(也稱(chēng)培養(yǎng)基或培養(yǎng)液)中進(jìn)行體外培養(yǎng)后進(jìn)行分離和純化。例如，骨髓中存在造血干細(xì)胞和骨髓間質(zhì)干細(xì)胞兩種干細(xì)胞，在骨髓的體外培養(yǎng)中，造血干細(xì)胞和骨髓呈懸浮集落生長(zhǎng)，而骨髓間質(zhì)干細(xì)胞則貼壁生長(zhǎng)，這兩種干細(xì)胞就很容易進(jìn)行區(qū)分，而且也很容易通過(guò)更換培養(yǎng)試劑把兩者分開(kāi)。②有分子標(biāo)記的干細(xì)胞。如外周血干細(xì)胞具有表面特異抗原，一般利用帶有標(biāo)記的抗體與之結(jié)合，然后用流式細(xì)胞儀(FACS)、磁珠分選儀(MACS)等分選設(shè)備進(jìn)行分選，然后在培養(yǎng)試劑中進(jìn)行體外培養(yǎng)，再用于治療血液病或作進(jìn)一步研究。③未發(fā)現(xiàn)有特異分子標(biāo)記的干細(xì)胞，可利用條件培養(yǎng)試劑篩選。例如，神經(jīng)干細(xì)胞需要在低血清、成纖維生長(zhǎng)因子(FGF)及轉(zhuǎn)換生長(zhǎng)因子β(TGFβ)等多種因子存在的培養(yǎng)試劑中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)才能生長(zhǎng)，而大部分細(xì)胞對(duì)血清是依賴(lài)的，長(zhǎng)期的培養(yǎng)結(jié)果使大部分的其他細(xì)胞死亡，而神經(jīng)干細(xì)胞則得到了純化和擴(kuò)增。
有關(guān)干細(xì)胞培養(yǎng)所用的試劑，目前主要有來(lái)自于美國(guó)Stem cell公司的MesencultTM培養(yǎng)試劑(間質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)的專(zhuān)用試劑，間質(zhì)干細(xì)胞即Mesenchymal stem cells，簡(jiǎn)稱(chēng)MSC)、美國(guó)GIBICO公司的高糖DMEM(即H-DMEM)培養(yǎng)試劑、低糖DMEM(即L-DMEM)培養(yǎng)試劑、α-MEM培養(yǎng)試劑、F12培養(yǎng)試劑和RPMI 1640培養(yǎng)試劑等。文獻(xiàn)報(bào)道，骨髓MSC多用L-DMEM培養(yǎng)試劑培養(yǎng)，臍血MSC使用MesencultTM培養(yǎng)試劑或α-MEM培養(yǎng)試劑培養(yǎng)，成人外周血單核細(xì)胞(Monocytes)來(lái)源的多潛能干細(xì)胞(Pluripotent stem cells，簡(jiǎn)稱(chēng)PSC)使用的培養(yǎng)試劑是RPMI 1640培養(yǎng)試劑。這些培養(yǎng)試劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)試劑的主要成分包括氨基酸(amino acid)類(lèi)、維生素或脂類(lèi)、無(wú)機(jī)鹽類(lèi)、核酸類(lèi)、葡萄糖類(lèi)以及其他成分等，在此基礎(chǔ)上再加上血漿、血清或細(xì)胞因子，得到該試劑的完全培養(yǎng)試劑。
成體干細(xì)胞是人體自身的PSC，是具有相同或相似的細(xì)胞表型、多系分化能力的亞全能干細(xì)胞群體，存留在多種組織中并能夠分離出來(lái)，而且在適合的微環(huán)境(nich)下能分化產(chǎn)生具有特定形態(tài)和功能的細(xì)胞(特化細(xì)胞)，實(shí)現(xiàn)跨系統(tǒng)分化，即能夠分化成多種組織細(xì)胞，例如，骨髓MSC、外周血單核細(xì)胞來(lái)源的PSC等。所謂微環(huán)境是指存在于干細(xì)胞所處的細(xì)胞基質(zhì)中，對(duì)干細(xì)胞命運(yùn)(是增殖還是分化)起調(diào)控作用的各種信號(hào)分子(生長(zhǎng)因子及其受體、激素及介導(dǎo)分子)的總稱(chēng)(Watt FM，Hogana-Brigid LM.A bipotential precursor populationfor pancreas and liver within the embryonic endoderm.Science，2000，128871～811)。例如，骨髓MSC具有向骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺基質(zhì)等組織細(xì)胞轉(zhuǎn)化的能力(Goodell MA，Jackson KA，Majika SM，et al.Stem cell plasticity in muscle and bone marrow.Ann NY Acad Sci，2001，938208，和Almeida-Porada G，Zanjani ED，Adult stem cell plasticity and methods of detection.Rev ClinExp Hematol，2001，526)，肌組織衛(wèi)星細(xì)胞能在特定的環(huán)境下造血，神經(jīng)干細(xì)胞能分化為肝、血液和骨骼肌等多種組織。但是，成體干細(xì)胞在分化為特化細(xì)胞之前常產(chǎn)生一種或幾種祖細(xì)胞，然后由祖細(xì)胞再分化產(chǎn)生特化細(xì)胞。
臍血中的細(xì)胞成分一部分來(lái)源于新生兒機(jī)體，一部分來(lái)源于胎盤(pán)組織，其早期細(xì)胞含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于成人外周血，因此理論上除已報(bào)道的CD34+造血干細(xì)胞和MSC外，應(yīng)該還存在其它的成體干細(xì)胞，只是用目前所報(bào)道的細(xì)胞培養(yǎng)試劑及方法不易培養(yǎng)。如果改變目前所使用的試劑，在臍血中發(fā)現(xiàn)、分離出新的成體干細(xì)胞將變?yōu)榭赡堋?br> 此外，成體干細(xì)胞如骨髓MSC和外周血單核細(xì)胞來(lái)源的PSC在自身的移植過(guò)程中不存在排斥反應(yīng)的問(wèn)題，但骨髓的抽取勢(shì)必造成組織損傷和病人的痛苦，而且其含量非常低，105～106個(gè)細(xì)胞中含有1個(gè)骨髓MSC；提取外周血單個(gè)核細(xì)胞(主要包括單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和少量的其它細(xì)胞等)來(lái)源的PSC時(shí)，用血量較大，一般在500ml左右，對(duì)于多數(shù)患者顯然是不可行的；更重要的是，不管是骨髓MSC，還是外周血單核細(xì)胞來(lái)源的PSC，分離純化時(shí)間均較長(zhǎng)(21～24天)，對(duì)于急需PSC治療的患者，如果使用自身的骨髓或外周血，更是無(wú)法實(shí)現(xiàn)。因此，盡管成體干細(xì)胞移植是目前治療血液系統(tǒng)疾病、先天性遺傳疾病以及多發(fā)性和轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤疾病的有效方法之一，但其在臨床治療與研究方面的應(yīng)用根本無(wú)法滿(mǎn)足要求。所以尋找新的細(xì)胞培養(yǎng)試劑，用于發(fā)現(xiàn)、分離與體外大量擴(kuò)增高純度的成體干細(xì)胞，就顯得非常重要。
但是，迄今為止，尚未見(jiàn)新的細(xì)胞培養(yǎng)試劑方面的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種新的細(xì)胞培養(yǎng)試劑，目的之二是公開(kāi)其用途。
本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思如下1.細(xì)胞作為有機(jī)體的最小組成單位，在其生長(zhǎng)和增殖過(guò)程中需要必須的營(yíng)養(yǎng)成分如氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)鹽以及某些細(xì)胞因子等，不同的細(xì)胞對(duì)某些營(yíng)養(yǎng)成分的需求也不盡相同。目前常用的細(xì)胞培養(yǎng)試劑(如L-DMEM培養(yǎng)試劑、α-MEM培養(yǎng)試劑或RPMI 1640培養(yǎng)試劑等)的營(yíng)養(yǎng)成分能夠滿(mǎn)足絕大多數(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)的需要，但對(duì)于某些細(xì)胞來(lái)講，其中某些營(yíng)養(yǎng)成分有可能不足甚至缺乏。如果調(diào)整(增加或補(bǔ)加)細(xì)胞培養(yǎng)試劑的某些基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)成分，就有可能發(fā)現(xiàn)和培養(yǎng)出新的細(xì)胞。
2.常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)是采用等滲的培養(yǎng)試劑，在原代細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中往往幾種細(xì)胞同時(shí)增長(zhǎng)，不易獲得較純的目的細(xì)胞。研究表明，滲透壓的改變可導(dǎo)致細(xì)胞容積的改變，激活細(xì)胞膜上的離子通道(Robert W，Wei G，Scott H.Blocking swelling-activated chloridecurrent inhibits mouse liver cell proliferation.J Physio 2001，532661和Shen MR，Droogmans G，Eggmont J，et al.Differential expression of volume-regulated anion channel during cell cycleprogression of human cervical cancer cells.J Physio.2000，529385)，這些改變與細(xì)胞增殖的調(diào)控密切相關(guān)。對(duì)造血干細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，滲透壓對(duì)集落形成細(xì)胞有影響，當(dāng)滲透壓低于正常的17％或高于正常的23％時(shí)對(duì)集落的形成明顯的影響，并提示低滲透壓對(duì)造血細(xì)胞體外培養(yǎng)更有害(張孝兵等，影響臍血造血細(xì)胞體外培養(yǎng)與檢測(cè)的因素，華東理工大學(xué)學(xué)報(bào)1999，2532)。因此，如果改變培養(yǎng)試劑的滲透壓，就有可能實(shí)現(xiàn)對(duì)一些細(xì)胞增殖，而抑制另外一些細(xì)胞的生長(zhǎng)或促進(jìn)其凋亡，從而達(dá)到篩選細(xì)胞的目的。
本發(fā)明通過(guò)調(diào)整現(xiàn)有培養(yǎng)試劑的組分和含量，配制新的培養(yǎng)試劑，對(duì)以上構(gòu)思進(jìn)行了逐一實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。一是添加某些缺少的營(yíng)養(yǎng)成分，如某些氨基酸、維生素或核苷酸等；二是在所培養(yǎng)細(xì)胞必需營(yíng)養(yǎng)成分的基礎(chǔ)上，再適當(dāng)增加其含量；三是通過(guò)提高某些成分的含量，來(lái)提高培養(yǎng)試劑的滲透壓，例如增加無(wú)機(jī)鹽等的含量，可高出正常值的60％。下文所述的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和結(jié)果均證實(shí)本發(fā)明的構(gòu)思是正確的。為便于敘述，將該細(xì)胞培養(yǎng)試劑暫定名Potentculture培養(yǎng)試劑。
這里所述的Potentculture培養(yǎng)試劑是指Potentculture基礎(chǔ)培養(yǎng)試劑，也就是說(shuō)還可以加入血漿或血清類(lèi)組分，配制成Potentculture完全培養(yǎng)試劑。
1000ml的Potentculture培養(yǎng)試劑主要包括1000～2000mg氨基酸類(lèi)、8000～18000mg無(wú)機(jī)鹽類(lèi)、10～90mg維生素及脂類(lèi)、30～100mg核酸類(lèi)、800～1500mg葡萄糖類(lèi)和100～200mg其它成分，各組分分別優(yōu)選1400～1800mg、10000～15000mg、30～60mg、40～70mg、1000～1400mg和120～170mg，分別特別優(yōu)選1682.9mg、12479.9mg、54.7mg、48mg、1200mg和147.1mg。
與1000ml的Potentculture培養(yǎng)試劑配套使用的血漿或血清類(lèi)組分是指200～600ml的血漿，或200～600ml血漿和血清的混合物，優(yōu)選使用400ml的血漿，或300ml血漿和100ml血清的混合物。
這里所述的氨基酸(amino acid)類(lèi)包括必需氨基酸(essential amino acid)和非必需氨基酸(nonessential amino acid)，必需氨基酸是包括異亮氨酸(L-isoleucine)、亮氨酸(L-leucine)、賴(lài)氨酸(L-lysine·HCL)、蛋氨酸(L-methionine)、苯丙氨酸(L-phenylalanine)、色氨酸(L-tryptophan)、蘇氨酸(L-threonine)或纈氨酸(L-valine)等；非必需氨基酸是包括丙氨酸(L-alanine)、精氨酸(L-arginine)、天冬酰胺(L-asparagine)、天冬氨酸(L-aspartic acid)、半胱氨酸(L-cysteine·HCL·H2O)、胱氨酸(L-cysteine)、谷氨酸(L-glutamic acid)、甘氨酸(glycine)、谷氨酰胺(L-glutamic)、組氨酸(L-histidine)、脯氨酸(L-proline)、絲氨酸(L-serine)或酪氨酸(L-tyrosine)等。
這里所述的無(wú)機(jī)鹽類(lèi)是包括CaCl2、Fe(NO3)3·9H2O、KCl、MgSO4·7H2O、NaCl、NaHCO3或NaH2PO4·2H2O等。
這里所述的維生素和脂類(lèi)是包括抗壞血酸(L-ascorbic acid)、生物素(biotin)、偏多酸鈣(D-Ca pantothenate)、氧化膽堿(choline chloride)、葉酸(folic acid)、肌醇(I-inositol)、菸酰胺(nicotinamide)、吡哆醛(pyridoxal-HCL)、核黃素(riboflavin)、硫氨酸(thiamine HCL)或維生素B12(vitamin B12)等。
這里所述的核酸類(lèi)是包括腺苷(adenosine)、胞嘧啶核苷(cytidine)、脫氧腺苷(deoxyadenosine)、脫氧胞嘧啶核苷(deoxycytidine)、脫氧鳥(niǎo)嘌呤核苷(dexyguanosine)、鳥(niǎo)苷(guanosine)、胸腺嘧啶(thymidine)或尿嘧啶(uridine)等。
這里所述的葡萄糖類(lèi)是包括葡萄糖(glucose)等。
這里所述的其它成分是包括硫辛酸(lipoic acid)、酚紅(sodium phenol red)或丙酮酸鹽(pyruvate)等。
這里所述的血漿或血清類(lèi)組分是血漿或血漿和血清的混合物。這里所述的血漿是包括多個(gè)健康成人的混合血漿或多份臍血血漿的混合物等中的一種；優(yōu)選三個(gè)以上健康人的混合血漿，或三份以上臍血血漿的混合物；進(jìn)一步優(yōu)選三個(gè)乙肝、丙肝、愛(ài)滋病病毒陰性的健康人的混合血漿，或三份臍血血漿的混合物。這里所述的血清是包括馬血清、牛血清或人血清中的一種，優(yōu)選新生馬血清或胎牛血清。
Potentculture培養(yǎng)試劑對(duì)現(xiàn)有細(xì)胞培養(yǎng)試劑進(jìn)行改進(jìn)①與目前常用的單一細(xì)胞培養(yǎng)試劑相比較，添加了更豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，并且部分營(yíng)養(yǎng)成分的含量也更高，有營(yíng)養(yǎng)成分互補(bǔ)或疊加的作用，有利于目的細(xì)胞的生長(zhǎng)；②作為一種篩選細(xì)胞的培養(yǎng)試劑，Potentculture培養(yǎng)試劑的滲透壓要比等滲培養(yǎng)試劑高出40％～80％，有利于篩選目的細(xì)胞；③Potentculture完全培養(yǎng)試劑含有高濃度的血漿或血清成分如臍血漿，使細(xì)胞所處的培養(yǎng)環(huán)境更接近細(xì)胞自然生長(zhǎng)環(huán)境，有利于目的細(xì)胞的快速擴(kuò)增；④在大多數(shù)情況下，使用Potentculture完全培養(yǎng)試劑不需要額外添加細(xì)胞因子，因此使用Potentculture完全培養(yǎng)試劑培養(yǎng)細(xì)胞的成本低廉，與目前專(zhuān)用的干細(xì)胞培養(yǎng)試劑相比，便宜2～5倍。
本發(fā)明Potentculture培養(yǎng)試劑既能夠用于現(xiàn)有細(xì)胞的一般培養(yǎng)，也能夠?qū)ｉT(mén)用于目的細(xì)胞的篩選培養(yǎng)，特別是能夠用于干細(xì)胞的一般培養(yǎng)和篩選培養(yǎng)；如果選擇合適的細(xì)胞培養(yǎng)方法，還能夠用于分離與體外大量擴(kuò)增高純度的成體干細(xì)胞，或者用于發(fā)現(xiàn)、分離新的成體干細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明公開(kāi)一種新的細(xì)胞培養(yǎng)試劑及其用途，以滿(mǎn)足人們疾病治療、科學(xué)研究、藥物開(kāi)發(fā)等方面的需要。
下面通過(guò)實(shí)施例來(lái)具體說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，所述的實(shí)施例是為了更好地闡述本發(fā)明，并不是用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1、Potentculture培養(yǎng)試劑配方之一1000ml的Potentculture培養(yǎng)試劑的具體組成和含量如下①氨基酸類(lèi)1682.9mg以下所述的氨基酸產(chǎn)品未標(biāo)記來(lái)源的，均來(lái)自美國(guó)Gibico公司。
A.8種必需氨基酸 592.4mg包括94.4mg的L-異亮氨酸(貨號(hào)22405013，純度＞99％)、94.4mg的L-亮氨酸(貨號(hào)12424016，純度＞99％)、131.6mg的L-賴(lài)氨酸(貨號(hào)12407011，純度＞99％)、26.9mg的蛋氨酸(美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)9625，純度98％)、59.4mg的L-苯丙氨酸(貨號(hào)12409017，純度＞99％)、15.7mg的L-色氨酸(貨號(hào)12432019，純度＞99％)、85.7mg的L-蘇氨酸(貨號(hào)12410015，純度＞99％)和84.3mg的L-纈氨酸(貨號(hào)12413019，純度＞99％)。
B.非必需氨基酸 1090.5mg包括15mg的L-丙氨酸(貨號(hào)21002019，純度＞99％)、126.2mg的L-精氨酸(貨號(hào)12401014，純度＞99％)、30mg的L-天冬酰胺(貨號(hào)12416012，純度＞99％)、18mg的L-天冬氨酸(貨號(hào)12417010，純度＞99％)、60mg的L-半胱氨酸(貨號(hào)11033016，純度＞99％)、43.2mg的L-胱氨酸(貨號(hào)12402012，純度＞99％)、45mg的L-谷氨酸(貨號(hào)11048014，純度＞99％)、48mg的L-甘氨酸(貨號(hào)12421012，純度＞99％)、525.6mg的L-谷氨酰胺(貨號(hào)21051024，純度＞99％)、50.4mg的L-組氨酸(貨號(hào)12422010，純度＞99％)、24mg的L-脯氨酸(貨號(hào)21096029，純度＞99％)、40.2mg的L-絲氨酸(貨號(hào)22430011，純度＞99％)和64.9mg的L-酪氨酸(貨號(hào)12412011，純度＞99％)。
②無(wú)機(jī)鹽類(lèi) 12479.9mg包括240mg的CaCl2(中國(guó)天津登峰化學(xué)試劑廠(chǎng)，分析純，純度≥98％)、0.06mg的Fe(NO3)3·9H2O(中國(guó)大港億中化工廠(chǎng)，分析純，純度＞98％)、480mg的KCl(中國(guó)天津市四通化工廠(chǎng)，分析純，純度≥99.5％)、240mg的MgSO4·7H2O(中國(guó)天津登峰化學(xué)試劑廠(chǎng)，分析純，純度≥98％)、7920mg的NaCl(中國(guó)天津市四通化工廠(chǎng)，分析純，純度≥99.5％)、3420mg的NaHCO3(中國(guó)河南焦作化工三廠(chǎng)，分析純，純度≥99％)和179.8mg的NaH2PO4·2H2O(中國(guó)上?；瘜W(xué)試劑總廠(chǎng)所屬上海試劑二廠(chǎng)，優(yōu)級(jí)純，純度≥99.9％)。
③維生素和脂類(lèi) 54.7mg以下所述的維生素和脂類(lèi)產(chǎn)品未標(biāo)記來(lái)源的，均來(lái)自美國(guó)Sigma公司。
30mg的抗壞血酸(貨號(hào)7631，純度＞99％)、0.06mg的D-生物素(貨號(hào)4501，純度＞99％)、0.8mg的維生素B12(美國(guó)Gibico公司，貨號(hào)13100011，純度＞99％)、3mg的吡哆醛(貨號(hào)9755，純度＞99％)、0.3mg的核黃素(貨號(hào)4500，純度＞99％)、3mg偏多酸鈣(貨號(hào)2625)、3mg氧化膽堿(貨號(hào)7527，純度＞98％)、3mg葉酸(貨號(hào)8758，純度98％)、5.5mg肌醇(貨號(hào)7508，純度99％)、3mg菸酰胺(貨號(hào)0636，純度95％)、3mg硫氨酸(貨號(hào)3902，純度97％)。
④核酸類(lèi) 48mg以下所述的核酸類(lèi)產(chǎn)品未標(biāo)記來(lái)源的，均來(lái)自美國(guó)Sigma公司。
包括6mg的腺苷(貨號(hào)9251，純度＞99％)、6mg的胞嘧啶核苷(貨號(hào)4654，純度≥99％)、6mg的脫氧腺苷(貨號(hào)8668，純度99％～100％)、6mg的脫氧胞嘧啶核苷(貨號(hào)0776，純度95％～98％)、6mg的脫氧鳥(niǎo)嘌呤核苷(貨號(hào)0991，純度99％～100％)、6mg的鳥(niǎo)苷(貨號(hào)6264，純度98％)、6mg的胸腺嘧啶(美國(guó)Gibico公司，貨號(hào)16495038，純度＞99％)和6mg的尿嘧啶(貨號(hào)3750，純度＞99％)。
⑤葡萄糖 1200mg來(lái)源中國(guó)天津登峰化學(xué)試劑廠(chǎng)，分析純，純度≥98％。
⑥其它成分 147.1mg包括0.12mg的葡萄糖硫辛酸(美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)1395，純度99％)、15mg的酚紅(美國(guó)Gibico公司，貨號(hào)11160025，純度＞99％)和132mg的丙酮酸鹽(美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)5194)。
Potentculture培養(yǎng)試劑還可以添加血漿或血清類(lèi)組分400ml，即400ml由三份臍血混合成的血漿，配成Potentculture完全培養(yǎng)試劑。
將本發(fā)明所配置的Potentculture培養(yǎng)試劑與其他的細(xì)胞培養(yǎng)試劑進(jìn)行比較，能夠發(fā)現(xiàn)在組分和含量方面均有明顯差異(表1)，組分更加全面，并調(diào)整了組分的含量，使其滲透壓明顯高于其他的細(xì)胞培養(yǎng)試劑的滲透壓(表2)，從而達(dá)到了所期望的篩選細(xì)胞的目的。
表1、Potentculture培養(yǎng)試劑與其他部分細(xì)胞培養(yǎng)試劑在組分和含量方面的比較


表2、Potentculture培養(yǎng)試劑與其他部分細(xì)胞培養(yǎng)試劑在滲透壓方面的比較吸光度實(shí)際測(cè)定值(單位A)滲透勢(shì)毫滲壓組 別第1次 第2次 第3次 均值(單位Pma) (單位mosmol/L)Potentculture培養(yǎng)試劑 0.489 0.483 0.482 0.484 1.205 480L-DMEM培養(yǎng)試劑0.302 0.307 0.305 0.305 0.757 300A-MEM培養(yǎng)試劑 0.303 0.308 0.302 0.304 0.750 298RPMI 1640培養(yǎng)試劑 0.301 0.300 0.301 0.301 0.747 296MesencultTM培養(yǎng)試劑 0.302 0.305 0.306 0.305 0.750 299實(shí)施例2、Potentculture培養(yǎng)試劑配方之二1000ml的Potentculture培養(yǎng)試劑的具體組成和含量如下①氨基酸類(lèi) 1682.9mg以下所述的氨基酸產(chǎn)品未標(biāo)記來(lái)源的，均來(lái)自美國(guó)Gibico公司。
A.7種必需氨基酸576.7mg
包括94.4mg的L-異亮氨酸(貨號(hào)22405013，純度＞99％)、94.4mg的L-亮氨酸(貨號(hào)12424016，純度＞99％)、131.6mg的L-賴(lài)氨酸(貨號(hào)12407011，純度＞99％)、26.9mg的蛋氨酸(美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)9625，純度98％)、59.4mg的L-苯丙氨酸(貨號(hào)12409017，純度＞99％)、85.7mg的L-蘇氨酸(貨號(hào)12410015，純度＞99％)和84.3mg的L-纈氨酸(貨號(hào)12413019，純度＞99％)。
B.非必需氨基酸 1090.5mg包括15mg的L-丙氨酸(貨號(hào)21002019，純度＞99％)、126.2mg的L-精氨酸(貨號(hào)12401014，純度＞99％)、30mg的L-天冬酰胺(貨號(hào)12416012，純度＞99％)、18mg的L-天冬氨酸(貨號(hào)12417010，純度＞99％)、60mg的L-半胱氨酸(貨號(hào)11033016，純度＞99％)、43.2mg的L-胱氨酸(貨號(hào)12402012，純度＞99％)、45mg的L-谷氨酸(貨號(hào)11048014，純度＞99％)、48mg的L-甘氨酸(貨號(hào)12421012，純度＞99％)、525.6mg的L-谷氨酰胺(貨號(hào)21051024，純度＞99％)、50.4mg的L-組氨酸(貨號(hào)12422010，純度＞99％)、24mg的L-脯氨酸(貨號(hào)21096029，純度＞99％)、40.2mg的L-絲氨酸(貨號(hào)22430011，純度＞99％)和64.9mg的L-酪氨酸(貨號(hào)12412011，純度＞99％)。
②無(wú)機(jī)鹽類(lèi) 12479.9mg包括240mg的CaCl2(中國(guó)天津登峰化學(xué)試劑廠(chǎng)，分析純，純度≥98％)、0.06mg的Fe(NO3)3·9H2O(中國(guó)大港億中化工廠(chǎng)，分析純，純度＞98％)、480mg的KCl(中國(guó)天津市四通化工廠(chǎng)，分析純，純度≥99.5％)、240mg的MgSO4·7H2O(中國(guó)天津登峰化學(xué)試劑廠(chǎng)，分析純，純度≥98％)、7920mg的NaCl(中國(guó)天津市四通化工廠(chǎng)，分析純，純度≥99.5％)、3420mg的NaHCO3(中國(guó)河南焦作化工三廠(chǎng)，分析純，純度≥99％)和179.8mg的NaH2PO4·2H2O(中國(guó)上海化學(xué)試劑總廠(chǎng)所屬上海試劑二廠(chǎng)，優(yōu)級(jí)純，純度≥99.9％)。
③維生素和脂類(lèi) 54.7mg以下所述的維生素和脂類(lèi)產(chǎn)品未標(biāo)記來(lái)源的，均來(lái)自美國(guó)Sigma公司。
30mg的抗壞血酸(貨號(hào)7631，純度＞99％)、0.06mg的D-生物素(貨號(hào)4501，純度＞99％)、0.8mg的維生素B12(美國(guó)Gibico公司，貨號(hào)13100011，純度＞99％)、3mg的吡哆醛(貨號(hào)9755，純度＞99％)、0.3mg的核黃素(貨號(hào)4500，純度＞99％)、3mg偏多酸鈣(貨號(hào)2625)、3mg氧化膽堿(貨號(hào)7527，純度＞98％)、3mg葉酸(貨號(hào)8758，純度98％)、5.5mg肌醇(貨號(hào)7508，純度99％)、3mg菸酰胺(貨號(hào)0636，純度95％)、3mg硫氨酸(貨號(hào)3902，純度97％)。
④核酸類(lèi) 48mg以下所述的核酸類(lèi)產(chǎn)品未標(biāo)記來(lái)源的，均來(lái)自美國(guó)Sigma公司。
包括6mg的腺苷(貨號(hào)9251，純度＞99％)、6mg的胞嘧啶核苷(貨號(hào)4654，純度≥99％)、6mg的脫氧腺苷(貨號(hào)8668，純度99％～100％)、6mg的脫氧胞嘧啶核苷(貨號(hào)0776，純度95％～98％)、6mg的脫氧鳥(niǎo)嘌呤核苷(貨號(hào)0991，純度99％～100％)、6mg的鳥(niǎo)苷(貨號(hào)6264，純度98％)、6mg的胸腺嘧啶(美國(guó)Gibico公司，貨號(hào)16495038，純度＞99％)和6mg的尿嘧啶(貨號(hào)3750，純度＞99％)。
⑤葡萄糖 1200mg來(lái)源中國(guó)天津登峰化學(xué)試劑廠(chǎng)，分析純，純度≥98％。
⑥其它 147.1mg包括0.12mg的葡萄糖硫辛酸(美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)1395，純度99％)、15mg的酚紅(美國(guó)Gibico公司，貨號(hào)11160025，純度＞99％)和132mg的丙酮酸鹽(美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)5194)。
Potentculture培養(yǎng)試劑還可以添加血漿或血清類(lèi)組分400ml，即300ml血漿(三個(gè)乙肝、丙肝、愛(ài)滋病病毒陰性的健康成人的混合血漿)、50ml胎牛血清(杭州四季青公司)和50ml新生馬血清(美國(guó)GIBICO公司)，配成Potentculture完全培養(yǎng)試劑。
表3、Potentculture培養(yǎng)試劑與其他部分細(xì)胞培養(yǎng)試劑在組分和含量方面的比較


實(shí)施例3、使用Potentculture培養(yǎng)試劑篩選培養(yǎng)新的目的細(xì)胞使用本發(fā)明Potentculture完全培養(yǎng)試劑(見(jiàn)實(shí)施例2)培養(yǎng)細(xì)胞，能夠進(jìn)行篩選培養(yǎng)目的細(xì)胞，現(xiàn)把使用Potentculture完全培養(yǎng)試劑篩選培養(yǎng)目的細(xì)胞的具體方法敘述如下其他主要試劑的來(lái)源新生馬血清、無(wú)鈣鎂Hank’s液均購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司，胎牛血清來(lái)源于杭州四季青公司，淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自上海試劑二廠(chǎng)。
①臍血單個(gè)核細(xì)胞的分離無(wú)菌條件下采集正常人新鮮臍血50～100ml(婦產(chǎn)科健康產(chǎn)婦)，肝素(50U/ml)抗凝；臍血收集后2h內(nèi)進(jìn)行處理新鮮臍血2500r·min-1離心15min，取白膜層(白細(xì)胞層)；再用含有2％胎牛血清的無(wú)鈣鎂Hank’s液按1∶3進(jìn)行稀釋?zhuān)B加在Ficoll-paque上層，3000r·min-1離心15min，取單個(gè)核細(xì)胞層，用含有2％胎牛血清的無(wú)鈣鎂Hank’s液洗滌備用。
②目的細(xì)胞的純化及擴(kuò)增培養(yǎng)將單個(gè)核細(xì)胞配成適當(dāng)濃度的細(xì)胞溶液，并接種到Potentculture完全培養(yǎng)試劑中，接種濃度1×106～1×108個(gè)細(xì)胞/cm2；置于37℃、5％CO2、80％相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7天，首先貼壁的為成熟的單核細(xì)胞，其形態(tài)主要為圓形或不規(guī)則形，棄去該貼壁的細(xì)胞；將未貼壁的懸浮細(xì)胞移種到24孔塑料培養(yǎng)板中，更換Potentculture完全培養(yǎng)試劑繼續(xù)培養(yǎng)2～3天，所得的貼壁細(xì)胞中的成纖維樣細(xì)胞即是所要篩選的目的細(xì)胞。該細(xì)胞經(jīng)以后的進(jìn)一步驗(yàn)證，被證明是一種新的成體干細(xì)胞。
從以上內(nèi)容可以看出，使用Potentculture培養(yǎng)試劑培養(yǎng)細(xì)胞具有以下優(yōu)點(diǎn)①本培養(yǎng)試劑具有篩選作用對(duì)貼壁的條梭狀細(xì)胞具有促進(jìn)作用，而對(duì)其他貼壁細(xì)胞具有明顯的抑制作用，并促進(jìn)其凋亡，能夠得到非常均一的條梭狀細(xì)胞，有可能得到新的成體干細(xì)胞。
②分離成功率高每份臍血均能夠分離出PSC。而國(guó)外報(bào)道，大約只有25％的臍血中能夠分離出MSC。
實(shí)施例4、使用Potentculture培養(yǎng)試劑篩選培養(yǎng)和大量擴(kuò)增新的目的細(xì)胞使用本發(fā)明Potentculture完全培養(yǎng)試劑(見(jiàn)實(shí)施例1)培養(yǎng)細(xì)胞，能夠進(jìn)行篩選培養(yǎng)目的細(xì)胞，現(xiàn)把使用Potentculture完全培養(yǎng)試劑篩選培養(yǎng)目的細(xì)胞的具體方法敘述如下其他主要試劑的來(lái)源新生馬血清、無(wú)鈣鎂Hank’s液均購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司，胎牛血清來(lái)源于杭州四季青公司，淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自上海試劑二廠(chǎng)。
①臍血單個(gè)核細(xì)胞的分離無(wú)菌條件下采集正常人新鮮臍血50～100ml(婦產(chǎn)科健康產(chǎn)婦)，肝素(50U/ml)抗凝；臍血收集后2h內(nèi)進(jìn)行處理新鮮臍血2500r·min-1離心15min，取白膜層(白細(xì)胞層)；再用含有2％胎牛血清的無(wú)鈣鎂Hank’s液按1∶3進(jìn)行稀釋?zhuān)B加在Ficoll-paque上層，3000r·min-1離心15min，取單個(gè)核細(xì)胞層，用含有2％胎牛血清的無(wú)鈣鎂Hank’s液洗滌備用。
②目的細(xì)胞的純化及擴(kuò)增培養(yǎng)將單個(gè)核細(xì)胞配成適當(dāng)濃度的細(xì)胞溶液，并接種到Potentculture完全培養(yǎng)試劑中，接種濃度1×106～1×108個(gè)細(xì)胞/cm2；置于37℃、5％CO2、80％相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7天，首先貼壁的為成熟的單核細(xì)胞，其形態(tài)主要為圓形或不規(guī)則形，棄去該貼壁的細(xì)胞；將未貼壁的懸浮細(xì)胞移種到24孔塑料培養(yǎng)板中，更換Potentculture完全培養(yǎng)試劑繼續(xù)培養(yǎng)2～3天，所得的貼壁細(xì)胞中的成纖維樣細(xì)胞即是所要篩選的目的細(xì)胞；再將該培養(yǎng)過(guò)程中的未貼壁細(xì)胞移種到另一培養(yǎng)器皿，留下的PSC3445繼續(xù)培養(yǎng)。如此反復(fù)4～7次，可獲得更大量的、高純度的目的細(xì)胞。
③待目的細(xì)胞占培養(yǎng)面積的70％～80％左右時(shí)，用含有0.1g％EDTA的0.125％胰酶消化，按1∶2傳代，這樣能夠得到更高純度的目的細(xì)胞。該細(xì)胞經(jīng)以后的進(jìn)一步驗(yàn)證，被證明是一種新的成體干細(xì)胞。
從以上內(nèi)容可以看出，使用Potentculture培養(yǎng)試劑培養(yǎng)細(xì)胞具有以下優(yōu)點(diǎn)①本培養(yǎng)試劑具有篩選作用對(duì)貼壁的條梭狀細(xì)胞具有促進(jìn)作用，而對(duì)其他貼壁細(xì)胞具有明顯的抑制作用，并促進(jìn)其凋亡，能夠得到非常均一的條梭狀細(xì)胞。而我們對(duì)報(bào)道的其他方法進(jìn)行重復(fù)，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，所得到的細(xì)胞至少在兩種以上，并非常有可能得到新的成體干細(xì)胞。
②分離成功率高每份臍血均能夠分離出PSC。而國(guó)外報(bào)道，大約只有25％的臍血中能夠分離出MSC。
③細(xì)胞的得率高利用該試劑得到PSC的量是常規(guī)方法分離得到PSC的量的8～12倍。
④得到高純度PSC的時(shí)間短使用該試劑和本方法能夠得到高純度的PSC，而且時(shí)間短，一般在15天左右，報(bào)道的時(shí)間為21～24天，比目前報(bào)道的時(shí)間縮短了4～8天，對(duì)于治療急性病更有利。
權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞培養(yǎng)試劑，其特征在于，該細(xì)胞培養(yǎng)試劑的組分和配比是1000ml的該細(xì)胞培養(yǎng)試劑包括1000～2000mg氨基酸類(lèi)、8000～18000mg無(wú)機(jī)鹽類(lèi)、10～90mg維生素及脂類(lèi)、30～100mg核酸類(lèi)、800～1500mg葡萄糖類(lèi)和100～200mg其它成分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)試劑，其特征在于，所述各組分的配比是1000ml的該細(xì)胞培養(yǎng)試劑包括1400～1800mg氨基酸類(lèi)、10000～15000mg無(wú)機(jī)鹽類(lèi)、30～60mg維生素及脂類(lèi)、40～70mg核酸類(lèi)、1000～1400mg葡萄糖類(lèi)和120～170mg其它成分。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的細(xì)胞培養(yǎng)試劑，其特征在于，所述各組分的配比是1000ml的該細(xì)胞培養(yǎng)試劑包括1682.9mg氨基酸類(lèi)、12479.9mg無(wú)機(jī)鹽類(lèi)、54.7mg維生素及脂類(lèi)、48mg核酸類(lèi)、1200mg葡萄糖類(lèi)和147.1mg其它成分。
4.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)試劑，其特征在于，所述的氨基酸類(lèi)包括必需氨基酸和非必需氨基酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的細(xì)胞培養(yǎng)試劑，其特征在于，所述的必需氨基酸是包括異亮氨酸、亮氨酸、賴(lài)氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蘇氨酸或纈氨酸中的一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的細(xì)胞培養(yǎng)試劑，其特征在于，所述的非必需氨基酸是包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、組氨酸、脯氨酸、絲氨酸或酪氨酸中的一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)試劑，其特征在于，所述的無(wú)機(jī)鹽類(lèi)是包括CaCl2、Fe(NO3)3·9H2O、KCl、MgSO4·7H2O、NaCl、NaHCO3或NaH2PO4·2H2O中的一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)試劑，其特征在于，所述的維生素和脂類(lèi)是包括抗壞血酸、生物素、偏多酸鈣、氧化膽堿、葉酸、肌醇、菸酰胺、吡哆醛、核黃素、硫氨酸或維生素B12中的一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)試劑，其特征在于，所述的核酸類(lèi)是包括腺苷、胞嘧啶核苷、脫氧腺苷、脫氧胞嘧啶核苷、脫氧鳥(niǎo)嘌呤核苷、鳥(niǎo)苷、胸腺嘧啶或尿嘧啶中的一種。
10.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)試劑，其特征在于，所述的葡萄糖類(lèi)是葡萄糖。
11.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)試劑，其特征在于，所述的其它成分是包括硫辛酸、酚紅或丙酮酸鹽中的一種。
12.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)試劑，其特征在于，所述的1000ml的該細(xì)胞培養(yǎng)試劑包括94.4mg的L-異亮氨酸、94.4mg的L-亮氨酸、131.6mg的L-賴(lài)氨酸、26.9mg的蛋氨酸、59.4mg的L-苯丙氨酸、15.7mg的L-色氨酸、85.7mg的L-蘇氨酸、84.3mg的L-纈氨酸、15mg的L-丙氨酸、126.2mg的L-精氨酸、30mg的L-天冬酰胺、18mg的L-天冬氨酸、60mg的L-半胱氨酸、43.2mg的L-胱氨酸、45mg的L-谷氨酸、48mg的L-甘氨酸、525.6mg的L-谷氨酰胺、50.4mg的L-組氨酸、24mg的L-脯氨酸、40.2mg的L-絲氨酸、64.9mg的L-酪氨酸、240mg的CaCl2、0.06mg的Fe(NO3)3·9H2O、480mg的KCl、240mg的MgSO4·7H2O、7920mg的NaCl、3420mg的NaHCO3、179.8mg的NaH2PO4·2H2O、30mg的抗壞血酸、0.06mg的D-生物素、0.8mg的維生素B12、3mg的吡哆醛、0.3mg的核黃素、3mg偏多酸鈣、3mg氧化膽堿、3mg葉酸、5.5mg肌醇、3mg菸酰胺、3mg硫氨酸、6mg的腺苷、6mg的胞嘧啶核苷、6mg的脫氧腺苷、6mg的脫氧胞嘧啶核苷、6mg的脫氧鳥(niǎo)嘌呤核苷、6mg的鳥(niǎo)苷、6mg的胸腺嘧啶、6mg的尿嘧啶、1200mg葡萄糖、0.12mg的葡萄糖硫辛酸、15mg的酚紅和132mg的丙酮酸鹽。
13.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)試劑，其特征在于，所述的1000ml的該細(xì)胞培養(yǎng)試劑還包括200～600ml血漿或血清類(lèi)組分。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的細(xì)胞培養(yǎng)試劑，其特征在于，所述的200～600ml血漿或血清類(lèi)組分是包括200～600ml的血漿，或200～600ml血漿和血清的混合物中的一種。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的細(xì)胞培養(yǎng)試劑，其特征在于，所述的200～600ml血漿或血清類(lèi)組分是400ml的血漿，或300ml血漿和100ml血清的混合物中的一種。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的細(xì)胞培養(yǎng)試劑，其特征在于，所述的血漿或血清類(lèi)組分是包括血漿或血漿和血清的混合物中的一種，其中血漿是包括多個(gè)健康成人的混合血漿或多份臍血血漿的混合物中的一種，血清是包括馬血清、牛血清或人血清中的一種。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的細(xì)胞培養(yǎng)試劑，其特征在于，所述的血漿或血清類(lèi)組分是包括三個(gè)以上健康人的混合血漿，或三份以上臍血血漿的混合物中的一種。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的細(xì)胞培養(yǎng)試劑，其特征在于，所述的血漿或血清類(lèi)組分是包括三個(gè)乙肝、丙肝、愛(ài)滋病病毒陰性的健康人的混合血漿，或三份臍血血漿的混合物中的一種。
19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的細(xì)胞培養(yǎng)試劑，其特征在于，所述的血清是包括新生馬血清或胎牛血清中的一種。
20.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)試劑作為現(xiàn)有細(xì)胞一般培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)試劑的應(yīng)用。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的細(xì)胞培養(yǎng)試劑作為干細(xì)胞一般培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)試劑的應(yīng)用。
22.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)試劑作為專(zhuān)門(mén)用于目的細(xì)胞篩選培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)試劑的應(yīng)用。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的細(xì)胞培養(yǎng)試劑作為專(zhuān)門(mén)用于干細(xì)胞篩選培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)試劑的應(yīng)用。
24.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)試劑作為用于分離與體外大量擴(kuò)增高純度成體干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)試劑的應(yīng)用。
25.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)試劑作為用于發(fā)現(xiàn)、分離新的成體干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)試劑的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞培養(yǎng)試劑及其用途。該細(xì)胞培養(yǎng)試劑是現(xiàn)有細(xì)胞培養(yǎng)試劑組分和含量的多方改進(jìn)，添加了現(xiàn)有培養(yǎng)試劑缺少的某些營(yíng)養(yǎng)成分，并在所培養(yǎng)細(xì)胞必需營(yíng)養(yǎng)成分的基礎(chǔ)上，再適當(dāng)增加其含量，還通過(guò)提高某些成分的含量，來(lái)提高該培養(yǎng)試劑的滲透壓，能高達(dá)正常值的60％。因此，該培養(yǎng)試劑除了能夠用于現(xiàn)有細(xì)胞的一般培養(yǎng)外，還能夠?qū)ｉT(mén)用于目的細(xì)胞的篩選培養(yǎng)，特別是能夠用于干細(xì)胞的一般培養(yǎng)和篩選培養(yǎng)；若選擇合適的細(xì)胞培養(yǎng)方法，還能夠用于分離與體外大量擴(kuò)增高純度的成體干細(xì)胞，或者用于發(fā)現(xiàn)、分離新的成體干細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N5/08GK1560236SQ20041001689
公開(kāi)日2005年1月5日 申請(qǐng)日期2004年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月11日
發(fā)明者趙書(shū)平, 沈茜, 于麗華, 張軍, 徐玉蓮, 李聞捷, 張俊潔 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)