專利名稱：培養(yǎng)生物的裝置和培養(yǎng)生物的方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及培養(yǎng)生物組織或生物細胞的裝置及方法。更具體地，本發(fā)明涉及無需將混合培養(yǎng)基與生物組織或生物細胞直接接觸，借助微孔體向生物組織或生物細胞供應培養(yǎng)基的培養(yǎng)生物組織或生物細胞的裝置及方法。
現(xiàn)有技術(shù)的描述由于近年來生物技術(shù)領(lǐng)域的快速進展，從研究特定基因的表達和特定因子代謝的基礎(chǔ)研究水平以及如稀有植物的繁殖，遺傳突變的擴大，有用物質(zhì)的大量生產(chǎn)，縮短培養(yǎng)期，遺傳資源的保存等的工業(yè)水平來看，生物組織培養(yǎng)技術(shù)已變得非常重要。
發(fā)明概述但是，在這類組織培養(yǎng)技術(shù)中，在使用固體培養(yǎng)基如瓊脂培養(yǎng)基的組織培養(yǎng)中，它需要在一個相對較短的時期內(nèi)進行轉(zhuǎn)至新培養(yǎng)基的傳代培養(yǎng)，這是因為培養(yǎng)基中的水和營養(yǎng)物質(zhì)會很快地被培養(yǎng)組織消耗掉，同時培養(yǎng)組織向培養(yǎng)基中分泌廢物。另外，在所述傳代操作的情況下，有時會污染培養(yǎng)基。此時存在下述問題，即培養(yǎng)組織不易于從培養(yǎng)組織和培養(yǎng)基直接接觸的傳統(tǒng)組織培養(yǎng)系統(tǒng)中從組織培養(yǎng)系統(tǒng)再次分離。另外，在存活細胞計數(shù)中，通過檢測瓊脂平板培養(yǎng)基上的克隆數(shù)目來計數(shù)存活細胞(如樣品中細菌)的數(shù)量。但是，該方法不能實施于某些細菌如乳酸菌等，因為所述細菌具有非常酸的生長pH范圍，因此，由于瓊脂的性質(zhì)，在所述條件下培養(yǎng)基不能固化從而不能制備瓊脂平培養(yǎng)基。
此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)微生物能生存于如高壓，低壓，強酸，強堿，高溫，低溫，高鹽濃度，厭氧，需氧條件，輻射，有機溶劑等惡性環(huán)境中(嗜壓的，嗜酸的，嗜堿的，嗜熱的，嗜冷的，高嗜鹽的，抗溶劑的，抗輻射的細菌等)，而且已知它們生產(chǎn)即便在這種惡性環(huán)境中仍能發(fā)揮有效作用的有用物質(zhì)如酶等。因此，期望通過培養(yǎng)這些微生物來分離所述有用物質(zhì)以便用于多種工業(yè)用途中，這就需要使用適于培養(yǎng)這類微生物的培養(yǎng)裝置和方法。
本發(fā)明人對上述問題進行了深入的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，可采用通過借助特定的微孔體向培養(yǎng)組織供應培養(yǎng)基可解決上述問題，從而完成了本發(fā)明。
即，在第一個方面，本發(fā)明提供了(1)一種生物-培養(yǎng)裝置，其包含培養(yǎng)基，具有吸水能力微孔體，其部分浸在培養(yǎng)基中，以及含有至少部分培養(yǎng)基和微孔體的容器，其中借助具有毛細管吸引力的微孔體內(nèi)部連通孔(communicating pole)將培養(yǎng)基向上轉(zhuǎn)移，從而為置于微孔體表面上的生物組織或生物細胞供應培養(yǎng)基，由此培養(yǎng)生物組織或生物細胞。
此外，在第二個方面，本發(fā)明提供了(2)根據(jù)(1)的生物-培養(yǎng)裝置，其中微孔體具有直立圓筒形或柱形的形狀。
此外，在第三個方面，本發(fā)明提供了(3)根據(jù)(1)或(2)的生物-培養(yǎng)裝置，其中微孔體包含圓筒形或柱形部件和向上續(xù)接圓筒形或柱形部件的盤形部件，且盤形部件的外徑大于圓筒形或柱形部件的外徑，盤形部件的中心凹陷，其中盤形部件的一部分向其直徑方向凸出且其外徑大于容器開口的外徑，通過突出部分的底部和容器開口邊緣間的接觸從而用容器支撐微孔體。
此外，在第四個方面，本發(fā)明提供了(4)根據(jù)(1)至(3)的任一項的生物-培養(yǎng)裝置，其中微孔體為非金屬無機固體材料的燒制品。
此外，在第五個方面，本發(fā)明提供了(5)根據(jù)(1)至(3)的任一項的生物-培養(yǎng)裝置，其中微孔體為開放單元(open-cell)型塑料泡沫。
此外，在第六個方面，本發(fā)明提供了(6)一種生物-培養(yǎng)裝置，其包含培養(yǎng)基，具有吸水能力的微孔體，與微孔體連接的插入體，其可通過部分插入體與培養(yǎng)基的接觸而向微孔體供應培養(yǎng)基，以及含有至少部分培養(yǎng)基和微孔體的容器，其中借助具有毛細管吸引力的微孔體內(nèi)部連通孔將通過插入體供應的培養(yǎng)基向上轉(zhuǎn)移，從而為置于微孔體表面上的生物組織或生物細胞供應培養(yǎng)基，由此培養(yǎng)生物組織或生物細胞。
此外，在第七個方面，本發(fā)明提供了(7)根據(jù)(1)至(6)的任一項的生物-培養(yǎng)裝置，其中生物組織或生物細胞為植物，真菌或細菌的組織或細胞。
此外，在第八個方面，本發(fā)明提供了(8)一種生物培養(yǎng)方法，其包含借助具有吸水能力的部分浸在培養(yǎng)基中的微孔體內(nèi)部連通孔將培養(yǎng)基向上轉(zhuǎn)移，從而為置于微孔體表面上的生物組織或生物細胞提供培養(yǎng)基，由此培養(yǎng)生物組織或生物細胞。
此外，在第九個方面，本發(fā)明提供了(9)根據(jù)權(quán)利要求8的生物培養(yǎng)方法，其中生物組織或生物細胞為植物，真菌或細菌的組織或細胞。
除非本說明書另有所指，將生物體和生物組織如動物，植物，真菌，細菌等的生物組織全體表示為生物組織。此外，將通過酶處理組織得到的單個細胞表示為生物細胞。此外，將包含多種介質(zhì)成分如營養(yǎng)物，緩沖劑，粘度調(diào)節(jié)劑，抗生素，滲透調(diào)節(jié)劑(ormoregulatories)，酶，天然物質(zhì)(如酵母提取物)，調(diào)節(jié)劑(如植物激素)，氨基酸，維生素等的介質(zhì)表示為培養(yǎng)基。
根據(jù)本發(fā)明的第一至九個方面，可降低培養(yǎng)基的消耗，因為與將生物組織與培養(yǎng)基直接接觸來進行培養(yǎng)的傳統(tǒng)培養(yǎng)系統(tǒng)相比，通過微孔體的毛細管作用可以僅將需要量的培養(yǎng)基供應給生物組織。
此外，在根據(jù)本發(fā)明的裝置和方法中，降低了對操作如攪拌和搖動的需要，因為生物組織在混合培養(yǎng)基外的微孔體上培養(yǎng)，故此培養(yǎng)組織需要的氣體如氧氣可以充分得以供應。
此外，在根據(jù)本發(fā)明的裝置和方法中，可以降低要實施的所需傳代次數(shù)，因為從生物組織分泌且在生物組織附近蓄積的廢物同樣可以借助微孔體而擴散至培養(yǎng)基中并在其中得以稀釋。因此，在本發(fā)明的裝置和方法中，除上述效果外，還能防止由傳代操作可能導致的污染，且使得在同一培養(yǎng)基中進行長期培養(yǎng)而不進行傳代培養(yǎng)成為可能。
此外，即使當發(fā)生了培養(yǎng)基被微生物等污染，生物組織也不會被污染，或至少延長了生物組織被污染的時間，因為是借助連通孔將培養(yǎng)基提供給生物組織，因此生物組織可在被污染前即被轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基，從而防止了生物組織自身的污染。
此外，不受pH，溫度，高壓，低壓，培養(yǎng)基成分，紫外線，輻射等影響的平板瓊脂培養(yǎng)成為可能，且可僅通過將已經(jīng)無菌處理的微孔體置于培養(yǎng)容器中，然后向其中傾注培養(yǎng)基即可實施培養(yǎng)，而無需溶解或固化瓊脂的操作步驟?；蛘?，可通過將用培養(yǎng)基飽和的微孔體無菌轉(zhuǎn)移至凈化臺，如通過用蒸餾袋等將其無菌包裝，在凈化臺上將其打開并將其置于培養(yǎng)容器內(nèi)，從而可以容易地培養(yǎng)生物組織。
特別地，根據(jù)本發(fā)明的第二個方面，通過使用便于成型的圓筒形或柱形微孔體可以降低制作生物-培養(yǎng)裝置的成本。
此外，根據(jù)本發(fā)明的第三個方面，通過使用具有直徑大于圓筒形或柱形微孔體的盤狀微孔體使長期培養(yǎng)或大量生物組織的培養(yǎng)成為可能。
此外，根據(jù)本發(fā)明的第四個方面，通過利用非金屬無機固體材料的燒制品作為微孔體，可以提供具有優(yōu)良易成形性和耐久性以及重量輕的生物-培養(yǎng)裝置。
此外，根據(jù)本發(fā)明的第五個方面，通過利用開放單元型塑料泡沫作為微孔體，可將本發(fā)明的生物-培養(yǎng)裝置用于多種用途，因為其具有優(yōu)良的模壓性能，其可以制成多種形狀，且其可被制備成輕型微孔體。
此外，本發(fā)明的生物-培養(yǎng)裝置可適于在如裝置的培養(yǎng)面積和重量受限的空間站(space station)中的環(huán)境下進行應用，因為，上述非金屬無機固體材料燒制品或開放單元型塑料泡沫可被成型為或模壓得更小。
此外，根據(jù)本發(fā)明的第六個方面，即使當培養(yǎng)基被消耗，其表面變低時，培養(yǎng)基仍可被持續(xù)地供應給微孔體和生物組織，由此使長期培養(yǎng)成為可能，因為即使在微孔體不與培養(yǎng)基直接接觸時，培養(yǎng)基仍能借助插入體而被供應給微孔體和生物組織。此外，從培養(yǎng)裝置的設(shè)計角度出發(fā)，因為增強了微孔體在容器內(nèi)相對位置的靈活性所以容器設(shè)計的自由程度得以增強。
此外，特別地，植物，真菌和細菌組織或細胞的代謝率和生長率相對低于動物組織或細胞。根據(jù)這一原因，由于培養(yǎng)基會干燥，故傳統(tǒng)培養(yǎng)基如瓊脂培養(yǎng)基的壽命短于培養(yǎng)組織或細胞，因此在單一培養(yǎng)基中長期培養(yǎng)植物，真菌和細菌的組織或細胞是不可能的。此外，盡管在液體培養(yǎng)基中可以長時間持續(xù)培養(yǎng)，除了必要的搖動，這就存在可能由于培養(yǎng)組織或細胞周圍環(huán)境中的顯著變化以及由于交換培養(yǎng)基可能導致的污染所帶來壓力的危險。根據(jù)本發(fā)明的第七個方面，因為培養(yǎng)基被持續(xù)地供應給培養(yǎng)裝置的微孔體，故生物組織或細胞可培養(yǎng)非常長的時間而無需傳代或移植。因此，可通過在從植物，真菌和細菌的組織或細胞提取有用物質(zhì)后，在單培養(yǎng)操作中更方便獲得大量有用物質(zhì)，和通過采用在再分化后僅僅交換培養(yǎng)基即可實施的調(diào)節(jié)操作，特別在植物培養(yǎng)的情況下，提供培養(yǎng)裝置。
此外，根據(jù)本發(fā)明的第八個方面，可提供具有上述優(yōu)點的生物-培養(yǎng)裝置。
此外，特別地，與動物的組織或細胞相比，植物，真菌和細菌的組織或細胞的代謝率和生長率更低。根據(jù)這一原因，由于培養(yǎng)基會干燥，故傳統(tǒng)培養(yǎng)基如瓊脂培養(yǎng)基的壽命短于培養(yǎng)組織或細胞，因此在單一培養(yǎng)基中長期培養(yǎng)植物，真菌和細菌的組織或細胞是不可能的。此外，盡管在液體培養(yǎng)基中可以長時間持續(xù)培養(yǎng)，除必要的搖動外，這就存在可能由于培養(yǎng)的細胞周圍環(huán)境中的顯著變化以及由于交換培養(yǎng)基可能導致的污染所帶來壓力的危險。根據(jù)本發(fā)明的第九個方面，因為培養(yǎng)基被持續(xù)地供應給培養(yǎng)裝置的微孔體，故生物組織或細胞可培養(yǎng)非常長的時間而無需傳代或移植。因此，可通過在從植物，真菌和細菌的組織或細胞提取有用物質(zhì)后在單培養(yǎng)操作中更方便獲得更多的有用物質(zhì)，和通過采用在再分化后僅僅交換培養(yǎng)基即可實施的調(diào)節(jié)操作，特別在植物培養(yǎng)的情況下，提供培養(yǎng)方法。
附圖簡述

圖1顯示本發(fā)明的培養(yǎng)裝置的一個實施方案的上方透視圖。
圖2顯示本發(fā)明的培養(yǎng)裝置的另一個實施方案的的上方透視圖。
圖3顯示本發(fā)明的培養(yǎng)裝置的另一個實施方案的上方透視圖。
圖4顯示本發(fā)明的培養(yǎng)裝置的另一個實施方案的上方透視圖。
圖5顯示本發(fā)明的培養(yǎng)裝置的另一個實施方案的側(cè)面剖面圖。
圖6顯示本發(fā)明的培養(yǎng)裝置的另一個實施方案的側(cè)面截面圖。
圖7作為顯示已經(jīng)在包含含有植物激素的培養(yǎng)基的本發(fā)明的培養(yǎng)裝置1中發(fā)芽的煙草(Nicotiana tabacum)種子的圖片的替代物的照片。
圖8作為顯示已經(jīng)在包含含有植物激素的培養(yǎng)基的本發(fā)明的培養(yǎng)裝置1中生長在接種10日后的煙草(Nicotiana tabacum)愈傷組織的圖片的替代物的照片。
圖9作為顯示已經(jīng)在包含含有植物激素的培養(yǎng)基的本發(fā)明的培養(yǎng)裝置1中生長在接種26日后的煙草愈傷組織的圖片的替代物的照片。
圖10作為顯示已經(jīng)在包含含有植物激素的培養(yǎng)基的本發(fā)明的培養(yǎng)裝置1中生長在接種28日后的煙草愈傷組織的圖片的替代物的照片。
圖11作為顯示已經(jīng)在包含含有植物激素的培養(yǎng)基的本發(fā)明的培養(yǎng)裝置1中生長在接種32日后的煙草愈傷組織的圖片的替代物的照片。
圖12作為顯示已經(jīng)用包含含有植物激素的培養(yǎng)基的本發(fā)明的培養(yǎng)裝置1發(fā)芽的煙草種子的圖片的替代物的照片。
圖13作為顯示將煙草幼苗置于包含含有植物激素的培養(yǎng)基的本發(fā)明的培養(yǎng)裝置2后即刻的葉片和頂端的圖片的替代物的照片。
圖14作為顯示置于包含含有植物激素的培養(yǎng)基的本發(fā)明的培養(yǎng)裝置2中10日后的煙草愈傷組織的圖片的替代物的照片。
圖15作為顯示置于包含含有植物激素的培養(yǎng)基的本發(fā)明的培養(yǎng)裝置2中33日后的煙草愈傷組織的圖片的替代物的照片。
圖16作為顯示置于包含含有植物激素的培養(yǎng)基的本發(fā)明的培養(yǎng)裝置2中56日后的煙草愈傷組織的圖片的替代物的照片。
圖17.作為顯示置于包含含有植物激素的培養(yǎng)基的本發(fā)明的培養(yǎng)裝置1中第35日的草莓(Fragaria chiloensis)花藥的圖片的替代物的照片。
圖18.作為顯示接種于本發(fā)明的培養(yǎng)裝置2后26小時的絲狀真菌(Oospora roseoflava)的真菌菌群的圖片的替代物的照片圖19.作為顯示接種于本發(fā)明的培養(yǎng)裝置2后49小時的絲狀真菌的真菌菌群的圖片的替代物的照片。
圖20.作為顯示接種于本發(fā)明的培養(yǎng)裝置2后73小時的絲狀真菌的真菌菌群的圖片的替代物的照片。
圖21.作為顯示接種于本發(fā)明的培養(yǎng)裝置2后91小時的絲狀真菌的真菌菌群的圖片的替代物的照片。
圖22.作為顯示接種于本發(fā)明的培養(yǎng)裝置2后10日的金針菇(Flammulina velutipes)的真菌菌群的圖片的替代物的照片。
圖23.作為顯示接種于本發(fā)明的培養(yǎng)裝置2后11日的金針菇的真菌菌群的圖片的替代物的照片。
圖24.作為顯示接種于本發(fā)明的培養(yǎng)裝置2后13日的金針菇的真菌菌群的圖片的替代物的照片。
圖25.作為顯示接種于本發(fā)明的培養(yǎng)裝置2后14日的金針菇的真菌菌群的圖片的替代物的照片。
圖26.作為顯示接種于本發(fā)明的培養(yǎng)裝置2后16日的金針菇的真菌菌群的圖片的替代物的照片。
圖27.作為顯示接種于本發(fā)明的培養(yǎng)裝置2后66小時的細菌枯草芽孢桿菌的細菌菌群的圖片的替代物的照片。
圖28.作為顯示接種于本發(fā)明的培養(yǎng)裝置2后109小時的細菌枯草芽孢桿菌的細菌菌群的圖片的替代物的照片。
圖29.作為顯示接種于本發(fā)明的培養(yǎng)裝置2后55日的Gonytrichummacrocladum的真菌菌群的圖片的替代物的照片。
圖30.作為顯示接種于本發(fā)明的培養(yǎng)裝置2后55日的Gonytrichummacrocladum的真菌菌群的圖片的替代物的照片。
優(yōu)選實施方案詳述下面，參照圖1-6，詳細描述本發(fā)明生物-培養(yǎng)裝置的實施方案。
首先，本發(fā)明生物-培養(yǎng)裝置的第一個實施方案為包含培養(yǎng)基3和直立于所述生物-培養(yǎng)裝置1底部的圓筒形或柱形微孔體2的生物-培養(yǎng)裝置，通過將生物組織或生物細胞4置于所述微孔體的表面上，可以繁殖，去分化，分化，再生，保存，選擇，分離或雜交生物組織或生物細胞4。
用在生物-培養(yǎng)裝置中的培養(yǎng)基3不受特別局限，但可以是任何培養(yǎng)基，只要其能繁殖，去分化，分化和再生生物組織或生物細胞。其實例包括，例如，用于植物組織的培養(yǎng)基如MS(Murashige-Skoog)培養(yǎng)基，B5培養(yǎng)基，W培養(yǎng)基，NT培養(yǎng)基，Kao8P培養(yǎng)基，LS培養(yǎng)基，H培養(yǎng)基，KC培養(yǎng)基，HB培養(yǎng)基，WPM，Kassanis培養(yǎng)基，Neelsen’s培養(yǎng)基，Galzy培養(yǎng)基，Nitsh和Nitsh培養(yǎng)基，Noushi培養(yǎng)基等，根據(jù)目的，可在其中加入多種植物激素，氨基酸，維生素，抗生素，滲透調(diào)節(jié)劑，緩沖劑，天然物質(zhì)(如酵母提取物)或酶；用于動物組織的培養(yǎng)基如199培養(yǎng)基，基本Eagle培養(yǎng)基(MEM)，dulbecco改良的基本Eagle培養(yǎng)基(DMEM)，RPMI1640，Ham’s F12培養(yǎng)基，MCDB 104培養(yǎng)基，MCDB 153培養(yǎng)基，ES培養(yǎng)基，MEM1，DEMEM1，DEMEM2等，根據(jù)目的，可在其中加入多種氨基酸成分，維生素，酶(例如胰蛋白酶)，抗生素，滲透調(diào)節(jié)劑，緩沖劑，天然物質(zhì)(如酵母提取物和血清)；用于真菌的培養(yǎng)基如改良的Ohta培養(yǎng)基，Hamada’s EBIOS-蔗糖培養(yǎng)基，M培養(yǎng)基，MYP培養(yǎng)基，PDA培養(yǎng)基，Ohta培養(yǎng)基，Mozelb-培養(yǎng)基，用于交配的Wessels和Niderpruem基本培養(yǎng)基，Kerruish和Da Costa培養(yǎng)基，Goodey和Lucetohole培養(yǎng)基，Czapek培養(yǎng)基，酵母融合培養(yǎng)基，Wickerham合成培養(yǎng)基，MY培養(yǎng)基，oatmeal培養(yǎng)基，改良的Gorodkowa培養(yǎng)基，Christensen’s尿素培養(yǎng)基，Henneberg培養(yǎng)基，Czapek-Dox培養(yǎng)基，Uschinsky培養(yǎng)基，用于厭氧真菌的巰基乙酸培養(yǎng)基，Kleyn醋酸鈉培養(yǎng)基，酵母完全合成培養(yǎng)基(Wickerham)，琥珀酸鹽-硝酸鹽培養(yǎng)基，Gorodkowa培養(yǎng)基，玉米粉培養(yǎng)基(cornmeal medium)，硝酸鹽培養(yǎng)基，F(xiàn)owells硝酸鈉培養(yǎng)基，Lindegren培養(yǎng)基等，根據(jù)目的，可在其中加入多種氨基酸，維生素，酶，抗生素，滲透調(diào)節(jié)劑，緩沖劑，天然物質(zhì)(如酵母提取物)；用于細菌的培養(yǎng)基如馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基，BL培養(yǎng)基，CW培養(yǎng)基，改良的CCFA培養(yǎng)基，B-CYEα培養(yǎng)基，WYOα培養(yǎng)基，DNase培養(yǎng)基，PS乳汁培養(yǎng)基，TCBS培養(yǎng)基，BGLB培養(yǎng)基，EC培養(yǎng)基，CVT瓊脂，EMB培養(yǎng)基，BCMO157培養(yǎng)基，NAC瓊脂，OF培養(yǎng)基基質(zhì)(medium base)，右旋糖-膦酸化物-胨培養(yǎng)基，Rusell培養(yǎng)基，Kligler培養(yǎng)基，TSI培養(yǎng)基，SIM培養(yǎng)基，Simmons檸檬酸鈉培養(yǎng)基，丙二酸鹽培養(yǎng)基，尿素培養(yǎng)基，Christensen尿素培養(yǎng)基，賴氨酸鐵瓊脂培養(yǎng)基，檢測賴氨酸脫碳的培養(yǎng)基，LIM培養(yǎng)基，OIML培養(yǎng)基，VPOF培養(yǎng)基，SS培養(yǎng)基，SS-SB培養(yǎng)基，MacConkey培養(yǎng)基，DHL培養(yǎng)基，亮綠培養(yǎng)基，XLD培養(yǎng)基，Rappaport肉湯，Hajna連四硫酸鹽肉湯基質(zhì)，亞硒酸鹽肉湯基質(zhì)，SBG硫肉湯基質(zhì)，連四硫酸鹽肉湯，EEM肉湯，心浸液培養(yǎng)基，腦心浸液培養(yǎng)基，SCD培養(yǎng)基，SCDLP培養(yǎng)基，BTB乳糖培養(yǎng)基，Drigalski培養(yǎng)基，SCDLP肉湯，乳糖肉湯JP培養(yǎng)基，用于產(chǎn)甲烷菌的牛糞，MS-1(1.5％酪蛋白氨基酸，0.01％半胱氨酸，0.01％色氨酸，0.05％檸檬酸鈉，0.2％琥珀酸鈉，0.05％K2HPO4，0.05％KH2PO430.01％KNO，2.0％MgSO4·7H2O，0.005％FeSO4·7H2O，22-26％NaCl)，MS-2培養(yǎng)基(0.5％酪蛋白氨基酸，1.0％酵母提取物，0.5％胨，0.3％檸檬酸鈉，0.5％ KCl，2.0％ MgSO4·7H2O，0.005％ FeSO4·7H2O，25％ NaCl)和用于高嗜鹽細菌的MS-3培養(yǎng)基(1.0％酵母提取物，0.5％ MgCl2.6H2O，0.5％ NH4Cl，25％ NaCl)和用于嗜堿和高嗜鹽菌的MSA-4培養(yǎng)基(1.0％胨，0.3％檸檬酸鈉，2.0％ MgSO4·7H2O，0.2％ KCl，5.0％NaCO3·10H2O，25％ NaCl)，用于嗜熱和嗜酸細菌的YSG培養(yǎng)基，MH-1培養(yǎng)基(1.0g酵母提取物，1.0g胰蛋白胨，30g NaCl，3.5g MgSO4·7H2O，2.8g MgCl·6H2O，0.2g FeSO4·7H2O，0.33g KCl，0.2g NH4-Cl，50mg NaBr，20mg H3BO3，0.5g KH2PO4，7.5mg SrCl·6H2O，10mg(NH4)2SO4，0.1mgNa2WO4·2H2O，50mg KI，0.75g CaCl·2H2O，2mg NiCl·6H2O，1mg刃天青(Resazurine)，10ml微量成分溶液(1.5g次氮基三乙酸酯(nitrirotriacetate)，3g MgSO4·7H2O，0.5g MnSO4·7H2O，1g NaCl，0.18gZnSO4·7H2O，10mg CuSO4·5H2O，20mg KAl(SO4)2·7H2O，10mg H3BO3，10mg Na2MoO2·2H2O，25mg NiCl2·6H2O，0.3mg Na2SeoO3·5H2O于每升蒸餾水中)，25g硫(Sulfer)，25g Na2S·9H2O于每升蒸餾水中)，MH-2培養(yǎng)基(0.01％酵母提取物，0.01％酪蛋白氨基酸，0.1％碳源，0.02％ NaCl，0.03％ KH2PO4，0.13％ (NH4)2SO4，0.025％ MgSO4·7H2O，0.005％CaCl2·2H2O，葡萄糖)和用于嗜熱古細菌的MH-3培養(yǎng)基(5g Bacto胨，1g Bacto酵母提取物，0.1g FeC5H5O7，19.45g NaCl，5.9g MgCl2，3.24gNa2SO4，1.8g CaCl2，0.55g KCl，0.16g NaHCO3，0.08g KBr，0.034g SrCl2，0.022g H3BO3，0.004g硅酸鈉，0.0024g NaF，0.0016g NH4NO3，0.008gNa2HPO4，10g酪蛋白或淀粉于每升蒸餾水中)。
其次，用于本發(fā)明的生物-培養(yǎng)裝置中的具有吸水能力的微孔體2不受特別地限制，但可以是任何微孔體，只要其具有在20℃時能夠保持0.005-500(重量/重量)，優(yōu)選為0.01-100(重量/重量)，更優(yōu)選為0.025-50(重量/重量)，最優(yōu)選為0.05-5(重量/重量)倍水量的吸水能力，以及具有0.2-900μm，優(yōu)選為0.05-80μm，更優(yōu)選為0.1-9μm，最優(yōu)選為0.2-3μm的孔徑且能以相對微孔體的0.05-1，優(yōu)選為0.2-0.4的孔率(體積/體積)的連通孔。與之相似的，通過調(diào)節(jié)微孔體的孔徑和孔率，由于微孔體的過濾作用，即使在培養(yǎng)基被病毒，細菌，絲狀真菌，藻類和原生動物所污染時，那些生物仍然不能接觸或需要很長時間才能接觸到培養(yǎng)的生物組織，而在此期間通過將生物組織轉(zhuǎn)移到另一培養(yǎng)裝置中，即可防止生物組織自身受污染。
此外，優(yōu)選的微孔體不僅具有上述特征，而且還能耐受高溫和高壓滅菌處理如高壓滅菌器處理，以及強堿，強酸，高溫，低溫，有機溶劑，輻射，或使用重力條件等，微孔體的實例包括根據(jù)傳統(tǒng)方法通過捏合，成型和燒制非金屬無機固體原料如10號粘土，瓷2號粘土(Shiroyama Cerapot)和Murakami粘土(由日本的Niigata Prefecture制造)而獲得的多孔體，和開放單元型塑料泡沫材料如聚乙烯醇泡沫，聚氨酯泡沫塑料，聚苯乙烯泡沫，氯乙烯樹脂泡沫，聚乙烯泡沫，聚丙烯泡沫，酚樹脂泡沫和尿素樹脂泡沫。特別地，當將非金屬無機固體原料制成易于吸水和釋放水分的多孔體時，優(yōu)選燒制那些原料，同時包含例如50-60％重量的透鋰長石和氧化鋁。通常，優(yōu)選透鋰長石包含76.81％重量的SiO2，16.96％重量的Al2O3，4.03％重量的LiO2，0.26％重量的K2O和1.94％重量的不可避免的雜質(zhì)。此外，非金屬無機原材料可以包含粉末狀無機泡沫。另外，用于本發(fā)明的生物-培養(yǎng)裝置中的微孔體由非金屬無機材料組成，而該材料即使已吸收水，其強度也基本上不會降低或其形狀基本上不會改變。
作為非金屬無機固體原料成型的方法，有本領(lǐng)域中已知的成型方法，如滑移澆鑄成型，擠壓成型，壓制成型和陶輪成型。特別地，從大規(guī)模生產(chǎn)和降低成本的角度考慮，優(yōu)選擠壓成型。此外，可以使用本領(lǐng)域公知的一般方法和條件在成型后實施干燥。成型體的隨后燒制不受特別局限，只要是采用傳統(tǒng)的條件和方法實施燒制即可。例如可選擇易于獲得所需孔的氧化燒制。燒制溫度為1000℃～2000℃，優(yōu)選為1100℃～1500℃，更優(yōu)選為1150℃～1250℃，最優(yōu)選為1200℃。當燒制非金屬無機固體原料的溫度低于1000℃時，易于保持硫成分，另一方面，當溫度高于2000℃時，則不能獲得所需的吸水特性。
另一方面，作為模塑由開放單元型塑料泡沫構(gòu)成的微孔體的方法，有熔融發(fā)泡模塑，固相發(fā)泡模塑和鑄造發(fā)泡模塑。
熔融發(fā)泡模塑的主要步驟包含熔融和捏合，未發(fā)泡的片材模塑，加熱發(fā)泡或擠壓發(fā)泡，冷卻，裁剪和加工。在固相發(fā)泡模塑中，聚合物發(fā)泡為固相或接近固相的狀態(tài)。此外，在鑄造發(fā)泡模塑中，液體原材料(單體或寡聚物)在空氣中反應時被鑄造和發(fā)泡。為發(fā)泡開放單元型塑料泡沫，通常使用發(fā)泡劑。
此外，微孔體2具有圓筒形或柱形的形狀，一種形狀，其包括圓筒形或柱形部件和從圓筒形部件或柱形部件上行續(xù)接且具有大于圓筒形或柱形部件的外徑的盤形部件，其中盤形部件中心凹陷，或一種結(jié)構(gòu)，其中空間突出或concovity置于盤形部件凹陷的底部，以便根據(jù)培養(yǎng)目的而增加特定表面積。
培養(yǎng)基3與微孔體2的一部分相接觸，由于毛細管作用借助微孔體內(nèi)部的連通孔而向上輸送，在其內(nèi)部保存并被供應給生物組織或生物細胞4，由此，可誘導生物組織的繁殖，去分化，分化，再生，保存，選擇，分離和雜交。另外，根據(jù)本發(fā)明的實施方案，在培養(yǎng)開始時不與培養(yǎng)基接觸的接種于微孔體上的生物組織或細胞有時會生長得大并在培養(yǎng)過程中與混合培養(yǎng)發(fā)生接觸。這種情況也包括在本發(fā)明范圍中。
含有至少部分前述培養(yǎng)基3和微孔體2的容器5是足夠的，只要通過用鋁箔密封容器開口，可將微孔體2，培養(yǎng)基3和生物組織或生物細胞4隔絕在容器之外即可。優(yōu)選地，容器抗高溫和高壓滅菌處理如高壓滅菌器處理，各種培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基條件如強堿，強酸，高溫，低溫，高鹽濃度，高壓，低壓，有機溶劑，輻射，或使用重力條件等，具有可從外面觀察到培養(yǎng)狀態(tài)的材料和形狀，由通常用作組織培養(yǎng)容器的材料如玻璃，塑料和乙烯基聚合物制成，具有如圓筒形，平底瓶型，杯型，點陣型和平板型的形狀。此外，當通過用特定氣體置換容器中氣體來培養(yǎng)生物組織或生物細胞時，以及當通過加壓或減壓容器內(nèi)氣體來培養(yǎng)生物組織或生物細胞時，蓋6和容器7被提供以能夠咬合從而使容器內(nèi)部可以在即使壓力或減壓條件下仍能保持密封的螺紋裝置8，和給料管9，如圖2中所示。(當容器中的氣體被特定氣體替換時，提供了兩個或多個給料管)。另外，當通過實施重力來培養(yǎng)生物組織或生物細胞時，或當從微孔體收集培養(yǎng)的組織培養(yǎng)的細胞分泌的成分時，離心管可用作容器和蓋子，如圖3中所示。
當使用本發(fā)明的生物-培養(yǎng)裝置培養(yǎng)生物組織時，通常實施如下操作。
首先，培養(yǎng)基3和微孔體2經(jīng)開口7被置于容器5中，容器的開口7用如鋁箔，棉花塞，硅氧烷塞，橡皮塞和軟木塞的塞子6密封，這證實了培養(yǎng)基3已經(jīng)遍及微孔體2而被吸收，然后對生物-培養(yǎng)裝置進行高溫和高壓滅菌處理如高壓滅菌器處理?；蛘?，可對所述生物-培養(yǎng)裝置進行非加熱滅菌處理如紫外線滅菌。
然后，將該生物-培養(yǎng)裝置冷卻至室溫，在無菌條件下如在凈化臺上除去塞子6，然后采用設(shè)備如鑷子，吸液管，鉑圈和鉑針將預先用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法進行無菌處理的生物組織或生物細胞置于微孔體2的表面上。然后，開口7再用塞子密封，采用靜置，搖動，離心等培養(yǎng)裝置在適當條件下培養(yǎng)生物組織或生物細胞4。
或者，通過將置于容器5的微孔體2和置于另一容器的培養(yǎng)基3單獨進行高溫和高壓滅菌干熱滅菌和在無菌條件下將培養(yǎng)基3分散在容器5中，可遍及微孔體吸收培養(yǎng)基。或者，將微孔體2和置于容器中的培養(yǎng)基3分別進行紫外線或γ射線無菌，可在無菌條件下將微孔體2置于包含培養(yǎng)基的容器中。
在該實施方案中，微孔體2直立置于容器5的底部。但是，在本發(fā)明的生物-培養(yǎng)裝置中，以這樣的位置關(guān)系，即該部件與培養(yǎng)基3接觸或浸漬在培養(yǎng)基3中，將一部分微孔體2安置于容器5中就足夠了。例如，微孔體可懸掛于容器5或塞子6的側(cè)面或上部。
或者，如圖6所示，提供了在微孔體12下半部的由聚乙烯醇，碳纖維束，玻璃纖維束或吸水性丙烯腈纖維束構(gòu)成的插入體20，而且通過浸漬一部分插入體，培養(yǎng)基3借助插入體可滲透入微孔體中。此外，優(yōu)選這種插入體20具有彈性。然后，通過使用插入體從而借助插入體將培養(yǎng)基滲透入微孔體中，使得給予微孔體和容器的尺寸自由度成為可能。此外，包含于培養(yǎng)基中的可沉淀組分可通過使用插入體從而使可沉淀組分沉淀在插入體上，從而避免了沉淀在微孔體孔內(nèi)。此外，優(yōu)選微孔體和插入體能夠耐受熱，低溫，強堿，強酸，有機溶劑，輻射，紫外線，壓力，和減壓，和具有不會由于重力而改變形狀的強度。
本發(fā)明的生物-培養(yǎng)裝置可用于培養(yǎng)植物組織或細胞如有用樹木的種子，葉，苗端，莖，根，花藥，花絲，生長點(頂芽，側(cè)芽，苗端和根端)，腋芽，鱗片，子房，胚珠，胚，花粉，不定芽，不定胚和不定根，所述有用樹木如bishop的花(Ammi majus)，洋蔥(Allium cepa)，蒜(Alliumsativum)，芹菜(Apium graveolens)，石刁柏(Asparagus officinalis)，甜菜(Beta vulgaris)，花椰菜(Brassica oleracea var.botrytis)，抱子甘藍(Brassica oleracea var.gemmifera)，甘藍(Brassica oleracea var.capitata)，油菜(Brassica napus)，葛縷子(Carum carvi)，菊花(Chrysanthemummorifolium)，斑點毒參(Conium maculatum)，黃連(Coptis japonica)，菊苣(Cichorium intybus)，矮生西葫蘆(Curcurbita pepo)，曼陀羅(Daturameteloides)，胡蘿卜(Daucus carota)，麝香石竹(Dianthus caryophyllus)，蕎麥(Fagopyrum esculentum)，茴香(Foeniculum vulgare)，草莓(Fragariachiloensis)，大豆(Glycine max)，風信子(Hyacinthus orientalis)，紅薯(Ipomoea batatas)，萵苣(Lactuca sativa)，百脈根(Lotus corniculatus，Lotus japonieus)，番茄(Lycopersicon esculentum)，苜蓿(Medicago sativa)，煙草(Nicotiana tabacum)，稻(Oryza sativa)，歐芹(Petroselinum hortense)，豌豆(Pisum sativum)，玫瑰(Rosa hybrida)，茄子(Solanum melongena)，馬鈴薯(Solanum tuberosum)，小麥(Triticum aestivum)，玉米(Zea mays)等；觀葉植物(foliage plant)如金魚草(Antirrhinum majus)，鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)，巴豆(Codiaeum variegatum)，仙客來(cyclamen)(Cyclamen persicum)，一品紅(Euphorbia pulcherrima)，非洲菊(Gerberajamesonii)，向日葵(Helianthus annuus)，天竺葵(fish geranium)(Pelargonium hortorum)，矮牽牛(Petunia hybrida)，非洲紫羅蘭(Saintpaulia ionatha)，藥薄公英(Taraxacum officinale)，藍豬耳(Toreniafournieri)，白車軸草(Trifolium repens)，蘭屬(Cymbidium)等；有用樹木如beat tree(Azadirachta indica)，柑桔屬(Citrus)，小果咖啡(commoncoffee)(Coffea arabica))，桉屬(Eucalyptus)，橡膠樹(para rubber tree)(Hevea brasiliensis)，枸骨葉冬青(Ilex aquifolium)，枸桔(Poncirustrifoliata)，扁桃(Prunus amygdalus)，加拿大楊(carolina poplar)(Populuscanadensis)，側(cè)柏(Biota orientalis)，日本柳杉(Cryptomeria japonica)，挪威云杉(Picea abies)，松屬(Pinus)，葡萄藤(Vitis vinifera)，蘋果(Maluspumila)，杏(Prunus armeniaca)，柿(Diospyros kaki)，無花果(Ficus carica)，栗屬(chestnut)(Castanea crenata)等；動物細胞如動物的肺成纖維細胞，表皮角質(zhì)化細胞，黑色素細胞，真皮成纖維細胞，支氣管上皮細胞，支氣管平滑肌細胞，近尿管上皮細胞，腎皮質(zhì)(cortex renis)上皮細胞，腎小球系膜細胞(mesangial cell)，細支氣管上皮細胞，星形膠質(zhì)細胞，臍帶(unbilical cord)血管內(nèi)皮細胞，冠狀血管內(nèi)皮細胞，冠狀血管的平滑肌細胞，滑膜細胞，主動脈內(nèi)皮細胞，主動脈平滑肌細胞，肺靜脈內(nèi)皮細胞，肺靜脈平滑肌細胞，肺微血管內(nèi)皮細胞，真皮微血管內(nèi)皮細胞，髂內(nèi)皮細胞，新生兒微血管內(nèi)皮細胞，人毛發(fā)真皮乳頭細胞，軟骨細胞，牛冠狀動脈內(nèi)皮細胞，牛冠狀動脈平滑肌細胞，雞動脈平滑肌細胞，小鼠腦微管上皮細胞，豬肝巨噬細胞，豬睪丸巨噬細胞，大鼠動脈平滑肌細胞，大鼠前脂肪細胞等，所述動物如人類(智人)，日本獼猴(Macaca fuscata)，獼猴(Macaca muulatta)，黑猩猩(Pan troglodytes)，猩猩(Pongo pygmmaeus)，豬(Sun scrofa)，小鼠(Mus musculus)，大鼠(Rattus norvegicus)，家禽(Allus gallus)等，真菌的菌絲體或細胞，所述真菌如金針菇(Flammlinavelutipes)，香菇(shiitake mushroom)(Lentinula edodes)，真姬菇(bunashimejimushroom)(Hypsizygus marmoreus)，荷葉離褶傘(fried chicken mushroom)(Lyophyllum decastes)，滑菇(nameko mushroom)(Pholiota nameko)，墨汁鬼傘(inky cap)(Coprinus atramentarius)，sulphur tuft(Naematolomasublateritium)，馬勃(Lycoperdon gemmatum)，靈芝(mannentake mushroom)(Ganoderma lucidum)，裂褶菌(suehirotake muchroom)(Schizophyllumcommune)，平菇(oyster mushroom)(Pleurotus ostreatus)，舞菇(maitakemushroom)(Grifola frondosa)，松口蘑(matsutake mushroom)(Tricholomamatsutake)，柱狀田頭菇(yanagimatsutake mushroom)(Agrocybecylindracea)，云芝(turkey tails)(Coriolus versicolor)，褐環(huán)乳牛肝菌(brownyellow boletus)(Suillus luteus)，厚環(huán)乳牛肝菌(larch boletus)(Suillusgrevillei)，、空柄小牛肝菌(amihanaiguchi)(Boletinus cavipes)，honshimejimushroom(Lyophyllum shimeji)，毛霉菌屬，根霉菌屬，犁頭霉屬，藻菌，曲霉菌如黑曲霉(Aspergillus niger)，米曲霉(Aspergillus oryzae)和溜曲霉(Aspergillus tarmarii)等，青霉菌(penicillium)，鐮刀菌(Fusarium)，木霉菌(Trichoderma)，念珠菌(Monilia)以及酵母(釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae))等；細菌如光合作用細菌(Rhodospillum molischianum，嗜酸紅假單胞菌(Rhodopseudomonas acidophila)，萬尼氏紅微菌(Rhodomicrobium vannielii)，酒色著色菌(Chromatium vinosum)，桃紅莢硫菌(Thiocapsa roseopersicina)，玫瑰色板硫菌(Thiopedia rosea)，泥生綠菌(Chlorobium limicola)，褐弧狀綠菌(Chlorobium phaeovibrioides)，格形暗網(wǎng)菌(Pelodictyon clathratiforme)，紫色光合作用細菌(嗜鹽外硫紅螺菌(Ectothiorhodospira halophila))，滑動細菌(橙色粘球菌(Myxococcusfulvus)，珊瑚狀粘球菌(Myxococcus coralloides)，葉柄粘球菌(Myxococcusstipitatus)，黃色粘球菌(Myxococcus xanthus))，鞘細菌(浮游球衣菌(Sphearotilus natans))，芽殖細菌，具有附屬體的細菌(海王生絲單胞菌(Hyphomonas neptunium)，銹色嘉利翁氏菌(Gallionella ferruginea))，螺旋體(出血黃疸螺旋體(Spirochaeta icterohaemorrhagiae)，蒼白螺旋體(Spirochaeta pallida)，橙黃螺旋體(Spirochaeta aurantia))，螺菌，螺旋或扭轉(zhuǎn)細菌，需氧桿菌或球菌(熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)，銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，卵狀假單胞菌(Pseudomonas ovalis)，Pseudomonas gluconicum)，水稻黃單胞菌(Xanthomonas oryzae)，氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans))，固氮細菌(褐球固氮菌(Azotobacterchroococcum)，豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)，三葉草根瘤菌(Rhizobium trifolii)，苜蓿中華根瘤菌(Rhizobium meliloti)，菜豆根瘤菌(Rhizobium phaseoli)，大豆慢生根瘤菌(Rhizobium japonicum)，巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum))，Methylomonadaceae(甲烷甲基單胞菌(Methylomonas methanica))，乙酸菌(醋化醋桿菌(Acetobacter aceti))，兼性厭氧細菌(大腸桿菌，產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)，傷寒桿菌(傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi))，鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)，腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)，痢疾桿菌(Shigella typhimurium)，Serratia marcescescens，普通變形菌(Proteus vulgaris)，霍亂弧菌(Vibriocholerae)，副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)，厭氧菌(產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌(Bacteroides succinogenes))，需氧球菌或球桿菌(金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)，腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)，釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)，無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)，綠色鏈球菌(Streptococcusviridans)，肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)，糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)，屎腸球菌(Enterococcus faecium)，鳥腸球菌(Enterococcus avium)，白喉棒桿菌(Corynebacterium diphtheriae)，枯草桿菌(Bacillus subtilis)，炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)，蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)，厭氧球菌(淋病奈瑟氏球菌(Nesseria gonorrhoeae))，革蘭陰性無機營養(yǎng)菌(歐洲亞硝化單胞菌(Nitrosomonas europaea)，海洋亞硝化細菌(Nitrosococcusoceani)，漢堡硝化桿菌(Nitrobacter hamburgensis)，Nitrobacter vulgaris，維氏硝化桿菌(Nitrobacter winogradskyi)，氧化硫硫桿菌(Thiobacillusthiooxydans))，革蘭陽性球菌(谷氨酸發(fā)酵細菌(谷氨酸微球菌(Micrococcusglutamicus))，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，乳酸乳球菌乳亞種(Spreptococcus lactis)，牛鏈球菌(Streptococcus bovis)，變異鏈球菌(Streptococcus mutans)，腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)，乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)，啤酒片球菌(Pediococcus cerevisiae)，乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)，戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)，德式乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)，裂阿托波氏菌(Lactobacillus rimae)，菊糖芽孢乳桿菌(Sporolactobacillus inulinus)，凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)，枯草桿菌，多粘芽孢桿菌(Bacillus polymyxa)，Bacillus maercerans，Bacilluspycnoticus，炭疽細菌(炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis))，丁酸(butylic acid)發(fā)酵細菌(Clostridium butyrium)，丙酮丁醇發(fā)酵細菌(丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum))，生胞梭菌(Clostridium sporogenes)，肉毒梭菌(Clostridium botulinum)，產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)，破傷風桿菌(破傷風梭菌(Clostridium tetani))，還原硫細菌(瘤胃脫硫腸狀菌(Desulfotomaculum rumimis))，孢子八疊球菌(脲芽孢八疊球菌(Sporosarcina ureae))，分支桿菌相關(guān)的細菌(白喉(白喉棒桿菌(Corynebacterium diphtheriae))，藤黃紅球菌(Corynebacterium fascians)，拉氏拉氏桿菌(Corynebacterium rathayi)，腐爛分枝桿菌(Corynebacteriumsepedonicum)，密執(zhí)安棍狀桿菌詭譎亞種(Corynebacterium insidiosum)，萎蔫短小桿菌(Corynebacterium flaccumfaciens)，牛型放線菌(Actinomycesbovis)，皮諾卡氏菌(Nocardia farcinica)，灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)，枝鏈霉菌(Streptomyces rameus)，委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(Streptomycesvenezuelae)，大宮鏈霉菌(Streptomyces omiyaensis)，金霉素鏈霉菌(Streptomyces aureofaciens)，榛色鏈霉菌(Streptomyces avellaneus)，Streptomyces lutianus，嗜熱菌(嗜熱古菌(Aeropyrum pernix)，Aquifexaeolicus，閃爍古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)，喜熱芽孢桿菌(Bacillusthermoleovorans)，詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)，熾熱甲烷嗜熱菌(Methanothermus fervidus)，耐超高溫熱棒菌(Pyrobaculum aerophilum)，Pyrobaculum calidifontis，冰島熱棒菌(Pyrobaculum islandicum)，Pyrobaculum oguniense，激烈熱球菌(Pyrococcus furiosus)，深海嗜熱古細菌(Pyrococcus horikoshii)，Pyrococcus kodakaraensis，Pyrococcus shinkaj，Pyrolobus fumarii，Rhodothermus obamensis，直逗號糖多孢菌(Saccharopolyspora rectivirgula)，嗜酸熱硫化葉菌(Sulfolobusacidocaldarius)，希氏硫化葉菌(Sulfolobus shibatae)，希氏硫化葉菌(Sulfolobus shibatae)，硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobus solfataricus)，Sulfolobustokodaii，普通高溫放線菌(Thermoactinomyces vulgaris)，速生熱球菌(Thermococcus celer)，Thermococcus odakaraensis，Thermococcus litoralis，Thermococcus profundus，熱球菌屬菌株(Thermococcus strain)，嗜酸熱原體(Thermoplasma acidophilum)，火山熱原體(Thermoplasma volcanium)，海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)，那不勒斯棲熱袍菌(Thermotoga neapolitana)，嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)，甲烷細菌(甲酸甲烷桿菌(Methanobacterium formicicum)，嗜堿甲烷桿菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum)，嗜樹木甲烷短桿菌(Methanobrevibacter arboriphilus)，瘤胃甲烷短桿菌(Methanobrevibacter ruminantium)，史氏甲烷短桿菌(Methanobrevibacter smithii)，詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)，Methanoculleus chikugoensis，Methanopyrus kandleri，聯(lián)合鬃毛甲烷菌(Methanosaeta concilii)，巴氏甲烷八疊球菌(Methanosarcina barkeri)，Methanosarcina mazeii，Methanosphaera stadmaniae，Methanothermobacterthermautotrophicus)，嗜鹽細菌(日本鹽盒菌(Haloarcula japonica)，死海鹽盒菌(Haloarcula marismortui)，鹽生鹽桿菌(Halobacterium halobium)，鹽沼鹽桿菌(Halobacterium salinarium)，Haloferax mediterranei，沃氏富鹽菌(Haloferax volcanii)，Halomonas variabilis，法老嗜鹽堿桿菌(Natronobacterium pharaonis)，(Tetragenococcus halohila)，副溶血弧菌，創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus))，嗜冷細菌(Colwellia psychrerythraea，Moritellamarina，小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Yersinia enterocolitica)，假結(jié)核耶爾森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)，海底希瓦氏菌(Shewanella benthica))，嗜壓細菌(Moritella japonica，Moritella yayanosii，Photobacterium profundum，海底希瓦氏菌，Shewanella violacea，沙雷菌(Shewanella oneidensis))，嗜酸細菌(嗜熱古菌)，硫磺礦硫化葉菌，Sulfolobus tokodaii，嗜酸熱硫化葉菌，嗜酸熱原體)，嗜堿細菌(嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)，(Bacillushalodurans)，巴氏芽孢桿菌(Bacillus pasturii)，金橙黃微小桿菌(Exiguobacterium aurantiacum))，耐輻射細菌(耐放射異常球菌(Deinococcusradiodurans)，耐放射異常球菌(Micrococcus radiodurans)，蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus))，Shizuoka Prefecture的油田分離的代謝石油細菌HD-1菌株(固定CO2型石油合成或降解的細菌)，TK-122菌株和耐有機溶劑細菌(惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)IH-2000菌株)等。作為特定的培養(yǎng)方法，任何本領(lǐng)域已知的培養(yǎng)方法是可能的。當植物為實施對象時，其實例包括去分化(愈傷組織化)和植物組織的再分化，花藥培養(yǎng)，苗端培養(yǎng)，原生質(zhì)培養(yǎng)，批培養(yǎng)，克隆的細胞培養(yǎng)，種子培養(yǎng)，高密度培養(yǎng)，共培養(yǎng)，保育培養(yǎng)方法，調(diào)理培養(yǎng)方法(conditioning culture method)，同位素競爭方法，直接標記方法，子房培養(yǎng)方法，胚珠培養(yǎng)方法，胚胎培養(yǎng)方法，花粉培養(yǎng)方法，同步培養(yǎng)方法等。此外，當真菌為實施對象時，其實例包括從部分如菇實體的莖，莖上部，菌褶和菌蓋的分離培養(yǎng)，孢子分離培養(yǎng)，從土壤和空氣的分離培養(yǎng)和從分離的真菌菌株的傳代培養(yǎng)等。此外，當動物為實施對象時，其實例包括胃腸上皮細胞培養(yǎng)，肝細胞培養(yǎng)，人表皮角質(zhì)細胞培養(yǎng)，血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)，腎細胞培養(yǎng)，朗格罕氏島細胞培養(yǎng)，成纖維細胞培養(yǎng)，肌細胞培養(yǎng)，中幼粒細胞培養(yǎng)，癌細胞培養(yǎng)，神經(jīng)細胞培養(yǎng)，支氣管上皮細胞培養(yǎng)，神經(jīng)細胞分化培養(yǎng)，血細胞分化培養(yǎng)，胚胎干細胞分化培養(yǎng)和肝癌細胞分化培養(yǎng)。另外，當細菌為實施對象時，其實例包括使用氮氣，二氧化碳等作為氣體的厭氧培養(yǎng)，使用空氣，加壓氧氣等的需氧培養(yǎng)，強堿條件下的培養(yǎng)，強酸條件下的培養(yǎng)，高溫培養(yǎng)，低溫培養(yǎng)，高鹽濃度培養(yǎng)，在大于大氣壓的氣體中實施的加壓培養(yǎng)，減壓培養(yǎng)，有機溶劑中的培養(yǎng)，在輻射下的培養(yǎng)和通過離心施以重力來實施的培養(yǎng)本發(fā)明的生物-培養(yǎng)裝置的第二個實施方案為生物-培養(yǎng)裝置11，其包含培養(yǎng)基13和包括圓筒形部件以及從圓筒形部件上行續(xù)接的，且具有大于圓筒形部件外徑的盤形部件的微孔體12，其通過將生物組織14置于中心凹陷的盤形部件的底部15上而誘導繁殖，去分化，分化，再生，保存，選擇，分離和雜交，如圖4和圖5中所示。包括圓筒形部件和盤形部件的微孔體12由容器18支撐，并通過凸向盤形部件直徑方向的部件16的底部17和容器開口外周的接觸來密封容器的內(nèi)部?；蛘?，微孔體的盤形部件12可通過在其上安裝蓋19而密封，所述蓋具有可從外部可觀察到培養(yǎng)狀態(tài)的材料和形狀，例如具有相應于或大于盤形部件外徑的內(nèi)徑的培養(yǎng)皿。備選地，盤形部件如第一個實施方案中所述用鋁箔簡單密封。此外，部件16上的蓋19，容器18將部件與給料管相聯(lián)結(jié)。即使在壓力或減壓下，該裝置仍能保持密封。此外，優(yōu)選能耐受熱，強堿，強酸，高壓，低壓，有機溶劑，輻射，紫外線等的微孔體。
由于培養(yǎng)基，原料和微孔體的材料以及可作為培養(yǎng)對象的生物組織或生物細胞與第一個實施方案中的那些一致，省略對其的解釋。
發(fā)明的實施方式實施例為了證明可用本發(fā)明的生物-培養(yǎng)裝置培養(yǎng)細胞，采用下述裝置和樣品來進行實驗。
培養(yǎng)實驗1(1)培養(yǎng)裝置已通過在1250℃燒制24小時而制得同時包含50-60％重量的Murakami粘土中氧化鋁Al2O3的外徑為1.4cm，內(nèi)徑為0.9cm以及高度為4.5cm的圓筒形微孔體(由日本的Niigata Prefecture所制)被直立置于具有2.3cm直徑和15cm高度的平底玻璃試管的底部，并在其中注入6ml的包含萘乙酸(NAA)和芐基腺嘌呤(BA)各2ppm的去分化MS液體培養(yǎng)基。然后，用雙層鋁箔密封平底玻璃試管的開口。在證實了試管中，培養(yǎng)基遍及微孔體被吸收，使用高壓滅菌器以高溫和高壓(121℃，壓力1.2atm)對其滅菌10分鐘，允許冷卻，以獲得培養(yǎng)裝置1。用于本實驗的微孔體具有耐熱性。
單獨地，將已用與上述培養(yǎng)裝置1相同的原材料和條件所制備的微孔體與容積為570ml的玻璃容器裝配好，所述微孔體由外徑為7.5cm，內(nèi)徑為5.5cm以及深度為5.0cm的盤形部件和外徑為1.7cm，內(nèi)徑為0.7cm以及高度為4.7cm的圓筒形部件組成，并具有外徑為1.5cm，高度為4.3cm柱形部件，所述柱形部件在盤形部件中心內(nèi)凹的底部向上凸出，并通過覆蓋培養(yǎng)皿密封盤形部件的開口。在加熱器中干熱滅菌2小時(161℃)。另一方面，在Erlenmeyer瓶中注入包含萘乙酸(NAA)和芐基腺嘌呤(BA)各2ppm的去分化MS液體培養(yǎng)基，并使用高壓滅菌器以高溫和高壓(121℃，壓力1.2atm)對其滅菌10分鐘。然后，在無菌條件下，小心地提起微孔體以從容器分離，然后通過間隙倒入130ml已進行無菌處理的去分化MS液體培養(yǎng)基。然后，允許靜置直至培養(yǎng)基遍及微孔體被吸收，以獲得培養(yǎng)裝置2。
(2)試驗材料作為試驗材料，使用萌芽17日后的未成熟煙草SR1(Nicotianatabacum)的種子和葉以及直徑為3mm的草莓(Fragaria chiloensis)芽中的花藥。采用流水沖洗，浸入70％乙醇數(shù)秒，浸入5％次氯酸鈉水溶液中10分鐘來對這些試驗材料進行無菌(sterilication)處理以使用。作為草莓芽中的花藥，在無菌條件下將已如上所述無菌處理的芽中分離花藥，并用作試驗材料。
(3)培養(yǎng)在無菌條件下除去培養(yǎng)裝置1的鋁箔，將試驗材料置于微孔體頂端內(nèi)表面，并再用鋁箔密封開口。單獨地，在相同條件下除去培養(yǎng)裝置2的培養(yǎng)皿，將試驗材料置于微孔體盤形部件的底部，并再用培養(yǎng)皿密封盤形部件的開口。如此，將置于培養(yǎng)裝置1或2上的試驗材料在天然光照條件下于26℃靜置培養(yǎng)(磨砂玻璃外約10cm)。
(4)結(jié)果(i)煙草種子表1中顯示了置于如上述培養(yǎng)裝置1上的煙草種子的生長過程，而圖7-11分別顯示了放置后5，10，26，28和32日時的情況。單獨地，圖12中顯示了用既不包含NAA也不包含BA的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)的煙草種子的生長作為對照。
表1接種后的天數(shù)煙草種子的生長過程0日 接種5日 萌芽，根未分化7日 愈傷組織化10日愈傷組織，直徑0.8mm26日愈傷組織，直徑4.3mm28日愈傷組織，直徑5.0mm32日愈傷組織，直徑6.6mm(ii)未成熟煙草的葉表2中顯示了置于如上述培養(yǎng)裝置2上的未成熟煙草植物葉子的生長過程，圖13-16分別顯示了放置后10，33，和56日，放置后的即刻情況。
表2放置后天數(shù) 煙草葉子和愈傷組織直徑的改變0日放置，3.1mm10日 愈傷組織，直徑4.7mm33日 愈傷組織，直徑4.9mm56日 愈傷組織，直徑5.1mm(iii)草莓的花藥表3中顯示了置于如上述培養(yǎng)裝置1上的草莓的花藥(N＝29)的生長過程，圖17顯示為放置后35日時草莓花藥的愈傷組織的圖片。
表3樣品號26接種后天數(shù) 草莓花藥的生長過程
0日放置7日愈傷組織化10日 愈傷組織，直徑0.3mm28日 愈傷組織，直徑0.8mm35日 愈傷組織，直徑2.6mm從這些結(jié)果，證實了根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)裝置，無論植物和組織部分是何種類，所述植物組織均可以象在傳統(tǒng)瓊脂培養(yǎng)基中一樣生長，而且培養(yǎng)基中的植物激素可以借助微孔體對植物組織的形態(tài)發(fā)生和繁殖產(chǎn)生影響。草莓花藥的愈傷組織形成率為55.1％。
由此，證實了可以使用本發(fā)明培養(yǎng)裝置中的微孔體作為培養(yǎng)介質(zhì)來培養(yǎng)植物組織，而且優(yōu)勢可得到有效的發(fā)揮，且沒有已有介質(zhì)的缺點。
培養(yǎng)實驗2(1)培養(yǎng)裝置根據(jù)用于上述培養(yǎng)實驗1的相同的方法，除了將130ml改良的Ohta培養(yǎng)基(通過在1升水中溶解10g葡萄糖，1g檸檬酸，1g酒石酸銨，1g磷酸鉀，1g硫酸鎂，50mg氯化鈣和7g HEPES獲得)作為培養(yǎng)基置于培養(yǎng)裝置中，來實施實驗。
(2)試驗材料絲狀真菌和金針菇用作試驗材料。
(3)培養(yǎng)在無菌條件下，除去培養(yǎng)裝置2上的培養(yǎng)皿，用鉑針將絲狀真菌接種在微孔體的盤形部件的底部中部，并再用培養(yǎng)皿密封盤形部件。如此，將接種于培養(yǎng)裝置2上的絲狀真菌在天然光照條件下于26℃靜置培養(yǎng)(磨砂玻璃外約10cm)。
(4)結(jié)果(i)絲狀真菌表4和圖18-21中顯示了接種于如上述培養(yǎng)裝置2上的絲狀真菌的生長過程。
表4接種后小時 絲狀真菌的生長過程
0小時 接種26小時 菌群，直徑5.2nm49小時 菌群，直徑29.6nm73小時 菌群，直徑56.8mm91小時 菌群，直徑56.8mm(底部22.9mm，內(nèi)側(cè)5.1mm)(ii)金針菇表5和圖22-26中顯示了接種于如上述培養(yǎng)裝置2上的金針菇菌絲的生長過程。
表5接種后時間0小時 接種10日菌群，直徑19.6mm11日菌群，直徑34.6mm12日菌群，直徑42.0mm13日菌群，直徑44.8mm14日菌群，直徑54.0nun15日菌群，直徑56.0mm從這些結(jié)果，證實了不管何種類型的真菌都能用本發(fā)明的培養(yǎng)裝置生長。
培養(yǎng)實驗3(1)培養(yǎng)裝置根據(jù)用于上述培養(yǎng)實驗1的相同的方法，除了將130ml馬鈴薯-蔗糖培養(yǎng)基(通過將表皮完全脫去的200g馬鈴薯置于適量水中，煮沸30分鐘，過濾，加入10g蔗糖和水調(diào)整至1升而獲得)作為培養(yǎng)基置于培養(yǎng)裝置2中，來實施實驗。
(2)試驗材料將細菌枯草芽孢桿菌用作試驗材料。
(3)培養(yǎng)在無菌條件下，除去培養(yǎng)裝置2上的培養(yǎng)皿，將枯草芽孢桿菌懸液鋪覆于微孔體的盤形部件的底部，并再用培養(yǎng)皿密封盤形部件。如此，將接種于培養(yǎng)裝置2上的細菌在天然光照條件下于26℃靜置培養(yǎng)(磨砂玻璃外約10cm)。
(4)結(jié)果圖27和28顯示了接種于如上述培養(yǎng)裝置2上的枯草芽孢桿菌的生長外觀，表6顯示了1個菌群的生長過程。
表6接種后時間細菌生長過程0小時 接種66小時菌群，直徑2.00mm92小時菌群，直徑5.29mm109小時 菌群，直徑5.94mm118小時 菌群，直徑7.12mm132小時 菌群，直徑7.74mm從這一結(jié)果，證實了細菌也能用本發(fā)明的培養(yǎng)裝置生長。
污染抑制實驗將絲狀真菌，Gonytrichum macrocladum接種在用于草莓花藥的上述培養(yǎng)實驗中的培養(yǎng)裝置2的培養(yǎng)基上，并將其在天然光照條件下于26℃靜置培養(yǎng)(磨砂玻璃外約10cm)。圖29和30中顯示了結(jié)果。
如這些圖明顯所示，接種在培養(yǎng)基上絲狀真菌的生長和延長即使在接種后55日仍能在微孔體柱形部件的下半部分被抑制，而且真菌沒有到達培養(yǎng)生物組織的盤形部件。從該結(jié)果，證實了根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)裝置，即使混合培養(yǎng)基被絲狀真菌污染，絲狀真菌的侵入也會由于培養(yǎng)基和生物樣品之間的微孔體的濾過作用而得以抑制或遏制，而且生物樣品可以在污染前轉(zhuǎn)移至另一培養(yǎng)裝置，由此，樣品可繼續(xù)得以培養(yǎng)。
工業(yè)實用性根據(jù)本發(fā)明，提供了培養(yǎng)裝置，其中僅消耗少量培養(yǎng)基，且降低了對某些操作如攪拌和搖動的需要，且降低了所需傳代次數(shù)，因此使得生物組織或生物細胞的長期培養(yǎng)成為可能而無需傳代操作，因此提供了培養(yǎng)裝置，通過其從組織或細胞中提取有用物質(zhì)后，在單培養(yǎng)操作中更方便獲得更多量的有用物質(zhì)。而且可以預防傳代操作帶來的污染和其它具有不利影響的刺激(傳代培養(yǎng)的物理刺激)。此外，還使培養(yǎng)在不受培養(yǎng)基的pH和培養(yǎng)溫度等的影響實施成為可能。此外，可以提供更窄，更小，更輕的培養(yǎng)裝置。
權(quán)利要求
1.一種生物-培養(yǎng)裝置，其包含培養(yǎng)基，具有吸水能力的微孔體，其部分浸在所述培養(yǎng)基中，和一個含有至少部分所述培養(yǎng)基和所述微孔體的容器，其中借助具有毛細管吸引力的所述微孔體內(nèi)部的連通孔將所述培養(yǎng)基向上轉(zhuǎn)移，以將所述培養(yǎng)基供應給置于所述微孔體表面上的生物組織或生物細胞，由此培養(yǎng)所述生物組織或生物細胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的生物-培養(yǎng)裝置，其中所述微孔體具有直立的圓筒形或柱形的形狀。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的生物-培養(yǎng)裝置，其中所述微孔體包含圓筒形或柱形部件，和向上續(xù)接所述圓筒形或柱形部件并具有外徑大于所述圓筒形或柱形部件的外徑的盤形部件，其中所述盤形部件的中心是凹陷的，其中所述盤形部件的一部分向其直徑方向凸出且其外徑大于容器開口的外徑，通過所述凸出部分的底部和所述容器開口邊緣間的接觸用所述容器支撐所述微孔體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項的生物-培養(yǎng)裝置，其中所述微孔體為非金屬無機固體材料的燒制品。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項的生物-培養(yǎng)裝置，其中所述微孔體為開放單元型塑料泡沫。
6.一種生物-培養(yǎng)裝置，其包含培養(yǎng)基；具有吸水能力的微孔體，與所述微孔體連接的插入體，其可通過部分所述插入體與所述培養(yǎng)基間的接觸向所述微孔體供應培養(yǎng)基，和含有至少部分培養(yǎng)基和所述微孔體的容器，其中借助具有毛細管吸引力的所述微孔體內(nèi)部的連通孔將所述通過插入體供應的培養(yǎng)基向上轉(zhuǎn)移，從而將所述培養(yǎng)基供給置于所述微孔體表面上的生物組織或生物細胞，由此培養(yǎng)所述生物組織或生物細胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項的生物-培養(yǎng)裝置，其中所述生物組織或生物細胞為植物，真菌或細菌的組織或細胞。
8.一種培養(yǎng)生物的方法，其包含借助微孔體內(nèi)部的連通孔將培養(yǎng)基向上轉(zhuǎn)移，以將所述培養(yǎng)基供給置于所述微孔體表面上的生物組織或生物細胞，由此培養(yǎng)所述生物組織或生物細胞，所述微孔體具有吸水能力，其部分浸在所述培養(yǎng)基中。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的培養(yǎng)生物的方法，其中所述生物組織或生物細胞為植物，真菌或細菌的組織或細胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種其中混合培養(yǎng)基與生物組織不直接接觸的生物培養(yǎng)裝置，其包含培養(yǎng)基，具有吸水能力的微孔體，其部分浸在培養(yǎng)基中，或連接到微孔體的插入體，其借助一部分插入體與培養(yǎng)基間的接觸可將培養(yǎng)基供應到微孔體，其中通過微孔體內(nèi)部的連通孔將培養(yǎng)基向上轉(zhuǎn)移以將培養(yǎng)基供應給置于置于微孔體表面上的生物組織或生物細胞，從而培養(yǎng)生物組織或生物細胞，以及使用所述裝置的培養(yǎng)生物的方法。
文檔編號C12N5/04GK1589321SQ0282277
公開日2005年3月2日 申請日期2002年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月16日
發(fā)明者長谷川亮, 鈴村大輔 申請人:哈伊特卡爾查株式會社