專利名稱：用于生產(chǎn)病毒抗原的禽胚胎顆粒生物質(zhì)的制作方法
背景技術(shù)：
用于生產(chǎn)病毒抗原的傳統(tǒng)方法包括卵內(nèi)生產(chǎn)，即在感染的含胚卵中的生產(chǎn)；或細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)，即原代細(xì)胞或已被感染的細(xì)胞系。一般用于生產(chǎn)抗原的卵內(nèi)方法涉及許多難于自動(dòng)化、勞動(dòng)集約、費(fèi)時(shí)且易受污染的步驟。通常細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)需要使用盡可能小的單個(gè)細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)塊，這就需要將組織用機(jī)械力或酶最大程度地分解或分離。這種處理可能導(dǎo)致許多細(xì)胞的裂解，從而可能引起細(xì)胞蛋白質(zhì)的高度污染，而后者很難從所需產(chǎn)物中分離。生產(chǎn)蜱傳腦炎病毒抗原和流感病毒疫苗的方法在US 5,391,491和US 5,698,433中分別有描述。這些方法使用直徑＞100μm至＜1000μm的禽胚胎細(xì)胞團(tuán)塊并且需要酶促步驟。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種用于病毒抗原生產(chǎn)的生物質(zhì)，其克服了卵內(nèi)抗原生產(chǎn)以及利用單個(gè)細(xì)胞、細(xì)胞系或微米量級(jí)細(xì)胞團(tuán)塊生產(chǎn)抗原的缺陷。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種病毒抗原的生產(chǎn)方法，該方法獲得的病毒抗原產(chǎn)量較高且可能在商業(yè)范圍內(nèi)使用。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是生物質(zhì)易于處理，且這種抗原生產(chǎn)方法提供了經(jīng)濟(jì)的步驟并顯著減少感染的機(jī)會(huì)。
本發(fā)明的特征是有效抵抗病毒感染和疾病的疫苗可更容易且更經(jīng)濟(jì)地生產(chǎn)。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的和特征將在下面的詳細(xì)說(shuō)明中更加明顯。
發(fā)明概述一種用于生產(chǎn)病毒抗原的生物質(zhì)，該生物質(zhì)包含顆粒大小約為0.5-10.0mm的禽胚胎顆粒，其中所述顆粒被病毒感染。
本發(fā)明還提供了一種用于生產(chǎn)病毒抗原的方法，其包括a)在培養(yǎng)基中用病毒感染約0.5mm至10.0mm大小的禽胚胎顆粒以形成生物質(zhì)；b)在升高的溫度下對(duì)所述生物質(zhì)充氧(oxygenate)以形成充氧混合物；以及c)過(guò)濾所述混合物以獲得含有所需病毒抗原產(chǎn)物的濾過(guò)物。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種用于制備疫苗的方法，其包括a)在培養(yǎng)基中用病毒感染約0.5mm至10.0mm大小的禽胚胎顆粒以形成生物質(zhì)；b)在升高的溫度下對(duì)所述生物質(zhì)充氧以形成充氧混合物；c)過(guò)濾所述混合物以獲得含有所需病毒抗原產(chǎn)物的濾過(guò)物。
d)將所述濾過(guò)物與藥理學(xué)上可接受的液體載體混合；以及e)任選加入免疫原性促進(jìn)佐劑。
發(fā)明詳述用于生產(chǎn)病毒抗原的傳統(tǒng)方法包括在感染的含胚卵如母雞卵中的生產(chǎn)，在已被感染的原代細(xì)胞培養(yǎng)中或在感染的細(xì)胞系中的生產(chǎn)或使用微米量級(jí)的禽胚胎細(xì)胞團(tuán)塊的生產(chǎn)。所有這些方法都涉及多個(gè)步驟和/或酶促斷裂和例如離心，沉降等分離技術(shù)。
令人驚奇的是，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)一種包含禽類，優(yōu)選雞的被病毒感染的胚胎顆粒的生物質(zhì)可用于有效且經(jīng)濟(jì)地生產(chǎn)病毒抗原，其中顆粒大小約0.5-10.0mm，優(yōu)選約1.0-3.0mm。根據(jù)本發(fā)明生物質(zhì)的禽胚胎顆?？赏ㄟ^(guò)例如高剪切混合、快速多擋板攪拌以及勻漿等傳統(tǒng)的機(jī)械粉碎方法獲得，其中優(yōu)選勻漿。例如，取自孵育9-12天，優(yōu)選11天的母雞卵的雞胚胎可用無(wú)菌緩沖溶液洗滌，并用例如胰蛋白 磷酸鹽肉湯的培養(yǎng)基稀釋至每升約50至250，優(yōu)選約80-120，更優(yōu)選約100胚胎的濃度，并且經(jīng)機(jī)械粉碎提供具有約0.5mm至10.0mm，優(yōu)選約1.0mm至3.0mm顆粒大小的禽胚胎顆粒懸浮液。該懸浮液隨后可用病毒或病毒原種(master seed)感染以提供合乎本發(fā)明的生物質(zhì)。適合的病毒包括能夠在禽胚胎細(xì)胞中復(fù)制的任何病毒或其它抗原，例如呼腸孤病毒、傳染性法氏囊病病毒(IBDV)、馬立克病病毒(MDV)、新城疫病毒(NDV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、痘病毒、雞貧血病毒(CAV)、產(chǎn)卵下降綜合癥(Egg Drop Syndrome，EDS)、火雞鼻氣管炎(TRT)病毒、肺病毒、傳染性喉氣管炎(ILT)病毒、腦脊髓炎病毒、流感病毒、狂犬病病毒、瘟熱病毒、出血性腸炎病毒、肝炎病毒、鸚鵡熱衣原體、副雞嗜血桿菌等，優(yōu)選禽類病毒，更優(yōu)選傳染性法氏囊病病毒。
相應(yīng)的，本發(fā)明提供了一種用于病毒抗原生產(chǎn)的方法，其包括在培養(yǎng)基中用病毒，優(yōu)選禽病毒，更優(yōu)選傳染性法氏囊病病毒感染具有約0.5mm至10.0mm，優(yōu)選約1.0mm至3.0mm顆粒大小的禽胚胎顆粒以形成生物質(zhì)；在升高的溫度下對(duì)所述生物質(zhì)充氧以形成充氧混合物；以及過(guò)濾所述混合物以獲得含有所需病毒抗原產(chǎn)物的濾過(guò)物。
適于本發(fā)明方法中使用的培養(yǎng)基包括胰蛋白 磷酸鹽肉湯，EMEM，DMEM，(Anhui Chemicals生產(chǎn))或任何適于生物培養(yǎng)的傳統(tǒng)培養(yǎng)基，優(yōu)選胰蛋白 磷酸鹽肉湯。
適于本發(fā)明方法中使用的升高的溫度是約90°F至110°F，優(yōu)選約95°F至105°F，更優(yōu)選98°F至102°F的溫度。
本發(fā)明方法中獲得的充氧混合物可含有約40％至60％，優(yōu)選45％至55％，更優(yōu)選50％的溶解氧。
在實(shí)際操作中，在具有每升培養(yǎng)基約50-250，優(yōu)選約80-120，更優(yōu)選約100胚胎濃度的培養(yǎng)基，例如胰蛋白 磷酸鹽肉湯中，具有約0.5mm至10.0mm，優(yōu)選約1.0mm至3.0mm顆粒大小的禽胚胎顆粒的懸浮液用病毒，優(yōu)選禽病毒，更優(yōu)選傳染性法氏囊病病毒感染以獲得生物質(zhì)所述生物質(zhì)在約90°F至110°F，優(yōu)選約95°F至105°F，更優(yōu)選約98°F至102°F的升高的溫度下充氧，以獲得含有約40％至60％，優(yōu)選約45％至55％，更優(yōu)選約50％溶解氧的充氧混合物；該充氧混合物通過(guò)約50微米至100微米，優(yōu)選約70微米至80微米，更優(yōu)選約75微米的篩子過(guò)濾，從而獲得含有所需抗原產(chǎn)物的濾過(guò)物。這樣得到的抗原原液可以通過(guò)例如穩(wěn)定劑、抗氧化劑、消泡劑等傳統(tǒng)賦形劑加以處理并通過(guò)冷凍或冷凍干燥保藏用于日后的疫苗制備，或者可能被用于疫苗的制劑中。
相應(yīng)的，本發(fā)明還提供了一種用于制備疫苗的方法，其包括將通過(guò)上述方法生產(chǎn)的抗原原液與藥理學(xué)上可接受的載體混合，并和任選加入免疫原性促進(jìn)佐劑。
適于本發(fā)明的疫苗制備方法中使用的藥理學(xué)上可接受的載體包括任何適于獸用藥物制劑的傳統(tǒng)液體載體，優(yōu)選適于在組織培養(yǎng)基中使用的平衡鹽溶液。
適于本發(fā)明的疫苗制備方法中使用的免疫原性促進(jìn)佐劑包括任何當(dāng)與抗原聯(lián)合施用時(shí)能夠增強(qiáng)或促進(jìn)動(dòng)物免疫反應(yīng)的化合物，例如表面活性劑，即十六胺、十八胺、溶血卵磷脂、二甲基二(十八烷基)溴化銨、N，N-雙十八烷基-N’-N-雙(2-羥乙基-丙二胺)、甲氧基十六烷基甘油、Pluronic多元醇、皂角苷、QuilA等；聚陰離子，例如吡喃、硫酸葡聚糖、聚肌苷酸多聚胞苷酸的多核苷酸復(fù)合物、聚丙烯酸、聚羧乙烯、氫氧化鋁、磷酸鋁等；肽，例如胞壁酰二肽、二甲基甘氨酸、吞噬作用激素等；油乳狀液；免疫調(diào)節(jié)劑，例如白介素-1、白介素-2、白介素-12、GM-CSF等；或其組合。
在實(shí)際操作中，根據(jù)上述本發(fā)明的抗原生產(chǎn)方法得到的、優(yōu)選禽病毒抗原、更優(yōu)選傳染性法氏囊病病毒抗原的病毒抗原原液與例如磷酸緩沖鹽溶液等藥理學(xué)上可接受的載體和任選的免疫原性促進(jìn)佐劑混合，以獲得具有高于最小保護(hù)劑量約1.2log抗原濃度的疫苗產(chǎn)物。
這樣制得的疫苗可進(jìn)一步用例如穩(wěn)定劑、抗氧化劑、消泡劑等獸用疫苗中通常使用的傳統(tǒng)賦形劑處理。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，病毒抗原原液可在疫苗制備前滅活。根據(jù)本發(fā)明的抗原生產(chǎn)方法制備的病毒抗原原液可通過(guò)傳統(tǒng)的滅活方式失活，例如使用如吖丙啶、β-丙醇酸內(nèi)酯、福爾馬林、硫柳汞、戊二醛、十二烷基硫酸鈉等化學(xué)滅活劑或其混合物，優(yōu)選福爾馬林進(jìn)行的化學(xué)滅活。所述抗原也可以通過(guò)加熱或通過(guò)在紫外光下的補(bǔ)骨脂素被滅活。
為了更清楚地理解本發(fā)明，列出下述的實(shí)施例。這些實(shí)施例僅僅是說(shuō)明性的而并不應(yīng)以任何方式理解為限制本發(fā)明的范圍或基本要素。實(shí)際上，除了在此顯示和描述的之外，根據(jù)下述實(shí)施例和前文的描述，本發(fā)明的多種改進(jìn)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。這些改進(jìn)也落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
除非另外提到，所有的份數(shù)都是重量份。
實(shí)施例1傳染性法氏囊病病毒(IBDV)抗原的制備從在99°F下孵育11天的母雞卵中獲取的胚胎用含慶大霉素(30mg/mL)的磷酸鹽緩沖液在室溫下洗滌三次。經(jīng)洗滌的胚胎在胰蛋白 磷酸鹽肉湯中稀釋至每升大約100個(gè)胚胎。利用Chemineer(Greerco)生產(chǎn)的W250V(Gifford-Wood)型勻漿器，縫隙預(yù)設(shè)為3.0mm，將稀釋的胚胎勻漿至1.0至3.0μm的顆粒大小。所得懸浮液與每胚胎0.2mL X+4 Lukert株工作種(USDA-APHIS認(rèn)定的IBDV)(5.5 TCID50/mL)機(jī)械混合20-30分鐘。所得混合物在pH7.1，3.0psi，100.4°F和20胚胎/升的濃度下充氧至最終溶解氧(DO)含量為50％DO。48小時(shí)后，充氧混合物通過(guò)75微米的篩子過(guò)濾，在室溫下與穩(wěn)定劑H1以1∶1的比例混合一小時(shí)并于≤40°F保藏。
通過(guò)使用上述步驟，獲得具有9.2 TCID50/mL效價(jià)的IBDV抗原原液。TCID代表組織培養(yǎng)感染劑量。
1穩(wěn)定劑H配方以下列出的成分按照所列出的順序混合。每一成分在下一成分加入前充分溶解。必要時(shí)進(jìn)行加熱至最高溫度為60℃。
成分重量/體積純化水 0.5kg/LPharmatone，American Labs生產(chǎn)5.0g/LPeptone Bacto，Becton Dickinson生產(chǎn) 45.0g/L蔗糖 50.0g/LYt型N-Z-胺，Quest International生產(chǎn) 25.0g/L谷氨酸一鈉 5.0g/L純化水 Q.S.
實(shí)施例2病毒抗原的制備用與實(shí)施例1基本相同的步驟，用適合的病毒，獲得表1中所示的抗原原液。
表1抗原效價(jià)呼腸孤病毒 8.26 TCID50/mL傳染性法氏囊病病毒 9.20 TCID50/mL新城疫病毒 8.60 EID150/Ml1EID＝胚胎感染劑量實(shí)施例3傳染性法氏囊病病毒疫苗的制備根據(jù)實(shí)施例1中描述的步驟制備并冷凍的傳染性法氏囊病抗原原液在室溫下解凍，并且用以1∶1比例混合的穩(wěn)定劑H和D-mem1稀釋至高于最小保護(hù)劑量1.2log的最終抗原濃度。經(jīng)稀釋的原液經(jīng)機(jī)械攪拌至少15分鐘并置于單或多劑量小瓶中。
1D-mem是JRH Bioscience生產(chǎn)的極限必需培養(yǎng)基。
權(quán)利要求
1.一種用于生產(chǎn)病毒抗原的生物質(zhì)，該生物質(zhì)包含顆粒大小約為0.5-10.0mm的禽胚胎顆粒，其中所述顆粒被病毒感染。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的生物質(zhì)，其中所述顆粒大小為約1.0mm至3.0mm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的生物質(zhì)，其中所述禽胚胎是雞胚胎。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的生物質(zhì)，其中所述病毒選自呼腸孤病毒、傳染性法氏囊病病毒、馬立克病病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、痘病毒、雞貧血病毒、產(chǎn)蛋下降綜合癥、火雞鼻氣管炎病毒、肺病毒、傳染性喉氣管炎病毒、腦脊髓炎病毒、流感病毒、狂犬病病毒、瘟熱病毒、出血性腸炎病毒、肝炎病毒、副雞嗜血桿菌和鸚鵡熱衣原體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的生物質(zhì)，所述病毒是禽病毒。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的生物質(zhì)，其中所述病毒是傳染性法氏囊病病毒。
7.—種用于生產(chǎn)病毒抗原的方法，其包括a)在培養(yǎng)基中用病毒感染具有約0.5mm至10.0mm顆粒大小的禽胚胎顆粒以形成生物質(zhì)；b)在升高的溫度下對(duì)所述生物質(zhì)充氧以形成充氧混合物；以及c)過(guò)濾所述混合物以獲得含有所需病毒抗原產(chǎn)物的濾過(guò)物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述胚胎顆粒大小為約1.0mm至3.0mm。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述培養(yǎng)基是胰蛋白 磷酸鹽肉湯。
10.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述充氧混合物含有約40％至60％的溶解氧。
11.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述升高的溫度是約95°F至105°F。
12.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述病毒選自呼腸孤病毒、傳染性法氏囊病病毒、馬立克病病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、痘病毒、雞貧血病毒、產(chǎn)蛋下降綜合癥、火雞鼻氣管炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒、腦脊髓炎病毒、流感病毒、狂犬病病毒、瘟熱病毒、腸炎病毒、肝炎病毒和衣原體病毒。
13.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述病毒是禽病毒。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中的病毒是傳染性法氏囊病病毒。
15.一種用于制備病毒疫苗的方法，其包括a)在培養(yǎng)基中用病毒感染具有約0.5mm至10.0mm顆粒大小的禽胚胎顆粒以形成生物質(zhì)；b)在升高的溫度下對(duì)所述生物質(zhì)充氧以形成充氧混合物；c)過(guò)濾所述混合物以獲得含有所需病毒抗原產(chǎn)物的濾過(guò)物；d)將所述濾過(guò)物與藥理學(xué)上可接受的液體載體混合；以及e)任選加入免疫原性促進(jìn)佐劑。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述病毒選自呼腸孤病毒、傳染性法氏囊病病毒、馬立克病病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、痘病毒、雞貧血病毒、產(chǎn)蛋下降綜合癥、火雞鼻氣管炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒、腦脊髓炎病毒、流感病毒、狂犬病病毒、瘟熱病毒、腸炎病毒、肝炎病毒和衣原體病毒。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述病毒是禽病毒。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述病毒是傳染性法氏囊病病毒。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述禽胚胎顆粒具有約1.0mm至3.0mm的顆粒大小。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述顆粒是雞胚胎顆粒。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種包含具有約0.5mm至10.0mm顆粒大小的禽胚胎顆粒的生物質(zhì)及其在病毒抗原生產(chǎn)方法中的用途。還提供了一種利于病毒疾病的改善和預(yù)防的疫苗的制備方法。
文檔編號(hào)C12N7/01GK1604961SQ02825312
公開(kāi)日2005年4月6日 申請(qǐng)日期2002年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月21日
發(fā)明者D·L·維德奎斯特 申請(qǐng)人:惠氏公司