專利名稱：可吸收煅燒骨的制備方法
技術領域：
本發(fā)明可吸收煅燒骨的制備方法是一種可吸收雙相煅燒骨的制備、涂層及細胞復合法，涉及一種鈣磷陶瓷生物材料和骨組織工程的支架。
人工合成的生物陶瓷往往因孔隙間的交通不足而影響骨組織進入材料深部。煅燒骨的孔隙與松質骨有相似的結構，有良好的孔與孔之間的交通，有利于成骨細胞、血管的長入，具有良好的傳導成骨作用。傳統方法制作的煅燒骨主要由HAP組成，雖HAP能直接與新生骨結合，但在體內難以吸收，從而影響了新生骨的后期重塑，并影響其生物力學的強度。因此有必要將煅燒骨中HAP部分或完全轉化為β-TCP。
另外，未經表面改性的煅燒骨不利于細胞的貼附，材料表面改性的方法在文獻中有用纖維連接素、膠原等促進細胞與材料的貼附。傳統的方法單純用膠原溶液浸泡煅燒骨，晾干后使用，細胞貼附也不好，需對煅燒骨的表面膠原涂層方法進行改進。
材料與細胞的復合方法是組織工程的難點，表面的貼附效率和密度是復合中要解決的難題，文獻中有用纖維蛋白原等提高細胞在材料內部的聚集，材料和細胞的復合方法仍需改進。
本發(fā)明的目的可通過下述技術方案實現一種可吸收的雙相煅燒骨，可作為骨缺損的修復材料，HAP和β-TCP雙相煅燒骨其以成年牛椎體骨為原料，如使用內徑16-18mm的空心電鉆，鉆取椎體中心的松質骨，經處理后，通過浸漬(NH4)2HPO4溶液、經一次性煅燒和降低煅燒溫度，將煅燒骨中的HAP部分或完全轉化為β-TCP，其中煅燒溫度為900-1300℃。本發(fā)明原理是羥基磷灰石是骨的主要成分，當(NH4)2HPO4溶液(AP)液滲入牛煅燒骨(CBB)，其中的HPO42-離子加熱后濃縮成P2O74-，P2O74-能與CBB的HAP的OH-反應，產生PO43-離子。(NH4)2HPO4溶液的濃度和煅燒的次數、溫度及時間是決定β-TCP/HAP雙相煅燒骨成分、含量和結晶度的重要因素。通過降低煅燒溫度來降低結晶度，有利于材料的吸收。
在上述技術方案基礎上，制備四種多用的煅燒骨，其β-TCP/HAP比例分別是4/6、6/4、8/2和10/0時，(NH4)2HPO4溶液濃度分別是0.3M，0.6M，1.0M和1.2M。
在上述技術方案基礎上，對煅燒骨及多孔材料采用膠原凝膠表面涂層，2-4mg/ml的膠原溶液經對pH為3.0去離子水配置的稀鹽酸溶液在冷藏室內透析，涂層時與1/10體積的10倍濃度的PBS混合，37℃溫育1小時。其原理是膠原溶液交聯成凝膠，膠原纖維貼于煅燒骨孔隙表面，有利于細胞的貼附，并消除對細胞的毒性及對機體的免疫原性。
經過表面涂層處理的雙相煅燒骨可與細胞復合，細胞與煅燒骨及多孔材料的復合方法收集骨髓間充質干細胞，讓細胞懸液完全吸入材料內，培養(yǎng)箱中孵育2-5小時，加入含血清培養(yǎng)液，孵育3-8天后植入體內。解決了傳統的材料與細胞的復合方法存在的缺陷，即細胞丟失多，細胞活力差，細胞密度底，本發(fā)明所述的煅燒骨與細胞的復合方法，可提高細胞在材料內部的貼附效率、密度和活性。
具體煅燒骨的制備松質骨的來源取成年牛椎體或股骨頭及股骨下端，用內徑16-18mm的空心電鉆鉆取椎體中心或股骨下端的松質骨。牛椎體松質骨內部孔隙呈縱形小管，小管之間有側孔相交通，抗壓強度比較高，本發(fā)明優(yōu)選椎體松質骨。股骨下端的松質骨的孔隙呈網狀，但骨小梁較纖細，抗壓強度較低。首先對原料預處理，目的是盡可能去除雜質、軟組織、脂肪和骨髓。流水沖洗，蒸餾水漂洗，去離子水煮沸5-12小時，最佳時間是10小時，高壓流水沖洗，去離子水漂洗2次，系列酒精脫水，烘干，溫度為50℃-70℃，4天；其次，進行初次煅燒在高溫爐中煅燒，800℃，3小時，升溫速率為5℃-10℃/分。該步驟可以省略，以簡化步驟；再次進行浸漬煅燒骨塊浸泡于(NH4)2HPO4溶液中24小時，去除多余液體，50℃-70℃烘干4天。制備四種多用的煅燒骨(β-TCP/HAP比例分別是4/6、6/4、8/2和10/0)時的(NH4)2HPO4溶液濃度分別是0.3M，0.6M，1.0M和1.2M。再次煅燒在高溫爐中900℃-1300℃，1-4小時，升溫速率為5℃/分，自然降溫。溫度過高鈣磷陶瓷的結晶度過高，材料不易吸收，最佳溫度是1000℃。流水沖洗，去離子水漂洗2次，50℃-70℃烘干4天，高溫消毒備用，

圖1β-TCP/HAP雙相可吸收煅燒骨。膠原表面涂層可溶性膠原溶液，可購自Cohesion公司的Vitrogen牌膠原或羅氏公司及Sigma公司的可溶性膠原，也可從豬、牛的真皮和肌腱中用3％的醋酸提取，4-6℃冷藏，pH2-4，濃度2-4mg/ml。透析可去除醋酸等對細胞有毒的物質，并有利于形成凝膠。取4-6℃冷藏可溶性膠原溶液，裝入透析袋，對去離子水配置的稀鹽酸溶液，pH為3.0，透析6-10天或以上，置于4-6℃冷藏室中，磁力攪拌，每100ml膠原溶液對1.5-2L的透析液，每兩天換液一次，共2-3次。臨用前從冰箱取出，與1/10體積的10倍濃度的PBS混合，立即將煅燒骨投入液中，抽真空，反復三次，或將混合液滴到煅燒骨上。37℃溫育0.5-2小時，使膠原形成凝膠，超凈臺內晾干，去離子水沖洗2次，超凈臺內晾干，環(huán)氧乙烷消毒，如圖2膠原表面涂層后的煅燒骨。
另一種涂層方法是用pH為3.0去離子水配置的稀鹽酸溶液調節(jié)膠原濃度為2mg/ml，用針頭濾器超濾消毒，4-6℃冷藏。用前取出，與1/10體積的10倍的不含NaCl的PBS混合，立即將高溫消毒過的煅燒骨投入液中，37℃溫育0.5-2小時，使膠原形成凝膠，放置于無菌培養(yǎng)皿內，打開蓋子，超凈臺內紫外線照射干燥，無菌容器包裝備用，可不需環(huán)氧乙烷消毒。上述兩種膠原表面涂層方法也適合于其他多孔材料的表面涂層。細胞與材料的復合方法培養(yǎng)并收集骨髓間充質干細胞(BMSC)，用含血清a-MEM制成0.5-5×107個/1ml細胞懸液，滴入煅燒骨中，或將煅燒骨投入懸液中，抽真空，一個大氣壓，每次10-20秒，間隔5-15秒，反復三次，讓細胞懸液完全吸入材料內。培養(yǎng)箱中孵育2-5小時，緩慢加入20-30ml含血清培養(yǎng)液，在37℃、5％CO2的條件下孵育3-8天后植入體內。該方法同樣適合其他多孔材料與細胞復合。
本發(fā)明的優(yōu)越性在于可吸收雙相煅燒骨可用于修復骨缺損、骨不連、脊柱融合，并可以作為骨髓基質干細胞及成骨細胞的載體，構建組織工程化人工骨，也可用此可吸收雙相煅燒骨作為BMP的緩釋載體修復骨缺損。經X線衍射分析加0.3M，0.6M，1.0M和1.2M的AP液組制備的三種煅燒骨出現典型的β-TCP的波型，其中β-TCP/HAP比例分別是4/6，6/4，8/2和10/0，其中4/6如圖3所示，X線衍射分析示浸漬AP液后的煅燒骨(中)出現典型的β-TCP和HAP的混合波型。掃描電鏡觀察雙相煅燒骨孔徑和孔隙率均與松質骨相似，孔徑約400-600μm，孔隙率約85％，均保留骨陷窩的結構，如圖4，掃描電鏡觀察示雙相煅燒骨孔徑約400-600μm，孔隙率約85％，孔隙間交通良好(40×)。超微結構觀察(2000-4000倍)見材料有蜂窩狀微孔。雙相煅燒骨比HAP煅燒骨孔隙率較高，微孔較大，約0.5-5μm，如圖5超微結構觀察見煅燒骨有蜂窩狀微孔。雙相煅燒骨比HAP煅燒骨孔隙率較高，微孔較大，約0.5-5μm(2000×)；生物力學測定β-TCP的存在對煅燒骨的力學性能無明顯影響，最大抗壓強度3.188±0.943，彈性模量85.327±21.534。細胞在材料表面的貼附能力掃描電鏡下可見細胞在材料表面貼附良好，細胞呈扁平的梭形、多邊形或多角形。表面涂層后，4小時細胞部分貼壁，24小時基本匯合；4天部分呈復層生長，如圖6，表面涂層的煅燒骨與細胞復合后4天，細胞部分呈復層生長(200×)；8天呈復層生長，如圖7，表面涂層的煅燒骨與細胞復合后8天，細胞呈復層生長(200×)；30天呈網狀完全長滿孔隙。復合后4-8天是植入的最佳時機。
裸鼠皮下誘導成骨試驗3周，煅燒骨加BMSC組可見煅燒骨表面有大量類骨質形成，以直接成骨為主，有少量軟骨內成骨，如圖8，裸鼠皮下誘導成骨試驗，復合BMSC的煅燒骨植入后3周，可見煅燒骨表面有大量類骨質形成(100×)。5周材料表面成熟骨痂明顯，與材料無明顯界限，見圖9，裸鼠皮下誘導成骨試驗5周，材料表面成熟骨痂明顯，與材料無明顯界限(100×)。本發(fā)明表明雙相煅燒骨與BMSC復合組織工程化人工骨有良好的誘導成骨作用，說明雙相煅燒骨是BMSC的良好的載體。
吸收時間6個月時β-TCP/HAP比例分別是4/6的吸收率約40％，1年時吸收60％。β-TCP/HAP比例分別是8/2的吸收率6個月約70％，1年時完全吸收，該比例符合骨折愈合的需要。
圖5超微結構觀察見煅燒骨有蜂窩狀微孔。雙相煅燒骨比HAP煅燒骨孔隙率較高，微孔較大，約0.5-5μm(2000×)圖6表面涂層的煅燒骨與細胞復合后4天，細胞部分呈復層生長(200×)圖7表面涂層的煅燒骨與細胞復合后8天，細胞呈復層生長(200×)圖8裸鼠皮下誘導成骨試驗 復合BMSC的煅燒骨植入后3周，可見煅燒骨表面有大量類骨質形成(100×)圖9裸鼠皮下誘導成骨試驗 5周，材料表面成熟骨痂明顯，與材料無明顯界限(100×)
方法2取成年牛椎體骨，用內徑16-18mm的空心電鉆鉆取椎體中心的松質骨。流水沖洗，蒸餾水漂洗，蒸餾水煮沸10小時，流水沖洗，去離子水漂洗2次，系列酒精脫水，50℃烘干4天。骨塊浸泡于(NH4)2HPO4溶液中24小時，傾去多余液體，50℃烘干4天。在高溫爐中煅燒，1000℃，3小時，升溫速率為5℃/分，自然降溫。流水沖洗，去離子水漂洗兩次，50℃烘干4天，高溫消毒備用。制備四種多用的煅燒骨(β-TCP/HAP比例分別是4/6和8/2和10/0)時的(NH4)2HPO4溶液濃度分別是0.3M，0.6M，1.0M和1.2M。
2.膠原表面涂層可溶性膠原溶液，可購自Cohesion公司的Vitrogen牌或羅氏公司可溶性膠原，也可從豬、牛的真皮和肌腱中用3％的醋酸提取，4-6℃冷藏，PH3，2-4mg/ml。取4-6℃冷藏可溶性膠原溶液，裝入透析袋(預煮沸30分鐘消毒并脫甘油)，對pH為3.0去離子水配置的稀鹽酸溶液透析8天，置于4-6℃冷藏室中，磁力攪拌，100ml膠原溶液對1.5L的透析液，每兩天換液一次，共三次。臨用前從冰箱取出，與1/10體積的10倍的PBS混合，立即將煅燒骨投入液中，抽真空，反復三次，或將混合液滴到煅燒骨上。37℃溫育1小時，使膠原形成凝膠，超凈臺內晾干，去離子水沖洗2次，超凈臺內晾干，環(huán)氧乙烷消毒。
另一種涂層方法是用pH為3.0去離子水調節(jié)膠原濃度為2mg/ml，用針頭濾器超濾消毒，4-6℃冷藏。用前取出，與1/10體積的10倍的不含NaCl的PBS混合，立即將高溫消毒過的煅燒骨投入液中，37℃溫育1小時，使膠原形成凝膠，放置于無菌培養(yǎng)皿內，打開蓋子，超凈臺內紫外線照射干燥，無菌容器包裝備用，可不用環(huán)氧乙烷消毒。
3.細胞與材料的復合方法培養(yǎng)并收集骨髓間充質干細胞，用含血清a-MEM制成2×107個/ml細胞懸液，滴入煅燒骨中，或將煅燒骨投入懸液中，抽真空，一個大氣壓，每次15秒，間隔10秒，反復三次，讓細胞懸液完全吸入材料內。培養(yǎng)箱中孵育4小時，緩慢加入20ml含血清a-MEM或D-MEM，在37℃、5％CO2的條件下孵育4-8天后植入體內。
權利要求
1，一種作為骨缺損的修復材料的可吸收煅燒骨的制備方法，其特征是HAP和β-TCP雙相煅燒骨以松質骨為原料，通過浸漬(NH4)2HPO4溶液、一次性煅燒和降低煅燒溫度，將煅燒骨中的HAP部分或完全轉化為β-TCP，其中煅燒溫度為900-1300℃。
2，根據權利要求1所述的可吸收煅燒骨的制備方法，其特征是制備四種多用的煅燒骨之β-TCP/HAP比例分別是4/6、6/4、8/2和10/0時，其(NH4)2HPO4溶液濃度分別是0.3M，0.6M，1.0M和1.2M。
3，根據權利要求1所述的可吸收煅燒骨的制備方法，其特征是對所得煅燒骨及多孔材料采用膠原凝膠表面涂層，2-4mg/ml的膠原溶液經對pH為3.0去離子水配置的稀鹽酸溶液，在冷藏室內透析，涂層時與1/10體積的10倍濃度的PBS混合，37℃溫育1小時。
4，根據權利要求3所述的可吸收煅燒骨的制備方法，其特征是所得煅燒骨可與細胞復合，細胞與煅燒骨及多孔材料的復合方法是收集骨髓間充質干細胞，讓細胞懸液完全吸入材料內，培養(yǎng)箱中孵育2-5小時，加入含血清培養(yǎng)液，孵育3-8天后植入體內。
5，根據權利要求1或2所述的可吸收煅燒骨的制備方法，其特征是所述松質骨取成年牛椎體或股骨頭及股骨下端，用內徑16-18mm的空心電鉆鉆取椎體中心或股骨下端的松質骨。
6，根據權利要求5所述的可吸收煅燒骨的制備方法，其特征是第一，對所述松質骨進行預處理，包括流水沖洗、蒸餾水漂洗、去離子水煮沸5-12小時、高壓流水沖洗、去離子水漂洗、酒精脫水、烘干，其中，烘干溫度為50℃-70℃，4天；第二，進行浸漬，煅燒骨塊浸泡于(NH4)2HPO4溶液中24小時，去除多余液體，50℃-70℃烘干4天；第三，煅燒，在高溫爐中900℃-1300℃，1-4小時，升溫速率為5℃/分，自然降溫；第四，流水沖洗，去離子水漂洗2次，50℃-70℃烘干4天，高溫消毒備用；第五，膠原表面涂層，4-6℃冷藏可溶性膠原溶液，裝入透析袋，對去離子水配置的稀鹽酸溶液，pH為3.0，透析6-10天或以上，置于4-6℃冷藏室中，磁力攪拌，每100ml膠原溶液對1.5-2L的透析液，每兩天換液一次，共2-3次，臨用前從冰箱取出，與1/10體積的10倍濃度的PBS混合，立即將煅燒骨投入液中，抽真空，反復三次，或將混合液滴到煅燒骨上，37℃溫育0.5-2小時，使膠原形成凝膠，超凈臺內晾干，去離子水沖洗2次，超凈臺內晾干，環(huán)氧乙烷消毒，成膠原表面涂層后的煅燒骨。
7，根據權利要求3所述的可吸收煅燒骨的制備方法，其特征是，煅燒骨的涂層方法是用pH為3.0去離子水配置的稀鹽酸溶液調節(jié)膠原濃度為2mg/ml，用針頭濾器超濾消毒，4-6℃冷藏，用前取出，與1/10體積的10倍的不含NaCl的PBS混合，立即將高溫消毒過的煅燒骨投入液中，37℃溫育0.5-2小時，使膠原形成凝膠，放置于無菌培養(yǎng)皿內，打開蓋子，超凈臺內紫外線照射干燥，無菌容器包裝備用。
8，根據權利要求6所述的可吸收煅燒骨的制備方法所得煅燒骨的用途，其特征是，用于細胞與材料的復合，即培養(yǎng)并收集骨髓間充質干細胞(BMSC)，用含血清a-MEM制成0.5-5×107個/1ml細胞懸液，滴入煅燒骨中，或將煅燒骨投入懸液中，抽真空，一個大氣壓，每次10-20秒，間隔5-15秒，反復三次，讓細胞懸液完全吸入材料內；培養(yǎng)箱中孵育2-5小時，緩慢加入20-30ml含血清培養(yǎng)液，在37℃、5％CO2的條件下孵育3-8天后植入體內。
9，根據權利要求6所述的可吸收煅燒骨的制備方法，其特征是，在將煅燒骨塊浸泡于(NH4)2HPO4溶液前，進行初次煅燒，在高溫爐中煅燒，800℃，3小時，升溫速率為5℃-10℃/分。
10，根據權利要求1所述的可吸收煅燒骨的制備方法所得煅燒骨的用途，其特征是，可用于修復骨缺損、骨不連、脊柱融合，骨髓基質干細胞及成骨細胞的載體，構建組織工程化人工骨，也可作為BMP的緩釋載體修復骨缺損。
全文摘要
本發(fā)明可吸收煅燒骨的制備方法是一種可吸收雙相煅燒骨的制備、涂層及細胞復合法。一種作為骨缺損的修復材料的可吸收煅燒骨的制備方法,HAP和β－TCP雙相煅燒骨以松質骨為原料,通過浸漬(NH
文檔編號C12N5/08GK1422672SQ0214549
公開日2003年6月11日 申請日期2002年11月21日 優(yōu)先權日2002年11月21日
發(fā)明者徐小良, 湯亭亭, 戴尅戎 申請人:上海第二醫(yī)科大學附屬第九人民醫(yī)院