專利名稱：：測定延伸產(chǎn)物的存在的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種方法及試劑，用于測定在包含核酸鏈延伸的反應如循環(huán)微測序(cyclicminisequencing)中產(chǎn)生的延伸產(chǎn)物，還涉及該方法在檢測特異性點突變和遺傳變異中的應用。
背景技術(shù)：
：點突變，即基因中單個核苷酸的改變，是人類遺傳病的一個主要原因。因為診斷的目的，有很多適用于檢測已知點突變的技術(shù)。這些方法可分為依靠全部和部分互補DNA鏈之間的差示雜交動力學手段的，或是依靠酶輔助點突變檢測的(Landegren，etal.，1998)。利用放射性標記寡核苷酸探針進行的經(jīng)典ASO(等位基因特異性寡核苷酸雜交)(Wallace，etal.，1979)，經(jīng)過多年的發(fā)展已成為一種動力學均一性分析系統(tǒng)(Whitcombe，etal.，1998；Wittwer，etal.，1997a；Wittwer，etal.，1997b)，這證明了該領(lǐng)域的快速發(fā)展。當高密度DNA陣列可以直接在玻璃表面合成后，研究成百上千的突變成為可能(Fodor，etal.，1991；Lipshutz，etal.，1999)。這種快速發(fā)展的DNA微陣列技術(shù)也是基于全部和部分互補DNA鏈之間的差示雜交。酶輔助方法一般是依靠DNA聚合酶或DNA連接酶的活性(Barany，1991；Landegren，etal.，1988；Wallace，etal.，1979)。最初用于處理單個樣品的點突變分析(Syvanen，etal.，1990)(Ihalainen，etal.，1994)已經(jīng)發(fā)展成為一種以陣列形式完成的多元分析(Kurg，etal.，2000；Pastinen，etal.，1997；Pastinen，etal.，1996；Pastinen，etal.，2000；Shumaker，etal.，1996)，并且可以用于檢測點突變或單核苷酸多態(tài)性(SNP)。在所有這些系統(tǒng)中，只有在測試探針完全互補于靶序列的檢測環(huán)境條件下，才能形成可檢測到的反應產(chǎn)物(Syvanen，1999)。在依賴DNA聚合酶的檢測中，只有當反應混合物中存在可以與模板DNA中的序列互補的核苷三磷酸時，才能形成反應產(chǎn)物。目前有多種已經(jīng)過深入研究的工具用于檢測已知點突變，但單次試驗的價格相對較高。在最近的遺傳學研究進展中這已成為一個主要擔心的問題，因為越來越明顯地是，個體之間的差異是由于我們的基因組中每1～2kb內(nèi)隨機分布的微小差異如SNP造成的(Sachidanandam，etal.，2001)。在公共數(shù)據(jù)庫中已有至少1.4×106個SNP(Sachidanandam，etal.，2001)，這一數(shù)字還將與日俱增，而且SNP已成為遺傳學和生物醫(yī)學研究的一種有力手段。這些差異在對致病基因或易感基因的鑒定和精細作圖中也是很有用的。特別是，多因子疾病目前是用SNP基因分型來研究的。用SNP進行基因分型的一個主要問題是，單個的SNP沒有足夠的信息，有效鑒定如與某疾病相關(guān)的等位基因，需要位于該染色體上一個狹窄節(jié)段內(nèi)的一組SNP(SNP單體型)，其結(jié)果是必須研究比傳統(tǒng)標記更多的SNP標記(Dawson，1999；Isaksson，etal.，2000；Martin，etal.，2000)，而且必須開發(fā)出非常成熟的算法(Morris，etal.，2000)才能得到可靠的結(jié)果。尋找這些單核苷差異的最常用方法是對基因的多態(tài)性區(qū)域直接進行DNA測序，通常是在用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增從靶組織中分離到的基因組DNA或mRNA之后。不過，由于大規(guī)模人類測序計劃中累積的原始測序數(shù)據(jù)的巨大容量，通過比較從多個個體中獲得的有效序列，經(jīng)計算機程序鑒定出了大量的SNP。獲得足夠量SNP數(shù)據(jù)的主要困難之一是目前用于對他們進行檢測的方法的復雜性及高額花費。SNP基因分型方法的主要花費之一是對用于這些檢測的寡核苷酸引物進行修飾。對寡核苷酸引物進行標記或其他修飾，通常是與錨定或熒光檢測單元偶聯(lián)，同時還有這些偶聯(lián)反應后的必需的純化步驟，增加了單個寡核苷酸的花費。如果一個項目中需要數(shù)百個經(jīng)修飾的寡核苷酸，隨著時間的延長這將成為一個主要的花費。最令人激動的可能性是，DNA陣列技術(shù)的使用具有比較高的前期花費，但陣列一旦印好，測試格局就不再改變，而且不必重新印制這些模片就可以完成所有的SNP。由于這個原因，本發(fā)明中開發(fā)出了一種便宜、耐用且簡單的方法，用于檢測在涉及核酸鏈延伸的反應中的延伸產(chǎn)物，也就是經(jīng)延伸的寡核苷酸引物。本發(fā)明還涉及一種用于檢測循環(huán)微測序(cyclicminisequencing)結(jié)果的有效方法，所述測序用于如SNP的檢測中。這里描述的新方法主要優(yōu)勢是，當分析一個SNP時，僅需要三個便宜的標準非修飾引物，兩個用于PCR擴增病人基因組DNA中的目標區(qū)域，一個用于循環(huán)微測序(cMS)以檢測由上述PCR擴增所得模板核酸中的特異性位點(SNP)。如果兩條鏈都要檢測SNP，只需另外加一種非修飾引物。本發(fā)明的方法允許以任何次序靈活地研究SNP，而且可以在需要的時候在整體設計中添加或去除SNP。在對一個目標區(qū)域進行精細作圖時這是很重要的。當檢測不同的SNP時，只需要做略作優(yōu)化或修飾。該檢測是基于熒光檢測，可以用一個標準板式熒光計來完成，而且該檢測可與全自動液體處理步驟相兼容。本發(fā)明的方法還涉及一種利用熒光共振能轉(zhuǎn)移(FRET)的方法，F(xiàn)RET是指在兩種染料分子的電子激發(fā)態(tài)之間發(fā)生的距離依賴性相互作用，其中在沒有質(zhì)子發(fā)射的情況下激發(fā)能從一個供體分子轉(zhuǎn)移至一個受體分子。FRET的基本條件是(i)供體(源)和受體(靶)分子一定要十分接近(一般要在10～100)；(ii)受體吸收波譜一定要與供體的熒光發(fā)射波譜相重疊。在美國專利號6,028,190中，描述了用這類能量轉(zhuǎn)移偶聯(lián)型染料標記的探針。熒光已被證明是一種有無數(shù)應用的萬能工具。在分析化學、生物化學、細胞生物學、生理學、腎臟學、心病學、光化學和環(huán)境科學等領(lǐng)域的分子相互作用研究中，該方法都是一種有效的技術(shù)。對于在納摩濃度水平進行研究的分析化學家或生命科學家來說，該方法值得夸耀的是其出色的靈敏性。而且熒光法提供的遠不止于信號收集能力。在儀器、軟件、探針和應用各方面的新發(fā)展，已使這一在150年前首次發(fā)現(xiàn)的技術(shù)迅速流行。由于對熒光理論基礎的了解更加深入，出現(xiàn)了一系列更有效的應用，能夠提供關(guān)于復雜分子及其反應途徑的詳細信息?？梢苑奖愕卦谠贿M行生化物質(zhì)結(jié)合的研究。也有可能對大分子的內(nèi)部距離進行測量?？梢匝芯康鞍踪|(zhì)折疊動力學?？梢栽诨罴毎麅?nèi)測量離子濃度?？梢杂脽晒馓结槍δそY(jié)構(gòu)和功能進行研究?？梢匝芯克幬锱c細胞受體之間的相互作用。可對混合物中痕量熒光物質(zhì)進行檢測和鑒定?？筛鶕?jù)油類樣品的熒光對他們進行指紋繪圖和鑒定?？申U明分子的激發(fā)態(tài)的電子結(jié)構(gòu)和動力學。這里僅列舉了現(xiàn)代熒光技術(shù)應用的幾個實例。熒光是一種現(xiàn)象，該現(xiàn)象中熒光分子吸收某一給定波長的光后發(fā)射更長波長的光。能引發(fā)熒光的波長依賴性強度的分布被稱作熒光激發(fā)波譜，發(fā)射能的波長依賴性強度分布被稱作熒光發(fā)射波譜。熒光檢測相對其他基于光的研究方法來說有三個主要優(yōu)勢高靈敏度、高速度和安全性。安全性是指，在加工過程中樣品不受影響或毀壞，也沒有有害副產(chǎn)物產(chǎn)生。靈敏度是一個重要問題，因為熒光信號是與被研究物的濃度成比例的?；罴毎须x子濃度的相對輕微變化可能產(chǎn)生顯著的生理影響。吸光度測量法僅能可靠地檢測低至幾十分之一毫摩的濃度，而熒光技術(shù)可精確地測量比這低一百萬倍的濃度，皮摩甚至弗摩水平?？梢詸z測到一阿摩(＜10-18摩爾)以下的量。應用熒光技術(shù)，可以監(jiān)控濃度的非常迅速的變化。如果必要，可以檢測到熒光強度的皮秒級變化。由于這是一項非侵入式技術(shù)，熒光并不干涉樣品。產(chǎn)生熒光信號所需的激發(fā)光水平很低，減輕了照片脫色的效應。因此，可以在對活組織正常生理行為無不良影響的條件下，對活組織進行研究。垂直測光技術(shù)通常與微孔板儀器一起使用。它不僅能夠檢測矩陣型微孔板，而且還能帶來一些令人感興趣的好處。垂直測光技術(shù)最重要的特點是，吸收值并不是樣品濃度的函數(shù)，而僅僅依賴于試管中吸收物質(zhì)的量。因此，揮發(fā)或分層帶來的影響可以幾乎被消除?，F(xiàn)在，同樣的技術(shù)通常與有著相同優(yōu)點的微孔板熒光計協(xié)同使用。如果樣品中熒光分子的運動被限制，致使負責發(fā)射的電子偶極振蕩器的振蕩方向與負責吸收激活光子的偶極振蕩器的方向相同或具有固定的關(guān)系，則即使激發(fā)光未被極化，發(fā)射光也是極化的。如果監(jiān)測系統(tǒng)的靈敏度依賴于發(fā)射態(tài)的極化狀態(tài)，則熒光強度測定中就可能發(fā)生錯誤。另一方面，各向異性的時間依賴性為激發(fā)態(tài)的研究提供重要信息。可以由恒態(tài)熒光各向異性得知電子躍遷的細節(jié)和熒光團的微環(huán)境。對各向異性(或極化作用)的測定可以為熒光壽命期內(nèi)的分子運動提供信息。那么，測定熒光各向異性的時間依賴性衰減，甚至可以提供關(guān)于大分子轉(zhuǎn)動及擴散運動的更多信息，就不足為怪了。Suovaniemi(1994)、Tiusanen(1992)和Harjunmaa(1986)中描述了垂直測量熒光計的設計內(nèi)容。發(fā)明簡述本發(fā)明涉及一種在反應混合物中檢測延伸產(chǎn)物，也就是經(jīng)延伸后的寡核苷酸引物的存在的方法，其中，將要通過模板依賴方式摻入寡核苷酸引物3′端的脫氧核苷(5′-)三磷酸(dNTP)帶有標記，該方法包括如下步驟a)在適于引物延伸的條件下，用該dNTP延伸該寡核苷酸引物；b)使熒光試劑與得自步驟a)的所述經(jīng)延伸的寡核苷酸引物接觸，從而與該延伸的寡核苷酸引物結(jié)合；c)通過測量激發(fā)后的熒光發(fā)射強度來測定該延伸的寡核苷酸引物的存在。本發(fā)明還提供了一種在反應混合物中測定延伸產(chǎn)物，也就是經(jīng)延伸后的寡核苷酸引物存在的方法，其中，通過模板依賴方式摻入在該已延伸的寡核苷酸引物3′端的核苷酸帶有熒光檢測組分，該方法包括如下步驟a)處理該反應混合物以獲得單鏈延伸產(chǎn)物，或者延伸產(chǎn)物已經(jīng)是單鏈狀態(tài)時，直接執(zhí)行步驟b)；b)使熒光試劑與該反應混合物中的單鏈延伸產(chǎn)物相接觸，使其結(jié)合在已經(jīng)延伸的寡核苷酸引物的3′端附近，以便在該熒光檢測組分和該熒光試劑之間形成一種能量轉(zhuǎn)換關(guān)系，為在該熒光檢測組分和該熒光試劑間的熒光共振能轉(zhuǎn)移(FRET)作好準備；c)通過測量激發(fā)后的熒光強度來檢測該延長的寡核苷酸引物的存在。本發(fā)明還提供了一種在反應混合物中測定延伸產(chǎn)物，也就是經(jīng)延伸后的寡核苷酸引物存在的方法，其中，通過模板依賴方式摻入在該已延伸的寡核苷酸引物3′端的核苷酸帶有分離組分，該方法包括如下步驟a)處理該反應混合物以獲得單鏈延伸產(chǎn)物，或者該延伸產(chǎn)物已經(jīng)是單鏈狀態(tài)時，直接執(zhí)行步驟(b)；b)從該反應混合物中分離該延伸的寡核苷酸引物；c)使熒光試劑與從步驟(b)中分離的該延伸的寡核苷酸引物相接觸，使其與該延伸的寡核苷酸引物相結(jié)合；d)通過測量激發(fā)后的熒光強度來檢測該延伸的寡核苷酸引物的存在。本發(fā)明還涉及循環(huán)微測序、點突變的檢測和基因分型單核苷酸多態(tài)性(SNP)。圖1顯示當使用不同的cMS引物濃度時，結(jié)合cMS引物的單鏈DNA特異性熒光試劑(OliGreenTM)在635nm波長的發(fā)射值與在535nm波長的發(fā)射值之比。圖2圖示實施例1的步驟。rxn，反應；w/，有；w/o，沒有；F-dNTP，用熒光標記的dNTP，針對突變(mut)或野生型(WT)等位基因。圖3顯示當用實施例2的方法篩選病人樣品時，檢測SNP、因子VLeiden突變、Arg506Gln的結(jié)果。正?；蛐?、純合-和雜合型突變基因型的對照樣品以及空白樣品(H2O)都有顯示。圖4顯示當用實施例2的方法篩選病人樣品時，檢測SNP、因子VLeiden突變、Arg506Gln的結(jié)果。正常基因型、純合-和雜合型突變基因型的對照樣品以及空白樣品(H2O)都有顯示。圖5顯示當樣品管是例如一種微孔板小池時，其熒光測定幾何學。粗黑箭頭代表激發(fā)信號的方向。細灰箭頭代表發(fā)射信號的方向。顯示了四種不同的構(gòu)架(a，b，c和d)。發(fā)明詳述下面描述一種在包括核酸鏈延伸的反應中檢測延伸產(chǎn)物的方法，及其在SNP檢測過程中的用途。本發(fā)明中SNP篩選程序的第一步，是使用特異性引物對，針對突變座位，分別對病人的DNA或RNA樣品進行的標準PCR或RT-PCR擴增。然后如大多數(shù)目前的檢測系統(tǒng)一樣，經(jīng)ExoI-SAP-處理降解PCR引物和dNTP。當然，還有可選擇的方法用于從完成的聚合酶反應中去除引物和dNTP，如不同的過濾方法。第二步，是在一次循環(huán)引物延伸反應中，用經(jīng)熒光染料如TexasRedTM標記的dNTP對未經(jīng)修飾的循環(huán)微測序(cMS)引物進行模板依賴型引物延伸。由于循環(huán)標記檢測引物，標記效率高于傳統(tǒng)的固相微測序，從而產(chǎn)生了高的信噪比。在循環(huán)微測序步驟中，用相同的特異性cMS引物對上述PCR步驟中得來的模板核酸進行平行引物延伸反應，但每個反應中僅包含一種經(jīng)過標記的dNTP。選擇用于每次反應的dNTP種類如dATP、dCTP、dGTP或dTTP，依賴于被檢測的核苷酸位點的不同。引物與模板雜交，從而使引物的3′端與緊密靠近被檢測的核苷酸位點的一個核苷酸相結(jié)合。在美國專利No.6,013,431中對固相微測序方法進行了詳細描述，美國專利5,710,028中討論了在篩選特異性DNA序列時，循環(huán)引物延伸反應的優(yōu)勢。由于使用dNTP，可以在cMS步驟中使用便宜的標準熱穩(wěn)定DNA聚合酶。在已完成的cMS反應中加入寡核苷酸或單鏈DNA(ssDNA)特異性熒光染料(如OliGreenTM，MolecularProbes)后，經(jīng)延伸并因此被，例如TexasRedTM標記的引物，可通過基于熒光共振能轉(zhuǎn)移(FRET)的系統(tǒng)檢測出來。由于結(jié)合在延伸引物上的兩個染料分子之間的距離很短，應用于cMS引物上并已均勻分布的寡核苷酸或單鏈DNA(ssDNA)特異性熒光染料所發(fā)出的熒光能量，可以轉(zhuǎn)移到在引物延伸反應中與引物3’端結(jié)合的核苷酸的熒光標記上。在本發(fā)明方法中，熒光標記是作為熒光檢測組分發(fā)揮作用的。如果使用的熒光檢測組分是TexasRedTM染料，則反應中的熒光強度與已摻入的經(jīng)TexasRedTM標記的核苷酸的量直接相關(guān)。這是由DNA聚合酶根據(jù)模板DNA序列嚴格篩選可接受的核苷酸來控制的，并因而是由初始模板DNA序列控制的。本發(fā)明描述的方法顯示了基因型的巨大差異。但是，準備引物延伸反應時，在取液體積上總是存在微小的技術(shù)差別，這能夠造成技術(shù)差異。在測定該方法的結(jié)果時，可以采用如下策略來避免這種差異帶來的干擾效應。在不僅僅測量熒光檢測組分的發(fā)射信號，而是對熒光檢測組分和單鏈DNA特異性熒光染料的發(fā)射信號都進行測量，然后計算它們之間的比率來確定結(jié)果時，該方法的靈敏度可以提高。從兩種染料的發(fā)射光譜中取兩個以上的波長來測量，在計算能量轉(zhuǎn)移量時也是有用的?？梢越?jīng)由樣品管的無蓋液表面或經(jīng)由樣品管的底側(cè)激發(fā)樣品，并測量從激發(fā)側(cè)發(fā)射出的光來獲得熒光強度結(jié)果。另外一種選擇是，測量激發(fā)側(cè)的對側(cè)的發(fā)射光來獲得熒光強度結(jié)果。樣品管可以是諸如微孔板小池或固體支持物。圖5中顯示了熒光測量幾何學。原則上來講，以各項同性方式發(fā)射的熒光，可以在與激發(fā)信號的方向形成的幾乎任何角度上進行測量。而且，激發(fā)信號與樣品管或樣品表面之間的角度可以改變。在實施例1中，OliGreenTM是單鏈DNA特異熒光染料，TexasRedTM用作熒光檢測組分，他們分別作為供體熒光團和受體熒光團。OliGreenTM染料在498nm左右有最大吸收，在518nm左右有最大發(fā)射，而TexasRedTM染料在596nm左右有最大吸收，在620nm左右有最大發(fā)射。所以，為了確定TexasRedTM和OliGreen之間發(fā)射強度的比率，這些信號分別用波長635nm和波長535nm進行了測定。任何在635/535nm比值上的變化，都是由于從OliGreen染料到TexasRedTM標記發(fā)生的FRET，因為在沒有延伸產(chǎn)物和TexasRedTM標記時，OliGreen發(fā)射強度在這些波長下的比率，當反應中存在不同量的寡核苷酸時是保持穩(wěn)定的(見圖1)。本發(fā)明方法的一個優(yōu)點是質(zhì)量控制比傳統(tǒng)方法更方便，因為可以仿照模板鏈合成標準非修飾寡核苷酸，并且在寡核苷酸合成中引入感興趣的多態(tài)性，然后用該寡核苷酸而不是擴增后的病人DNA作模板。因此，SNP基因分型的常見問題之一，即如何獲得測試試驗性能的異源對照DNA，可以通過提供單個寡核苷酸來解決。在點突變檢測和SNP基因分型中采用FRET的原理，幾年前已經(jīng)由Chen和Kwock提出，而且在這些均相檢測中也都使用了DNA連接酶(Chen，etal.1998)和DNA聚合酶(Chen和Kwok，1997；Chen，etal.，1997)。然而，本工作中的關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)是，非特異ssDNA染料可以用作FRET檢測中的熒光團之一。這有兩個主要優(yōu)點。首先，因檢測中僅使用便宜的非修飾寡核苷酸，致使分析單個SNP的花費大幅度下降。其次，與將單個熒光素分子附于檢測寡核苷酸5′端的傳統(tǒng)系統(tǒng)不同，本檢測中的熒光染料是沿著寡核苷酸的骨架分布的，這很有利。這樣一來，可使用多種來源的熒光團，而且FRET檢測中的關(guān)鍵因素即源和靶熒光團之間的最適距離也能夠達到了。熒光偏振(FP)也可以用于SNP檢測(Chen，etal.，1999；Gibson，etal.，1997)，而且這種方法也要求使用無修飾的寡核苷酸，該檢測模式與本發(fā)明的方法非常相似。在該檢測中，經(jīng)染料標記的ddNTP終止子的FP，由于附著于檢測引物而變化。在FP-和FRET間的主要區(qū)別是，F(xiàn)P測量中必須用到特殊的熒光計，而且必須付出更多的精力去優(yōu)化PCR和Exo-SAP步驟，從而將dNTP從PCR中完全清除。這么做是因為，熒光標記的染料的量一定要低才能檢測到FP的變化，而即使這樣，F(xiàn)P信號的變化依然相對較低，使得該檢測對技術(shù)誤差敏感。本發(fā)明方法中的信噪比高，使之能夠進行更可靠的基因分型。本發(fā)明還涉及一種方法，其中本發(fā)明SNP篩選過程的第一步，是用一特異性引物對突變座位進行標準PCR擴增，而且引物和dNTP如上所述在Exo-ISAP處理中降解。這一過程也可以用不同的過濾方法來完成。但下一步是在循環(huán)引物延伸反應，如微測序反應中，對帶有生物素化dNTP的非修飾cMS引物進行模板依賴型延伸。接下來，經(jīng)延伸并結(jié)合有生物素的引物被分離出來，例如將該引物捕捉在固相支持物上，如用與生物素分子有高親和力的NeutravidinTM(Pierce)或鏈霉抗生物素蛋白包被的384孔板的底部。因此，在該方法中生物素可用作分離組分。洗掉未結(jié)合的引物之后，結(jié)合引物的量可簡單地通過加入單鏈DNA(ssDNA)特異熒光染料來測量。反應中熒光強度的大小直接與摻入的生物素化核苷酸的量相關(guān)，該核苷酸的摻入是通過DNA聚合酶根據(jù)模板DNA序列嚴格篩選合適核苷酸來控制的，也就是由原始模板DNA控制的。熒光染料標記ssDNA檢測中的高靈敏度一般來講，分離最佳激發(fā)和發(fā)射波長的Stoke’sshift在20～40nm左右。對大多數(shù)用于熒光檢測的設備來說，光學系統(tǒng)難以完全避免激發(fā)信號的滲漏，這就導致背景增強及檢測靈敏度降低。我們發(fā)現(xiàn)用OliGreen輔助的FRET時，在對例如Cy5TM標記的寡聚核苷酸進行檢測中可達到很高的靈敏度。在OliGreen存在下，可在485nm處激發(fā)，在667nm檢測。這個接近200nm的差異，使得對激發(fā)和發(fā)射都可以使用很大的狹縫，從而產(chǎn)生很高的檢測靈敏度。用于在DNA模板之間檢測單個核苷酸差異的一種引物延伸反應，可以有很多應用。引起突變的疾病或有先天多態(tài)性的疾病是本發(fā)明的一個應用領(lǐng)域。在個體間的多數(shù)表型(fenotype)差異是由單核苷酸多態(tài)性(SNP)造成的，已有數(shù)以百萬計的SNP被鑒定出來。此外，通過研究單核苷酸差異，已鑒定出動物、細菌或病毒甚或植物的真實品系或種類。對單堿基差異的檢測還可用于評估對藥物或抗生素的抗性。在微生物學及藥物基因組學方面，造成藥物反應或新陳代謝變化的SNP正在廣泛的研究當中。以下實施例是對本發(fā)明的闡述，而不是意欲限定本發(fā)明的范圍。實施例1用原初固相微測序(美國專利6,013,431)改良后的循環(huán)微測序(cMS)技術(shù)測定SNP基因型。圖2示意了實施例1的步驟。作為模板的DNA是用常規(guī)方法從冷凍的EDTA血樣品中抽提出來的。用于PCR擴增的引物是多態(tài)性SNP位點的側(cè)翼序列，所述位點在本例中是因子VLeiden突變(Arg506Gln，相當于在基因組DNA編碼鏈中核苷酸從G變?yōu)锳)，它賦予蛋白C抗性并增加了病人患trombosis的風險。引物序列為5′-TCTCTTGAAGGAAATGCCCCA-3′和5′-GGGCTAATAGGACTACTTCTA-3′。在40μL預先在96孔PCR板中分配好的PCR主要混合物中加入5μL模板DNA(5ng/μL)。PCR擴增在DNA聚合酶反應緩沖液中進行并加入25μM的PCR引物、200μM的dNTP和0.5單位的熱穩(wěn)定DNA聚合酶。該擴增反應是在MJResearchTetrad循環(huán)儀中用64℃＝＞58℃的動態(tài)下降PCR程序完成的，共35個循環(huán)開始先在96℃保溫5分鐘，然后96℃1分鐘、將退火溫度從64℃漸降至58℃1分鐘，接著72℃2分鐘。在PCR擴增后，通過將含有0.2個單位的蝦堿性磷酸酶(SAP)和1個單位的核酸外切酶I(EXOI)的10μLDNA聚合酶反應緩沖液，加入2.5μlPCR反應物中，可以將沒有反應掉的dNTP和引物除掉。引物和dNTP在37℃降解45分鐘，之后通過在80℃保溫15分鐘滅活這些酶。從經(jīng)酶處理過的PCR產(chǎn)物中取出兩份5μl的等分溶液，轉(zhuǎn)移至新的PCR板(Thermo-Fast384，ABgene，Epsom，Surrey)。之后加入5μl引物延伸主混合物，其中包括5pmolcMS引物5′-GAGCAGATCCCTGGACAGGC-3′、0.5單位熱穩(wěn)定DNA聚合酶和10pmoleTexasRedTM標記的dGTP或dATP，每一等分中有一種標記的dNTP，以便于分別檢測WT和突變的等位基因。該板用板封蓋(Microseal384，MJResearch)蓋上，循環(huán)引物延伸是按照以下循環(huán)來進行的96℃10秒鐘，56℃10秒鐘，50個循環(huán)。循環(huán)之后，加入5μL用TE緩沖液(10mMTris-HCl，pH7.0，1mMEDTA)以1∶50稀釋的單鏈DNA特異熒光染料OliGreen(MolecularProbes，EugeneOR)，延伸的cMS引物的量通過熒光能量共振轉(zhuǎn)移(FRET)系統(tǒng)來測定。該板在恒速搖動的情況下，在室溫保溫10分鐘。樣品的熒光強度通過在485nm激發(fā)、在535nm和635nm發(fā)射來測量。635/535nm的比率用于基因分型。如果cMS引物在循環(huán)過程中延伸，由于距離很近，來自OliGreenTM的熒光發(fā)射能就轉(zhuǎn)移到TexasRedTM染料上，結(jié)果導致635/535nm發(fā)射比率的提高。如圖3所示，用于檢測SNP，即因子VLeiden突變Arg506Gln的樣品，表現(xiàn)出基因型之間的顯著差異性。實施例2用作模板的DNA是用常規(guī)方法從冷凍EDTA血樣品中抽提出來的。用于PCR擴增的引物是多態(tài)性SNP位點的側(cè)翼序列，所述位點在本例中是因子VLeiden突變(Arg506Gln，相當于在基因組DNA編碼鏈中核苷酸從G變?yōu)锳)，它賦予蛋白C抗性并增加了病人患trombosis的風險。引物序列為5′-TCTCTTGAAGGAAATGCCCCA-3′和5′-GGGCTAATAGGACTACTTCTA-3′。在40μL預先在96孔PCR板中分配好的PCR主混合物中加入5μL模板DNA(5ng/μL)。PCR擴增在DNA聚合酶反應緩沖液中進行，并加入25μM的PCR引物、200μM的dNTP和0.5單位的熱穩(wěn)定DNA聚合酶。該擴增反應是在MJResearchTetrad循環(huán)儀中用64℃＝＞58℃的動態(tài)下降PCR程序進行的開始先在96℃保溫5分鐘，然后96℃1分鐘、在1分鐘內(nèi)退火溫度從64℃漸降至58℃，接著72℃2分鐘。在PCR擴增后，通過將含有0.2單位的蝦堿性磷酸酶(SAP)和1單位的核酸外切酶I(EXOLI)的10μLDNA聚合酶反應緩沖液，加入2.5μlPCR反應物中，可以將沒有反應掉的dNTP和引物除掉。引物和dNTP在37℃降解45分鐘，之后通過在80℃保溫15分鐘滅活這些酶。從經(jīng)酶處理過的PCR產(chǎn)物中取出兩份5μl的等分溶液，轉(zhuǎn)移至新的PCR板(Thermo-Fast384，ABgene，Epsom，Surrey)。之后加入5μl引物延伸主混合物，包括5pmolcMS引物5′-GAGCAGATCCCTGGACAGGC-3′、0.5單位熱穩(wěn)定DNA聚合酶和10pmole生物素化dGTP或dATP，每一等分中有一種標記的dNTP，以便于分別檢測WT和突變的等位基因。該板用板封蓋(Microseal384，MJResearch)蓋上，循環(huán)引物延伸是按照以下循環(huán)來進行的96℃10秒鐘，56℃10秒鐘，50個循環(huán)。循環(huán)之后，全部反應混合物轉(zhuǎn)移至用鏈霉抗生物素蛋白包被的黑384微孔板(384blackNeutrAvidinTM配備有SuperblockerTM，Pierce)的孔中。這些板子在37℃保溫1小時使生物素化的引物能夠結(jié)合至孔中。在洗板機上洗板，之后用TE緩沖液(10mMTris-HCl，pH7.0，1mMEDTA)將50μl單鏈DNA特異熒光染料OliGreen(MolecularProbe，EugeneOR)以1∶250的比率稀釋。在恒速搖動下，將該板在室溫保溫10分鐘，通過測量485nm激發(fā)熒光和535nm發(fā)射熒光來定量附著于孔中的cMS引物的量。如圖4所示，用于檢測SNP，即因子VLeiden突變Arg506Gln的樣品，表現(xiàn)出基因型之間的顯著差異性。實施例3我們試驗了多種熒光染料作為受體，接收來自ssDNA結(jié)合型熒光試劑OliGreen(MolecularProbes，Eugene，OR)的FRET能量的情況。我們?nèi)?μL用TE緩沖液(10mMTris-HCl，pH7.0，lmMEDTA)以1∶50稀釋的單鏈DNA特異熒光試劑OliGreen，加入含有5pmol用下列之一染料標記的引物的樣品中四甲基若丹明(在552nm左右發(fā)射)、TexasRedTM(在620nm左右發(fā)射，MolecularProbe，EugeneOR)、Cy3(在570nm左右發(fā)射，AmershamLifescience，Inc.)或Cy5TM(在667nm左右發(fā)射，AmershamLifeScience，Inc.)。當附著至寡核苷酸后，所有這些染料都在他們預期的發(fā)射波長發(fā)射，而且有結(jié)合引物的OliGreen存在下，在485nm激發(fā)。因此，使用ssDNA結(jié)合型熒光試劑和FRET，能夠檢測多個攜帶有具有不同發(fā)射峰的熒光團的寡核苷酸的存在。參考文獻Barany，F(xiàn).(1991)GeneticdiseasedetectionandDNAamplificationusingclonedthermostableligase，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica，88，189-93.Chen，X.andP.Y.Kwok(1997)Template-directeddye-terminatorincorporation(TDI)assayahomogeneousDNAdiagnosticmethodbasedonfluorescenceresonanceenergytransfer，NucleicAcidsResearch，25，347-53.Chen，X.，L.LevineandP.Y.Kwok(1999)Fluorescencepolarizationinhomogeneousnucleicacidanalysis，GenomeResearch，9，492-8.Chen，X.，K.J.LivakandP.Y.Kwok(1998)Ahomogeneous，ligase-mediatedDNAdiagnostictest，GenomeResearch，8，549-56.Chen，X.，B.Zehnbauer，A.GnirkeandP.Y.Kwok(1997)FluorescenceenergytransferdetectionasahomogeneousDNAdiagnosticmethod，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica，94，10756-61.Dawson，E.(1999)SNPmapsmoremarkersneeded？[news]，MolecularMedicineToday，5，419-20.Fodor，S.P.，J.L.Read，M.C.Pirrung，L.Stryer，A.T.LuandD.Solas(1991)Light-directed，spatiallyaddressableparallelchemicalsynthesis，Science，251，76773.Gibson，N.J.，H.L.Gillard，D.Whitcombe，R.M.Ferrie，C.R.NewtonandS.Little(1997)Ahomogeneousmethodforgenotypingwithfluorescencepolarization，ClinicalChemistry，43，1336-41.HarjunmaaH.(1986)Theory，designandimmunologicalapplicationsofaverticallymeasuringfluorometer，doctoralthesis，UniversityofHelsinki.Ihalainen，J.，H.Siitari，S.Laine，A.C.SyvanenandA.Palotie(1994)Towardsautomaticdetectionofpointmutationsuseofscintillatingmicroplatesinsolid-phaseminisequencing，Biotechniques，16，938-43.Isaksson，A.，U.Landegren，A.C.Syvanen，P.Bork，C.Stein，F(xiàn).OrtigaoandA.J.Brookes(2000)Discovery，scoringandutilizationofhumansinglenucleotidepolymorphismsamultidisciplinaryproblem，EuropeanJournalofHumanGenetics，8，154-6.Kurg，A.，N.Tonisson，1.Georgiou，J.Shumaker，J.TollettandA.Metspalu(2000)Arrayedprimerextensionsolid-phasefour-colorDNAresequencingandmutationdetectiontechnology，GeneticTesting，4，1-7.Landegren，U.，R.Kaiser，J.SandersandL.Hood(1988)Aligase-mediatedgenedetectiontechnique，Science，241，1077-80.Landegren，U.，NilssonM.andKwok，P-Y(1998)ReadingbitsofgeneticinformationMethodsforsingle-nucleotidepolymorphismanalysis，GenomeResearch，8，769-776.Lipshutz，R.J.，S.P.Fodor，T.R.GingerasandD.J.Lockhart(1999)Highdensetysyntheticoligonucleotidearrays，NatureGenetics，21，20-4.Martin，E.R.，E.H.Lai，J.R.Gilbert，A.R.Rogala，A.J.Afshari，J.Riley,K.L.Finch，J.F.Stevens，K.J.Livak，B.D.Slotterbeck，S.H.Slifer，L.L.Warren，P.M.Conneally，D.E.Schmechel，I.Purvis，M.A.Pericak-Vance，A.D.RosesandJ.M.Vance(2000)SNPingawayatcomplexdiseasesanalysisofsingle-nucleotidepolymorphismsaroundAPOEinAlzheimerdisease，AmericanJournalofHumanGenetics，67，383-94.Morris，A.P.，J.C.WhittakerandD.J.Balding(2000)Bayesianfine-scalemappingofdiseaseloci，byhiddenMarkovmodels，AmericanJournalofHumanGenetics，67，155-69.Pastinen，T.，A.Kurg，A.Metspalu，L.PeltonenandA.C.Syvanen(1997)MinisequencingaspecifictoolforDNAanalysisanddiagnosticsonoligonucleotidearrays，GenomeResearch，7，606-14.Pastinen，T.，J.PartanenandA.C.Syvanen(1996)Multiplex，fluorescent，solid-phaseminisequencingforefficientscreeningofDNAsequencevariation，ClinicalChemistry，42，1391-7.Pastinen，T.，M.Raitio，K.Lindroos，P.Tainola，L.PeltonenandA.C.Syvanen(2000)Asystemforspecific，high-throughputgenotypingbyallele-specificprimerextensiononmicroarrays，GenomeResearch，10，1031-42.Sachidanandam，R.，D.Weissman，S.C.Schmidt，J.M.Kakol，L.D.SteinandM.G.(2001)Amapofhumangenomesequencevariationcontaining1.42millionsinglenucleotidepolymorphisms，Nature，409，928-33.Shumaker，J.M.，A.MetspaluandC.T.Caskey(1996)Mutationdetectionbysolidphaseprimerextension，HumanMutation，7，346-54.SuovaniemiO.(1994)Automatedinstrumentationforclinicalandresearchlaboratories，doctoralthesis，UniversityofHelsinki.Syvanen，A-C(1999)Fromgelstochips″Minisequencing″primerextensionforanalysisofpointmutationsandsinglenucleotidepolymorphisms，HumanMutation，13，1-10.Syvanen，A-C，K.Aalto-Setala，L.Harju，K.KontulaandH.Soderlund(1990)Aprimer-guidednucleotideincorporationassayinthegenotypingofapolipoproteinE，Genomics，8，684-92.Tiusanen，T.(1992)Inner-filtercorrectionwithafluorometer-basedmultifunctionalinstrument，doctoralthesis，UniversityofHelsinki.Wallace，R.B.，J.Shaffer，R.F.Murphy，J.Bonner，T.HiroseandK.Itakura(1979)Hybridizationofsyntheticoligodeoxyribonucleotidestophichi174DNAtheeffectofsinglebasepairmismatch，NucleicAcidsResearch，6，3543-57.Whitcombe，D.，J.Brownie，H.L.Gillard，D.McKechnie，J.Theaker，C.R.NewtonandS.Little(1998)AhomogeneousfluorescenceassayforPCRampliconsitsapplicationtoreal-time，single-tubegenotyping，ClinicalChemistry，44，918-23.Wittwer，C.T.，M.G.Herrmann，A.A.MossandR.P.Rasmussen(1997a)ContinuousfluorescencemonitoringofrapidcyclicDNAamplification，Biotechniques，22，130-1，134-8.Wittwer，C.T.，K.M.Ririe，R.V.Andrew，D.A.David，R.A.GundryandU.J.Balis(1997b)TheLightCycleramicrovolumemultisamplefluorimeterwithrapidtemperaturecontrol，Biotechniques，22，176-81.權(quán)利要求1.在反應混合物中測定延伸產(chǎn)物，即經(jīng)延伸后的寡核苷酸引物的存在的方法，其中，將要通過模板依賴方式摻入寡核苷酸引物3′端的脫氧核苷(5′-)三磷酸(dNTP)中含有標記，該方法包括如下步驟a)在適于引物延伸的條件下，用該dNTP延伸該寡核苷酸引物；b)使熒光試劑與得自步驟a)的所述經(jīng)延伸的寡核苷酸引物接觸，從而與該延伸的寡核苷酸引物結(jié)合；c)通過測量激發(fā)后的熒光發(fā)射強度來測定該延伸的寡核苷酸引物的存在。2.在反應混合物中測定延伸產(chǎn)物，即經(jīng)延伸后的寡核苷酸引物的存在的方法，其中，通過模板依賴方式摻入在該已延伸的寡核苷酸引物3′端的核苷酸含有一個熒光檢測組分，該方法包括如下步驟a)處理該反應混合物以獲得單鏈延伸產(chǎn)物，或者延伸產(chǎn)物已經(jīng)是單鏈狀態(tài)時，直接執(zhí)行步驟b)；b)使熒光試劑與該反應混合物中的單鏈延伸產(chǎn)物相接觸，使其結(jié)合在已經(jīng)延伸的寡核苷酸引物的3′端附近，以便在該熒光檢測組分和該熒光試劑之間形成一種能量轉(zhuǎn)換關(guān)系，為在該熒光檢測組分和該熒光試劑間的熒光共振能轉(zhuǎn)移(FRET)作好準備；c)通過測量激發(fā)后的熒光強度來檢測該延伸后的寡核苷酸引物的存在。3.權(quán)利要求2的方法，其中該能量轉(zhuǎn)移關(guān)系是基于供體熒光團和受體熒光團之間的能量轉(zhuǎn)移。4.權(quán)利要求2的方法，其中該延伸的寡核苷酸引物的存在，是在步驟(c)中通過測量該熒光檢測組分和該熒光試劑的發(fā)射光譜中不止一個波長來確定的。5.權(quán)利要求2的方法，其中作為供體熒光團的該熒光試劑，在大約498nm處有最大吸收，在大約518nm處有最大發(fā)射，而作為受體熒光團的該熒光檢測組分，在大約596nm處有最大吸收，在大約620nm處有最大發(fā)射。6.權(quán)利要求2的方法，其中只有一個核苷酸摻入到了該延伸的寡核苷酸引物的3′端。7.權(quán)利要求2的方法，其中該反應混合物包括循環(huán)微測序所必需的成分。8.權(quán)利要求2的方法，其中該反應包括循環(huán)微測序所必需的成分，而且在該反應混合物中的模板是病人樣本的PCR或RT-PCR產(chǎn)物。9.權(quán)利要求2的方法，用于確認人類或動物的點突變，例如SNP、等位性或基因型。10.權(quán)利要求2的方法，其中以模板依賴方式摻入到延伸的寡核苷酸引物3′端的核苷酸，是來自該反應混合物中帶有熒光染料標記的dATP、dCTP、dGTP或dTTP。11.權(quán)利要求2的方法，其中該熒光試劑是一個單鏈DNA結(jié)合型熒光染料。12.權(quán)利要求2的方法，其中該延伸的寡核苷酸引物的存在，是在步驟(c)中，經(jīng)由無蓋的液表面或經(jīng)由該樣品管底部激發(fā)樣品管中的該反應混合物，并測量從激發(fā)側(cè)發(fā)射出的光來確定的。13.權(quán)利要求2的方法，其中該延伸的寡核苷酸引物的存在，是在步驟(c)中，經(jīng)由無蓋的液體表面或經(jīng)由該樣品管底部激發(fā)樣品管中的該反應混合物，并測量從激發(fā)側(cè)的對側(cè)發(fā)射出的光來確定的。14.一種在反應混合物中測定延伸產(chǎn)物，即經(jīng)延伸后的寡核苷酸引物的存在的方法，其中，通過模板依賴方式摻入在該已延伸的寡核苷酸引物3′端的核苷酸含有一個分離組分，該方法包括如下步驟a)處理該反應混合物以獲得單鏈延伸產(chǎn)物，或者該延伸產(chǎn)物已經(jīng)是單鏈狀態(tài)時，直接執(zhí)行步驟(b)；b)從該反應混合物中分離該延伸的寡核苷酸引物；c)使熒光試劑與從步驟(b)中分離的該延伸的寡核苷酸引物相接觸，使其與該延伸的寡核苷酸引物相結(jié)合；d)通過測量激發(fā)后的熒光強度來檢測該延伸的寡核苷酸引物的存在。15.權(quán)利要求14的方法，其中該延伸的寡核苷酸引物在步驟(b)中是固定在已用該分離組分的特異性受體包被的固體支持物上的。16.權(quán)利要求14的方法，其中將生物素用作該分離組分，而該延伸的寡核苷酸引物在步驟(b)中是固定在已用鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白包被的固體支持物上。17.權(quán)利要求14的方法，其中該延伸的寡核苷酸引物的存在，是在步驟(c)中通過測量該熒光試劑發(fā)射光譜中不止一個波長來確定的。18.權(quán)利要求14的方法，其中該熒光試劑在大約498nm處有最大吸收，在大約518nm處有最大發(fā)射。19.權(quán)利要求14的方法，其中只有一個核苷酸摻入在該延伸的寡核苷酸引物3′端。20.權(quán)利要求14的方法，其中該反應混合物包含循環(huán)微測序所必需的成分。21.權(quán)利要求14的方法，其中該反應混合物包括循環(huán)微測序所必需的成分，而且在該反應混合物中的模板是病人樣本的PCR或RT-PCR產(chǎn)物。22.權(quán)利要求14的方法，用于確認人類或動物的點突變，例如SNP、等位性或基因型。23.權(quán)利要求14的方法，其中以模板依賴方式摻入到延伸的寡核苷酸引物3′端的核苷酸，是來自該反應混合物中帶有生物素標記的dATP、dCTP、dGTP或dTTP。24.權(quán)利要求14的方法，其中該熒光試劑是單鏈DNA結(jié)合型熒光染料。25.權(quán)利要求14的方法，其中該延伸的寡核苷酸引物的存在，是在步驟(d)中經(jīng)由無蓋的液表面或經(jīng)由該樣品管底部激發(fā)樣品管中的該反應混合物，并測量從激發(fā)側(cè)發(fā)射出的光來確定的。26.權(quán)利要求14的方法，其中該延伸的寡核苷酸引物的存在，是在步驟(d)中經(jīng)由從無蓋的液體表面或經(jīng)由該樣品管底部激發(fā)樣品管中的該反應混合物，并測量從激發(fā)側(cè)的對側(cè)發(fā)射出的光來確定的。27.權(quán)利要求1或14的方法，其中將要延伸的寡核苷酸引物包含熒光染料。28.權(quán)利要求27的方法，其中測定步驟是通過測量由于該熒光試劑和該熒光染料之間的一種能量轉(zhuǎn)移關(guān)系而產(chǎn)生的熒光強度來完成的，這種能量轉(zhuǎn)移關(guān)系是用于該熒光試劑和該熒光染料間的熒光共振能轉(zhuǎn)移(FRET)。全文摘要本發(fā)明涉及一種方法及試劑，用于測定在包含核酸鏈延伸的反應如循環(huán)微測序中產(chǎn)生的延伸產(chǎn)物，還涉及該方法在鑒定特異性點突變和遺傳變異中的應用。需要三種標準的未修飾的引物，可用一種非特異熒光試劑(如一種單鏈DNA結(jié)合染料)作為FRET檢測中使用的熒光團之一。該發(fā)明還涉及垂直光束熒光計量術(shù)。文檔編號C12P19/34GK1745178SQ02811552公開日2006年3月8日申請日期2002年6月6日優(yōu)先權(quán)日2001年6月6日發(fā)明者阿托·奧帕納,奧斯莫·斯沃瓦尼米申請人:拜奧希特公司