專利名稱：生產(chǎn)重組色氨酸酶的表達(dá)系統(tǒng)及重組色氨酸酶的制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)重組色氨酸酶的表達(dá)系統(tǒng)，還涉及一種重組色氨酸酶的制備方法及在色氨酸生產(chǎn)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
L-色氨酸，是一種芳香族氨基酸，是人和動(dòng)物體內(nèi)的必需氨基酸，對(duì)人和動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)供給和促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育十分重要。它被廣泛應(yīng)用于藥品和食品工業(yè)，并且是繼蘇氨酸、賴氨酸之后的第三大動(dòng)物飼料添加氨基酸。
色氨酸的研究和生產(chǎn)前后經(jīng)歷了20多年，生產(chǎn)途徑多種多樣，主要有蛋白水解提取法、化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法和酶促轉(zhuǎn)化法四種。就目前的情況來(lái)看，無(wú)論從高產(chǎn)量還是高效率來(lái)說(shuō)，這四種方法中還沒(méi)有十分滿意的大規(guī)模生產(chǎn)色氨酸的方法。但是相比較而言，酶促轉(zhuǎn)化法是目前較為有效的工業(yè)化方法。但是迄今為止，掌握這種技術(shù)進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)的還僅限于美國(guó)、日本、德國(guó)等少數(shù)發(fā)達(dá)國(guó)家，我國(guó)雖有中國(guó)科學(xué)院微生物研究所進(jìn)行了多年的研究工作，正在進(jìn)行中試放大研究，但他們的工藝仍然使用比較昂貴的絲氨酸為前體原料，工藝上也需要進(jìn)一步完善。因此，我國(guó)還沒(méi)有比較理想的批量生產(chǎn)色氨酸的高收率、高產(chǎn)量、穩(wěn)定的生產(chǎn)工藝。故色氨酸非常昂貴，藥用原料市價(jià)達(dá)每公斤上千元人民幣，我國(guó)目前基本依賴進(jìn)口。
細(xì)菌合成色氨酸是由一系列酶所催化的反應(yīng)過(guò)程，這些酶是由一基因簇表達(dá)的，它們組成了色氨酸操縱子。反應(yīng)的最后一步由色氨酸合成酶(EC4.2.1.20)催化，它能夠在細(xì)菌細(xì)胞中催化L-絲氨酸和吲哚甘油磷酸酯反應(yīng)產(chǎn)生色氨酸。色氨酸合成酶也可以在體外直接催化吲哚和絲氨酸反應(yīng)生成色氨酸。為了能夠在體外控制反應(yīng)的合成方向，如要使反應(yīng)朝著色氨酸的合成方向，就要使用高濃度的絲氨酸或者吲哚。然而，絲氨酸是一種非常貴的原材料，就使得這種方法不經(jīng)濟(jì)，而吲哚在低濃度下就對(duì)細(xì)菌有毒性，因此通過(guò)控制吲哚濃度的方法來(lái)控制在細(xì)菌中的合成反應(yīng)也是極為不利的。
在細(xì)菌細(xì)胞中，同時(shí)存在著起分解作用的酶——色氨酸酶(EC4.1.99.1)，分子量為220KD，是由4個(gè)相同的亞基組成的同質(zhì)四聚體，每一亞基含有一個(gè)磷酸吡哆醛結(jié)合位點(diǎn)，催化活性需要單價(jià)陽(yáng)離子如K+和NH4+，它能夠催化L-色氨酸分解為吲哚、丙酮酸和氨。其中，丙酮酸和氨都是十分便宜的原料，可以它們的濃度來(lái)控制反應(yīng)向色氨酸合成的方向進(jìn)行，同時(shí)，色氨酸酶對(duì)吲哚則具有良好的穩(wěn)定性。因此，使用色氨酸酶來(lái)催化產(chǎn)生色氨酸就具有潛在的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，雖然動(dòng)力學(xué)特征不如色氨酸合成酶，但由于色氨酸酶在生產(chǎn)上具有色氨酸合成酶所無(wú)法替代的優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)受到了人們更為廣泛的關(guān)注，不斷尋找著將其用于L-色氨酸生物合成的最佳方法。
然而，使用色氨酸酶在操作過(guò)程上也有一定的困難。使用細(xì)菌產(chǎn)生高水平的色氨酸酶難度比較大由于普通使用的廉價(jià)的細(xì)菌生長(zhǎng)培養(yǎng)基中含有色氨酸，它會(huì)破壞色氨酸酶的存在，而自身被分解產(chǎn)生吲哚，而吲哚在低濃度下對(duì)細(xì)菌就是有害的，必須克服這一困難。
為了克服吲哚的毒性問(wèn)題，已知的工序是在培養(yǎng)基中使用表面活性劑。表面活性劑將吲哚同生長(zhǎng)環(huán)境分離開(kāi)，從而使細(xì)菌周圍的吲哚濃度降到最低。然而研究發(fā)現(xiàn)，表面活性劑的存在可能對(duì)色氨酸酶的活性產(chǎn)生不利的影響。并且，由于表面活性劑的存在，使下游的色氨酸生產(chǎn)過(guò)程，變得更加難以操作。
作為普通培養(yǎng)基的替代物，缺乏色氨酸的培養(yǎng)基可以被用來(lái)培養(yǎng)色氨酸酶產(chǎn)生菌。然而，這種培養(yǎng)基很貴，使生產(chǎn)成本過(guò)高，不適合工業(yè)應(yīng)用。
因此，人們建立了以下的步驟來(lái)生產(chǎn)色氨酸。
1)生物催化劑的產(chǎn)生過(guò)程增殖宿主細(xì)菌細(xì)胞，該細(xì)菌細(xì)胞中轉(zhuǎn)入了帶有編碼色氨酸酶基因的DNA序列的載體。在載體中，上述的色氨酸酶基因的表達(dá)可以直接得到控制。
2)通過(guò)誘導(dǎo)色氨酸酶基因的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)上述宿主細(xì)胞合成色氨酸酶。
3)將反應(yīng)底物加入到高效表達(dá)重組色氨酸酶的細(xì)菌混合液中使色氨酸在反應(yīng)混合物中積累。
4)色譜法分離色氨酸。
此生產(chǎn)過(guò)程中的生物催化劑的生產(chǎn)和生物轉(zhuǎn)化(酶法合成過(guò)程)分開(kāi)，這樣就具有實(shí)際用處在生物催化劑的生產(chǎn)階段，細(xì)菌可以充分進(jìn)行生長(zhǎng)，在沒(méi)有吲哚的情況下，色氨酸酶的生產(chǎn)將達(dá)到很高的水平；在隨后的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中，色氨酸的合成反應(yīng)也可以充分的進(jìn)行，因?yàn)椴恍枰紤]影響細(xì)胞生長(zhǎng)的因素，也不需要采取措施來(lái)克服吲哚的毒性。這樣，應(yīng)用所發(fā)明的生產(chǎn)過(guò)程，就解決了傳統(tǒng)工藝中為獲得高轉(zhuǎn)化率而加入表面活性劑所帶來(lái)的種種問(wèn)題。
Deeley等(1981)報(bào)道了E.coliK-12的色氨酸酶基因序列。Shibatani等(1987)克隆了Alcaligenes fecalis的色氨酸酶基因，工程菌色氨酸酶產(chǎn)量比野生菌高4倍。Tani等(1990)構(gòu)建了含色氨酸酶基因的重組質(zhì)粒pMD6B，轉(zhuǎn)化E.coliK-12 MD55，工程菌色氨酸酶表達(dá)量占整個(gè)可溶性蛋白的30％。張玉彬等(1996)構(gòu)建重組質(zhì)粒pTase 9，轉(zhuǎn)化E.coli JM105，其色氨酸酶表達(dá)量占菌體總蛋白的30％，但酶活只是供體菌的2倍。
韋平和等應(yīng)用PCR技術(shù)從E.coli JM105中擴(kuò)增出長(zhǎng)約1.4Kb的色氨酸酶基因，將其插入表達(dá)載體pET3a的Nde I/Bam HI位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，所構(gòu)建的產(chǎn)色氨酸酶基因工程菌，其色氨酸酶的表達(dá)量占細(xì)胞總可溶性蛋白的69.8％，并且做了色氨酸酶活力的測(cè)定，其中酶活力最高的工程菌比宿主菌高16倍。但這種表達(dá)蛋白分離純化困難，回收率僅20％，而且采用這種表達(dá)載體生產(chǎn)的色氨酸酶活性低，很多蛋白在分離純化中丟失，而且費(fèi)力耗時(shí)，特別是需要制備大量的色氨酸酶蛋白尤其如此。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種生產(chǎn)重組色氨酸酶的表達(dá)系統(tǒng)，該表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的色氨酸酶蛋白產(chǎn)量高，容易分離純化。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種重組色氨酸酶蛋白的制備方法。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供高活性的色氨酸酶蛋白從而進(jìn)行色氨酸生產(chǎn)的應(yīng)用。
本發(fā)明提供了一個(gè)新的生產(chǎn)色氨酸酶蛋白的表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)含有連接至質(zhì)粒的編碼色氨酸酶的DNA片段，其特征是在T7噬菌體啟動(dòng)子下游，連接有15-18個(gè)編碼5-6個(gè)連續(xù)組氨酸的堿基。在本發(fā)明中，首先設(shè)計(jì)一對(duì)引物，5’ggaattcatgaaggattatg taatggaa 3’，5’gaagctttta aacttcttta agttttgcg 3’；其次是應(yīng)用PCR技術(shù)從大腸桿菌(E.coli)TG1株中擴(kuò)增出長(zhǎng)約1.4Kb的色氨酸酶基因，將其插入到表達(dá)載體pET28a的EcoRI/HindIII位點(diǎn)以構(gòu)建重組質(zhì)粒pEVT，重組載體pEVT在T7噬菌體啟動(dòng)子下游，連接有15-18個(gè)編碼5-6個(gè)連續(xù)組氨酸的堿基；第三是將重組載體轉(zhuǎn)化克隆宿主E.coli TG1，挑單菌落培養(yǎng)，提取并篩選陽(yáng)性重組質(zhì)粒，再將其轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主E.coli BL21(DE3)，構(gòu)建色氨酸酶基因工程菌。
在本發(fā)明的一種優(yōu)化方案是本發(fā)明提供了一種表達(dá)載體，是連接有18個(gè)編碼6個(gè)連續(xù)的組氨酸的堿基的載體pVET，CCTCC M202038。其含有能編碼色氨酸酶蛋白的DNA片段，適宜的PCR引物選自SEQ ID NO1和SEQ ID NO2組成的引物而獲得該DNA片段，并且在T7噬菌體啟動(dòng)子下游，連接有18個(gè)編碼6個(gè)連續(xù)組氨酸的堿基。這樣含有該表達(dá)系統(tǒng)的宿主細(xì)胞將表達(dá)易分離純化且有生物學(xué)活性的色氨酸酶蛋白，而且產(chǎn)量穩(wěn)定，活性高。
本發(fā)明提供的DNA片段可在大腸桿菌中表達(dá)，優(yōu)選大腸桿菌E.coli BL21(DE3)。
本發(fā)明還提供了一種分離純化色氨酸酶蛋白的方法。使用本發(fā)明提供的重組載體表達(dá)的色氨酸酶蛋白，是一融合蛋白，其顯著特征是在N端含有5-6個(gè)連續(xù)的組氨酸，偏堿性，帶正電荷，這樣易于結(jié)合在固定化的組氨酸-蛋白質(zhì)鎳親和層析樹(shù)脂柱上，并且該融合蛋白N端附加的氨基酸不會(huì)對(duì)酶的活性造成任何的影響。當(dāng)進(jìn)行色氨酸酶蛋白純化時(shí)，首先離心沉淀收集菌液中的菌體，再將菌體懸浮于由Tris·Cl、NaCl等組成的緩沖液中，超聲波裂解菌體，離心，收集上清液，過(guò)柱，色氨酸酶蛋白便選擇性地吸附至固定化的組氨酸-蛋白質(zhì)鎳親和層析樹(shù)脂柱上，先用洗滌液(50mM Na3PO4，pH 8.0、0.3M NaCl、10mM咪唑)洗滌，然后利用洗脫液(50mM Na3PO4，pH 8.0、0.3M NaCl、250mM咪唑)洗脫結(jié)合的色氨酸酶蛋白，從而獲得含有色氨酸酶蛋白的溶液。洗脫的色氨酸酶蛋白分子量在50KD與60KD之間。
在本發(fā)明的又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了采用本發(fā)明生產(chǎn)的色氨酸酶蛋白在制備色氨酸中的應(yīng)用。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果其純度在90％以上，回收率在60％以上。本發(fā)明提供的色氨酸酶蛋白額外地含有不影響該酶生物學(xué)活性卻對(duì)該酶的的分離純化至關(guān)重要的5-6個(gè)連續(xù)組氨酸，偏堿性，帶正電荷，易于同固定化的含有組氨酸-蛋白質(zhì)鎳親和層析樹(shù)脂柱結(jié)合。這樣不需額外的化學(xué)處理而降低生產(chǎn)成本，提高回收率。


圖1產(chǎn)色氨酸酶蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建示意2色氨酸酶蛋白tnaA基因PCR擴(kuò)增電泳圖譜，圖中1、2、3、4PCR產(chǎn)物5PCRMarker圖3用Pst I消化PCR產(chǎn)物電泳圖，圖中1、2PCR產(chǎn)物被PstI消化所得的兩個(gè)片段3Lambda DNA/HindIII+EcoR I Marker 4、5PCR產(chǎn)物圖4連接反應(yīng)電泳圖，圖中1、2、3、4連接反應(yīng)產(chǎn)物5PCRmarker 6質(zhì)粒pET 28a圖中a.外源DNA.PCR產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后回b.載體DNA.pET 28a質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后回收的產(chǎn)物c.重組的質(zhì)粒DNApET 28a+tnaA gene圖5重組質(zhì)粒DNA的酶切電泳圖譜，圖中1、2用HindIII和EcoR I消化重組質(zhì)粒所得產(chǎn)物3Lambda DNA/HindIII+EcoR I Marke 4PCR產(chǎn)物5質(zhì)粒pET28a圖6重組色氨酸酶蛋白SDS-PAGE圖譜，圖中1、2、3所構(gòu)建的工程菌所表達(dá)的色氨酸酶4宿主菌(E.coil BL21)5標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量圖7單克隆菌落平板劃線示意圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例。進(jìn)一步闡述本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護(hù)的范圍，下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件和方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等主編，科學(xué)出版社，1992，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版)；D.L.斯佩克特等，科學(xué)出版社，2001，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南等書中所述的條件；或接照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1、色氨酸酶蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建PCR擴(kuò)增色氨酸酶基因用滅菌槍頭挑取E.coli TG1單菌落懸作為克隆基因所用的模板，浮于20μL裂解液(裂解液組成為NP-40與Tween-20分別取0.5體積，溶于99體積的雙蒸水中，混勻，每種濃度均為0.5％)，再加20μL的水，充分振散后于100C溫浴15min，離心(15000rpm，10min)取上清10μL用于總體積100μL的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為100μL，加樣清單如下10×buffer10μL引物11μL引物21μL4dNTP2μL滅菌ddH2O75μL模板10μLTaq DNA聚合酶1μL95℃預(yù)變性5min循環(huán)條件94℃變性1min、57℃復(fù)性1min、72℃延伸1min，循環(huán)反應(yīng)30次，再72℃延伸10min。
其中引物1(引導(dǎo)引物，5OD)溶于500μL無(wú)菌水，濃度為37.8μmol/L，貯于-20℃，含有SEQ ID NO1；引物2(折返引物，5OD)溶于500μL無(wú)菌水，濃度為37.2μmol/L，貯于-20℃，含有SEQ ID NO2；10×buffer為500mmol/L KCl、100mmol/L Tris·Cl，PH 9.0(25℃)、0.1％(v/v)Triton X-100、15mmol/L MgCl2；DNA模板為E.coli TG1的DNA；DNA聚合酶為2u/μL Taq。獲得含有色氨酸酶蛋白基因的DNA片段，再將此DNA片段經(jīng)EcoRI和HindIII雙酶切，與經(jīng)EcoRI和HindIII雙酶切的載體pET 28a通過(guò)T4DNA連接酶連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體tnaA/pET 28a，此表達(dá)載體保藏在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定并認(rèn)可的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心作申請(qǐng)專利目的的保藏保藏號(hào)CCTCC M202038保藏日2002年9月29日載體名稱pEVT
實(shí)施例2色氨酸酶蛋白基因PCR產(chǎn)物的回收用PCR產(chǎn)物回收試劑盒(購(gòu)于CLONTECH公司)回收PGR產(chǎn)物1)使用前，在緩沖液NT3中加入64mL 95％的乙醇。
2)用TE緩沖液(pH 8.0)將反應(yīng)混合物的體積調(diào)到100μL。
3)仔細(xì)旋轉(zhuǎn)NucleoTrap PCR懸液直到小珠子完全的重懸。
4)加入400μL緩沖液NT2和10μL NucleoTrap PCR懸液到反應(yīng)混合物中。
5)在室溫放置樣品10分鐘。此間每隔2-3分鐘快速旋轉(zhuǎn)一下管子。
6)將樣品于室溫離心，14000rpm，30秒，棄上清。
7)在小珠子中加入400μL緩沖液NT2，快速搖動(dòng)一下，又于室溫離心14000rpm，30秒，棄上清。
8)在樣品中加400μL的緩沖液NT3，快速搖動(dòng)于室溫14000rpm離心30秒。棄上清。
9)重復(fù)步驟8。
10)再次于室溫離心小珠子，14000rpm，30秒。于室溫下空氣干燥小珠子15分鐘。
11)先加20μL的無(wú)菌水，旋轉(zhuǎn)重旋小珠子。
12)在室溫將樣品放置10分鐘以洗脫DNA，在放置期間旋轉(zhuǎn)混合物2-3次。
13)于室溫14000rpm離心樣品30秒，轉(zhuǎn)移含有純化的DNA片段的上清夜到另一個(gè)100μL的EP管中。
14)再在小珠子中加10μL的無(wú)菌水，旋轉(zhuǎn)小珠子，再重復(fù)12)、13)步的操作。這樣100μL的PCR產(chǎn)物可以回收為30μL。該方法也適用于酶切PCR產(chǎn)物的回收以及酶切質(zhì)粒的回收。
實(shí)施例3、色氨酸酶蛋白DNA片段的確定PCR產(chǎn)物cDNA片段的粗檢取5μL PCR產(chǎn)物在1％的瓊脂糖凝膠(預(yù)加溴化乙錠)上檢查PCR產(chǎn)物。Marker選用PCR Markers(參照片段1543，994，697，515，377，237)。
如果片段大小與預(yù)期一致，并且沒(méi)有雜帶，則接著做下面的步驟。如果有雜帶，則需提高復(fù)性溫度，并適當(dāng)減少循環(huán)次數(shù)，直到?jīng)]有雜帶為止。
如附圖2所示。
由于tnaA基因上存在一個(gè)Aat I(AGGCCT)酶切位點(diǎn)，pos381；一個(gè)PstI(CTGCAG)酶切位點(diǎn)，pos616；Alu I(AGCT)酶切位點(diǎn)，pos.252，873，1168，所以可用酶切方法進(jìn)行PCR產(chǎn)物的再檢測(cè)，本實(shí)驗(yàn)選用Pst I進(jìn)行酶切，用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收的PCR產(chǎn)物，用Pst I酶切PCR產(chǎn)物，再進(jìn)行電泳，有0.6Kb和0.8Kb的片段產(chǎn)生，則證明PCR產(chǎn)物為預(yù)期的所要擴(kuò)增的基因。選用20μL的酶切體系進(jìn)行鑒定1μL DNA+2μL 10×buffer B+1μL Pst I+2μL BSA+14μLBSA+71μLH2O將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1％瓊脂凝膠上電泳，可以得到一條長(zhǎng)度約1.4kb的DNA片段，該片段與Deeley等(1981)報(bào)道的色氨酸酶基因(maA)的大小一致，如圖2所示。E.coli色氨酸酶基因上存在單一的Pst I酶切位點(diǎn)，所以酶切以后應(yīng)該得到兩個(gè)片段，大小分別為0.8kb和0.6kb，如附圖3所示實(shí)施例4、含色氨酸酶蛋白基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建及該質(zhì)粒的鑒定質(zhì)粒與回收PCR產(chǎn)物的酶切處理質(zhì)粒單酶切預(yù)實(shí)驗(yàn)由于選用雙酶切體系，所以并不能保證在兩個(gè)酶切位點(diǎn)都能酶切完全，也就是說(shuō)可能只有一種酶起了作用，這對(duì)于后面的連接反應(yīng)是非常不利的，所以只有用同一種緩沖液進(jìn)行單酶切預(yù)實(shí)驗(yàn)，摸一下對(duì)兩種酶都合適的反應(yīng)條件，再在此條件下進(jìn)行雙酶切。
將質(zhì)粒載體pET 28a取1μL跑電泳，與適當(dāng)?shù)?μL Marker進(jìn)行對(duì)比，因?yàn)镸arker的最亮的帶為0.5μg/μL，就可以粗略估計(jì)其濃度以確定反應(yīng)物的量，進(jìn)行20μL體系的預(yù)試驗(yàn)1μLDNA+2μL 10×bufferB+1μLEcoRI+2μLBSA+14μLH2O1μLDNA+2μL 10×bufferB+1μLHindIII+2μLBSA+14μLH2O
對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行電泳，如果產(chǎn)物帶清晰且只有一條，就可以進(jìn)行下面的雙酶切實(shí)驗(yàn)。
質(zhì)粒載體與回收的PCR產(chǎn)物的雙酶切取1μL質(zhì)粒pET 28a用EcoRI、HindIII進(jìn)行酶切。
先進(jìn)行20μL體系的小試1μLDNA+2μL 10×bufferB+1μLhindIII+1μLEcoR I+2μLBSA+13μL H2O于37℃水浴保溫4h-7h，也可以過(guò)夜，以保證酶切的完全。
取3μL酶切反應(yīng)物電泳，如果電泳的帶細(xì)、無(wú)雜帶，而且亮度還可以，則可以將反應(yīng)體系放大為100μL。
100μL酶切體系5μL DNA+10μL 10×buffer+2μL hindIII+2μLEcoR I+10μL BSA+71μL H2O將檢測(cè)剩下回收PCR產(chǎn)物按1.2.2.1的方法粗略估計(jì)其濃度，以確定反應(yīng)物的量，進(jìn)行雙酶切處理。PCR產(chǎn)物酶切的完全與否是無(wú)法用電泳檢測(cè)，不過(guò)由于有對(duì)質(zhì)粒載體進(jìn)行處理的經(jīng)驗(yàn)，所以酶切體系直接定為100μL5μL DNA+10μL 10×buffer+2μL hindIII+2μLEcoR I+10μL BSA+71μL H2O載體和PCR產(chǎn)物的酶切可以同時(shí)進(jìn)行，于37℃水浴保溫4h-7h，也可以過(guò)夜，以保證酶切的完全。
用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物，并與上面回收的tnaA基因PCR產(chǎn)物一起用電泳分析，觀察酶切的效果，并比較酶切質(zhì)粒與酶切PCR產(chǎn)物之間的亮度。
本實(shí)驗(yàn)得到兩管酶切PCR產(chǎn)物的回收產(chǎn)物，兩管酶切質(zhì)粒的回收產(chǎn)物。
連接反應(yīng)1)取四支eppendorf離心管，標(biāo)上記號(hào)1#、2#、3#、4#。
2)根據(jù)電泳的亮度按表二的量依次加入水、buffer、V-DNA、P-DNA、T4DNA連接酶。
表二連接反應(yīng)加樣清單

3)用微量吸樣槍頭輕輕攪幾下使混合，然后離心3分鐘，置室溫下(約18℃過(guò)夜。
4)次日取出，1#、2#、3#、4#、5#、6#各取3μL反應(yīng)液進(jìn)行電泳，看連接效果。如附圖4所示。
感受態(tài)細(xì)胞制備1)在5mL的培養(yǎng)液中接種一環(huán)E.coli TG1(從平皿的菌落挑)，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。
2)用1.5×18cm試管裝10mL的培養(yǎng)液，接種0.01mL的上述培養(yǎng)過(guò)夜的細(xì)菌，37℃快速振蕩，培養(yǎng)2-3小時(shí)，此時(shí)可見(jiàn)試管內(nèi)液體呈渾濁狀，如果感覺(jué)仍比較清亮，可適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，但是一定注意不要太久，否則細(xì)菌就長(zhǎng)老了，制備感受態(tài)細(xì)胞效果很差。有條件可以測(cè)OD550，其范圍應(yīng)在0.4-0.6之間。
3)用6支1.5mL的離心管(帶蓋子)每管裝1mL培養(yǎng)物于4℃ 5500rpm離心5分鐘，棄上清液。
4)在每管中加入4℃預(yù)冷的CaCl20.50mL(50mmol/L CaCl2，用蒸餾水配制，pH 6.6至6.9之間)后，用100mL的槍頭一端溫和地吸吹使沉淀地細(xì)胞分散懸浮。把管子插入冰中放20分鐘，以后操作過(guò)程管子盡量不離4℃或冰。
5)于4℃5500rpm離心5分鐘棄去上清。
6)每管加入0.10mL地冷的50mmol/L CaCl2，使細(xì)胞懸浮和分散，操作同4)，然后把管子插入冰中放4℃保存，在12-24h內(nèi)做轉(zhuǎn)染用。
DNA轉(zhuǎn)染1)取3支無(wú)菌試管標(biāo)上號(hào)碼，插入冰中預(yù)冷。
2)依下表在其中四支管中加入感受態(tài)細(xì)胞0.3mL(吸取前先輕輕搖勻)。
DNA轉(zhuǎn)化加樣清單

3)如上表所示地相應(yīng)的管中加入相應(yīng)的DNA。
4)輕搖幾下管子使DNA和細(xì)胞均勻接觸，插入冰中保持40分鐘。
5)把管子轉(zhuǎn)到42℃水浴中，保溫2分鐘后加入3mL的LB培養(yǎng)液，在37℃培養(yǎng)2-3小時(shí)。
6)分別取75μL涂平板(含卡那霉素Kan的LB平板)。倒置平皿于37℃培養(yǎng)過(guò)夜。然后檢查結(jié)果。
7)隨機(jī)挑選的帶質(zhì)粒的細(xì)菌，在事先劃好格子的培養(yǎng)基(含kan的LB培養(yǎng)基)中劃線，如圖7所示。
質(zhì)粒DNA的小量制備收獲1)將3mL含相應(yīng)抗生素的LB加入到容量為1.5×18mL并通氣良好(不蓋緊)的試管中，然后接入一單菌落，于37℃劇烈振搖下培養(yǎng)過(guò)夜。
2)將1.5mL培養(yǎng)物倒入微量離心管中，用微量離心機(jī)于4℃以4000rpm離心5min，將剩余的培養(yǎng)物貯于4℃。
3)吸去培養(yǎng)液，使細(xì)菌沉淀盡可能干燥。
堿裂解法提取1)將細(xì)菌沉淀重懸于100μL用冰預(yù)冷的溶液I中，劇烈振蕩。
2)加100μL新配制的溶液II。
蓋緊管口，快速顛倒離心管5次，以混合內(nèi)容物。應(yīng)確保離心管的整個(gè)內(nèi)表面均與溶液II接觸。不要振蕩，將離心管放置于冰上。
3)加200μL用冰預(yù)冷的溶液III。
蓋緊管口，將管倒置后溫和地振蕩10秒鐘使溶液III在粘稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻，之后將管置于冰上3-5分鐘。
4)用微量離心機(jī)于4℃以12000g離心5分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。
5)加等量酚氯仿，振蕩混勻，用微量離心機(jī)于4℃以15000rpm離心2分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。
6)用2倍體積的乙醇于室溫沉淀雙鏈DNA。振蕩混合，于室溫放置2分鐘。
7)用微量離心機(jī)于4℃以15000rpm離心5分鐘。
8)小心吸去上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。再將附于管壁的液滴除盡。
9)用1mL 70％乙醇于4℃洗滌雙鏈DNA沉淀，按步驟8)所述方法去掉上清，在空氣中使核酸沉淀干燥至呈現(xiàn)透明狀。
10)溶于30μL水中，貯存于-20℃，再逐一進(jìn)行酶切分析。
限制性酶切鑒定質(zhì)粒中外源DNA片段的插入1)用EcoRI、HindIII雙酶切所提取質(zhì)粒，方法同前質(zhì)粒載體與回收的PCR產(chǎn)物雙酶切。瓊脂糖凝膠電泳觀測(cè)。
2)如果發(fā)現(xiàn)能從質(zhì)粒上切下大小為1.4Kb的DNA片段，則此質(zhì)?；敬_定為所需的重組質(zhì)粒。將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主E.coli BL21(DE3)，涂平板，挑選單菌落進(jìn)行劃線培養(yǎng)。方法與轉(zhuǎn)入克隆宿主菌E.coli TG1是一致的。
鑒定結(jié)果如附圖5所示。
實(shí)施例5、色氨酸酶蛋白表達(dá)系統(tǒng)的制備與誘導(dǎo)表達(dá)色氨酸酶蛋白表達(dá)系統(tǒng)的制備將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主E.coli BL21(DE3)，涂平板，挑選單菌落進(jìn)行劃線培養(yǎng)。方法與轉(zhuǎn)入克隆宿主菌E.coli TG1是一致的。
色氨酸酶的誘導(dǎo)表達(dá)1)含質(zhì)粒pET 28a的E.coli BL21單克隆菌落、含重組質(zhì)粒的E.coli BL21單克隆菌落分別接種于5mL的含Kan的LB培養(yǎng)基，于37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜以獲得飽和培養(yǎng)物。
2)將含質(zhì)粒pET 28a E.coli BL21單克隆菌落、含重組質(zhì)粒的E.coli BL21單克隆菌落的飽和培養(yǎng)物50mL分別接種于5mL、7mL的含Kan的LB培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)2小時(shí)。
3)取1mL兩種未誘導(dǎo)的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至微量離心管中。按步驟4)和5)進(jìn)行處理。其余加IPTG至種濃度為1mmol/L，對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行誘導(dǎo)。
5)含質(zhì)粒pET 28a的E.coli BL21單克隆菌落在誘導(dǎo)后3小時(shí)取出1mL經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)的培養(yǎng)物，含重組質(zhì)粒的E.coli BL21單克隆菌落分別在誘導(dǎo)后0.5、1、2、3和6小時(shí)取出1mL經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)的培養(yǎng)物，迅速在室溫下以12000g離心1分鐘，棄去上清夜。
6)將每一沉淀重懸于100μL含Tris·Cl和NaCl，pH 8.0的緩沖液中，40Hz超聲波破碎細(xì)菌，離心取上清。
7)加入100μL的2×SDS凝膠加樣緩沖液中，100℃加熱3分鐘。所有被收集樣品均貯存于0℃，以備在凝膠上加樣。
實(shí)施例6、色氨酸酶蛋白確定聚丙烯酰胺凝膠電泳1)所選用丙烯酰胺濃度為12％，2)安裝玻璃板。
3)按表一給出的數(shù)值在一三角錐瓶中按所需丙烯酰胺濃度配制一定體積的分離膠溶液。依次混合各成分。一旦加入TEMED，馬上開(kāi)始聚合，故應(yīng)立即快速旋轉(zhuǎn)混合物并進(jìn)入下步操作。
4)迅速在兩玻璃板間的間隙中灌注丙烯酰胺溶液，留出灌注濃縮膠所需空間，梳子的齒長(zhǎng)再加1cm。用巴斯德吸管小心地在丙烯酰胺溶液上覆蓋一層乙醇，將凝膠垂直放置于室溫下。
5)分離聚合完全后30分鐘，傾出覆蓋層液體，用去離子水洗滌凝膠頂部數(shù)次以除去未聚合的丙烯酰胺，盡可能排去凝膠上的液體，再用紙巾的邊緣吸凈殘留液體。
6)按下法制備濃縮膠按表一給出的數(shù)據(jù)在一個(gè)一次性使用的塑料試管中制備一定體積及一定濃度的丙烯酰胺溶液，依次混合各成分，一旦加入TEMED，馬上開(kāi)始聚合，故應(yīng)立即快速旋動(dòng)混合物并進(jìn)入下一步操作。
7)在已聚合的分離膠上直接灌注濃縮膠，立即在濃縮膠溶液中插入干凈的Teflon梳子。小心避免混入氣泡，再加濃縮膠溶液以充滿梳子之間的空隙，將凝膠垂直放置于室溫下。
8)積層膠聚合完全后30分鐘，小心移出Teflon梳子，使用能噴射水流的瓶子，立即用去離子水洗滌加樣槽以除去未聚合的丙烯酰胺。如有必要，使用接于注射器的平頭皮下注射針頭把積層膠上加樣槽之間的齒弄直。把凝膠固定于電泳裝置上，上、下槽各加入Tris-甘氨酸電泳緩沖液。必須設(shè)法排出凝膠底部?jī)刹ＡО逯g的氣泡，為此最好使用接上注射器的彎形皮下注射針頭。
9)按預(yù)定順序加樣，每樣品加15μL，為能把樣品加到樣品孔底部，最好使用Hamilton微量注射器，每加完一個(gè)樣品應(yīng)在下槽緩沖液中洗滌加樣注射器，最后在所有不用的樣品孔中加上等體積的1×SDS凝膠加樣緩沖液。
10)將電泳裝置與電源相接，凝膠上所加電壓為8V/cm。當(dāng)染料前沿進(jìn)入分離膠后，把電壓提高到15V/cm，繼續(xù)電泳直至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部(約需4小時(shí))，然后關(guān)閉電源。
11)從電泳裝置上卸下玻璃板，放在紙巾上，用刮勺撬開(kāi)玻璃板。緊靠最左邊一孔凝膠下部切去一角以標(biāo)注凝膠的方位。
12)用至少5倍體積的染液浸泡凝膠，放在平緩搖動(dòng)的平臺(tái)上于室溫染色4小時(shí)以上。
13)移出并回收染液以被后用，將凝膠浸泡于不加染料的甲醇-乙酸溶液中，平緩搖動(dòng)4-8小時(shí)，其間應(yīng)更換脫色液三四次。
14)脫色后，將凝膠拍照，獲得的蛋白質(zhì)分子量大小為58KD，與色氨酸酶蛋白的分子量大小一致。
經(jīng)過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)，檢測(cè)到了一條分子量約為5.8KDa的顯著加深的蛋白。因?yàn)樗磉_(dá)的色氨酸酶其實(shí)是融合蛋白，色氨酸酶前面有一段附加的氨基酸序列。掃描結(jié)果表明，色氨酸酶的表達(dá)量占細(xì)胞中總可溶性蛋白的百分率平均為40％左右。
如附圖6所示。
實(shí)施例7、色氨酸酶蛋白的純化方法使用His-Bond Ni Affinity Resin(組氨酸-蛋白質(zhì)鎳親和層析樹(shù)脂)抽提1)用超聲波裂解菌液，方法見(jiàn)色氨酸酶的誘導(dǎo)表達(dá)。
2)細(xì)菌徹底裂解后，超速離心，將上清小心移入一干凈的離心管中，將咪唑的濃度調(diào)節(jié)至1-20mM，氯化鈉的濃度調(diào)節(jié)至0.15-0.5M，pH值調(diào)節(jié)至7.0-8.0之間，開(kāi)始純化。
小量純化(試純化)1)徹底懸浮His-Bond Ni Affinity Resin，移取40μL至一離心管中，5000×g離心30秒，小心棄上清。
2)加入200μL平衡液(參看使用說(shuō)明書的配方)溫和混勻后，5000×g離心30秒，小心棄上清。
3)加入100μL澄清的含目的蛋白質(zhì)的溶液，溫和地混勻1分鐘后，5000×g離心30秒，小心將上清移入一個(gè)干凈地離心管中。
4)在樹(shù)脂沉淀中加入500μL洗滌液(參看使用說(shuō)明書的配方)，溫和混勻后，5000×g離心30秒，小心將上清液移入一個(gè)干凈地離心管中，同樣再洗滌一次。
5)加入50μL洗脫液，溫和混勻后，5000×g離心30秒，小心將上清移入一個(gè)干凈的離心管中，同樣再洗滌一次。
6)將收集于各離心管中的液體上樣電泳(SDS-PAGE)，以檢測(cè)目的蛋白質(zhì)是否很好的純化。
大量純化
1)徹底懸浮His-Bond Ni Affinity Resin，移取適量的至一個(gè)層析柱中，先用2倍體積的去離子水洗滌，再用3倍體積的平衡液洗滌。
2)加入澄清的含目的蛋白質(zhì)的溶液，將流速控制于2-10倍體積柱/小時(shí)。
3)當(dāng)含目的蛋白質(zhì)的溶液不再流出時(shí)，加入洗滌液洗滌樹(shù)脂，將流速控制于10-20倍柱體積/小時(shí)。當(dāng)流出液的280nm值接近洗滌液的值時(shí)，洗滌完成。
4)加入3-10倍體積的洗脫液洗脫目的蛋白質(zhì)，將流速控制于2-10倍柱體積/小時(shí)。分步收集流出液，并測(cè)定出蛋白質(zhì)的所在。
采用本發(fā)明生產(chǎn)的色氨酸酶蛋白其純度在95％以上，回收率在60％以上。
實(shí)施例8、色氨酸酶蛋白活力測(cè)定按韋平和論文中的方法并參考Wood等(1947)和胡永紅方法并加以改進(jìn)。并且將酶的活力單位定義為在上述反應(yīng)條件下，于37℃、10min內(nèi)每形成0.01μmoL吲哚所需要的酶量稱為一個(gè)酶活力單位。
1)在10mL三角瓶中依次添加0.20mg/mL PLP溶液20μL 5mmol/L還原型谷胱甘肽溶液10μL、粗提酶液(磷酸二氫鉀緩沖液懸浮，pH8.0，約100mg濕菌體所含酶量)270μL。
2)用甲苯1mL覆蓋上述0.3mL溶液，于37℃保溫水浴中保溫5min后，加入5mg/mL的色氨酸溶液100μL，置37℃搖床振蕩使反應(yīng)進(jìn)行10min。
3)添加5％PDAB和5％硫酸正丁醇混合顯色液3mL中止反應(yīng)，30min后于570nm處進(jìn)行吸光度測(cè)定。
經(jīng)過(guò)酶活力的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)工程菌所表達(dá)的色氨酸酶的活力比宿主菌有較大程度的提高，其中最高的比宿主菌高20倍以上。
SEQUENCE LISTING<110>武漢大學(xué)<120>生產(chǎn)重組色氨酸酶的表達(dá)系統(tǒng)及重組色氨酸酶的制備方法和應(yīng)用<130>生產(chǎn)重組色氨酸酶的表達(dá)系統(tǒng)及重組色氨酸酶的制備方法和應(yīng)用<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>28<212>DNA<213>E.coli<400>1ggaattcatg aaggattatg taatggaa 28<210>2<211>29<212>DNA<213>E.coli<400>2gaagctttta aacttcttta agttttgcg29
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)重組色氨酸酶的表達(dá)系統(tǒng)，其特征在于重組色氨酸酶表達(dá)系統(tǒng)，Escheuchia coli BL21/pET-28a，CCTCC NOM202038。
2.一種實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)重組色氨酸酶的表達(dá)系統(tǒng)的制備方法，包括下列步驟A、首先設(shè)計(jì)一對(duì)引物，5’ggaattcatg aaggattatg taatggaa 3’，5’gaagcttttaaacttcttta agttttgcg 3’；B、應(yīng)用PCR技術(shù)從大腸桿菌E.coli TG1株中擴(kuò)增出長(zhǎng)1.4Kb的色氨酸酶基因，將其插入到表達(dá)載體pET28a的EcoRI/HindIII位點(diǎn)以構(gòu)建重組質(zhì)粒pEVT；C、所述的重組載體pEVT在T7噬菌體啟動(dòng)子下游，連接有15-18個(gè)編碼5-6個(gè)連續(xù)組氨酸的堿基；D、重組載體轉(zhuǎn)化克隆宿主E.coli TG1，挑單菌落培養(yǎng)，提取并篩選陽(yáng)性重組質(zhì)粒，再將其轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主E.coli BL21，構(gòu)建色氨酸酶基因工程菌。
3.一種用于權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)重組色氨酸酶的表達(dá)系統(tǒng)，其特征在于N端含有5-6個(gè)連續(xù)的組氨酸，偏堿性，帶正電荷，結(jié)合在固定化的組氨酸-蛋白質(zhì)鎳親和層析樹(shù)脂柱上；進(jìn)行色氨酸酶蛋白純化時(shí)，首先離心沉淀收集菌液中的菌體；其次是將菌體懸浮于由Tris·Cl、NaCl的緩沖液中；第三是用超聲波裂解菌體，離心，收集上清液，過(guò)柱，色氨酸酶蛋白便吸附至固定化的組氨酸-蛋白質(zhì)鎳親和層析樹(shù)脂柱上，用洗滌液洗滌，利用洗脫液洗脫結(jié)合的色氨酸酶蛋白。
4.權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)的色氨酸酶蛋白在制備色氨酸中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種生產(chǎn)重組色氨酸酶的表達(dá)系統(tǒng)及制備方法和應(yīng)用，色氨酸酶的表達(dá)載體pEVT(CCTCCM202038)，生產(chǎn)該載體的方法及一種純化菌種產(chǎn)色氨酸酶蛋白的方法。采用本發(fā)明提供的重組載體表達(dá)的色氨酸酶融合蛋白，由于含有6個(gè)連續(xù)的組氨酸，這樣易于結(jié)合在固定化的組氨酸－蛋白質(zhì)鎳親和層析樹(shù)脂柱上，而且這一段組氨酸不會(huì)對(duì)目的蛋白的活性造成影響。由此可以提高目的蛋白的回收率，并且回收的生產(chǎn)成本很低。這樣，在后續(xù)的色氨酸生產(chǎn)過(guò)程中，就避免了直接將細(xì)菌裂解液加到反應(yīng)底物中而造成的產(chǎn)物中混合物過(guò)多，最終色氨酸純化困難的問(wèn)題。采用本發(fā)明生產(chǎn)的色氨酸酶蛋白其純度在95％以上，回收率在60％以上。
文檔編號(hào)C12N9/88GK1497047SQ02139189
公開(kāi)日2004年5月19日 申請(qǐng)日期2002年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月18日
發(fā)明者王業(yè)富, 龔睿 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)