專利名稱：測定昆蟲對殺蟲劑抗性的方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及測定昆蟲對殺蟲劑抗性的方法和試劑盒，更具體地提供了用來測定昆蟲對擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗性的田間使用的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
化學(xué)殺蟲劑目前仍然是防治如瘧疾、登革熱、絲蟲病等媒介傳播疾病的最重要的試劑。自從1940年發(fā)明第一種合成殺蟲劑DDT以來，上述疾病的傳播造成無數(shù)的人死亡的現(xiàn)象大大減少了?？墒牵掷m(xù)地使用殺蟲劑導(dǎo)致攜帶上述疾病，主要是昆蟲媒介的抗性的發(fā)展，昆蟲的抗藥性降低了對媒介以及它們傳播的疾病的防治效果?？剐缘臏y定主要是基于世界衛(wèi)生組織(WHO)的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方法，這些方法對使用者來講是特別不易使用的，使用試劑盒的貨架壽命短并需要熟練的人員進(jìn)行試驗(yàn)并解釋試驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果，人們一般都不知道許多種昆蟲媒介的敏感性水平，而昆蟲的敏感性影響著防治的結(jié)果。
在防治疾病傳播媒介中的一個(gè)重大突破應(yīng)該是開發(fā)快速田間試劑盒。
通常，抗性的生化基礎(chǔ)是下述3種機(jī)理1)以有機(jī)磷和氨基甲酸酯為靶標(biāo)的非特定酯酶水平的增加；2)復(fù)合功能的氧化酶對擬除蟲菊酯的活性提高；和3)乙酰膽堿酯酶對有機(jī)磷和氨基甲酸酯的非敏感性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了使用單個(gè)昆蟲測定昆蟲中復(fù)合功能氧化酶活性提高的方法和試劑盒，本方法和試劑盒可快速和簡便的使用，且獲得的結(jié)果非常容易解釋。
根據(jù)本發(fā)明的試劑盒包含單獨(dú)的下述容器I.一種酸性的pH緩沖液，II.四甲基對二氨基聯(lián)苯，
III.一種溶解四甲基對二氨基聯(lián)苯的溶劑，和IV.過氧化氫。
用于田間的試劑盒還包括進(jìn)行試驗(yàn)的設(shè)備，例如混合容器、如Eppendorf試管的試驗(yàn)試管、移液管和微檢測盤(micro-assay plate)，通常還有顏色圖譜。
緩沖液的pH優(yōu)選為4-6，更優(yōu)選約5。
pH緩沖液優(yōu)選為乙酸鈉。
溶劑優(yōu)選為無水甲醇。
優(yōu)選使用的過氧化氫是3％w/w的水溶液。
本發(fā)明的方法包含用杵在緩沖液中將單個(gè)的昆蟲勻漿，優(yōu)選在如Eppendorf試管的小試管中研磨，加入四甲基對二氨基聯(lián)苯緩沖液作為基質(zhì)，加入過氧化氫作為氧化劑，并檢查藍(lán)色度，其強(qiáng)度表示復(fù)合功能氧化酶活性提高的水平，且由此確定對擬除蟲菊酯殺蟲劑的抗性。
非抗性昆蟲的著色非常淺，其隨著抗性水平的增加變?yōu)樯钏{(lán)。
通過與顏色圖譜比較，可用肉眼評價(jià)著色度，如果需要更準(zhǔn)確的結(jié)果，可在630nm用免疫-測定讀數(shù)器掃描。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是最先獲得了僅需要對單個(gè)的昆蟲進(jìn)行測定，就可測定復(fù)合功能氧化酶活性提高的試劑盒，使用本方法可以非常及時(shí)地獲得快速試驗(yàn)結(jié)果，且可以不需要儀器，通過目測和比色計(jì)讀數(shù)。本試劑盒和方法花費(fèi)的人力少且不需要特殊訓(xùn)練即可使用。而且，本試劑盒具有較長貨架壽命，可在室溫下穩(wěn)定數(shù)周。
應(yīng)用本試劑盒可以1.相當(dāng)簡單地測定抗性，2.確保用于防治害蟲和疾病媒介的化學(xué)殺蟲劑是有效的，從而減少死亡率、醫(yī)療費(fèi)用和人力，3.能夠穩(wěn)定和定期地監(jiān)測靶標(biāo)昆蟲的敏感性，和4.對新防治藥劑、防治策略和理解殺蟲劑作用模式的設(shè)計(jì)進(jìn)行支持。
具體實(shí)施例方式
分別制備包含下列物質(zhì)的5個(gè)瓶10ml乙酸鈉緩沖液(pH5)，2.5ml無水甲醇，5mg四甲基對二氨基聯(lián)苯，7.5ml乙酸鈉緩沖液(pH5)和5ml過氧化氫(3％)。
為了進(jìn)行試驗(yàn)，將無水甲醇倒入四甲基對二氨基聯(lián)苯中并振蕩使四甲基對二氨基聯(lián)苯完全溶解，且所得溶液用7.5ml乙酸鈉緩沖液緩沖。用杵在Eppendorf試管中的一滴緩沖液中將一只蚊子勻漿，然后用緩沖液稀釋到Eppendorf試管的1ml標(biāo)記。
將兩滴勻漿液滴入到微檢測盤的每個(gè)孔中，然后滴入4滴四甲基對二氨基聯(lián)苯溶液和一滴過氧化氫。
然后肉眼計(jì)分評價(jià)結(jié)果，通過與色圖標(biāo)準(zhǔn)比較檢查顏色或在630nm用免疫測定讀數(shù)器掃描。
權(quán)利要求
1.一種測定昆蟲中復(fù)合功能氧化酶活性提高的方法，包含在酸性pH緩沖液中將單個(gè)的昆蟲勻漿，加入酸性pH緩沖的四甲基對二氨基聯(lián)苯溶液作為基質(zhì)，加入過氧化氫作為氧化劑，并檢查藍(lán)色度，所述藍(lán)色度的強(qiáng)度表示復(fù)合功能氧化酶活性提高的水平。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法使用了試劑盒，該試劑盒包含單獨(dú)的下述容器I.一種酸性的pH緩沖液，II.四甲基對二氨基聯(lián)苯，III.一種溶解四甲基對二氨基聯(lián)苯的溶劑，和IV.過氧化氫。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的緩沖液是pH4-6的緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的緩沖液是pH5的緩沖液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的緩沖液是乙酸鈉。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述的溶劑是甲醇。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述的過氧化氫是3％w/w的水溶液。
8.權(quán)利要求1-7任意一項(xiàng)所述的方法中使用的試劑盒，包含單獨(dú)的下述容器I.一種酸性的pH緩沖液，II.四甲基對二氨基聯(lián)苯，III.一種溶解四甲基對二氨基聯(lián)苯的溶劑，和IV.過氧化氫。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述的緩沖液是pH4-6的緩沖液。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述的緩沖液是pH5的緩沖液。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述的緩沖液是乙酸鈉。
12.根據(jù)權(quán)利要求8-11任意一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述的溶劑是甲醇。
13.根據(jù)權(quán)利要求8-12任意一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述的過氧化氫是3％w/w的水溶液。
14.根據(jù)權(quán)利要求8-13任意一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還包含進(jìn)行試驗(yàn)的設(shè)備。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包含試驗(yàn)試管、移液管和微檢測盤。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還包含顏色圖譜。
全文摘要
使用單個(gè)昆蟲測定復(fù)合功能氧化酶活性提高的方法，其中包含用杵在酸性pH緩沖液中將單個(gè)的昆蟲勻漿，優(yōu)選在如Eppendorf試管的小試管中研磨，加入四甲基對二氨基聯(lián)苯緩沖液作為基質(zhì)，加入過氧化氫作為氧化劑，并檢查藍(lán)色度，其強(qiáng)度表示復(fù)合功能氧化酶活性提高的水平。本發(fā)明還提供了在本方法中使用的試劑盒，其包含單獨(dú)的下述容器I.一種酸性的pH緩沖液，II. 四甲基對二氨基聯(lián)苯，III.一種溶解四甲基對二氨基聯(lián)苯的溶劑，和IV.過氧化氫。
文檔編號C12Q1/28GK1502983SQ0215893
公開日2004年6月9日 申請日期2002年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月26日
發(fā)明者李·漢·林, 納茲尼·瓦西·艾哈邁德, 瓦西 艾哈邁德, 李 漢 林 申請人:醫(yī)藥研究院