專利名稱：人的重組白細(xì)胞介素-18(rhIL-18)的酵母表達(dá)方法及其產(chǎn)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酵母基因工程領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及用基因工程化的酵母細(xì)胞表達(dá)白細(xì)胞介素-18(IL-18)，尤其是人的重組IL-18(rhIL-18)。
背景技術(shù)：
IL-18的來源1989年，Nakamura等從痤瘡丙酸桿菌和脂多糖(LPS)致內(nèi)毒素休克的小鼠血清中分離出一種類似IL-12的因子，分子量約為75kD，有誘導(dǎo)IFN-γ產(chǎn)生的活性。1995年Okamura等發(fā)現(xiàn)用痤瘡丙酸桿菌處理的小鼠再用抗CD3單克隆抗體刺激，可釋放高水平的IFN-γ。從腹腔注射痤瘡丙酸桿菌和LPS致內(nèi)毒素休克的小鼠肝提取物中發(fā)現(xiàn)了一種均一的多肽，分子量為18.3kD，等電點為4.8，由157個氨基酸殘基組成；因其可誘導(dǎo)IFN-γ的產(chǎn)生，稱之為γ干擾素誘生因子(IGIF)。隨著IGIF-cDNA的克隆成功，對該蛋白質(zhì)的研究更加深入。由于IGIF有著與IL-1家族類似的結(jié)構(gòu)同源性，有人稱之為IL-1γ，但它與IL-1家族無任何功能上的相似。相反，IGIF與IL-12在功能上有相似之處，且在IFN-γ的誘生上兩者有協(xié)同效應(yīng)，但兩者的分泌途徑卻各不相同。基于IGIF功能上的多效性，Ushio等建議將其命名為白細(xì)胞介素18(IL-18)。
IL-18的現(xiàn)有生產(chǎn)工藝目前在臨床試用的IL-18基因工程產(chǎn)物大都為大腸桿菌所表達(dá)(杜勇，王海濤人PBMC中IL-18基因的克隆及在E.coli中的高效表達(dá)與純化，免疫學(xué)雜志，第15卷，第4期，1999年10月)。大腸桿菌包含體表達(dá)的產(chǎn)物存在純化工藝復(fù)雜，復(fù)性困難等問題，尤其是復(fù)性后產(chǎn)物的活性僅有天然產(chǎn)物的30-40％，也就是僅僅有部分產(chǎn)物有活性。另一個方面是大腸桿菌包含體表達(dá)的產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)上與天然產(chǎn)物不同，其分子由于大腸桿菌翻譯過程的要求必須在N端加上一個甲硫氨酸(Met)。
另一種表達(dá)IL-18基因工程產(chǎn)物的方法是，通過中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞進(jìn)行分泌表達(dá)(成軍，柯亨寧等小鼠白細(xì)胞介素18的cDNA克隆及在真核細(xì)胞中初步表達(dá)的研究，中國免疫學(xué)雜志，第16卷，2000年)。這樣表達(dá)得到的IL-18有接近100％的天然蛋白活性，但是由于其成本等問題，目前在規(guī)模化產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)過程中還不能采用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種能得到活性較高的rhIL-18產(chǎn)物、并具有規(guī)模化產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用前景的方法，以克服現(xiàn)有大腸桿菌表達(dá)和CHO細(xì)胞表達(dá)的不足。
為此，本發(fā)明提供了一種用酵母工程細(xì)胞進(jìn)行IL-18表達(dá)的方法，包括在誘導(dǎo)IL-18基因表達(dá)的條件下培養(yǎng)含有IL-18基因的酵母細(xì)胞，并收獲表達(dá)產(chǎn)物。
更具體地，本發(fā)明利用酵母細(xì)胞表達(dá)IL-18的方法包括1)選擇適于大規(guī)模生產(chǎn)的酵母菌株作為宿主細(xì)胞；2)將IL-18目標(biāo)基因按照1)所選宿主細(xì)胞的偏好進(jìn)行密碼子優(yōu)化；3)將優(yōu)化后的目標(biāo)基因引入所述宿主細(xì)胞；4)誘導(dǎo)酵母宿主細(xì)胞中的目標(biāo)基因進(jìn)行表達(dá)。
在如3)所述將目標(biāo)基因引入宿主細(xì)胞時，為了提高成功引入的可能性，可以借助適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，優(yōu)選能使目標(biāo)基因在酵母細(xì)胞中進(jìn)行分泌表達(dá)的那些載體。為此，需要在將目標(biāo)基因引入宿主細(xì)胞之前，構(gòu)建目標(biāo)基因與表達(dá)載體的構(gòu)建體。從提高表達(dá)能力，即生產(chǎn)能力的方面考慮，可以使所述構(gòu)建體包含盡可能多拷貝的目標(biāo)基因。
為了保證表達(dá)產(chǎn)物的活性，可以將目標(biāo)基因連接在酵母的信號肽酶切位點之后。從而使得表達(dá)產(chǎn)物能被準(zhǔn)確酶切，得到與天然產(chǎn)物更為接近或完全相同活性的產(chǎn)物。
為了明確指示目標(biāo)基因已成功引入宿主細(xì)胞，可以使所述構(gòu)建體中的目標(biāo)基因與報道基因相連。常用的報道基因如抗藥性基因(如氨芐青霉素抗性基因，四環(huán)素抗性基因)，螢光素酶基因等。
本發(fā)明用于進(jìn)行表達(dá)的宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞，優(yōu)選糖酵母屬(Saccharomyces)和畢赤酵母屬(Picha)的細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及用于通過酵母表達(dá)生產(chǎn)IL-18的表達(dá)系統(tǒng)，它包括IL-18基因，以及適于在酵母細(xì)胞中表達(dá)的啟動子。在所述表達(dá)系統(tǒng)中，所述啟動子可以選自T3/T7啟動子，PHO1啟動子/AOX1啟動子中的一或多種。所述表達(dá)系統(tǒng)還可包含信號肽序列，以達(dá)到分泌表達(dá)的目的。該信號肽序列可與目標(biāo)基因直接相連，也可通過本領(lǐng)域常用的其它接頭序列相連。所述表達(dá)系統(tǒng)可以是一種質(zhì)粒，優(yōu)選pYE3載體。
本發(fā)明還包括用這種方法得到的IL-18產(chǎn)物。


圖1是表達(dá)載體的模式圖，該載體用于在酵母細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明所述的重組IL-18。
圖2的序列是經(jīng)過酵母偏性密碼子優(yōu)化以后的目的基因序列。
圖3是IL-18表達(dá)產(chǎn)物的HPLC圖譜。
具體實施例方式
IL-18的鑒定特征Okamura等從內(nèi)毒素休克的小鼠肝中提純出IL-18，經(jīng)胰蛋白酶消化后獲得多肽片斷，根據(jù)其氨基酸序列合成了一段核苷酸作為引物，從肝臟mRNA中用反轉(zhuǎn)錄法克隆出cDNA片斷，繼而以該片斷為探針從cDNA文庫中篩選，獲得一個編碼192個氨基酸前體多肽的基因，全長約0.9kb。該多肽包括一個不常見的含35個氨基酸的前導(dǎo)序列，沒有N-糖基化位點，推測的序列中也不包含有任何疏水的信號肽。重組的IL-18經(jīng)層析柱純化，SDS-PAGE顯示其分子量為18～19kD，以單體形式表現(xiàn)生物學(xué)活性。Ushio等用鼠IL-18的cDNA做探針，從正常人的肝cDNA文庫中分離出人IL-18的cDNA克隆。該cDNA克隆有一個大的開放讀碼框，長度約1.1kb，編碼一個193個氨基酸的前體多肽。經(jīng)分析，它與鼠的IL-18在氨基酸水平和核苷酸水平上均有65％的同源性。預(yù)測的人IL-18的氨基酸序列中也沒有疏水的信號肽位點，同樣它也不含有N-糖基化位點。目前普遍認(rèn)為193個氨基酸的人IL-18的裂解位點是36Asp-37Tyr，成熟的IL-18的長度為157個氨基酸。它們的分子中沒有N-糖基化位點，不存在二硫鍵，很可能巰基(-SH)就是分子的活性中心。我們通過中國人的基因家族分析，發(fā)現(xiàn)了結(jié)構(gòu)域基本相似的多個其他IL-18亞型，具有系統(tǒng)的生物學(xué)活性。
IL-18的生物學(xué)作用1)誘導(dǎo)Th1細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ。體外實驗發(fā)現(xiàn)，用抗CD3單抗刺激T細(xì)胞后，單獨加入IL-18或IL-12均可促進(jìn)IFN-γ的產(chǎn)生；當(dāng)IL-18與IL-12共同加入后，產(chǎn)生的IFN-γ可以達(dá)到非常高的水平。這表明IL-18和IL-12在誘導(dǎo)IFN-γ的產(chǎn)生上有協(xié)同效應(yīng)。此外，在二者的協(xié)同效應(yīng)中，IL-12主要是誘導(dǎo)原始T細(xì)胞分化為Th1細(xì)胞，而IL-18作為一種激活因子作用于Th1細(xì)胞，促進(jìn)IFN-γ的產(chǎn)生。
2)促進(jìn)T細(xì)胞增殖。在體外實驗中，以抗CD3單抗刺激的T細(xì)胞為對象，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-18的加入可促進(jìn)受刺激T細(xì)胞的增殖，促進(jìn)IL-2和GM-CSF在T細(xì)胞的表達(dá)，并且使T細(xì)胞表達(dá)的CD25(IL-2受體α鏈，是活化T細(xì)胞的標(biāo)志)達(dá)到最大程度。同時還觀察到，T細(xì)胞的增殖可以被抗IL-2中和抗體阻止，但不被抗IFN-γ的抗體阻止。這些結(jié)果提示，IL-18促進(jìn)T細(xì)胞增殖的作用為IL-2依賴性，進(jìn)而增強Th1細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的能力。為了觀察IL-12和IL-18在產(chǎn)生細(xì)胞因子上是否有協(xié)同效應(yīng)，向抗CD3單抗激活的T細(xì)胞中加入IL-12和IL-18，未觀察到兩者在IL-2和GM-CSF產(chǎn)生上的協(xié)同性，僅在IFN-γ的產(chǎn)生上有協(xié)同效應(yīng)。
3)加強FasL介導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)，鼠IL-18可以選擇性地激活FasL介導(dǎo)的鼠Th1細(xì)胞，而非Th2或Th0細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)。體外培養(yǎng)Th0、Th1、Th2細(xì)胞，加入抗原和抗原提呈細(xì)胞，用FasL特異的引物進(jìn)行PCR擴增，檢測FasL的表達(dá)情況，結(jié)果只有Th0和Th1細(xì)胞表達(dá)了FasLmRNA。進(jìn)一步用鼠Fas轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系A(chǔ)-1及其母細(xì)胞系L5178Y作靶細(xì)胞，檢測FasL的功能活性，發(fā)現(xiàn)IL-18單獨作用就可加強Th1細(xì)胞對A-1的細(xì)胞毒效應(yīng)，而當(dāng)IL-18和抗CD3單抗共同作用時，這種細(xì)胞毒效應(yīng)被加強，但上述因素對L5178Y細(xì)胞均無作用。同樣的實驗在Th0和Th2細(xì)胞中也沒有觀察到細(xì)胞毒效應(yīng)。這表明Th1細(xì)胞細(xì)胞毒效應(yīng)是通過Fas而進(jìn)行的。這個結(jié)論以后在Jurkat(人或鼠系統(tǒng)中Fas依賴的細(xì)胞毒效應(yīng)的靶細(xì)胞)中被確證。抗體中和實驗證明，這種細(xì)胞毒效應(yīng)不是由內(nèi)源性IL-18誘生的IFN-γ所介導(dǎo)。所有這些都有力地證明，IL-18可直接增強FasL介導(dǎo)的Th1細(xì)胞毒效應(yīng)。
4)與IL-12共同作用誘導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ?？笴D40抗體刺激的B細(xì)胞加入IL-12和IL-18，可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量IFN-γ的mRNA和蛋白。而抗CD40抗體單獨刺激B細(xì)胞或加入IL-12和IL-18中的任何一個，卻幾乎檢測不到IFN-γ的mRNA和蛋白。體內(nèi)實驗表明，IL-12和IL-18共同作用可誘導(dǎo)IFN-γ產(chǎn)生，抑制IgE產(chǎn)生，而加入抗IFN-γ抗體后，發(fā)現(xiàn)IgE產(chǎn)生增加。B細(xì)胞經(jīng)CD40活化后，在IL-12和IL-18的共同刺激下，可發(fā)育成IFN-γ產(chǎn)生細(xì)胞，進(jìn)而產(chǎn)生IFN-γ，并因此而抑制IgE和IgG1的產(chǎn)生，且在不抑制B細(xì)胞增殖的條件下增強IgG2a的產(chǎn)生。
IL-18的抗腫瘤作用是目前IL-18在基礎(chǔ)和臨床上研究得較多的應(yīng)用。Osaki等在實驗中證實IL-18能抑制各種腫瘤細(xì)胞株的生長，如黑色素瘤、纖維肉瘤等。如在腫瘤細(xì)胞移植前用IL-18能抑制腫瘤細(xì)胞株的建立。IL-18的抗腫瘤效果是由NK細(xì)胞和CD4+細(xì)胞所介導(dǎo)。Micallet等亦證實在腫瘤移植前用IL-18預(yù)處理，至少90％的鼠存活期延長，這種效果可因消除NK細(xì)胞活性而消除。IL-18的抗腫瘤活性也需IFN-γ參與。但Yashida等將IL-12，IL-15，IL-18的基因通過逆轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)入人胰腺癌細(xì)胞(AsPC-1)，然后接種于裸鼠，發(fā)現(xiàn)有IL-12及IL-15表達(dá)的AsPC-1細(xì)胞與未轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞相比較生長緩慢，但I(xiàn)L-18表達(dá)的AsPC-1細(xì)胞并未顯示任何抗腫瘤作用，轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞腫瘤生長與野生型細(xì)胞相同。由此可見，上述IL-12，IL-15及IL-18對非T細(xì)胞的分化作用可以在裸鼠上產(chǎn)生不同的抗腫瘤作用，雖然它們都刺激Th1型T輔助細(xì)胞。IL-18與IL-12作為IFN-γ的共刺激因子有相同的生物活性。已證實IL-12除能誘導(dǎo)IFN-γ外，也能提高NK細(xì)胞活性及促進(jìn)T細(xì)胞增殖，因此二者在功能上有協(xié)同性，但在結(jié)構(gòu)上卻無同質(zhì)性。IL-12由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生，由P35和P40兩亞單位組成。IL-12可使CD4+T細(xì)胞、NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，IL-12通過淋巴細(xì)胞和非淋巴細(xì)胞改變宿主-腫瘤關(guān)系。通過CD4-T細(xì)胞的Th1亞單位的分化提高細(xì)胞免疫，上調(diào)MHC抗原表達(dá)并分泌IL-2和IFN-γ。這些細(xì)胞因子促進(jìn)或激活CD8-細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)、NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，這些細(xì)胞均與腫瘤消退有關(guān)。又因IFN-γ能提高抗原-非特異性免疫反應(yīng)，包括直接與TNF-α結(jié)合時產(chǎn)生的細(xì)胞毒性使細(xì)胞增殖減慢，產(chǎn)生一氧化氮及抑制腫瘤血管形成，特別是通過抑制腫瘤血管形成，IL-12可激活多種抗腫瘤機制。雖然IL-18的抗腫瘤作用是由于IL-12的協(xié)同作用使IFN-γ含量升高所致，但需要指出的是IL-18與IL-12作為IFN-γ共刺激因子時它們的受體和信號傳遞途徑不同。同時IL-18的抗腫瘤效果不依賴IFN-γ或IL-12，而IL-12的抗瘤效果依賴IFN-γ。故IL-18用于治療腫瘤的可能性是存在的。
在其他應(yīng)用方面，IL-18有多種生物學(xué)功能，如誘導(dǎo)Th1細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ；增強NK細(xì)胞的活性；增強FasL介導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)；通過IFN-γ的產(chǎn)生調(diào)節(jié)免疫球蛋白的產(chǎn)生；促進(jìn)IL-2和GM-CSF的產(chǎn)生等。這預(yù)示著IL-18是一種具有廣泛應(yīng)用的細(xì)胞因子，可能在抗微生物、抗自身免疫疾病等方面得到應(yīng)用。早期研究表明，痤瘡丙酸桿菌和LPS可引發(fā)小鼠的嚴(yán)重肝損傷，在無胸腺的裸鼠中加入IL-18抗血清可阻止肝損傷，并使血清GOT和GPT水平恢復(fù)正常，這說明IL-18可參與抗炎癥反應(yīng)。進(jìn)一步研究表明，內(nèi)毒素刺激可激活細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，誘發(fā)IL-18的產(chǎn)生，從而誘導(dǎo)IFN-γ、TNF-α的產(chǎn)生，增強FasL介導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)?？笽L-18抗體可保護(hù)肝不受損傷，表明IL-18在這一全身性炎癥反應(yīng)中起著核心作用。弄清楚IL-18在炎癥反應(yīng)中的具體作用環(huán)節(jié)，對于臨床上治療和預(yù)防炎癥反應(yīng)有極大意義。最近的研究表明，小鼠表皮角質(zhì)化細(xì)胞也是IL-18來源之一。IL-18可能作為表皮T細(xì)胞的共生長因子，表達(dá)一種限制性的γδT細(xì)胞。雖然它的功能未知，但其它表皮細(xì)胞生長因子，如IL-7、IL-15等，已被證明是γδT細(xì)胞增殖的誘導(dǎo)因子；IL-18有可能在這些細(xì)胞的分化過程中發(fā)揮作用。IL-18的發(fā)現(xiàn)、克隆和生物學(xué)活性的確認(rèn)，尤其是發(fā)現(xiàn)它具有誘導(dǎo)Th1細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ、增強NK細(xì)胞活性、增強FasL介導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)等功能。
針對腫瘤的免疫反應(yīng)主要依靠Th1淋巴細(xì)胞，TH1細(xì)胞應(yīng)答包括分泌細(xì)胞因子IL-2/IL-12/IL-18以及IFN-gama，以及產(chǎn)生特異的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞識別特異的腫瘤抗原。TH1反應(yīng)還是機體防御多種微生物的主要機制。
IL-18可以作為抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的輔助藥物。在研究模型中，其主要是通過激活NK細(xì)胞和產(chǎn)生IFN-gama，但是在這些臨床治療實驗中，IL-18產(chǎn)生的毒副作用不容忽視，正是這些毒副作用可能影響其全身給藥使用。因為在腫瘤細(xì)胞表面或抗原提呈細(xì)胞表面的表達(dá)只是一種局部作用，沒有全身作用。并且IL-18還有被血液中的IL-18結(jié)合蛋白(IL-18BP)中和的問題，IL-18BP對其親和力高(400pM)，并且在血液中濃度高，比IL-18的摩爾濃度高出20倍，推測其功能是在感染后盡量使TH1細(xì)胞應(yīng)答控制在低水平，以防止自體免疫疾病的發(fā)生。而在有些腫瘤細(xì)胞能產(chǎn)生IL-18BP以抑制機體的免疫反應(yīng)。
由于IL-18在臨床上使用的前景，其功能與TH1淋巴細(xì)胞的抗腫瘤、抗微生物功能相關(guān)，所以受到人們的關(guān)注。
材料所有引物由上海生工公司合成上游引物例1tcatttggcaagcttgaatct(序列2)上游引物例2tactttggcaagcttgaatctaaat(序列3)下游引物例1gtcttcgctttgaacagtga(序列4)下游引物例2gtcttcgctttgaacagtgaacat(序列5)RT-PCR采用GIBCOBRL公司的SuperScript IITM(cat#18089-011；Lot#1072465)反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，采用TAKARA公司的Ex Taq酶(cat#DRR001A)進(jìn)行PCR反應(yīng)。
菌株GS115/KM71/購自Invitrogen公司。
菌株XL-1Blue購自CLONTECH公司。
制備方法表達(dá)載體構(gòu)建設(shè)計大腸桿菌-酵母穿梭載體作為表達(dá)載體pYE3。該載體中包含大腸桿菌的復(fù)制信號，AMP/NEO抗性基因，T3/T7啟動子，PHO1啟動子/AOX1啟動子，α因子信號肽序列，增強子序列，PHO1基因的3’非翻譯序列等(圖1)。
目的基因的獲取提取中國人血淋巴細(xì)胞的mRNA，采用特異性引物(如序列2或3，序列4或5)進(jìn)行RT-PCR擴增，將得到的產(chǎn)物克隆到pMD18-T(#D504CA，TAKARA)載體中，篩選出陽性克隆并進(jìn)行測序。
基因序列的優(yōu)化得到的IL-18mut(甲醇利用陽性，methanol utilization plus)基因序列，可按照文獻(xiàn)所述(Wright F.Gene 1990 Mar 1；87(1)23-9；Zhang等，Gene(1991)105，61-72；XH Xia.(1998)Genetics，14937-44)進(jìn)行酵母偏性密碼子優(yōu)化我們得到如下序列tactttggtaagttagcatctaaattatcagtcattagaaatttgaatgaccaagttttattcattgaccaaggtaatagacctttatttgaagatatgactgattctgactgtagagataatgcaccaagaaccatttttattatttctatgtatgcagattctcaacctagaggtatggctgttactatctctgttaagtgtgaaaaaatttcaactttatcctgtgaaaacaaaattatttcctttaaggaaatgaatcctcctgataacatcaaggatacaaaatctgacatcattttctttcaaagatctgtcccaggtcatgataataagatgcaatttgaatcttcatcatacgaaggttactttttagcttgtgaaaaagaaagagacttatttaaattaattttgaaaaaagaagatgaattgggtgatagatctattatgttcactgttcaaaacgaagactgatag(序列1)設(shè)計拼接寡核苷酸序列合成以上序列，測序得到所要求產(chǎn)物后，克隆到表達(dá)載體。
合成的目的基因用Xba I/EcoR I酶切克隆到酵母表達(dá)載體pYE3(圖1)上，轉(zhuǎn)化到XL-1 BLUE大腸桿菌中，挑選陽性克隆，并且進(jìn)行質(zhì)粒擴增。
宿主細(xì)胞宿主細(xì)胞采用畢赤酵母的GS115菌株，以電轉(zhuǎn)化把線性化的基因序列轉(zhuǎn)到酵母細(xì)胞中，再用YPD-G418平板(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，1.5％瓊脂，100mg/ml來自Life Technologies，Inc.的G418)篩選出陽性克隆，進(jìn)一步用高濃度G418抗性平板篩選出多拷貝整合菌株。
表1 YPD-G418平板中的G418濃度G418終濃度(mg/ml) ml G418原液/250ml YPD0.250.6250.501.250.751.8751.002.51.503.751.754.3752.005.03.007.54.0010.0
純化方法工程菌培養(yǎng)與上清收集設(shè)定發(fā)酵溫度30℃，利用全自動發(fā)酵罐(BiostatC，B.BraunBiotech)進(jìn)行發(fā)酵。根據(jù)需要進(jìn)行培養(yǎng)基成分添加，待甘油耗盡后(OD6001-10)，進(jìn)入甲醇誘導(dǎo)階段。在誘導(dǎo)階段，將pH控制在3.5-7.5的范圍內(nèi)，溶氧量控制在10-30％的范圍內(nèi)。整個發(fā)酵時間視工程菌生長情況確定。培養(yǎng)結(jié)束后離心法收集發(fā)酵上清液。發(fā)酵液預(yù)處理利用Pellicon超濾系統(tǒng)(美國Millipore公司)的孔徑為5000的超濾膜堆，以5∶1的比例，用20mmol/LTris HCl(pH80)緩沖液對發(fā)酵上清進(jìn)行超濾脫鹽處理，使最終發(fā)酵上清的電導(dǎo)小于5mS cm。rhIL-18的純化采用的層析系統(tǒng)為AKTApurifier(瑞典Pharmacia公司)。發(fā)酵上清先經(jīng)SPSepharoseFF柱層析純化。柱子先用20mmol LTris HCl(pH80)平衡，經(jīng)預(yù)處理的發(fā)酵上清液直接上樣后，用NaCl梯度洗脫(洗脫液為20mM NaAc，0.5M NaCl，pH6.6，分40％、70％、10％，三個梯度，所述梯度為NaCl/NaAc)。收集rhIL-18目標(biāo)峰，再加入固體硫酸銨至20mol/L，加載至PhenylSephrose HP柱，用20-0mol/L硫酸銨梯度洗脫。收集目標(biāo)峰后，再上經(jīng)5mmol L磷酸緩沖液(pH7.0)平衡的SephadexG25柱脫鹽獲得純化終產(chǎn)品。
從純化工藝上來看，畢赤酵母和釀酒酵母的表達(dá)上清中雜蛋白含量很低(參見圖3)，所以減低了純化難度，降低了純化成本；從表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)上來看，把酵母的信號肽酶切割位點直接設(shè)計在成熟肽的前面，試驗證明酵母細(xì)胞能準(zhǔn)確識別該位點，所以能得到結(jié)構(gòu)和天然蛋白完全一致的產(chǎn)物，減少了臨床用藥過程中產(chǎn)生抗體，從而降低藥效的可能性；另一方面，酵母分泌的IL-18，其活性接近天然蛋白，活性比大腸桿菌包涵體產(chǎn)物提高一倍以上，并且酵母發(fā)酵生產(chǎn)成本低，適合大規(guī)模生產(chǎn)，經(jīng)初步表達(dá)結(jié)果表明IL-18的表達(dá)量在500mg/L左右。
實施例分泌表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建同時用EcoR I和Xba I雙酶切拼接產(chǎn)物克隆載體pMD18T-IL18和酵母分泌表達(dá)載體pPICZαA，瓊脂糖凝膠電泳分離片段，回收613bp的chIL18基因片段；乙醇沉淀純化回收3.5kb的載體DNA片段。然后在T4DNA連接酶(2.5單位/μl，含ATP的10X連接緩沖液，TAKARA CO.#2011A CA)的作用下，將基因片段與載體相連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌宿主細(xì)胞TOP10F’(Invitrogen)。經(jīng)Zeocin抗性平板篩選，對陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR鑒定，篩選可擴增出613bp DNA片段的陽性克隆。任選其中兩株，小量提取質(zhì)粒，進(jìn)行進(jìn)一步的酶切鑒定。
質(zhì)粒的大量提取用QIAgen試劑盒提質(zhì)粒時，按照試劑盒說明書進(jìn)行，簡述如下從固體培養(yǎng)基上挑取單個菌落接種于3-5ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基(5g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，10g/L NaCl，pH7.0)中，37℃振搖過夜培養(yǎng)活化菌種；再按0.2-0.5％同前接種、培養(yǎng)100mL菌體；6000g 4℃15分鐘離心收集菌體(約濕重0.3克)，沉淀重懸于10mL P1溶液中，混懸后加入10mL P2，冰浴5min，再加入10mL P3，冰浴20min，20,000rpm 4℃10min，離心2次；同時用10mLQBT預(yù)平衡質(zhì)粒純化柱，將離心后的上清加到平衡好的純化柱上，讓質(zhì)粒與純化柱上的樹脂結(jié)合；待上清流出純化柱后，用QC洗滌純化柱2次，每次30mL，洗去樹脂上樣品中的雜質(zhì)；最后用15mLQF將質(zhì)粒從純化柱上洗脫下來，收集洗脫液，加入10.5mL異丙醇室溫沉淀10min，15,000rpm室溫離心30min，5mL 70％乙醇洗滌沉淀，吹干，沉淀重懸于適量滅菌水中(其中P1，P2，P3，QBT，QC，QF為試劑盒提供，也可自行配制。)化學(xué)法質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備挑取單個宿主菌GS115或KM71，接種于10mL YPD培養(yǎng)基中，28-30℃過夜培養(yǎng)。次日將培養(yǎng)的菌液稀釋至OD600為0.1-0.2，取10mL繼續(xù)培養(yǎng)4-6小時。使OD600為0.6-1.0，500g，5分鐘，室溫離心收集菌體，沉淀重懸于10mL溶液I中，同上離心，沉淀重懸于1mL溶液I中，即得酵母菌感受態(tài)細(xì)胞。制備好的感受態(tài)細(xì)胞可分裝成50-200μL的小份，迅速凍存于-70℃保存，反復(fù)凍融也不會明顯地改變其轉(zhuǎn)化效率。
轉(zhuǎn)化取50μL感受態(tài)細(xì)胞，加入3μg線性化的DNA，再加入1mL溶液II，振蕩混勻，30℃放置1小時，并且每15分鐘搖動混合一次；42℃，10分鐘，熱激活；將轉(zhuǎn)化液分成兩管，每管中加入1mL YPD，30℃放置1小時；3000g室溫離心5分鐘，收集沉淀，沉淀重懸于500μL溶液III中，并將轉(zhuǎn)化液合并成一管；同上離心，沉淀重懸于100-150μL溶液III中；將轉(zhuǎn)化液涂布于YPDs平板上，30℃倒置培養(yǎng)2-4天待轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。
電擊轉(zhuǎn)化法感受態(tài)細(xì)胞的制備接種宿主菌GS115或KM71于5mL YPD培養(yǎng)基中，30℃過夜培養(yǎng)；次日以0.02-0.1％的比例接種于200mL YPD中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600為1.2-1.5；1500g 4℃離心5分鐘，收集菌體，分別用200mL、100mL用冰預(yù)冷的滅菌水和8mL用冰預(yù)冷的1mol/L山梨醇溶液洗滌沉淀，最后將沉淀重懸于0.4mL用冰預(yù)冷的1mol/L山梨醇溶液中，即得感受態(tài)細(xì)胞。制備好的感受態(tài)細(xì)胞始終置于冰上，當(dāng)天使用，不能保存。
轉(zhuǎn)化取80μL感受態(tài)細(xì)胞，加入5-10μg線性化的DNA(溶于5-10μL滅菌水中)，混勻，加到預(yù)冷的0.2cm電擊杯中；冰浴5分鐘；選取電壓400V，電容20μF，電阻200Ω，時間5-10ms，電擊；電擊后迅速加入1mL用冰預(yù)冷的1mol/L山梨醇溶，30℃靜置1-2小時；每份10-200μL涂布于YPDs平板上，30℃倒置培養(yǎng)2-4天待轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。
酵母重組子的篩選直接PCR篩選法模板的制備挑取單個菌落，于YPD培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，次日取10μL，加到1.5mL離心管中，加入5μL的5U/μL裂解酶，30℃溫浴10分鐘；再將樣品于-70℃中凍10分鐘；隨后取5μL作為細(xì)胞裂解物模板。
PCR反應(yīng)按照第一部分“標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系加入Taq酶和底物。反應(yīng)程序為95℃1分鐘變性，54℃1分鐘退火，72℃1分鐘延伸，共30個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果。
營養(yǎng)表型的確定用滅菌牙簽挑取單個克隆，按照先MMH(添加了甲醇和組氨酸的基本培養(yǎng)基，MinimalMethanol+Histidine)平板后MDH(添加了組氨酸的基本葡萄糖培養(yǎng)基，MinimalDextrose Medium+Histidine)平板的順序平行點板，以GS115/白蛋白(Albumin)為Muts(甲醇利用緩慢，Mehanol Utilization Slow)對照，以GS115/pPICZ/lacZ為Mut+(甲醇利用陽性，Methanol Utilization Plus)對照。點好的平板于30℃溫箱內(nèi)倒置培養(yǎng)2天，觀察、分析結(jié)果。
雙層濾膜篩選法將經(jīng)PCR鑒定確有VEGF基因整合的重組子點在滅菌的醋酸纖維素薄膜上，于豐富培養(yǎng)基BMGY平板上培養(yǎng)40小時，將此醋酸纖維素薄膜重疊放在滅菌的硝酸纖維素薄膜上，于誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMMY平板上誘導(dǎo)培養(yǎng)60-72小時，取下硝酸纖維素薄膜，進(jìn)行免疫印跡分析。免疫印跡的方法參見Current Protocol in Protein Science，chapter 10，Unit 10.10ImmunoblotDetection。
酵母菌的誘導(dǎo)表達(dá)Mut+表型的誘導(dǎo)表達(dá)將單個克隆接種于25mL BMGY培養(yǎng)基(緩沖型甘油復(fù)合培養(yǎng)基，Buffered Glycerol-complex Medium)中，28-30℃培養(yǎng)16-18小時，使OD600為2-6，此時的酵母菌正處于對數(shù)生長期；1500-3000g室溫離心收集菌體，用BMMY培養(yǎng)基(緩沖型甲醇復(fù)合培養(yǎng)基，Buffered Methanol-complex Medium)重懸菌體沉淀，使OD600為1.0；在通氣良好的搖瓶中28-30℃培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速應(yīng)在250rpm以上；每天補加100％甲醇，使其終濃度為0.5％；誘導(dǎo)后每12小時取樣1mL，-70℃保存，最后進(jìn)行SDS-PAGE分析。以GS115/白蛋白為分泌表達(dá)的陽性對照，以GS115宿主菌為空白對照。
Muts表型的誘導(dǎo)表達(dá)將單個克隆接種于100mL BMGY培養(yǎng)基中，28-30℃培養(yǎng)16-18小時，使OD600為2-6，此時酵母菌正處于對數(shù)生長期；1500-3000g室溫離心收集菌體，用BMMY培養(yǎng)基重懸菌體沉淀，使OD600為1.0；在通氣良好的搖瓶中28-30℃培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速應(yīng)在250rpm以上；每天補加100％甲醇，使其終濃度為0.5％；
誘導(dǎo)后每24小時取樣1mL，-70℃保存，最后SDS-PAGE分析。以GS115/白蛋白為分泌表達(dá)的陽性對照，以KM71宿主菌為空白對照。
IL-18活性的測定1)IL-18標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成10U/ml；2)分離PBMC；用完全RPMI1640-10％FCS培養(yǎng)基配成106細(xì)胞/ml，分成若干份，對應(yīng)rhIL-18表達(dá)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品。然后在已稀釋好的96孔板中每孔加入細(xì)胞100μl，37℃5％CO2孵箱培養(yǎng)48小時。收集細(xì)胞上清，用ELISA測定IFN-γ含量。
表2 IL-18活性的測定濃度刺激產(chǎn)生IFN-γ活性(IU/mL)酵母分泌重組IL-18 2nM 450標(biāo)準(zhǔn)品 2nM 500陰性對照 - 0
序列表<110>華特森基因科技有限公司<120>人的重組白細(xì)胞介素-18(rhIL-18)的酵母表達(dá)方法及其產(chǎn)物<130>PJPY5575N<141>2002-11-06<160>5<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>477<212>DNA<213>人<400>1tactttggta agttagcatc taaattatca gtcattagaa atttgaatga ccaagtttta60ttcattgacc aaggtaatag acctttattt gaagatatga ctgattctga ctgtagagat 120aatgcaccaa gaaccatttt tattatttct atgtatgcag attctcaacc tagaggtatg 180gctgttacta tctctgttaa gtgtgaaaaa atttcaactt tatcctgtga aaacaaaatt 240atttccttta aggaaatgaa tcctcctgat aacatcaagg atacaaaatc tgacatcatt 300ttctttcaaa gatctgtccc aggtcatgat aataagatgc aatttgaatc ttcatcatac 360gaaggttact ttttagcttg tgaaaaagaa agagacttat ttaaattaat tttgaaaaaa 420gaagatgaat tgggtgatag atctattatg ttcactgttc aaaacgaaga ctgatag 477<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>2ttcatttggc aagcttgaat ct 22<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>3
tactttggca agcttgaatc taaat 25<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>4gtcttcgctt tgaacagtga 20<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>5gtcttcgctt tgaacagtga acat 2權(quán)利要求
1.利用酵母表達(dá)來生產(chǎn)白細(xì)胞介素18(IL-18)的方法，包括在誘導(dǎo)IL-18基因表達(dá)的條件下培養(yǎng)含有IL-18基因的酵母細(xì)胞，并收獲表達(dá)產(chǎn)物。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述IL-18基因的表達(dá)為分泌型表達(dá)。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述IL-18基因連接在酵母的信號肽酶切位點之后。
4.權(quán)利要求1-3中任一項的方法，其中所述酵母細(xì)胞是畢赤酵母或釀酒酵母。
5.權(quán)利要求1-4中任一項的方法，還包括將所述IL-18基因?qū)虢湍杆拗骷?xì)胞的步驟，和/或?qū)Ρ磉_(dá)產(chǎn)物純化的步驟。
6.權(quán)利要求1-5中任一項的方法，其中所述IL-18基因來源于人類。
7.用于通過酵母表達(dá)生產(chǎn)IL-18的表達(dá)系統(tǒng)，包括IL-18基因，以及適于在酵母細(xì)胞中表達(dá)的啟動子。
8.權(quán)利要求7的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述啟動子選自T3/T7啟動子，PHO1啟動子/AOX1啟動子中的一或多種。
9.權(quán)利要求7的表達(dá)系統(tǒng)，還包含信號肽序列。
10.權(quán)利要求1-9中任一項的表達(dá)系統(tǒng)，為一種質(zhì)粒。
全文摘要
本發(fā)明公開了通過酵母的表達(dá)來生產(chǎn)IL－18的方法，它是利用基因工程手段將編碼IL－18的基因?qū)虢湍讣?xì)胞，然后在誘導(dǎo)IL－18表達(dá)的條件下培養(yǎng)酵母細(xì)胞，最終收獲表達(dá)產(chǎn)物。利用酵母表達(dá)IL－18有利于表達(dá)產(chǎn)物的純化，可得到與天然蛋白結(jié)構(gòu)完全一致的產(chǎn)物。
文檔編號C12N15/12GK1498971SQ0214981
公開日2004年5月26日 申請日期2002年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月6日
發(fā)明者鄭海發(fā) 申請人:北京華特森基因科技有限公司