專利名稱：人乳頭瘤病毒的病毒樣顆粒的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，更具體地，涉及用昆蟲細(xì)胞表達(dá)體系表達(dá)、純化人乳頭瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)的病毒樣顆粒(VLP)的方法，還涉及所獲得的重組病毒樣顆粒，及其在HPV疫苗研制和臨床檢測(cè)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
人乳頭瘤病毒(HPV)是一類雙鏈小分子DNA病毒，具有嚴(yán)格的種屬特異性，主要感染人的皮膚和粘膜組織，引起相應(yīng)部位上皮組織的增生性病變。根據(jù)感染部位可分為皮膚型和粘膜型兩組，粘膜組HPV又根據(jù)引起病變的性質(zhì)分為兩類引起粘膜上皮良性增生病變的低危型和與人類多種器官惡性腫瘤(如宮頸癌、陰莖癌、喉及支氣管癌、食管癌、口腔癌等)密切相關(guān)的高危型(Zur Hausen H.Biochim Biophys Acta 1996；1288F55-F78.)。根據(jù)核酸序列同源性，HPV可分為80多型，不同型別的HPV引起不同的疾病。HPV 1、2、3、4、7、10、26-29在正?；蛎庖呷睋p個(gè)體中引起良性疣。HPV 5、8、9、12、14、15、17、19-25、36、46-50在免疫缺損個(gè)體中引起扁平狀損傷。HPV 6、11、34、39、41-44、51-55引起生殖道或呼吸道粘膜發(fā)生非惡性濕疣。HPV 16和18與宮頸癌的發(fā)生高度相關(guān)，其中HPV 16是最主要的致癌因素。HPV 6和11是90％以上生殖器疣和喉乳頭瘤的致病因子。在我國，HPV 6b是HPV 6的主要亞型(國外是以HPV 6a為主)。
完整的乳頭瘤病毒(Papillomavirus，PV)顆粒直徑約55nm，由病毒基因組DNA與衣殼兩部分組成，無包膜，衣殼呈二十面體，由72個(gè)殼粒組成，病毒顆粒在CsCl中的浮力密度為1.34g/cm3。病毒基因組是雙鏈環(huán)狀DNA，約8kb，動(dòng)物PV和HPV具有相似的基因組結(jié)構(gòu)，遺傳信息儲(chǔ)存于其中一條DNA鏈上(Pfister H and Fuchs PG.Intervirology 1994；37143-9)。基因組含至少8個(gè)開放閱讀框(ORF)，ORF間可部分或全部重疊，基因組根據(jù)功能分為三個(gè)功能區(qū)早期區(qū)，編碼6個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(E1、E2、E4、E5、E6、E7)，編碼的蛋白與病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)化作用有關(guān)；晚期區(qū)，含L1、L2兩個(gè)ORF，編碼主要衣殼蛋白L1和次要衣殼蛋白L2兩個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，參與病毒粒子的組裝；長(zhǎng)控制區(qū)(LCR)，又稱非編碼區(qū)或上游調(diào)控區(qū)，不編碼任何蛋白，但含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、沉寂子等多種調(diào)控元件，影響病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。
疫苗防治HPV相關(guān)疾病是近幾年來的研究熱點(diǎn)。EGW病變部位HPV病毒粒子很少，嚴(yán)格的種屬特異性決定了HPV疫苗無法直接通過動(dòng)物體內(nèi)繁殖病毒體來制備，而且，現(xiàn)還不能從細(xì)胞組織培養(yǎng)中獲得足夠量的病毒粒子。因此，通過獲得病毒體進(jìn)行減毒活疫苗或滅活疫苗的研制路線是行不通的。目前HPV疫苗研究主要集中在基因工程生產(chǎn)HPV亞單位疫苗。
HPV衣殼是HPV疫苗研發(fā)及抗原檢測(cè)的首選目的蛋白。HPV衣殼是由L1和L2蛋白共同構(gòu)成，二者比例約10∶1。單獨(dú)的L1蛋白可以自發(fā)組裝成直徑與HPV成熟病毒大小相近(約55nm)的病毒樣顆粒(virus-likeparticle，VLP)(Rose RC et al.，J Virol 1993，67(4)1936-1944)，VLP和天然PV的形態(tài)相似，都是二十面體結(jié)構(gòu)，只是VLP內(nèi)部無病毒核酸。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，只有L1蛋白裝配成的VLP誘發(fā)的抗體具有中和病毒、預(yù)防感染的能力，而變性的L1蛋白(不具有VLP結(jié)構(gòu))免疫后不能預(yù)防感染(Suzich，J.A et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1995 Dec 5；92(25)11553-7)。VLP保留了天然病毒粒子的抗原表位，是最有希望的HPV預(yù)防性候選疫苗，VLP結(jié)構(gòu)的保留對(duì)預(yù)防病毒感染至關(guān)重要。因此，在HPV疫苗研制及HPV臨床診斷中，獲得保留有天然病毒構(gòu)象及盡可能多的表位的重組病毒樣顆粒是關(guān)鍵，而且需要高效率的表達(dá)及制備方法。
在原核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)因缺乏必要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾、加工、轉(zhuǎn)運(yùn)等機(jī)制不能在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)過程中自動(dòng)折疊形成衣殼立體結(jié)構(gòu)(即VLP)。有報(bào)道表明在大腸桿菌中表達(dá)L1盡管不能自動(dòng)裝配成VLP，但經(jīng)過復(fù)雜的體外變性復(fù)性過程，仍可以形成VLP，但得率非常低，僅有0.02-0.04％(Zhang W，et al.，Virology.1998，243(2)423-431)。所以，盡管在基因工程產(chǎn)物制備上原核表達(dá)系統(tǒng)有成本低、工藝簡(jiǎn)單、產(chǎn)量高的優(yōu)點(diǎn)，但實(shí)現(xiàn)重組HPV L1裝配成VLP這一目的，不適合選擇原核表達(dá)系統(tǒng)。
最早關(guān)于HPV衣殼蛋白裝配成病毒樣顆粒(VLP)的研究是用痘苗病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)HPV-16的L1和L2蛋白(Zhou J et al.，Virology 1991Nov；185(1)251-257)。Rose等用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)單獨(dú)表達(dá)HPV-11 L1蛋白時(shí)自動(dòng)裝配成VLP(Rose RC et al.，J Virol 1993，67(4)1936-1944)，WO9420137(Rose RC et al.)公開了桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備L1蛋白及VLP。Hofmann在釀酒酵母中表達(dá)了HPV-6a L1和L1+L2并觀察到了自組裝成的VLP(Hofmann KJ，et al.，Virology.1995，209(2)506-518.)，WO9531532(Hofmann KJ，et al.)公開了由酵母表達(dá)系統(tǒng)制備重組VLP(L1，L1+L2)的方法。然而，酵母細(xì)胞用于表達(dá)HPV衣殼蛋白時(shí)，VLP產(chǎn)量低。酵母作為低等真核生物，具有與哺乳動(dòng)物細(xì)胞非常不同的蛋白質(zhì)翻譯后加工系統(tǒng)，表達(dá)的蛋白含有酵母來源的糖基化修飾，這會(huì)影響到抗原表位，并且應(yīng)用于人體時(shí)會(huì)引起機(jī)體的免疫反應(yīng)。此外，哺乳細(xì)胞表達(dá)外源蛋白時(shí)，產(chǎn)量低、操作復(fù)雜、成本高，不適合于制備疫苗。
據(jù)報(bào)道，細(xì)菌表達(dá)的GST-BPV4 L2誘導(dǎo)的血清中和抗體使動(dòng)物免受BPV-4感染(Gaukroger JM，et al.，J.Gen.Virol.77(Pt 7)1577-1583，1996)，HPV L2存在交叉中和表位(Roden RBS，et al.，Virology 270(2)254-257，2000)。
本發(fā)明人在相關(guān)工作中發(fā)現(xiàn)，利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)同時(shí)表達(dá)HPV的L1和L2蛋白，二者可裝配成VLP，特別令人意想不到地是，L2蛋白的引入大大提高了VLP的產(chǎn)量，并且增加了VLP的抗原表位，免疫后誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生了更廣泛的抗體反應(yīng)。因此，本發(fā)明人基于這一發(fā)現(xiàn)，完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種高效制備人乳頭瘤病毒的病毒樣顆粒的方法，所述方法包括如下步驟(a)分別將編碼所述病毒衣殼蛋白L1和L2的基因克隆到桿狀病毒載體中，構(gòu)建重組桿狀病毒；(b)用所構(gòu)建的重組桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞，表達(dá)所述衣殼蛋白，形成病毒樣顆粒；和(c)純化所述病毒樣顆粒。其中用含L1基因的重組桿狀病毒和含L2基因的重組桿狀病毒同時(shí)感染昆蟲細(xì)胞時(shí)，含L1基因的重組桿狀病毒感染復(fù)數(shù)占二者總感染復(fù)數(shù)的比例在30％至100％。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在衣殼蛋白編碼區(qū)的起始密碼子前引入了核苷酸序列“AAT”，以利于桿狀病毒載體對(duì)外源基因的表達(dá)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述人乳頭瘤病毒為HPV 6b亞型，利用本發(fā)明方法，L1和L2蛋白表達(dá)量可以分別達(dá)到細(xì)胞總蛋白的16％和13％，每5×107細(xì)胞貼壁培養(yǎng)物可以純化得到40μg以上高純度VLP。另外，采用細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)可以獲得更高的產(chǎn)量和產(chǎn)率。
本發(fā)明還涉及由本發(fā)明方法制備的HPV病毒樣顆粒，以及所述HPV病毒樣顆粒在制備疫苗和診斷劑中的應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供了一種高效制備重組HPV VLP的方法。用昆蟲細(xì)胞表達(dá)體系高效率表達(dá)、純化HPV衣殼蛋白，獲得重組病毒樣顆粒。衣殼蛋白編碼區(qū)起始密碼子前引入“AAT”序列，并且在L1蛋白表達(dá)的同時(shí)增加L2蛋白的表達(dá)，提高了L1蛋白的表達(dá)量及組裝成病毒樣顆粒的產(chǎn)量。純化的病毒樣顆?？蛇_(dá)95％以上的純度。病毒樣顆粒具有天然HPV病毒粒子的免疫原性，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高滴度的抗體，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)?？贵w可以抑制感染性HPV對(duì)敏感細(xì)胞的吸附和對(duì)人上皮組織的感染。其中，由L1和L2蛋白組裝成的病毒樣顆粒同時(shí)誘導(dǎo)出特異于L1和L2蛋白的兩種抗體。由本發(fā)明提供的方法制備的L1-L2 VLP具有更廣泛的免疫反應(yīng)和免疫保護(hù)效果。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，進(jìn)行了HPV6b衣殼蛋白的表達(dá)，在我國，HPV 6b是HPV 6的主要亞型。本發(fā)明提供的方法同樣適用于制備HPV 6a、11、16、18等其它型別HPV的重組病毒樣顆粒。本發(fā)明方法中使用的桿狀病毒載體及昆蟲細(xì)胞是本領(lǐng)域熟知的常規(guī)載體和細(xì)胞，例如苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)載體、家蠶核型多角體病毒(BmNPV)載體、昆蟲細(xì)胞Sf9、Sf21、BmN等。
本發(fā)明的方法具有如下優(yōu)點(diǎn)1)表達(dá)效率高。2)L2蛋白可以提高L1蛋白的表達(dá)量及VLP的產(chǎn)量。3)包含了L2蛋白的VLP抗原表位增加，免疫機(jī)體產(chǎn)生了針對(duì)L1和L2的抗體。4)制備的VLP免疫產(chǎn)生的抗體具有中和病毒預(yù)防感染的效果。5)屬于真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)，具有與高等生物類似的蛋白質(zhì)翻譯加工系統(tǒng)，有利于表達(dá)產(chǎn)物蛋白具有天然的高級(jí)結(jié)構(gòu)，保持原有活性與功能。6)昆蟲細(xì)胞可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模懸浮培養(yǎng)，相對(duì)操作技術(shù)簡(jiǎn)單、成本低，適合于規(guī)模生產(chǎn)。


圖1示出重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFB-6L1和pFB-6L2酶切鑒定。
圖2示出重組桿狀病毒的PCR鑒定。
圖3示出重組病毒感染的Sf9細(xì)胞中L1蛋白的表達(dá)與Western印跡雜交的結(jié)果。M標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量標(biāo)記；1做為對(duì)照的感染bacmid的Sf9細(xì)胞；2感染Bac6L1的Sf9細(xì)胞；1′、2′分別是1、2的Western印跡鑒定結(jié)果。箭頭指示L1蛋白條帶。
圖4示出重組病毒感染的Sf9細(xì)胞中L2蛋白的表達(dá)與Western印跡雜交的結(jié)果。M標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量標(biāo)記；1感染bacmid的Sf9細(xì)胞做對(duì)照；2感染Bac6L2的Sf9細(xì)胞；1′、2′分別是1、2的Western印跡鑒定結(jié)果。箭頭指示L2蛋白條帶。
圖5示出不同比例重組病毒感染的Sf9細(xì)胞中L1和L2蛋白的表達(dá)。其中不同比例的Bac6L1和Bac6L2同時(shí)感染Sf9細(xì)胞，總的病毒感染復(fù)數(shù)為10PFU/細(xì)胞。在SDS-PAGE電泳圖中，L1和L2蛋白條帶以箭頭標(biāo)出。Bac6L1∶Bac6L2＝100/0時(shí)的L1蛋白表達(dá)量定為1，計(jì)算出其它條件下L1和L2蛋白的相對(duì)表達(dá)量，所得的相對(duì)值在柱方圖的對(duì)應(yīng)位置示出。
圖6示出VLP的電鏡觀察與免疫電鏡鑒定的結(jié)果。其中A，B分別是從Bac6L1和Bac6L1+Bac6L2感染的Sf9細(xì)胞中純化的VLP。內(nèi)嵌圖C，D分別為B圖中的VLP與HPV 6 L1和L2抗體進(jìn)行免疫電鏡檢測(cè)的結(jié)果。
圖7示出純化的VLP的SDS-PAGE和Western印跡鑒定結(jié)果。其中M標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量標(biāo)記；A，B分別是從Bac6L1和Bac6L1+Bac6L2感染的Sf9細(xì)胞中純化的VLP。N′(N＝A，B)是用HPV 6 L2抗體檢測(cè)N的Western印跡結(jié)果。N″是用HPV 6 L1抗體和L2抗體混和物檢測(cè)N的Western印跡結(jié)果。實(shí)心箭頭指示L1蛋白條帶，空心箭頭指示L2蛋白條帶。
圖8示出用ELISA分析L1-L2 VLP的免疫反應(yīng)性的結(jié)果。
圖9示出用ELISA方法測(cè)定免疫小鼠血清抗體效價(jià)的結(jié)果。其中L1A，L1N，L1+2A，L1+2N，control分別代表按照表2分組免疫后的小鼠血清。
圖10示出L1-L2-VLP誘導(dǎo)出特異于L2蛋白的抗體。
圖11示出免疫小鼠抗體識(shí)別構(gòu)象依賴的表位。其中未變性的HPV-6L1 VLP(對(duì)應(yīng)圖線L1A和L1+2A)和變性的VLP(對(duì)應(yīng)圖線L1A denat.和L1+2A denat.)包被于酶標(biāo)板孔中，抗血清L1A和L1+2A用于ELISA檢測(cè)。
圖12示出HPV-6 L1-VLP免疫血清(L1A)與HPV-11和16 L1-VLP的交叉反應(yīng)。
圖13小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)放射計(jì)數(shù)。
圖14小鼠脾淋巴細(xì)胞經(jīng)HPV 6 L1 VLP體外誘導(dǎo)后IFN-γ，IL-2，IL-10的分泌。
圖15激光共聚焦掃描顯微鏡觀察上皮細(xì)胞對(duì)VLP的吸附攝入及抗血清對(duì)其阻斷作用。其中A和B分別為HPV-6 L1 VLP和L1-L2 VLP對(duì)上皮細(xì)胞的吸附攝入；C陰性對(duì)照；抑制實(shí)驗(yàn)D-G中都用的是HPV-6 L1-L2VLP，而D、E、F、G中所用的抗體分別為未免疫、L1 VLP免疫、L1-L2VLP免疫小鼠血清和已知的兔抗HPV-6 L1 VLP多抗。
圖16裸鼠腎包膜下移植物的組織學(xué)鑒定(HE染色) 原始放大倍數(shù)200×。A，B分別是經(jīng)抗血清和對(duì)照血清處理感染性病毒懸液得到的結(jié)果。
以下實(shí)施例是用于說明本發(fā)明，但不是限制其范圍。
實(shí)施例1增加“AAT”序列的HPV 6b L1和L2編碼序列的獲得以重組HPV 6b L1和L2基因的質(zhì)粒載體(pGEM-T easy，Promega公司)為模板，用如下引物，按常規(guī)PCR方法分別擴(kuò)增在起始密碼子前增加“AAT”序列的HPV 6b L1和L2編碼序列。L1基因上游引物P15′-CCGGATCCBamHIAATA5789TGTGGCGGCCTAGCGACAGCA-3′；下游引物P25′-CAGGATCCBamHIT7291TACCTTTTAGTTTTGGCGCGCTT-3′。L2基因上游引物P35′-GCAGATCTBglIIAATA4423TGGCACATAGTAGGGCCCGACGACG-3′；下游引物P45′-CTAGATCTBglIIC5802TAGGCCGCCACATCTGAAAAAAATAAGGG-3′。黑體字顯示了在引物中引入的BamH I和Bgl II酶切位點(diǎn)，下標(biāo)數(shù)字為相應(yīng)堿基在原型HPV-6基因組中的位置。
實(shí)施例2 重組桿狀病毒的構(gòu)建1、重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的構(gòu)建分別用BamH I和Bgl II酶切實(shí)施例1中獲得的PCR擴(kuò)增片斷，低融點(diǎn)瓊脂糖電泳回收HPV-6 L1和L2基因基因片段，分別與經(jīng)BamH I酶切并脫磷的pFastbac I(GIBCO BRL公司)載體連接，轉(zhuǎn)化DH5 α菌株，涂布于氨芐青霉素抗性LB平板，37℃過夜培養(yǎng)，挑單克隆于液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用堿裂解法小量提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切電泳初步鑒定篩出陽性克隆，然后用多酶切鑒定篩選出正向陽性克隆，獲得的重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒分別命名為pFB-6L1和pFB-6L2。酶切電泳鑒定結(jié)果見圖1，其中，泳道1L1基因的PCR產(chǎn)物(1.5k bp)；泳道2pFB-6L1/Xba I(1.5k bp)；泳道3pFB-6L1/StuI(1.2k bp)；泳道4pFB-6L1/BamH I(1.5k bp)；泳道5pBR322/Hinf I DNA標(biāo)記；泳道6pFB-6L2/Pst I(0.48k bp)；泳道7pFB-6L2/BamH I+EcoR I(1.4kbp)；泳道8L2基因的PCR產(chǎn)物(1.4kbp)。酶切位點(diǎn)在載體多克隆位點(diǎn)或(和)L1、L2基因內(nèi)部，酶切結(jié)果均與預(yù)期相符。測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)重組正確。
2、重組桿狀病毒的獲得將pFB-6L1和pFB-6L2分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac(GIBCO BRL公司，菌體中含有桿狀病毒穿梭載體bacmid)，在菌體內(nèi)，通過轉(zhuǎn)座作用使外源基因整合到bacmid，并受桿狀病毒多角體蛋白基因啟動(dòng)子的直接控制，將提取的bacmid通過脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Sf9(GIBCO BRL公司)，培養(yǎng)細(xì)胞至充分病變，收獲重組桿狀病毒。擴(kuò)增病毒，提取病毒DNA，用上述P1、P2、P3、P4引物及根據(jù)bacmid提供的插入位點(diǎn)兩側(cè)的M13正反向引物序列合成的引物通過PCR方法分別鑒定L1和L2基因重組桿狀病毒(圖2)，其中泳道1Bac6L1用引物M13+和M13-擴(kuò)增的產(chǎn)物(3.8kbp)；泳道2Bac6L1用P1和M13-擴(kuò)增的產(chǎn)物(2.1k bp)；泳道3Bac6L1用M13+和P2擴(kuò)增的產(chǎn)物(3.2k bp)；泳道4Bac6L1用P1和P2擴(kuò)增的產(chǎn)物(1.5k bp)；泳道5λDNA/Hind III標(biāo)記；泳道6Bac6L2用P3和P4擴(kuò)增的產(chǎn)物(1.4kbp)；泳道7Bac6L2用M13+和P4擴(kuò)增的產(chǎn)物(3.1k bp)；泳道8Bac6L2用P3和M13-擴(kuò)增的產(chǎn)物(2.0k bp)；泳道9Bac6L2用M13+和M13-擴(kuò)增的產(chǎn)物(3.7k bp)。
分別獲得HPV-6 L1和L2基因以正確方式插入的重組桿狀病毒，命名為Bac6L1和Bac6L2。桿狀病毒的構(gòu)建、純化、滴度測(cè)定及細(xì)胞培養(yǎng)的具體方法參照GIBCO BRL公司Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)操作手冊(cè)。病毒的擴(kuò)增是于75cm培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)接種1×107個(gè)Sf9細(xì)胞，加入原病毒液5～10μl(病毒感染復(fù)數(shù)MOI約0.01～0.1)，27℃培養(yǎng)48～72h，收獲培養(yǎng)上清，離心去除細(xì)胞殘?jiān)?，獲得重組桿狀病毒。
實(shí)施例3 L1蛋白和L2蛋白在Sf9細(xì)胞中的表達(dá)1.病毒感染與蛋白表達(dá)的檢測(cè)在24孔板中按每孔3×105個(gè)Sf9細(xì)胞接種，每孔加0.5ml TC-100完全培養(yǎng)基(GIBCO BRL公司)，28℃培養(yǎng)1小時(shí)以上，使細(xì)胞完全貼壁。實(shí)施例2獲得的重組桿狀病毒病毒以感染復(fù)數(shù)(MOI)為10感染細(xì)胞，28℃培養(yǎng)72h后收獲細(xì)胞，細(xì)胞經(jīng)PBS(1L8g NaCl+0.2g KCl+1.44gNa2HPO4+0.24gKH2PO4，pH7.4)洗滌后，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。檢測(cè)不同比例的L1和L2基因重組桿狀病毒同時(shí)感染細(xì)胞的蛋白表達(dá)情況時(shí)保證總MOI＝10。向收集的細(xì)胞加1×SDS-PAGE上樣緩沖液(200μl/106細(xì)胞)，煮沸5分鐘，室溫下離心2分鐘(10000rpm)，取20μl進(jìn)行SDS-PAGE不連續(xù)電泳(積層膠5％，pH6.8；分離膠10％，pH8.8)。凝膠用考馬斯亮蘭R250染色，或用于Western印跡雜交，ECL Western印跡熒光檢測(cè)按試劑盒(Amersham Pharmacia公司)使用說明書進(jìn)行。蛋白電泳凝膠經(jīng)染色、掃描后，用圖像處理軟件TotalLab(Nonlinear Dynamics公司)分析特異條帶對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)的分子量、相對(duì)含量及占細(xì)胞總蛋白百分比。
根據(jù)所述方法，分別收獲重組桿狀病毒Bac6L1和Bac6L2感染的Sf9細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞裂解液進(jìn)行SDS-PAGE電泳和Western印跡雜交(圖3，圖4)，結(jié)果顯示相對(duì)于陰性對(duì)照(空載bacmid感染細(xì)胞)，Bac6L1表達(dá)出表觀分子量為54.5kD的蛋白(圖3的泳道2，箭頭所示)，并且此蛋白非常特異地與抗HPV-6 L1抗體(H6C6，由Milton S.Hershey醫(yī)學(xué)中心Christensen惠贈(zèng))反應(yīng)(圖3泳道2′，箭頭所示)；Bac6L2表達(dá)出表觀分子量約72.0kD的蛋白(圖4的泳道2，箭頭所示)，此蛋白也與兔抗HPV-6 L2多克隆抗體(由華盛頓大學(xué)Fred Hutchinson癌癥研究中心Carter惠贈(zèng))反應(yīng)(圖4的泳道2′，箭頭所示)。在優(yōu)化的條件下，L1和L2蛋白表達(dá)量可以分別達(dá)到細(xì)胞總蛋白的16％和13％。
2.L2蛋白表達(dá)可以提高L1蛋白表達(dá)量如1中所述方法，進(jìn)行單獨(dú)的Bac6L1或Bac6L2感染或者二者按不同比例同時(shí)感染Sf9細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞裂解液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，假定單獨(dú)Bac6L1感染表達(dá)的L1蛋白量為1，對(duì)L1和L2蛋白對(duì)應(yīng)的各條帶進(jìn)行相對(duì)含量分析，結(jié)果見圖5。其中，比值代表總MOI＝10時(shí)Bac6L1與Bac6L2感染的相對(duì)量。結(jié)果表明，適當(dāng)?shù)腖2蛋白表達(dá)可以提高L1蛋白的表達(dá)量，以Bac6L1∶Bac6L2＝3∶1(75％)比例同時(shí)感染獲得的L1蛋白表達(dá)量最高，之后，L1蛋白表達(dá)量隨Bac6L1占感染細(xì)胞總病毒的比例的下降而下降；相反，L2蛋白表達(dá)量始終隨Bac6L1占感染細(xì)胞總病毒的比例的下降(Bac6L2所占比例的上升)而上升。
實(shí)施例4 VLP的大量制備與鑒定1.病毒感染方法I收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，加入病毒液，接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，27℃培養(yǎng)72h；方法II收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，27℃孵育2～5h或更長(zhǎng)時(shí)間，棄去培養(yǎng)液，以1/2量無血清培養(yǎng)基(含病毒)加入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，27℃孵育2～5h，再補(bǔ)加1/2量2×血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至感染后72h。
2.表達(dá)產(chǎn)物VLP的提取收集感染72h的5×108Sf9細(xì)胞，4℃4000g×10min，4℃PBS洗滌兩次；10ml PBS(含0.1％Triton X-100，1mmol/L PMSF)懸浮細(xì)胞，冰浴30min；冰浴超聲粉碎細(xì)胞；4℃10000g×15min，離心，上清加于325g/L蔗糖-PBS墊層的離心管上部，4℃25000rpm(141000g，BACKMAN SW-28轉(zhuǎn)頭)離心150min；棄上清，沉淀加2ml 307g/L CsCl-PBS，超聲波助懸浮，補(bǔ)加307g/L CsCl至11ml，4℃33500rpm(141000g，BACKMAN SW-41轉(zhuǎn)頭)離心20h；收集1.29g/ml密度帶，4℃PBS透析，PEG20000濃縮，收獲蛋白4℃或-70℃保存。
3.表達(dá)產(chǎn)物VLP的鑒定從Bac6L1和Bac6L1+Bac6L2(Bac6L1∶Bac6L2＝3∶1)感染的細(xì)胞(MOI＝10 PFU/cell，72hpi)純化VLP，經(jīng)負(fù)染，電鏡觀察VLP形態(tài)(圖6A和B)。Bac6L1感染細(xì)胞純化的VLP(L1-VLP)和Bac6L1+Bac6L2感染細(xì)胞純化的VLP(L1+2-VLP)形態(tài)上無明顯差異，VLP為圓形，直徑約50nm。免疫電鏡結(jié)果顯示L1+2-VLP可以分別與抗HPV-6 L1-VLP抗體和抗HPV-6 L2抗體呈陽性反應(yīng)(圖6C，D)，這與SDS-PAGE電泳和Western印跡雜交鑒定L1+2-VLP組成的結(jié)果(圖7)一致，說明L2蛋白可以自發(fā)參入到L1蛋白自組裝形成的VLP中。對(duì)L1+2-VLP的SDS-PAGE電泳圖譜中的L1和L2蛋白相對(duì)含量分析表明，二者摩爾比例為4∶1。
4.L2蛋白與L1蛋白同時(shí)表達(dá)可以提高病毒樣顆粒的產(chǎn)量與單獨(dú)L1蛋白表達(dá)相比，L2蛋白與L1蛋白同時(shí)表達(dá)可以顯著提高病毒樣顆粒的產(chǎn)量。比較單獨(dú)感染Bac6L1(MOI＝10或15)和同時(shí)感染Bac6L1(MOI＝10)和Bac6L2(MOI＝5)，后者的VLP產(chǎn)量是前者的4-5倍(表1)。
表1 L2蛋白與L1蛋白同時(shí)表達(dá)可以提高病毒樣顆粒的產(chǎn)量L1-VLPL1+L2-VLPL1-VLP/L1+L2-VLPMOI/(PFU/細(xì)胞) Bac6L1＝10Bac6L1＝15Bac6L1∶Bac6L2＝10∶5 平行實(shí)驗(yàn)中的比值VLP產(chǎn)量/μg 實(shí)驗(yàn)1 101 / 466 1∶4.6實(shí)驗(yàn)2 / 103 441 1∶4.3實(shí)施例5 VLP的免疫原性將上述實(shí)施例4所述的經(jīng)大量細(xì)胞培養(yǎng)純化得到的病毒樣顆粒用于免疫檢測(cè)和免疫動(dòng)物。
動(dòng)物免疫方案取BALB/c小鼠，隨機(jī)分組，每組8只，按下述方案(表2)選擇四肢上部?jī)?nèi)側(cè)皮下免疫。免疫方法、小鼠血清的分離、小鼠脾淋巴細(xì)胞的分離、脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)、細(xì)胞因子IL-2，IFN-γ，IL-10測(cè)定、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法參照文獻(xiàn)(沈關(guān)心，周如麟，主編現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，武漢，湖北科學(xué)技術(shù)出版社，1998；朱立平，陳學(xué)情，主編免疫學(xué)常用實(shí)驗(yàn)方法，北京，人民軍醫(yī)出版社，2000)。
表2 小鼠免疫方案

VLP的免疫反應(yīng)性用一系列已知抗體(鼠單克隆抗體H6E51，識(shí)別HPV-6及HPV-11VLP共有的變性表位；H6M48，識(shí)別HPV-6型特異性L1 VLP構(gòu)像表位；H6K57，識(shí)別HPV-6及HPV-11共有的L1 VLP構(gòu)象表位，由Milton S.Hershey醫(yī)學(xué)中心Christensen惠贈(zèng)；兔抗HPV-6 L1-VLP多克隆抗體(rabbitL1)由澳大利亞Queensland大學(xué)Frazer惠贈(zèng)；其它抗體同實(shí)施例3中所述)對(duì)純化的VLP的免疫反應(yīng)性進(jìn)行鑒定，針對(duì)L1+2 VLP的ELISA結(jié)果見圖8，其中兔對(duì)照血清(rabbit control)和鼠對(duì)照血清(mouse control)取自未經(jīng)VLP免疫動(dòng)物。HPV-6 L1和L2兔多抗與L1+2 VLP呈陽性反應(yīng)，該VLP中保留了HPV-6和HPV-11病毒粒子共有的表面線性表位(與H6E51陽性反應(yīng))和表面構(gòu)象表位(與H6K57陽性反應(yīng))以及HPV-6特異性構(gòu)象表位(與H6M48陽性反應(yīng))。
免疫血清抗體鑒定第三次免疫后14天取血，摘除眼球，收集血液于1.5ml EP管內(nèi)，37℃放置30min，轉(zhuǎn)4℃放置30min，2000g離心20min，收取血清，-20℃保存?zhèn)溆?。?duì)不同組免疫小鼠獲得的血清(每組各鼠血清合并)用ELISA方法測(cè)定抗體效價(jià)(圖9)。實(shí)驗(yàn)制備的VLP可誘導(dǎo)出特異于HPV-6 L1VLP的抗體，其中，加佐劑組免疫血清(L1A和L1+2A)滴度在1∶10000以上，未加佐劑組免疫血清(L1N和L1+2N)滴度約1∶2000，陰性對(duì)照組(control)未測(cè)到抗體活性。
L1+2-VLP免疫血清可以與L2重組桿狀病毒(Bac6L2)感染細(xì)胞裂解物發(fā)生陽性反應(yīng)，而與對(duì)照的非重組病毒(bacmid)感染細(xì)胞裂解物不反應(yīng)(圖10)。免疫血清抗體測(cè)定結(jié)果說明，我們所提取的HPV-6 VLP免疫小鼠后，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了高滴度的特異性抗體，并且免疫佐劑可以提高VLP的免疫原性。
當(dāng)用于包被的HPV-6 L1-VLP抗原在堿性(pH＝10.6)和還原劑存在條件下加熱處理后，免疫血清(L1A和L1+2A)與變性抗原的結(jié)合力顯著下降(圖11)。說明，制備的抗血清中的抗體主要識(shí)別構(gòu)象依賴的抗原表位。
為了進(jìn)一步考察用本發(fā)明的VLP免疫獲得的血清在不同HPV型別之間的免疫交叉反應(yīng)性，分析了用HPV-6 L1-VLP免疫獲得的抗血清L1A同時(shí)與HPV-6，-11，-16的L1 VLP抗原的免疫反應(yīng)性。結(jié)果(圖12)表明L1A顯示出與HPV-6 L1 VLP的高反應(yīng)性，在低稀釋倍數(shù)(小于300)情況下，亦與HPV-11 L1 VLP呈陽性交叉反應(yīng)，而與HPV-16 L1VLP在稀釋倍數(shù)為33時(shí)僅有微弱反應(yīng)?？梢姡肏PV-6 L1-VLP免疫獲得的抗血清對(duì)HPV-11抗原顯示出一定的交叉反應(yīng)，而與HPV-16無明顯交叉反應(yīng)。
淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)測(cè)定結(jié)果取L1A、L1+2A及對(duì)照組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，分別以HPV-6 L1 VLP抗原刺激，同時(shí)設(shè)分裂原ConA陽性對(duì)照和1640培養(yǎng)基陰性(medium)對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)三個(gè)重復(fù)。用3H-TdR摻入法測(cè)定淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)。放射計(jì)數(shù)及刺激指數(shù)(SI)計(jì)算結(jié)果如表3及圖13?？梢娒庖呓M小鼠脾淋巴細(xì)胞在特異性抗原刺激下發(fā)生明顯的增殖反應(yīng)，3H-TdR摻入值(cpm)升高，明顯高于未免疫對(duì)照組，P＜0.01，L1A和L1+2A兩組間無顯著性差異，P＞0.05，L1A和L1+2A組刺激指數(shù)(SI)分別為6.4和6.2，而對(duì)照組為1.1。
表3 免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)小鼠分組 ConA(cpm)HPV-6 L1 VLP(cpm) 培養(yǎng)基(cpm) ConA刺激指數(shù) VLP刺激指數(shù)L1A 17034±4317 7690±1842 1195±248 14.3 6.4L1+2A 21101±5371 8098±1621 1302±331 16.2 6.2對(duì)照 20844±4668 1426±360 1318±259 15.8 1.1
細(xì)胞因子IFN-γ，IL-2，IL-10測(cè)定對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞在抗原刺激下分泌細(xì)胞因子的情況采用雙抗體夾心ELISA方法進(jìn)行了測(cè)定。根據(jù)系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品450nm的光密度推導(dǎo)濃度與光密度之間的線性函數(shù)關(guān)系，再計(jì)算被檢樣品中的細(xì)胞因子含量，結(jié)果見表4和圖14。ConA可以非特異性刺激免疫組(L1A和L1+2A)和對(duì)照(未免疫)組IFN-γ、IL-2、IL-10的釋放，HPV-6 L1 VLP刺激只引起IFN-γ釋放的微弱增加，但可以特異的使免疫組IL-2和IL-10分泌明顯增加，顯著高于未免疫對(duì)照組，P＜0.01。IL-10在無誘生劑存在下可有低水平的表達(dá)。
表4 HPV 6 L1 VLP體外誘導(dǎo)免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)IL-6，IL-2，IFN-γ分泌的影響IFN-γ(pg/ml) IL-2(pg/ml) IL-10(pg/ml)小鼠分組 ConA VLP 培養(yǎng)基ConA VLP 培養(yǎng)基 ConA VLP 培養(yǎng)基L1A 175±10 16±0.8 7.1±1.5 249±63 94±12 23±3.1 427±21 107±11 26±5.6L1+2A 157±18 13±1.1 9.4±0.4 226±77 102±15 20±4.9 435±39 93±5.3 19±3.2對(duì)照 192±35 12±1.2 7.6±0.8 190±23 19±2.1 19±1.5 464±41 28±2.4 23±1.9上述結(jié)果說明，制備的VLP具有良好的抗原性，在免疫的小鼠體內(nèi)同時(shí)誘導(dǎo)了細(xì)胞免疫和體液免疫。
實(shí)施例6 免疫血清中和病毒、抗感染作用1.上皮細(xì)胞對(duì)VLP的吸附攝入與免疫血清的阻斷作用研究資料表明乳頭瘤病毒結(jié)構(gòu)基因表達(dá)產(chǎn)物裝配成的VLP可吸附于宿主敏感細(xì)胞并被吞入至胞漿內(nèi)。VLP的這一特性為研究VLP與細(xì)胞之間的相互作用提供了方便，同時(shí)為研究相應(yīng)抗體的中和作用也提供了一種有效的手段。本實(shí)施例以人胚上皮細(xì)胞為靶細(xì)胞，檢測(cè)了前述實(shí)施例制備的VLP與其受體間的相互作用，激光共聚焦掃描顯微鏡觀察結(jié)果如圖15所示，當(dāng)VLP不與免疫血清孵育可見細(xì)胞漿內(nèi)熒光染色陽性，說明VLP可被吸附并進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，在實(shí)驗(yàn)條件下，細(xì)胞吸附與內(nèi)吞L1-VLP與L1+L2-VLP的能力未見明顯差異。VLP預(yù)先與免疫血清作用后，就不能有效地被細(xì)胞攝入，說明免疫血清具有中和作用，阻斷了VLP對(duì)細(xì)胞的吸附，進(jìn)而阻斷了細(xì)胞對(duì)VLP的攝入。這在細(xì)胞水平上提示免疫血清具有中和病毒、阻斷感染的作用。
免疫血清在裸鼠異源組織移植模型中的抗感染作用裸鼠異源組織移植模型是由Kreider等人建立的HPV感染試驗(yàn)?zāi)Ｐ?Kreider J W，et al.Nature，1985，317(6038)639-641.)。HPV體外感染人上皮組織后，將感染的組織塊移植于無胸腺小鼠腎包膜下培養(yǎng)，HPV可以復(fù)制擴(kuò)增，并引起感染組織發(fā)生增生病變。在裸鼠異源組織移植模型中，直接評(píng)估了VLP免疫血清的抗HPV感染能力。從新鮮的尖銳濕疣活檢標(biāo)本制備HPV懸液，與血清孵育后，用其感染新鮮的人包皮上皮組織塊(1×1mm)，將組織塊移植入裸鼠腎包膜下，通過小鼠體內(nèi)培養(yǎng)，飼養(yǎng)至第102天時(shí)取出移植物，發(fā)現(xiàn)對(duì)照血清(未免疫小鼠)處理過的病毒的感染移植物直徑由移植前的1mm增至2-4mm，增厚，對(duì)腎實(shí)質(zhì)有一定侵入，硬度增加，表面有顆粒突起，呈菜花狀，而L1-VLP和L1+2-VLP免疫血清中和過的病毒的感染移植物未見上述變化，L1-VLP和L1+L2-VLP兩組免疫血清中和試驗(yàn)結(jié)果相似。取出移植物經(jīng)固定、包埋、切片、HE染色，進(jìn)行組織學(xué)鑒定，結(jié)果如圖16?？寡逯泻瓦^的病毒懸液感染的包皮組織具有正常上皮組織的分化特征(圖16A)，而未經(jīng)抗血清中和的HPV可以感染包皮，引起上皮角化不全(上皮分化不明顯)，發(fā)生增生性病變，棘層變厚，上部出現(xiàn)凹空細(xì)胞，呈HPV感染的典型癥狀(圖16B)。因此，組織學(xué)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，抗血清具有中和病毒，抑制病毒感染的作用。
實(shí)施例7 臨床檢測(cè)基于VLP抗原包被的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)用50μl包被液(磷酸鹽緩沖液PBS)將抗原適當(dāng)稀釋，使微量反應(yīng)板上每孔加樣50μl，37℃包被1h，再置于4℃包被過夜。傾去孔內(nèi)液體，用PBS洗滌兩次。隨后加5％脫脂奶粉-PBS 50μl/孔，室溫封閉30分鐘。加用1％脫脂奶粉-PBS稀釋的患者血清50μl/孔，37℃(或室溫)孵育1小時(shí)后用PBS洗5次。之后加入用1％脫脂奶粉-PBS 1/1000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠/兔IgG 50μl/孔，37℃(或室溫)孵育1小時(shí)。再次用PBS洗7次。洗滌后，每孔加新鮮配制的50μl底物液(2.43ml 0.1M檸檬酸+2.57ml 0.2M Na2HPO4+5ml H2O+4mg OPD+15μl 30％H2O2)，37℃避光顯色反應(yīng)5-15分鐘。最后每孔加50μl 2M H2SO450μl終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀于490nm波長(zhǎng)檢測(cè)每孔光密度值。結(jié)果判定，陰性對(duì)照OD＜0.2，按下式計(jì)算P/N值P/N＝(待檢孔OD-空白對(duì)照孔OD)/(陰性對(duì)照孔OD-空白對(duì)照孔OD)若P/N≥2.1，判為陽性；≤1.5判為陰性；1.5-2.1為可疑。
用上述方法，酶標(biāo)反應(yīng)板每孔加入50μl HPV-6b L1-L2 VLP(0.1-0.2μg，PBS稀釋)包被，對(duì)來自臨床明確診斷為尖銳濕疣患者的血清進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)陽性率為38％?；谏鲜隹乖贵w反應(yīng)原理，應(yīng)用制備的VLP或/和VLP抗體可以設(shè)計(jì)出多種檢測(cè)診斷方法，包括但不限于ELISA、RIA、快速試紙條檢測(cè)等方法。
權(quán)利要求
1.一種制備人乳頭瘤病毒的病毒樣顆粒的方法，所述方法包括如下步驟(a)分別將編碼所述病毒衣殼蛋白L1和L2的基因克隆到桿狀病毒載體中，構(gòu)建重組桿狀病毒；(b)用所構(gòu)建的重組桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞，表達(dá)所述衣殼蛋白，形成病毒樣顆粒；和(c)純化所述病毒樣顆粒。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中在衣殼蛋白L1和L2編碼區(qū)起始密碼子前引入“AAT”序列，以利于桿狀病毒載體對(duì)外源基因的表達(dá)。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中用含L1基因的重組桿狀病毒和含L2基因的重組桿狀病毒同時(shí)感染昆蟲細(xì)胞時(shí)，含L1基因的重組桿狀病毒感染復(fù)數(shù)占二者總感染復(fù)數(shù)的比例在30％至100％。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述人乳頭瘤病毒選自人乳頭瘤病毒亞型6b、6a、11、16和18。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述人乳頭瘤病毒為亞型6b。
6.由權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法獲得的重組人乳頭瘤病毒的病毒樣顆粒。
7.如權(quán)利要求6的病毒樣顆?？乖目贵w。
8.包含權(quán)利要求6的病毒樣顆粒的疫苗。
9.一種診斷試劑盒，其包含權(quán)利要求6的病毒樣顆?；驒?quán)利要求7的抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用昆蟲細(xì)胞－桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備重組人乳頭瘤病毒的病毒樣顆粒(VLP)的方法，其中該病毒衣殼蛋白L2蛋白可以提高衣殼蛋白L1蛋白的表達(dá)量及病毒樣顆粒的產(chǎn)量。本發(fā)明還涉及制備的重組病毒樣顆粒在人乳頭瘤病毒疫苗研制和臨床檢測(cè)中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N7/01GK1498963SQ02149970
公開日2004年5月26日 申請(qǐng)日期2002年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月8日
發(fā)明者王淼, 宋國興, 王 淼 申請(qǐng)人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所