專利名稱：由丙酮合氰化氫生產(chǎn)2－羥基異丁酸和甲基丙烯酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種使用酶催化劑生產(chǎn)2-羥基異丁酸的方法。更具體地說，本發(fā)明是關(guān)于使用具有敏捷假單胞菌72W腈水解酶活性的催化劑或具有睪丸酮假單胞菌5-MGAM-4D或睪丸酮假單胞菌22-1的組合腈水合酶和酰胺酶活性的催化劑，由丙酮合氰化氫生產(chǎn)2-羥基異丁酸。2-羥基異丁酸可用作生產(chǎn)甲基丙烯酸的中間體。
背景技術(shù)：
甲基丙烯酸及其酯廣泛用于生產(chǎn)聚丙烯酸酯板材、澆鑄產(chǎn)品、涂料和耐沖擊性改進劑。它還應(yīng)用于例如洗滌劑增效助劑、流動改性劑、機油添加劑、不溶油墨、油漆和上光劑產(chǎn)品中。雖然存在幾種制備甲基丙烯酸的生產(chǎn)方法，但目前水解甲基丙烯酰胺硫酸鹽(用丙酮合氰化氫制備)的方法占全世界工業(yè)生產(chǎn)的大部分(W.Bauer，Jr.“Methacrylic Acid and Derivatives”在Ullmann’s Encyclopediaof Industrial Chemistry，第5版中；編輯B.Elvers，S.Hawkins，G.Schulz；VCH，New York，1990；vol.A16，441-452頁；A.W.Gross，J.C.Dobson，“Methacrylic Acid and Derivatives”在Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology，第4版中；編輯J.I.Kroschwitz，M.Howe-Grant；John Wiley and Sons，New York，1995；vol.16，474-506頁)。該方法中，通過甲基丙烯酰胺硫酸鹽制備甲基丙烯酸1kg需要硫酸約1.6kg。因此，非常需要替代的方法以省去目前工業(yè)化生產(chǎn)甲基丙烯酸方法中的硫酸的回收和再生(和所需要的大量能源)。
在US 3,666,805和US 5,225,594中公開了2-羥基異丁酸化學(xué)轉(zhuǎn)化為甲基丙烯酸，其中使用金屬氧化物和氫氧化物、離子交換樹脂、氧化鋁、二氧化硅、胺、膦、堿金屬的醇化物或羧酸鹽使2-羥基異丁酸脫水，其中反應(yīng)溫度一般在160℃和250℃之間。在優(yōu)選的方法中(US5225594)，2-羥基異丁酸和氫氧化鈉在185℃-195℃真空(300乇)條件下攪拌進行反應(yīng)，得到2-羥基異丁酸的轉(zhuǎn)化率為97.1％，甲基丙烯酸得率為96％。
生產(chǎn)甲基丙烯酸的另一路徑是使用微生物催化劑或酶催化劑將丙酮合氰化氫水解成2-羥基異丁酸，隨后將2-羥基異丁酸脫水制備甲基丙烯酸。已知多種將α-羥基腈微生物水解或酶水解為對應(yīng)的α-含氧酸的方法。用這些方法制備的α-含氧酸的實例包括羥基乙酸，乳酸，2-羥基異丁酸，2-羥基-2-羥苯基丙酸，苯乙醇酸，2-羥基-3，3-二甲基-4-丁內(nèi)酯和4-甲基硫代丁酸。
能夠催化α-羥基腈水解的微生物包括屬于諾卡氏菌、芽胞桿菌、短桿菌、金桿菌、假單胞細(xì)菌、乳酪桿菌、產(chǎn)堿桿菌、不動桿菌、腸桿菌、節(jié)桿菌、埃希氏菌、小球菌、鏈霉菌、黃質(zhì)菌、產(chǎn)氣單孢菌、枝動桿菌、纖維單胞菌、歐氏植病桿菌、假絲酵母、無芽孢桿菌、曲霉屬菌、青霉屬菌、Cochliobolus、鐮刀菌、紅假單胞菌、紅球菌、棒狀桿菌、小棒狀桿菌、肥桿菌和戈登氏菌屬的微生物。(JP-A-4-99495，JP-A-4-99496和JP-A-4-218385相應(yīng)于美國專利號5,223,416；JP-A-4-99497相應(yīng)于美國專利號5,234,826；JP-A-5-95795相應(yīng)于美國專利號5,296,373；JP-A-5-21987；JP-A-5-192189相應(yīng)于美國專利號5,326,702；JP-A-6-237789相應(yīng)于EP-A-0610048；JP-A-6-284899相應(yīng)于EP-A-0610049；JP-A-7-213296相應(yīng)于美國專利號5,508,181)。
大部分以上提及的已知的使用酶催化劑由對應(yīng)的α-羥基腈制備α-含氧酸的方法不能在可達到工業(yè)需要的足夠高濃度條件下制備和富集產(chǎn)品。這通常是反應(yīng)初期的酶失活造成的。例如，U.S.5,756,306教導(dǎo)了“當(dāng)使用腈水解酶或腈水合酶將α-羥基腈酶水解或水合制備α-含氧酸或α-羥基酰胺時，存在的問題是在短期內(nèi)酶失活。因此難以高濃度和高產(chǎn)率地得到α-含氧酸或α-羥基酰胺。”(第1欄，49-54行)。
U.S.6,037,155教導(dǎo)了α-含氧酸產(chǎn)物的積累水平低與反應(yīng)開始后在短時間內(nèi)酶失活有關(guān)。在氰化氫存在下酶的活性被抑制(Asano等，Agricultural Biological Chemistry，461164-1165(1982)(更名為Bioscience，Biotechnology & Biochemistry as of January1992))。氫化氰是α-羥基腈在水中部分解離產(chǎn)生的，同時產(chǎn)生對應(yīng)的醛或酮(Mowry，Chemical Reviews，42189-284(1948))。對于生產(chǎn)2-羥基異丁酸，已知丙酮合氰化氫在水中可逆地離解為氰化氫和丙酮(Stewart等，J.Am.Chem.Soc.623281-5(1940))，而得到的氰化氫可以使酶活性喪失。
一種使用屬于棒狀桿菌屬的微生物制備2-羥基丙酸、羥基乙酸和2-羥基異丁酸的方法在日本專利Sho 61-56086中公開了。使用屬于紅球菌、假單胞菌、節(jié)桿菌或短桿菌(JP 04040897 A2)和無色桿菌(JP06237776 A2)菌屬的微生物由丙酮合氰化氫也制備了2-羥基異丁酸。使用紫紅紅球菌(ATCC 19140)時通過向反應(yīng)混合物中加入濃度0.5-50wt％的丙酮提高了2-羥基異丁酸的生產(chǎn)效率(JP 05219969 A2)，推測是由于隔離了氰化氫。
如上所述，已經(jīng)證明發(fā)展使用具有腈水解酶或者腈水合酶/酰胺酶活性的微生物催化劑以高效地生產(chǎn)2-羥基異丁酸的工業(yè)方法是困難的。反應(yīng)混合物中存在的氰根離子可以減除或抑制酶活性。
要解決的問題仍然是在具有高轉(zhuǎn)化率，高濃度和高選擇性特征的方法中缺乏易將丙酮合氰化氫轉(zhuǎn)化為2-羥基異丁酸的微生物催化劑，該方法相對于以前已知的方法另外還具有工藝溫度低和廢物產(chǎn)量低的優(yōu)點。
發(fā)明概述本發(fā)明提供一種高專一性和高轉(zhuǎn)化率的由丙酮合氰化氫制備2-羥基異丁酸的方法。本發(fā)明包括的步驟有(a)在合適的含水反應(yīng)混合物中使丙酮合氰化氫與催化劑接觸，催化劑的特征在于具有腈水解酶活性(EC 3.5.5.7)或具有腈水合酶(EC 4.2.1.84)和酰胺酶(EC3.5.1.4)活性；和(b)以酸或?qū)?yīng)鹽的形式分離(a)中生產(chǎn)的2-羥基異丁酸。通過使(a)中生產(chǎn)的酸脫水得到甲基丙烯酸；和分離酸或?qū)?yīng)的鹽。反應(yīng)如下所示。

本發(fā)明使用的酶催化劑(包括本文指明的由生物保藏物獲得的酶催化劑)是以完整的微生物細(xì)胞，經(jīng)滲透化的微生物細(xì)胞，微生物細(xì)胞提取物的一種或多種細(xì)胞組分以及不完全純化的酶或純化的酶的形式。不論何種形式的酶催化劑都可以固定在可溶的或不溶的載體中或載體上。
生物保藏物的簡要說明為了滿足專利程序的要求，申請人按照布達佩斯條約關(guān)于微生物保藏的國際認(rèn)可的條件制備了下列生物保藏物保藏物登記名稱國際保藏單位名稱保藏日期敏捷假單胞菌72-PF-17 ATCC 55745 1996年3月8日敏捷假單胞菌72WATCC 55746 1996年3月8日敏捷假單胞菌72-PF-15 ATCC 55747 1996年3月8日大腸桿菌SS1001 ATCC PTA-1177 2000年1月11日大腸桿菌SW91 ATCC PTA-1175 2000年1月11日睪丸酮假單胞菌22-1 ATCC PTA-1853 2000年5月10日睪丸酮假單胞菌5-MGAM-4DATCC 55744 1996年3月8日本文中使用的“ATCC”是指位于ATCC，10801 University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209，USA的美國典型培養(yǎng)物收集國際保藏管理局(American Type Culture Collection International DepositoryAuthority)?！皣H保藏單位名稱”是ATCC保藏的培養(yǎng)物的登錄號。
所列出的存放物將在指明的國際儲藏所保存至少三十(30)年，并且在公開該存放物的專利許可下公眾可以獲得。得到該存放物不構(gòu)成損害經(jīng)政府行為授予的專利權(quán)實施本發(fā)明的行為。
發(fā)明詳述申請人已經(jīng)解決了所述的問題，是通過使用具有腈水解酶活性或者具有組合的腈水合酶和酰胺酶活性的催化劑提供一種高選擇性和高轉(zhuǎn)化率的由丙酮合氰化氫制備2-羥基異丁酸的方法。在后續(xù)的步驟中，2-羥基異丁酸脫水制備甲基丙烯酸。
使用微生物催化劑腈水解酶(EC 3.5.5.7)可以直接將脂肪族或芳香族腈轉(zhuǎn)化成對應(yīng)的羧酸，其中沒有對應(yīng)的酰胺中間體(式1)產(chǎn)生，而腈水合酶(NHase)(EC 4.2.1.84)首先將脂肪族或芳香族腈轉(zhuǎn)化成酰胺，然后通過酰胺酶(EC 3.5.1.4)將酰胺接著轉(zhuǎn)化成對應(yīng)的羧酸(式2) 本發(fā)明生產(chǎn)的甲基丙烯酸可用于多種工業(yè)，包括添加劑和涂料。相對于在前的已知方法，本方法提供了所需要的加工溫度低和生產(chǎn)浪費低的優(yōu)點。
定義在本申請中，使用了許多術(shù)語和縮寫。除另外特殊說明之外，使用下列定義。
術(shù)語“催化劑”、“酶催化劑”或“微生物細(xì)胞催化劑”是指特征為具有腈水解酶活性或具有組合的腈水合酶和酰胺酶活性的催化劑。酶催化劑可以以完整的微生物細(xì)胞，經(jīng)滲透化的微生物細(xì)胞，微生物細(xì)胞提取物的一種或多種細(xì)胞組分以及不完全純化的酶或純化的酶的形式。
術(shù)語“敏捷假單胞菌”和“A.Facilis”的使用可互換。
術(shù)語“大腸桿菌”和“E.Coli”的使用可互換。
術(shù)語“睪丸酮假單胞菌”和“C.testosteroni”的使用可互換。
術(shù)語“丙酮合氰化氫”與2-羥基-2-甲基-丙腈、2-甲基-2-羥基丙腈、a-羥基異丁腈；2-氰基-2-羥基丙烷；2-氰基-2-丙醇、2-羥基-2-氰基丙烷、2-羥基-2-甲基丙腈、2-羥基-2-甲基丙腈、2-羥基異丁腈、2-甲基-2-羥基丙腈、2-甲基丙醇腈、丙酮羥腈、二甲酮氰醇和其它所有CAS登記號為75-86-5的同義詞含義相同。
術(shù)語“2-羥基異丁酸”與2-羥基-2-甲基丙酸、2-甲基丙醇酸、α-HIB、α-羥基-α-甲基丙酸、α-羥基異丁酸、α-羥基異丁酸、2-羥基-2-甲基丙酸、2-羥基-2-甲基丙酸、2-甲基丙醇酸、醋酮酸、羥基二甲基乙酸和其它所有CAS登記號為594-61-6的同義詞含義相同。
術(shù)語“甲基丙烯酸”與2-甲基-2-丙烯酸、a-甲基丙烯酸、α-異丁烯酸、2-甲基-2-丙烯酸、2-異丁烯酸、異丁烯酸和其它所有CAS登記號為79-41-4的同義詞含義相同。
術(shù)語“合適的含水反應(yīng)混合物”是指丙酮合氰化氫和催化劑在其中接觸的材料和水。本文提到了合適的含水反應(yīng)混合物的組分，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠知道適合本方法的組分的變化范圍。
說明書中的縮寫相應(yīng)于如下的量度單位，技術(shù)，性質(zhì)或化合物“sec”意思是秒，“min”意思是分鐘，“h”意思是小時，“d”意思是天，“mL”意思是毫升，“L”意思是升，“mM”意思是體積毫克分子濃度，“M”意思是體積克分子濃度，“mmol”意思是毫摩爾，和“wt”意思是重量。“HPLC”意思是高效液相色譜“ca”意思是大約，“O.D.”意思是在指明的波長下的吸光度，“IU”意思是國際單位。
優(yōu)選實施方案的說明方法和材料微生物細(xì)胞酶催化劑本發(fā)明使用微生物細(xì)胞將丙酮合氰化氫轉(zhuǎn)化為2-羥基異丁酸，微生物細(xì)胞的特征在于具有脂肪族腈水解酶(EC 3.5.5.7)活性或具有腈水合酶(EC 4.2.1.84)和酰胺酶(EC 3.5.1.4)的組合活性。
具有全部三種酶的活性的微生物細(xì)胞是敏捷假單胞菌72W(ATCC55746)(US 6,066,490)。僅具有腈水解酶活性特征的用于本方法的微生物是敏捷假單胞菌的突變體72-PF-15(ATCC 55747)和72-PF-17(ATCC 55745)。在35-70℃下在合適的緩沖劑中加熱敏捷假單胞菌72W的懸浮液10至120分鐘使微生物細(xì)胞催化劑的腈水合酶和酰胺酶活性失活，而對需要的腈水解酶活性不產(chǎn)生明顯的減小(U.S.5,814,508)。這種熱處理產(chǎn)生的催化劑避免了當(dāng)沒有完全地轉(zhuǎn)變成對應(yīng)的酸時不需要的副產(chǎn)品2-羥基異丁酰胺的形成。當(dāng)突變體和轉(zhuǎn)化的微生物細(xì)胞缺乏敏捷假單胞菌72W的腈水合酶和酰胺酶活性時，不需要熱處理步驟。含敏捷假單胞菌腈水解酶活性的轉(zhuǎn)化的微生物細(xì)胞被歸入本發(fā)明。大腸桿菌SS1001(ATCC PTA-1177)和大腸桿菌SW91(ATCCPTA-1175)是這種缺乏腈水合酶和酰胺酶活性的轉(zhuǎn)化的微生物細(xì)胞催化劑的實例。
本發(fā)明還使用以具有腈水合酶和酰胺酶活性為特征的微生物細(xì)胞作為將丙酮合氰化氫轉(zhuǎn)化為2-羥基異丁酸的酶催化劑。優(yōu)選的微生物催化劑是睪丸酮假單胞菌5-MGAM-4D(ATCC 55744)和睪丸酮假單胞菌22-1(ATCC PTA-1853)和表達睪丸酮假單胞菌5-MGAM-4D或睪丸酮假單胞菌22-1的腈水合酶和酰胺酶活性的轉(zhuǎn)化的微生物細(xì)胞。沒有進行如上所述的熱處理步驟的敏捷假單胞菌72W細(xì)胞(ATCC 55746)也可以用于本發(fā)明。
微生物酶催化劑的培養(yǎng)按照下面所述分離用于丙酮合氰化氫轉(zhuǎn)化的微生物菌株。冷凍的15％甘油儲液保持在-65℃--70℃。
用E2基礎(chǔ)培養(yǎng)基(表1)(pH7.2)，使用標(biāo)準(zhǔn)富集方法從Orange，TX，U.S.A.采集的土壤中富集睪丸酮假單胞菌22-1，睪丸酮假單胞菌5-MGAM-4D和敏捷假單胞菌72W。
表1E2基礎(chǔ)培養(yǎng)基g/LKH2PO41.4 NaMoO4·2H2O 0.0025NaH2PO46.9 NiCl2·6H2O 0.01KCl 0.5 CuSO4·2H2O 0.005MgSO4.7H2O 0.5 維生素H 0.0002CaCl20.025葉酸 0.0002NaCl 1吡哆醇.HCl 0.001檸檬酸鈉 0.1 維生素B2 0.0005FeSO4·7H2O 0.05 煙酸 0.0005CoCl2·6H2O 0.01 泛酸 0.0005MnCl2·4H2O 0.001維生素B120.00001ZnCl20.0005 對氨基苯甲酸 0.0005H3BO30.000062表2包括對E2基礎(chǔ)培養(yǎng)基進行的修改，以用于如上所述的富集。
表2菌株 富集腈 其它睪丸酮假單胞菌22-1 0.2％3-羥基戊腈0.6％甘油敏捷假單胞菌72W 0.2％乙基丁二腈0.6％甘油睪丸酮假單胞菌5-MGAM-4D 0.2％2-甲基戊二酸酰胺 pH5.6睪丸酮假單胞菌22-1和睪丸酮假單胞菌5-MGAM-4D在下列條件下(表3)有氧培養(yǎng)用于檢測腈的轉(zhuǎn)化活性。
表3菌株 腈/酰胺 培養(yǎng)基 ℃時間，h22-1 0.1％(v/v)丁腈E2，1％(w/v)葡萄糖 30285-MGAM-4D 0.2％(w/v)丙酰胺 E2，0.6％(w/v)葡萄糖+ 3029二水合琥珀酸鈉敏捷假單胞菌72W在下列條件下(表4)有氧培養(yǎng)用于檢測腈的轉(zhuǎn)化活性。接種時向含8.5L發(fā)酵罐培養(yǎng)基(表4)的發(fā)酵罐中加入218g營養(yǎng)料液(見下文)，得到的甘油的起始濃度大約為7g/L。32℃，pH6.8-7.0的條件下溶解的氧保持在25％的飽和度。接種18h后，開始供給營養(yǎng)料液。營養(yǎng)料液包括下列組分，這些組分分別滅菌，冷卻后混合磷酸二氫鉀，19.6g，溶于0.25L去離子水中；硫酸鎂，七水合物，3.3g加硫酸，4mL，溶于0.15L去離子水中；微量金屬(表6)溶液，67mL，加400g甘油，溶于0.80L去離子水中。最初，營養(yǎng)料液以0.4g進料/分鐘(0.15g甘油/min)的速度加入。26h時，進料速度增加到0.9g進料/min(0.3g甘油/min)。34h時最后的進料速度增加到1.8g進料/min(0.6g甘油/min)。58小時時采集72W細(xì)胞。
表4組分 儲液濃度組分儲液濃度發(fā)酵罐培養(yǎng)基磷酸二氫鉀 0.39g/L 磷酸氫二鉀 0.39g/LDifco酵母提取物 5.0g/L微量金屬溶液鹽酸 10mL/L 七水合硫酸鋅1.77g/L二水合氯化鈣 11.4g/L 二水合鉬酸鈉0.05g/L一水合硫酸錳 1.23g/L 二水合硫酸釩0.08g/L五水合硫酸銅 0.63g/L 六水合硝酸鎳0.04g/L六水合氯化鈷 0.16g/L 亞硒酸鈉0.04g/L硼酸 0.91g/L 七水合硫酸亞鐵 6.0g/L采集的細(xì)胞在-65--70℃下冷凍直到用于腈的轉(zhuǎn)化。為了使用僅具有腈水解酶活性的酶催化劑，0.35M磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中10-50％(細(xì)胞濕重)敏捷假單胞菌72W細(xì)胞懸浮液首先加熱到50℃ 1h以除去存在的腈水合酶和酰胺酶的活性，而不顯著地減小腈水解酶活性。沒有在50℃熱處理過的并且具有腈水解酶活性和腈水合酶和酰胺酶活性的敏捷假單胞菌72W細(xì)胞生產(chǎn)2-羥基異丁酸和甲基丙烯酸的得率與熱處理過的僅含腈水解酶的細(xì)胞相似。
已經(jīng)制備出了僅產(chǎn)生很低水平的親株腈水合酶活性的敏捷假單胞菌72W(ATCC 55746)菌株的兩種突變體(U.S.5,858,736，并入作為參考)。這些由A.facilis 72W(敏捷假單胞菌72-PF-15(ATCC55747)和敏捷假單胞菌72-PF-17(ATCC 55745))獲得的腈水合酶缺乏的突變株不需要在用作將丙酮合氰化氫水解為2-羥基異丁酸的酶催化劑之前進行熱處理。
使用腈水解酶活性或腈水合酶/酰胺酶活性生產(chǎn)2-羥基異丁酸A.facilis 72W細(xì)胞除了含有腈水解酶還含有腈水合酶和酰胺酶。腈水合酶由丙酮合氰化氫生成2-羥基異丁酰胺，(如果沒有用酰胺酶完全地轉(zhuǎn)化為酸)，則可能產(chǎn)生不需要的副產(chǎn)品。為了避免產(chǎn)生這些副產(chǎn)品，A.facilis 72W微生物細(xì)胞催化劑可以經(jīng)熱處理以除去腈水合酶和酰胺酶活性，這樣就制備了一種對2-羥基異丁酸有高選擇性而沒有2-羥基異丁酰胺生成的微生物催化劑。酶活性維持穩(wěn)定狀態(tài)的時間更長。
具有腈水解酶或腈水合酶/酰胺酶活性的完整的微生物細(xì)胞不進行例如滲透化作用的任何預(yù)處理就能夠使用。另外，微生物細(xì)胞可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法(例如用甲苯或洗滌劑處理或進行凍融處理)進行滲透化以提高物質(zhì)進出細(xì)胞的擴散速率。
為了使催化劑易于回收和再利用，酶催化劑可以固定在聚合物基質(zhì)(如藻酸鹽、角叉菜膠、聚乙烯醇或聚丙烯酰胺凝膠(PAG))中或固定在可溶的或不溶的載體(如硅藻土)上。將細(xì)胞固定在聚合物基質(zhì)中或固定在可溶或不溶的載體上的方法已經(jīng)有廣泛的報道，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的。還可以從微生物細(xì)胞中分離出酶的活性或多種活性直接用作催化劑，或者將該酶的活性或多種活性固定在聚合物基質(zhì)中或固定在可溶或不溶的載體上。這些方法也已經(jīng)有廣泛的報道，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的(Methods in Biotechnology，Vol.1Immobilization of Enzymes and Cells；Gordon F.Bickerstaff編輯；Humana Press，Totowa，NJ，USA；1997)。
反應(yīng)混合物中酶催化劑的濃度取決于酶催化劑的具體催化活性，選擇酶催化劑的濃度以得到要求的反應(yīng)速率。水解反應(yīng)中微生物細(xì)胞催化劑的細(xì)胞濕重一般從每一毫升總反應(yīng)體積0.001g-0.100g濕細(xì)胞，優(yōu)選每一毫升0.002g-0.050g濕細(xì)胞。確定微生物細(xì)胞催化劑的比活度(IU/克細(xì)胞濕重)是通過在25℃下使用已知重量的微生物細(xì)胞催化劑，對0.10M丙酮合氰化氫溶液的水解速度(對于腈水解酶活性)或者水合速度(對于腈水合酶活性)進行測定。酶活性的單位IU定義為每分鐘將一微摩爾的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需要的酶活性的數(shù)值。
選擇水解反應(yīng)的溫度以使反應(yīng)速率和酶催化劑活性的穩(wěn)定性都最優(yōu)化。反應(yīng)的溫度可以剛好在懸浮液結(jié)冰點以上(大約0℃)至70℃，優(yōu)選的反應(yīng)溫度為5℃-35℃。使用酶催化劑的反應(yīng)可以在水中無緩沖體系條件下進行，或者在含有緩沖劑(如磷酸鈉或磷酸鉀)的含水反應(yīng)混合物中進行，反應(yīng)的初始pH在5.0和10.0之間，優(yōu)選在6.0和8.0之間。隨著反應(yīng)的進行，反應(yīng)混合物的pH由于2-羥基異丁酸的銨鹽的形成而發(fā)生變化，2-羥基異丁酸的銨鹽由丙酮合氰化氫的對應(yīng)的腈官能團形成。在不控制pH，或者加入控制pH的緩沖劑存在下，或者在反應(yīng)過程中加入合適的酸或堿以保持要求的pH，反應(yīng)都可以徹底的完成丙酮合氰化氫的轉(zhuǎn)化。
已知丙酮合氰化氫在水中可逆地解離為氰化氫和丙酮(Stewart等，J.Am.Chem.Soc.623281-5(1940))，當(dāng)反應(yīng)混合物的pH減小時平衡有利于丙酮合氰化氫。丙酮合氰化氫酶催化水解的最適pH是酶保持活性的條件下可能的最低pH，一般但不限于pH4.5-6.0。反應(yīng)結(jié)束剩余的丙酮可以回收再用于生產(chǎn)丙酮合氰化氫?；厥盏谋米髌鹗挤磻?yīng)物有利于丙酮合氰化氫更全部地轉(zhuǎn)化為2-羥基異丁酸。
這樣得到的2-羥基異丁酸通過普通技術(shù)人員熟知的方法處理反應(yīng)混合物(其中包括細(xì)胞的不溶物質(zhì)已經(jīng)除去)可以分離出來。這種方法包括但不局限于濃縮，離子交換，蒸餾，電滲析，萃取和結(jié)晶。產(chǎn)物可以以銨鹽或(酸化后)以2-羥基異丁酸的形式分離。
2-羥基異丁酸(或其對應(yīng)的鹽)通過多種方法脫水形成甲基丙烯酸，其中一些方法在US 3,666,805和US 5,225,594中描述。使用金屬氧化物和氫氧化物，離子交換樹脂，礬土，硅石，胺，膦，堿金屬醇鹽或羧酸鹽可以完成2-羥基異丁酸的脫水，反應(yīng)溫度一般在160℃-250℃之間。
實施例本發(fā)明在下面的實施例中進一步詳細(xì)說明。這些實施例應(yīng)理解為僅僅作為舉出的例證指明本發(fā)明的優(yōu)選具體實施方案。從以上詳述和這些實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的主要特征，不脫離本發(fā)明精神和范圍的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以作出本發(fā)明的各種改變和修飾以適應(yīng)各種用途和條件。
在下面的實施例中，丙酮合氰化氫的回收率和2-羥基異丁酸，2-羥基異丁酰胺和丙酮的百分得率以存在于反應(yīng)混合物中的丙酮合氰化氫的起始濃度為基準(zhǔn)，使用折射率檢測器和有預(yù)分離柱的Bio-Rad HPX87H有機酸分析柱(30cm×7.8mm直徑)在50℃下通過HPLC測定，洗脫液為0.010N H2SO4，洗脫速度1mL/min。
實施例1用睪丸酮假單胞菌5-MGAM-4D細(xì)胞將丙酮合氰化氫水解為2-羥基異丁酸0.383g(糊狀濕細(xì)胞)睪丸酮假單胞菌5-MGAM-4D細(xì)胞(ATCC55744)在5.56mL，50mM磷酸鉀緩沖液(pH6.0)中的懸浮液放入15mL的聚丙烯離心管中，然后加入51.0mg丙酮合氰化氫(懸浮液中丙酮合氰化氫的最后濃度為0.10M)，25℃下在轉(zhuǎn)動平臺上混合得到的懸浮液。用于分析的樣品(0.180mL)與0.020mL 1.0M的丙酸(HPLC外標(biāo))混合，離心，上層清液用HPLC分析丙酮合氰化氫，丙酮和2-羥基異丁酸。4h之后，2-羥基異丁酸，2-羥基異丁酰胺和丙酮的得率分別是73.5％，0％和20.4％，沒有剩余丙酮合氰化氫。
實施例2用睪丸酮假單胞菌22-1將丙酮合氰化氫水解為2-羥基異丁酸0.343g(糊狀濕細(xì)胞)睪丸酮假單胞菌22-1細(xì)胞(ATCC PTA-1853)在5.61mL，50mM磷酸鉀緩沖液(pH6.0)中的懸浮液放入15mL的聚丙烯離心管中，然后加入51.0mg丙酮合氰化氫(懸浮液中丙酮合氰化氫的最后濃度為0.10M)，25℃下在轉(zhuǎn)動平臺上混合得到的懸浮液。用于分析的樣品(0.180mL)與0.020mL 1.0M的丙酸(HPLC外標(biāo))混合，離心，上層清液用HPLC分析丙酮合氰化氫，丙酮和2-羥基異丁酸。21h之后，2-羥基異丁酸，2-羥基異丁酰胺和丙酮的得率分別是40.4％，0％和34.5％，剩余丙酮合氰化氫18.4％。
實施例3用敏捷假單胞菌72W將丙酮合氰化氫轉(zhuǎn)化為2-羥基異丁酸0.36g(糊狀濕細(xì)胞)敏捷假單胞菌72W細(xì)胞(ATCC 55746)在5.58mL，100mM磷酸鉀緩沖液(pH6.0)中的懸浮液放入15mL的聚丙烯離心管中，離心管含有51.0mg丙酮合氰化氫(懸浮液中丙酮合氰化氫的最后濃度為0.10M)，25℃下在轉(zhuǎn)動平臺上混合得到的懸浮液。用于分析的樣品(0.180mL)與0.020mL 1.0M的丙酸(HPLC外標(biāo))混合，離心，上層清液用HPLC分析丙酮合氰化氫，丙酮，2-羥基異丁酸和2-羥基異丁酰胺。22h之后，2-羥基異丁酸，2-羥基異丁酰胺和丙酮的得率分別是22.0％，0％和70.2％，剩余丙酮合氰化氫2.5％。
實施例4用敏捷假單胞菌72W的腈水解酶活性將丙酮合氰化氫轉(zhuǎn)化為2-羥基異丁酸0.34g(糊狀濕細(xì)胞)敏捷假單胞菌72W細(xì)胞(ATCC 55746)在5.61mL，100mM磷酸鉀緩沖液(pH6.0)中的懸浮液放入15mL的聚丙烯離心管中，細(xì)胞懸液在50℃加熱0.5小時(以完全減除不需要的腈水合酶和酰胺酶活性同時保存腈水解酶活性)，然后在水浴中冷卻至25℃。然后向離心管中加入51.0mg丙酮合氰化氫(懸浮液中丙酮合氰化氫的最后濃度為0.10M)，25℃下在轉(zhuǎn)動平臺上混合得到的懸浮液。用于分析的樣品(0.180mL)與0.020mL 1.0M的丙酸(HPLC外標(biāo))混合，離心，上層清液用HPLC分析丙酮合氰化氫，丙酮，2-羥基異丁酸和2-羥基異丁酰胺。21h之后，2-羥基異丁酸，2-羥基異丁酰胺和丙酮的得率分別是21.6％，0％和71.3％，沒有剩余丙酮合氰化氫。
實施例5用E.coli轉(zhuǎn)化體SS1001將丙酮合氰化氫轉(zhuǎn)化為2-羥基異丁酸0.66g(糊狀濕細(xì)胞)E.coli轉(zhuǎn)化體SS1001(ATCC-1177)在5.29mL，50mM磷酸鉀緩沖液(pH6.0)中的懸浮液放入15mL的聚丙烯離心管中，然后加入51.0mg丙酮合氰化氫(懸浮液中丙酮合氰化氫的最后濃度為0.10M)，25℃下在轉(zhuǎn)動平臺上混合得到的懸浮液。用于分析的樣品(0.180mL)與0.020mL 1.0M的丙酸(HPLC外標(biāo))混合，離心，上層清液用HPLC分析丙酮合氰化氫，丙酮和2-羥基異丁酸。8h之后，2-羥基異丁酸，2-羥基異丁酰胺和丙酮的得率分別是23.0％，0％和65.6％，沒有剩余丙酮合氰化氫。
實施例62-羥基異丁酸脫水轉(zhuǎn)化為甲基丙烯酸在上方裝有攪拌裝置和裝有回流冷凝器的燒瓶中混合根據(jù)實施例1描述的方法制備的2-羥基異丁酸(10g，96mmol)和氫氧化鈉(0.6g，15mmol)。燒瓶中的物質(zhì)加熱至185-195℃后，在攪拌和真空(300乇)條件下以5g/h的速度連續(xù)向反應(yīng)混合物中加入另外的2-羥基異丁酸。2-羥基異丁酸進料中還含有0.4wt％對甲氧基苯酚以防止產(chǎn)物甲基丙烯酸聚合。24h后停止反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)在2-羥基異丁酸轉(zhuǎn)化率＞97％時對甲基丙烯酸的選擇性＞98％，通過蒸餾從產(chǎn)物混合物中回收甲基丙烯酸。
權(quán)利要求
1.一種由丙酮合氰化氫制備2-羥基異丁酸的方法，包括(a)在合適的含水反應(yīng)混合物中將丙酮合氰化氫與催化劑接觸，催化劑的特征在于具有由敏捷假單胞菌72W獲得的腈水解酶活性或具有由睪丸酮假單胞菌獲得的組合的腈水合酶和酰胺酶活性；和(b)以鹽或酸的形式分離(a)中產(chǎn)生的2-羥基異丁酸。
2.一種由丙酮合氰化氫制備甲基丙烯酸的方法，包括(a)在合適的含水反應(yīng)混合物中將丙酮合氰化氫與催化劑接觸，催化劑的特征在于具有由敏捷假單胞菌72W獲得的腈水解酶活性或具有由睪丸酮假單胞菌獲得的組合的腈水合酶和酰胺酶活性；(b)使(a)中產(chǎn)生的2-羥基異丁酸脫水；和(c)以鹽或酸的形式分離(b)中產(chǎn)生的甲基丙烯酸。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中特征在于具有腈水解酶活性的催化劑是選自敏捷假單胞菌72-PF-15(ATCC 55747)，敏捷假單胞菌72-PF-17(ATCC 55745)的微生物細(xì)胞的形式，表達敏捷假單胞菌72W腈水解酶活性的轉(zhuǎn)化的微生物細(xì)胞的形式，和步驟(a)之前經(jīng)加熱破壞腈水合酶活性和酰胺酶活性而保存腈水解酶活性的敏捷假單胞菌72W的形式。
4.權(quán)利要求3的方法，其中表達敏捷假單胞菌72W腈水解酶活性的轉(zhuǎn)化的微生物細(xì)胞是大腸桿菌SS1001(ATCC PTA-1177)或大腸桿菌SW91(ATCC PTA-1175)。
5.權(quán)利要求1或2的方法，其中特征在于具有腈水合酶和酰胺酶活性的催化劑是選自睪丸酮假單胞菌5-MGAM-4D(ATCC 55744)和睪丸酮假單胞菌22-1(ATCC PTA-1853)的微生物細(xì)胞的形式，表達睪丸酮假單胞菌5-MGAM-4D或睪丸酮假單胞菌22-1腈水合酶和酰胺酶活性的轉(zhuǎn)化的微生物細(xì)胞的形式。
6.一種由丙酮合氰化氫制備2-羥基異丁酸的方法，包括(a)在合適的含水反應(yīng)混合物中將丙酮合氰化氫與催化劑接觸，催化劑的特征在于具有由敏捷假單胞菌72W獲得的腈水解酶活性和腈水合酶和酰胺酶活性；和(b)以鹽或酸的形式分離(a)中產(chǎn)生的2-羥基異丁酸。
7.一種由丙酮合氰化氫制備甲基丙烯酸的方法，包括(a)在合適的含水反應(yīng)混合物中將丙酮合氰化氫與催化劑接觸，催化劑的特征在于具有由敏捷假單胞菌72W獲得的腈水解酶活性和腈水合酶和酰胺酶活性；(b)使(a)中產(chǎn)生的2-羥基異丁酸脫水；和(c)以鹽或酸的形式分離(b)中產(chǎn)生的甲基丙烯酸。
8.權(quán)利要求1，2，3，4或5之一的方法，其中催化劑是完整的微生物細(xì)胞，經(jīng)滲透化的微生物細(xì)胞，微生物細(xì)胞提取物的一種或多種細(xì)胞組分，不完全純化的酶或純化的酶的形式。
9.權(quán)利要求8的方法，其中催化劑固定在可溶的或不溶的載體中或載體上。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)2－羥基異丁酸的方法，其中使用具有腈水解酶活性的催化劑或使用具有組合腈水合酶和酰胺酶活性的催化劑將丙酮合氰化氫轉(zhuǎn)化為2－羥基異丁酸。本發(fā)明還涉及甲基丙烯酸的生產(chǎn)，其中將用所述催化劑制備的2－羥基異丁酸脫水生產(chǎn)甲基丙烯酸。
文檔編號C12R1/19GK1635990SQ03803335
公開日2005年7月6日 申請日期2003年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月5日
發(fā)明者S·喬漢, R·迪科西莫, R·D·法隆, J·E·加瓦甘, L·E·曼澤, M·S·佩恩 申請人:納幕爾杜邦公司