專利名稱：人睪丸特異基因hsd－1(spag8)編碼蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為一個(gè)在精子發(fā)生過程中參與有絲分裂的人睪丸特異表達(dá)基因HSD-1(SPAG8)，其編碼的蛋白質(zhì)命名為hSMP-1，涉及生物醫(yī)學(xué)高技術(shù)中新基因、新蛋白質(zhì)的開發(fā)與應(yīng)用領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
1995年本實(shí)驗(yàn)室繆時(shí)英等采用含抗精子抗體、可引起精子凝集的不孕婦女血清作為探針篩選人睪丸λgt11表達(dá)型cDNA文庫，獲得一長約1.7kb的cDNA片段。后利用5’，3’-RACE的方法獲得了2482bp的全長核苷酸，并將該基因命名為HSD-1。經(jīng)克隆測序結(jié)合基因組信息學(xué)分析證實(shí)該基因由7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子組成，其mRNA的轉(zhuǎn)錄過程受到變位剪接的調(diào)控。多組織Northern blot分析顯示，該基因僅在睪丸組織中特異表達(dá)。其編碼的人精子膜蛋白hSMP-1在人睪丸的各級生精細(xì)胞中都有表達(dá)，提示該基因/蛋白與精子發(fā)生過程有關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明hSMP-1羧端親水性較強(qiáng)的肽段具有抗生育功能。2003年HSD-1基因被人類基因命名數(shù)據(jù)庫命名為SPAG8。
發(fā)明目的闡明hSMP-1蛋白的生理生化功能，不僅對了解精子發(fā)生過程中的調(diào)控機(jī)理具有重要的意義，并且為相關(guān)疾病的基因診斷、基因治療及抗生育研究提供可能的目標(biāo)基因，為相關(guān)疾病治療藥物提供潛在的靶向載體。
內(nèi)容與要求應(yīng)用基因組信息學(xué)原理、cDNA文庫篩選、DNA序列測定技術(shù)、5’，3’-RACE、酵母雙雜交技術(shù)、基因表達(dá)與蛋白質(zhì)純化技術(shù)、抗血清制備、Western Blot檢測、免疫組織化學(xué)等技術(shù)，克隆鑒定了編碼Ran結(jié)合蛋白-RanBPM的全長cDNA序列；表達(dá)純化了目的蛋白并免疫家兔制備了抗血清，進(jìn)而進(jìn)行了免疫組織化學(xué)分析；借助pull-down、免疫共沉淀技術(shù)、細(xì)胞免疫熒光及激光共聚焦顯微等技術(shù)，驗(yàn)證了hSMP-1蛋白和RanBPM蛋白在體外和體內(nèi)的相互作用；綜合運(yùn)用細(xì)胞培養(yǎng)、流式細(xì)胞分析、細(xì)胞免疫熒光及激光共聚焦顯微等技術(shù)初步確定了hSMP-1蛋白的生物學(xué)功能。
該基因/蛋白質(zhì)達(dá)到的技術(shù)指標(biāo)為1.HSD-1基因編碼蛋白質(zhì)hSMP-1和位于微管組織中心的Ran結(jié)合蛋白-RanBPM在酵母系統(tǒng)中能夠相互作用。
2.RanBPM與GST形成的融合蛋白于大腸桿菌中獲得明顯表達(dá)，經(jīng)親和層析純化后的產(chǎn)物免疫家兔，制備了高滴度抗GST-RanBPM抗體。
3.RanBPM蛋白在人睪丸組織中主要表達(dá)于精原細(xì)胞與初級精母細(xì)胞(見圖1)。
4.RanBPM蛋白和hSMP-1蛋白在體外和體內(nèi)都具有相互作用(見圖2，3，4)。
5.在CHO細(xì)胞中，RanBPM蛋白和hSMP-1蛋白呈現(xiàn)完全共定位(見圖5)。
6.hSMP-1蛋白對微管的組裝具有一定的抑制作用(見圖6)。
7.hSMP-1蛋白的過量表達(dá)使細(xì)胞周期在G2/M期延長。在有絲分裂的過程中，該蛋白質(zhì)與組成紡錘體的微管完全共定位(見圖7，8，9)。
8.該基因及其編碼蛋白質(zhì)與微管的組裝/去組裝，以及有絲分裂過程中紡錘體的形成等生命現(xiàn)象密切相關(guān)。


圖1.免疫組織化學(xué)方法檢測RanBPM在人睪丸組織中的表達(dá)左圖為對照組，藍(lán)色為蘇木精細(xì)胞核對照染色；右圖為實(shí)驗(yàn)組，RanBPM主要定位于精原細(xì)胞與初級精母細(xì)胞。左圖和右圖均放大500倍。
圖2.SDS-PAGE檢測hSMP-1與RanBPM的體外結(jié)合1MBP-hSMP-1實(shí)驗(yàn)組；2MBP對照組；3純化的MBP-hSMP-1蛋白；4純化的MBP蛋白；5純化的GST-RanBPM蛋白圖3.親和層析結(jié)合Western印跡檢測hSMP-1與RanBPM的體外結(jié)合1睪丸抽提液；2MBP-hSMP-1實(shí)驗(yàn)組；3MBP對照組；4免疫前血清對照組此結(jié)果表明純化的MBP-hSMP-1可以與睪丸抽提液中的RanBPM結(jié)合。
圖4.細(xì)胞免疫共沉淀結(jié)合Western Blot檢測hSMP-1與RanBPM的體內(nèi)結(jié)合以ProteinA-Agarose結(jié)合兔抗RanBPM蛋白抗血清為親和柱，加入轉(zhuǎn)染了相應(yīng)真核表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞裂解液進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。以抗hSMP-1的兔血清為第一抗體，AP結(jié)合的羊抗兔IgG為第二抗體進(jìn)行Western Blot檢測。組5中用免疫前兔血清代替兔抗hSMP-1蛋白抗血清。
1實(shí)驗(yàn)組GFP-hSMP-1和RanBPM共沉淀；2對照組GFP-hSMP-1在CHO-K1細(xì)胞中的表達(dá)；3對照組GFP在CHO-K1細(xì)胞中的表達(dá)；4對照組GFP和RanBPM不能共沉淀；5對照組GFP-hSMP-1和RanBPM不能與免疫前血清共沉淀。
圖5.hSMP-1蛋白與RanBPM蛋白在CHO-K1細(xì)胞中的共定位研究A中紅色熒光顯示RanBPM在細(xì)胞中的定位；B中綠色熒光顯示hSMP-1的定位；C為前兩張圖片疊加的結(jié)果。兩種熒光疊加后呈現(xiàn)黃色，顯示hSMP-1蛋白與RanBPM蛋白在CHO-K1細(xì)胞中完全共定位。
圖6.hSMP-1蛋白對微管的組裝具有一定的抑制作用A和D中的紅色熒光為α-tubulin；B和E中的綠色熒光分別為GFP-hSMP-1和GFP；C和F分別為其左側(cè)兩張圖片的疊加結(jié)果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染了pEGFP-C1載體的細(xì)胞低溫處理，然后在37℃培養(yǎng)30min，因低溫而解聚的微管蛋白被重新組裝；而轉(zhuǎn)染了pEGFP-C1-hSMP-1的細(xì)胞經(jīng)低溫處理后，37℃培養(yǎng)相同的時(shí)間，微管蛋白仍然以單體的形式存在，且與pEGFP-C1-hSMP-1完全共定位。推測這是由于hSMP-1抑制了微管的組裝。
圖7.細(xì)胞同步化后細(xì)胞周期的分析A釋放后6h實(shí)驗(yàn)組G1期和G2/M期細(xì)胞數(shù)分別為23.9％、57.8％；B釋放后6h對照組G1期和G2/M期細(xì)胞數(shù)分別為19.6％、59.8％；C釋放后8h實(shí)驗(yàn)組G1期和G2/M期細(xì)胞數(shù)分別為48.6％、16.9％；D釋放后8h對照組G1期和G2/M期細(xì)胞數(shù)分別為75.4％、4.1％。以上結(jié)果表明與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在G2/M期延長。
圖8.hSMP-1蛋白在CHO-K1中的表達(dá)定位研究左圖顯示的是hSMP-1蛋白在間期的表達(dá)定位，右圖顯示的是該蛋白質(zhì)在分裂期的表達(dá)定位。圖中藍(lán)色代表細(xì)胞核，綠色為GFP-hSMP-1融合蛋白，紅色為微管。三者疊加的結(jié)果見各圖的右下方。結(jié)果顯示細(xì)胞在間期時(shí)，hSMP-1蛋白位于微管組織中心區(qū)域；當(dāng)細(xì)胞處于分裂期時(shí)，hSMP-1蛋白與組成紡錘體的微管完全共定位。
實(shí)施例1.hSMP-1蛋白相互作用蛋白質(zhì)分子的篩選將HSD-1 cDNA的3’端429bp克隆入pAS2-1質(zhì)粒，構(gòu)建誘餌質(zhì)粒。
用500μg人睪丸pACT2文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化帶有pAS2-1-HSD-1的酵母菌株Y190，共得到轉(zhuǎn)化子1.92×106，轉(zhuǎn)化子總數(shù)大于睪丸文庫的獨(dú)立克隆數(shù)，可滿足篩庫要求。一周后在SD/Trp-Leu-His-+20mmol/L3-AT培養(yǎng)基上挑取較大的克隆進(jìn)行β-半乳糖苷酶活性檢測。隨后將初步判斷為陽性的克隆擴(kuò)增并抽提酵母質(zhì)粒，將酵母質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101進(jìn)行質(zhì)粒挽救；將挽救的質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化Y190，以排除假陽性。最后獲得一與誘餌質(zhì)粒相互作用克隆，該克隆編碼位于微管組織中心的Ran結(jié)合蛋白-RanBPM，全長500個(gè)氨基酸。
2.RanBPM的原核表達(dá)、純化及抗血清的制備將RanBPM cDNA克隆至pGEX-4T1載體中，轉(zhuǎn)化BL21細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后獲得高效表達(dá)的GST-RanBPM融合蛋白。GST-RanBPM融合蛋白的純化應(yīng)用Pharmacia公司純化試劑盒進(jìn)行，利用SDS-PAGE檢測蛋白質(zhì)的純度(圖2)。純度大于90％的蛋白質(zhì)即可用于抗血清的制備。
將純化的GST-RanBPM融合蛋白與弗氏完全佐劑混合，免疫新西蘭大耳白兔，采用背部皮下多點(diǎn)注射，約20-30點(diǎn)。初始免疫后2、4、8周采用抗原和弗氏不完全佐劑混合進(jìn)行加強(qiáng)免疫。酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)抗體滴度，Western Blot檢測抗體特異性。
3.睪丸組織切片的免疫組織化學(xué)分析用改良Bovin液固定5μm厚睪丸組織冰凍切片10min。PBS洗2次，每次5min。3％H2O2室溫孵育10min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。5-10％正常羊血清(PBS配)室溫封閉10min。傾去封閉液，滴加適當(dāng)稀釋的抗RanBPM抗血清，4℃過夜。PBS洗3次，每次5min。滴加適當(dāng)稀釋的生物素標(biāo)記二抗，37℃孵育30min。PBS洗3次，每次5min。滴加適當(dāng)稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈親和素霉卵白素復(fù)合物，37℃孵育30min。PBS洗3次，每次5min。AEC(Aminoethyl Carbazole)顯色(4mg AEC溶于1ml二甲基甲酰胺中，加入14ml 0.1mol/L乙酸緩沖液，pH5.2，加入15μl 30％H2O2，過濾后即可)40min。自來水充分沖洗，蘇木精復(fù)染，封片(圖1)。
4.pull-down實(shí)驗(yàn)證明hSMP-1蛋白和RanBPM蛋白在體外的相互作用將編碼hSMP-1蛋白羧基端143個(gè)氨基酸的cDNA克隆至pMAL-c2X(New England Biolabs)載體中，用CaCl2法轉(zhuǎn)化BL21細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后獲得高效表達(dá)的帶麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)標(biāo)簽的融合蛋白。
首先小量培養(yǎng)鑒定融合蛋白表達(dá)水平及該融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)形式，然后進(jìn)行大量表達(dá)，自經(jīng)過鑒定的質(zhì)粒保存板中挑單菌落入100ml新鮮LB的錐形瓶，37℃劇烈搖動(dòng)培養(yǎng)過夜。將過夜菌液按1/10比例接種到一個(gè)含500ml LB的2000ml錐形瓶中，37℃劇烈搖動(dòng)培養(yǎng)1-1.5h，使菌液的AD600nm值達(dá)0.4-0.6。加入IPTG至終濃度為0.2mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)2h。收集培養(yǎng)物，5000rpm離心10min，棄上清。PBS洗菌體沉淀，用PBS按照5ml/g重懸，冰浴下以工作10s/冷卻20s/300W/20次的參數(shù)，超聲破碎細(xì)胞。12000rpm離心20min，分別取少量上清和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE檢測，分析蛋白質(zhì)在胞內(nèi)表達(dá)形式。其余于-70℃凍存?zhèn)溆?。同時(shí)按照相同的方法轉(zhuǎn)化pMAL-c2X載體，并大量表達(dá)MBP蛋白。
采用New England Biolabs公司的amylose resin產(chǎn)品進(jìn)行蛋白質(zhì)的純化。經(jīng)鑒定MBP蛋白與MBP-hSMP-1蛋白都表達(dá)在上清中。首先用預(yù)冷的column buffer平衡50μl amylose resin，然后將amyloseresin與上清液混合，4℃孵育2～3小時(shí)，以column buffer漂洗amylose resin 3～5次后，將其重懸于50μl1×SDS上樣緩沖液中，100℃煮沸10min，電泳檢測蛋白質(zhì)的純度(圖2)。
取MBP-hSMP-1融合蛋白溶液和MBP蛋白溶液分別與50μl amylose resin混合，4℃孵育2h后，向?qū)游鲋蟹謩e加入純化的GST-RanBPM蛋白，4℃孵育2h。用column buffer沖洗后，加入洗脫液，使其緩慢流出。收集流出液，用10％SDS-PAGE電泳檢測洗脫的蛋白質(zhì)(圖2)。
取MBP-hSMP-1融合蛋白溶液和MBP蛋白溶液分別與50μl amylose resin混合，4℃孵育2h后，向兩個(gè)體系中分別加入以EBC(50mM Tris-Cl，pH8.0，120mM NaCl，0.5％NP-40，50mM NaF，50μg/ml PMSF，10μg/ml aprotinin and leupeptin)溶液制備的人睪丸提取液，4℃孵育3h。用column buffer沖洗后，將amyloseresin轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，向離心管中加入1×SDS上樣緩沖液100μl，懸浮凝膠珠，100℃煮沸10分鐘，取20μl行10％SDS-PAGE電泳。SDS-PAGE結(jié)束后，將塑料支架平放，依次放置海綿墊、3層濾紙、凝膠、NC膜、3層濾紙、海綿墊，驅(qū)除各層間氣泡，夾好支架，在冰浴中進(jìn)行電轉(zhuǎn)，40V，8-10h；或100V，1h 20min(PVDF膜需經(jīng)100％甲醇浸透，電轉(zhuǎn)液平衡20min后方可使用)。電轉(zhuǎn)結(jié)束后，將膜置于去離子水中漂洗5min。切下邊側(cè)的蛋白質(zhì)分子量Marker條帶，浸入0.2％氨基黑染液染色1-2min，然后10％乙酸脫色至可見蛋白質(zhì)條帶，蒸餾水漂洗觀察轉(zhuǎn)移效果，并密封保存留待以后作為分析結(jié)果時(shí)分子量的參照。轉(zhuǎn)移的濾膜勿干，準(zhǔn)備用于雜交。將做好標(biāo)記的濾膜經(jīng)TBS漂洗后，加入適量封閉液(含5％脫脂奶粉、1％正常羊血清的TBS-T溶液)中，室溫輕搖2h。將濾膜放入雜交袋內(nèi)，按照0.1ml/cm2加入1∶1000的抗RanBPM抗血清，除盡氣泡，封口。于4℃輕搖過夜。取出濾膜，用TBS-T洗三次，每次10min。將膜放入塑料袋內(nèi)，按照0.1ml/cm2加入堿性磷酸酶標(biāo)記的抗兔血清。趕除氣泡，封口。室溫振蕩2h。取出濾膜，用TBS-T洗三次，每次10min。用顯色緩沖液(100mM NaCl，5mM MgCl2，100mM Tris-HCl pH9.5)洗膜5min。將濾膜浸入含100μl ReagentA與100μl Reagent B(Bio-Rad)的10ml顯色緩沖液中，于室溫下輕輕搖晃使蛋白質(zhì)條帶顯現(xiàn)，蒸餾水中漂洗，4℃避光保存并掃描(圖3)。
5.細(xì)胞免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證明hSMP-1蛋白和RanBPM蛋白在體內(nèi)的相互作用由于Hela細(xì)胞中有RanBPM的內(nèi)源性表達(dá)，因此選擇Hela細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。首先將HSD-1 cDNA克隆入pEGFP-C1(Clontech公司)，構(gòu)建融合的綠色熒光蛋白表達(dá)載體，并對重組質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定。待細(xì)胞長至90％匯合度時(shí)，將pEGFP-C1-hSMP-1和pEGFP-C1質(zhì)粒用Lipofectamine2000分別轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。48h后收集細(xì)胞。每瓶中加入1ml冰預(yù)冷的EBC細(xì)胞裂解液(50mM Tris-Cl，pH8.0，120mM NaCl，0.5％NP-40，50mM NaF，50μg/ml PMSF，10μg/ml aprotinin and leupeptin)，放置冰上裂解1h，其間追加一次PMSF，并且間隔10min用細(xì)胞刮攪動(dòng)一次。細(xì)胞裂解物于4℃ 14000rpm離心20min后收集上清。向1ml細(xì)胞裂解液中加入40μl anti-RanBPM的兔抗血清；另取1ml細(xì)胞裂解液，加入40μl正常兔血清，作為對照組。4℃振搖1h后再分別加入40μl proteinA agarose，4℃振搖過夜。ProteinA agarose用NETN溶液(20mM Tris-Cl，pH8.0，100mM NaCl，0.5％NP-40，1mM EDTA)漂洗后，重懸于50μl 1×SDS上樣緩沖液中，100℃煮沸10min，用抗hSMP-1的兔血清作為一抗，堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗進(jìn)行WesternBlot檢測(圖4)。
6.hSMP-1蛋白和RanBPM蛋白在CHO-K1細(xì)胞中的共定位將RanBPM cDNA克隆入pDsRed1-N1(Clontech公司)，構(gòu)建融合的紅色熒光蛋白表達(dá)載體，并對重組質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定。在CHO-K1細(xì)胞中進(jìn)行pEGFP-C1-hSMP-1和pDsRed1-N1-RanBPM兩種質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染，以檢測兩者的定位情況。實(shí)驗(yàn)方法如下準(zhǔn)備將蓋玻片分次置于濃酸中浸泡2h，用去離子水洗凈后室溫干燥。將經(jīng)酸處理的蓋玻片置于10倍稀釋的多聚賴氨酸溶液中，室溫放置5min后取出，置于60℃干燥1h或室溫過夜。用前將蓋玻片浸泡于75％乙醇中至少30min。
將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于放置了蓋玻片的35mm培養(yǎng)皿中，每孔3×105個(gè)細(xì)胞，37℃，5％CO2培養(yǎng)至90％飽和度。用50μl無抗生素?zé)o血清DMEM分別稀釋5μg質(zhì)粒和5μl Lipofectamine 2000。室溫放置2min后將稀釋的質(zhì)粒和Lipofectamine 2000混勻，室溫放置20min。將上述混合物加到6孔培養(yǎng)板中，來回振蕩混勻后放置于CO2孵箱。轉(zhuǎn)染4-6h后，將培養(yǎng)基換為有血清DMEM培養(yǎng)基，于37℃，5％CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
細(xì)胞化學(xué)熒光染色1)細(xì)胞固定用PBS清洗細(xì)胞兩次，取出蓋玻片，用濾紙將殘留液體吸干，以4％多聚甲醛固定液室溫固定10min。2)PBS漂洗，3×5min。3)封片取10μl封片劑滴在載玻片上，將蓋玻片有細(xì)胞的一面朝下封片，周圍用指甲油封住。4)激光共聚焦顯微鏡(LEICA TCS NT)觀察。結(jié)果顯示，兩種蛋白在CHO-K1細(xì)胞中呈完全的共定位(圖5)。
7.hSMP-1蛋白能抑制微管的組裝按上述方法將pEGFP-C1-hSMP-1質(zhì)粒和pEGFP-C1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞，24h后將細(xì)胞4℃放置90min，然后換成正常培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)30min。收集細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色，實(shí)驗(yàn)方法如下1)細(xì)胞固定用PBS清洗細(xì)胞兩次，取出蓋玻片，用濾紙將殘留液體吸干，以4％多聚甲醛固定液室溫固定10min。2)PBS漂洗，3×5min。3)細(xì)胞透化室溫下，0.5％Triton/PBS透化處理10min。4)PBS漂洗，3×5min。5)細(xì)胞封閉以3％BSA/PBS封閉，37℃，30min或4℃過夜。6)一抗孵育小鼠α-tubulin抗體按1∶100稀釋，37℃，30min。7)PBS漂洗，3×5min。8)二抗孵育羊抗鼠抗體按1∶50稀釋，37℃，30min。9)PBS漂洗，3×5min。10)去離子水漂洗，2×5min。11)封片取10μl封片劑滴在載玻片上，將蓋玻片有細(xì)胞的一面朝下封片，周圍用指甲油封住。12)用激光共聚焦顯微鏡(LEICA TCS NT)觀察(圖6)。
8.穩(wěn)定表達(dá)hSMP-1蛋白的細(xì)胞株的篩選取處于對數(shù)生長期的CHO-K1細(xì)胞按5×104/孔的密度傳代于12個(gè)35mm培養(yǎng)皿，24h后向各培養(yǎng)皿中分別按以下濃度加入G4180，50μg/ml，100μg/ml，200μg/ml，300μg/ml，400μg/ml，500μg/ml，600μg/ml，700μg/ml，800μg/ml，900μg/ml，1000μg/ml。每3天換液，培養(yǎng)10-14天，以使35mm培養(yǎng)皿內(nèi)細(xì)胞全部死亡的最低濃度為G418最低致死濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)G418最低致死濃度為500μg/ml。
培養(yǎng)CHO-K1細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-hSMP-1和pEGFP-C1質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后24-72h，觀察細(xì)胞狀態(tài)。待細(xì)胞接近完全匯合時(shí)，1∶6-1∶10傳代。然后加入終濃度為500μg/ml的G418，每2-3天換一次液。待長出細(xì)胞克隆后，置于熒光顯微鏡下觀察。用記號筆在有綠色熒光的克隆的相應(yīng)位置標(biāo)記，然后在超凈臺上用無菌牙簽挑取陽性克隆，接種于24孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞長滿后，轉(zhuǎn)移至25cm2的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。收集培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞，加入100μl 1×SDS上樣緩沖液裂解細(xì)胞，Western檢測是否有目的蛋白的表達(dá)。
9.應(yīng)用表達(dá)hSMP-1蛋白的穩(wěn)定克隆，研究hSMP-1蛋白對細(xì)胞周期的影響及其在不同時(shí)相的表達(dá)定位情況將穩(wěn)定表達(dá)GFP-hSMP-1融合蛋白、GFP蛋白的CHO-K1細(xì)胞按照3×105/孔的密度分別傳至60mm培養(yǎng)皿中。待細(xì)胞生長至指數(shù)生長期時(shí)，向培養(yǎng)基中加入終濃度為2mM的脫氧胸苷，作用12h后換成正常培養(yǎng)基，間隔8-10h后再次加入終濃度為2mM的脫氧胸苷，使絕大部分細(xì)胞同步化于S期。換成正常培養(yǎng)基釋放，間隔2-4h取樣，以流式細(xì)胞計(jì)量儀分析細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)方法如下1)用胰酶消化收集細(xì)胞，PBS洗兩遍。2)以0.5mlPBS重懸細(xì)胞，迅速打入5ml 70％預(yù)冷乙醇中，吹打均勻，4℃固定12h以上。3)PBS洗去乙醇，1,500rpm，5min。4)0.5mlPBS重懸細(xì)胞，加入RNaseA至終濃度50μg/ml，37℃，30min。5)加入PI至終濃度50μg/ml，37℃，30min。6)用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期。(圖7)同時(shí)取樣進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色1)細(xì)胞固定用PBS清洗細(xì)胞兩次，取出蓋玻片，用濾紙將殘留液體吸干，以4％多聚甲醛固定液室溫固定10min。2)PBS漂洗，3×5min。3)細(xì)胞透化室溫下，0.5％Triton/PBS透化處理10min。4)PBS漂洗，3×5min。5)細(xì)胞封閉以3％BSA/PBS封閉，37℃，30min或4℃過夜。6)一抗孵育小鼠α-tubulin抗體按1∶100稀釋，37℃，30min。7)PBS漂洗，3×5min。8)二抗孵育羊抗鼠抗體按1∶50稀釋，37℃，30min。9)PBS漂洗，3×5min。10)Hochest33258染細(xì)胞核，室溫下5-10min。11)去離子水漂洗，2×5min。12)取10μl封片劑滴在載玻片上，將蓋玻片有細(xì)胞的一面朝下封片，周圍用指甲油封住。13)用激光共聚焦顯微鏡(LEICA TCS SP)觀察(圖8)。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明涉及一個(gè)人睪丸特異表達(dá)的HSD-1基因(2003年該基因被人類基因命名數(shù)據(jù)庫命名為SPAG8)編碼的蛋白質(zhì)，命名為hSMP-1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述之hSMP-1蛋白，其特征在于該蛋白質(zhì)在酵母雙雜交系統(tǒng)中能夠與位于微管組織中心的Ran結(jié)合蛋白-RanBPM相互作用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述之hSMP-1蛋白，其特征在于RanBPM蛋白和hSMP-1蛋白在體外和體內(nèi)都具有相互作用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3所述之hSMP-1蛋白，其特征在于在酵母雙雜交系統(tǒng)中與該蛋白質(zhì)相互作用的RanBPM蛋白在人睪丸組織中主要表達(dá)于精原細(xì)胞與初級精母細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4所述之hSMP-1蛋白，其特征在于在CHO細(xì)胞中，RanBPM蛋白和hSMP-1蛋白呈現(xiàn)完全共定位。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5所述之hSMP-1蛋白，其特征在于該蛋白質(zhì)對微管的組裝具有一定的抑制作用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5、6所述之hSMP-1蛋白，其特征在于該蛋白質(zhì)的過量表達(dá)使細(xì)胞周期在G2/M期延長。同時(shí)在有絲分裂的過程中，該蛋白質(zhì)與組成紡錘體的微管完全共定位。
8.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7所述之hSMP-1蛋白，其特征在于該蛋白質(zhì)與微管的組裝/去組裝，以及有絲分裂過程中紡錘體的形成等生命現(xiàn)象密切相關(guān)。在抗生育領(lǐng)域以及新藥的設(shè)計(jì)與開發(fā)中具有潛在的應(yīng)用前景。
全文摘要
本發(fā)明涉及一個(gè)人睪丸特異表達(dá)的基因編碼蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能，該基因命名為HSD－1，其編碼蛋白質(zhì)命名為hSMP－1。2003年HSD－1基因被人類基因命名數(shù)據(jù)庫命名為SPAG8。內(nèi)容包括以hSMP－1蛋白作為“誘餌”，利用酵母雙雜交的方法篩選人睪丸cDNA文庫，得到編碼RanBPM的cDNA片段。免疫組化結(jié)果顯示，RanBPM在人睪丸組織中主要定位于精原細(xì)胞與初級精母細(xì)胞。之后分別從體外和體內(nèi)兩個(gè)方面證實(shí)了hSMP－1蛋白和RanBPM蛋白的相互作用。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，在CHO－K1細(xì)胞中，過表達(dá)的“誘餌”蛋白和“捕獲”蛋白呈現(xiàn)完全共定位。一系列研究發(fā)現(xiàn)hSMP－1蛋白可調(diào)節(jié)微管的活生，參與有絲分裂的過程，引起細(xì)胞周期的變化。闡明其生理生化功能對了解基因表達(dá)調(diào)控規(guī)律和生殖細(xì)胞的發(fā)生機(jī)理具有重要的意義。
文檔編號C12N15/12GK1667121SQ20041000479
公開日2005年9月14日 申請日期2004年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月11日
發(fā)明者唐曉玲, 張建超, 才迎, 繆時(shí)英, 宗書東, 王琳芳 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所