專利名稱：甲型肝炎滅活疫苗呂8快株的選育和制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含有病毒抗原的醫(yī)用生物制品，尤其是一種用于預(yù)防人類甲型肝炎的滅活疫苗毒株及其制備方法。
甲型肝炎是由甲型肝炎病毒(HAV)引起的一種自限性病毒性傳染病，世界各地均有此病的發(fā)生。在不發(fā)達(dá)或發(fā)展中國家衛(wèi)生條件差的地區(qū)最容易傳播成為高度地方性的流行病，而在高流行區(qū)易感染者主要是兒童。我國是HAV感染的高流行區(qū)，平均每年有24萬人患甲型肝炎，為此，許多研究者致力于甲型肝炎疫苗的研究。如美國專利4.164.566公開了一種在人類靈長目動(dòng)物(如狨猴)細(xì)胞培養(yǎng)中選育出HAV制備甲型肝炎疫苗。美國專利4.506.016公開了一種將甲肝病毒首先適宜于人腎細(xì)胞，然后再適應(yīng)于人胚肺細(xì)胞的減毒HAV株制備甲肝減毒活疫苗。中國專利891065806公開了甲型肝炎減毒疫苗毒種(H2減毒株)及其制備方法。中國專利921149980公開了甲型肝炎疫苗的生產(chǎn)方法，提供了制備甲型肝炎疫苗的毒種LA-1減毒株及規(guī)?；a(chǎn)疫苗的方法。因此，加大研制甲型肝炎疫苗的進(jìn)度和力度已成為刻不容緩的任務(wù)。
本發(fā)明的目的在于提供一種安全、有效，繁殖周期短，適于大規(guī)模生產(chǎn)甲肝滅活疫苗的毒株。
本發(fā)明通過下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)所采用的甲型肝炎滅活疫苗毒株是從甲肝患者糞便中直接用人胚肺二倍體細(xì)胞(KMB17株)培養(yǎng)、分離而獲得的呂8株病毒毒種，經(jīng)過將人胚肺二倍體細(xì)胞37℃培養(yǎng)4-5天形成致密細(xì)胞單層，用PBS洗滌細(xì)胞，其特征在于將呂8株病毒液按1∶5-50的體積比接種在致密細(xì)胞單層上，置37℃吸附2小時(shí)，補(bǔ)充pH7.4-7.8的維持液，35-36℃培養(yǎng)傳代，1-2代次每代培養(yǎng)35天，3-6代次每代培養(yǎng)28天，7-26代次每代培養(yǎng)12-16天，收獲毒株。
本發(fā)明所用毒種-呂8株是在1988年我國上海地區(qū)流行甲肝時(shí)，從典型甲肝急性期患者糞便中分離的甲型肝炎病毒，經(jīng)KMB17人胚肺二倍體細(xì)胞培養(yǎng)、分離、適應(yīng)得到的毒種。
本發(fā)明所述毒株培養(yǎng)過程中，1-6代次每周更換維持液一次，維持液中含5-10％的小牛血清和卡那霉素80-100u/ml，7-26代次則不需要更換維持液。
用本發(fā)明方法制備的甲肝滅活疫苗毒株-呂8快株，其抗原滴度和感染性滴度較高，經(jīng)狨猴毒力實(shí)驗(yàn)證明已由強(qiáng)毒株變異為弱毒株，用它生產(chǎn)甲肝滅活疫苗不僅對人體安全，有良好的免疫原性和保護(hù)效果，而且由于病毒繁殖的高峰期由35天縮短為12-16天，因此，有利于進(jìn)行大規(guī)模的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，因此，是一種生產(chǎn)甲肝滅活疫苗的理想毒株。
本發(fā)明提供的甲型肝炎滅活疫苗毒株25代和26代經(jīng)中國藥品生物制品檢定所進(jìn)行檢定，其結(jié)果見下表
本發(fā)明提供的甲型肝炎滅活疫苗毒株-呂8快株的性質(zhì)如下形狀球形，27-30mm；氯化銫浮密度1.34g/cm2；耐熱性60℃30分鐘對感染性無明顯影響，100℃5分鐘可完全滅活；抗原滴度1∶512～1∶1024；感染性滴度107.5～108.5CCID50/ml；繁殖高峰時(shí)間12-16天；最適繁殖溫度35-36℃；繁殖部位細(xì)胞胞漿內(nèi)；
致細(xì)胞病變未見CPE；毒力未見血清酶的異常升高，肝臟組織未見病理變化；免疫原性可使小白鼠、恒河猴、狨猴產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。
實(shí)施例1按常規(guī)方法先將人胚肺二倍體細(xì)胞(KMB17株)置于37℃培養(yǎng)4-5天，使之長成致密細(xì)胞單層，棄舊液，用PBS洗滌細(xì)胞一次，按1∶5的體積比接種呂8株病毒，置37℃吸附2小時(shí)，補(bǔ)充pH7.4維持液，其中維持液中含5-10％小牛血清和80-100u/ml卡那霉素，置35℃繼續(xù)培養(yǎng)，1-2代次每代培養(yǎng)35天，3-6代次每代培養(yǎng)28天，每周更換維持液一次，7-26代次每代培養(yǎng)12天，收獲，收毒時(shí)用PBS洗滌細(xì)胞一次，加消化液，讓消化液過細(xì)胞面三次，當(dāng)細(xì)胞從瓶壁脫落后，按20μl/cm2的量加入無酚紅PBS或MEM制成懸浮液，收集懸浮液于PP瓶中，用大容量低速離心機(jī)在4℃2000～2500rpm離心15-20分鐘，用PBS或生理鹽水(0.85％NaCL)懸浮細(xì)胞沉淀，收集細(xì)胞懸液裝瓶，置-30℃冷藏，得呂8快株病毒液。
實(shí)施例2除接種呂8株病毒比例為1∶50，7-26代次每代培養(yǎng)16天，收獲毒株外，其余制備工藝過程均與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例3除接種呂8株病毒比例為1∶25，7-26代次每代培養(yǎng)14天，收獲毒株外，其余制備工藝過程均與實(shí)施例1相同。
動(dòng)物接種試驗(yàn)試驗(yàn)組將本發(fā)明之主種子批(25代)靜脈接種普通狨猴2只，接種劑量為7.44CCID50/ml，觀察12周。接種后兩周抗體陽轉(zhuǎn)，血清酶無異常升高，肝臟組織未見病理變化。
對照組將呂8糞便懸液接種2只狨猴，接種劑量為1.23CCID50/ml，接種后ALT有1-2周次升高，AST有3-4周次升高，肝臟出現(xiàn)+++的病理變化。
說明呂8株經(jīng)組織培養(yǎng)，快速傳代后，根據(jù)血清肝酶變化以及肝臟病理檢查結(jié)果，其毒力基本屬于弱毒性質(zhì)，且抗原性仍然保持良好。
權(quán)利要求
1.一種甲型肝炎滅活疫苗呂8快株的選育和制備方法，它包括從甲肝患者糞便中直接用人胚肺二倍體細(xì)胞(KMB17株)培養(yǎng)、分離而獲得的呂8株病毒毒種，以及將人胚肺二倍體細(xì)胞置于37℃培養(yǎng)4-5天形成致密細(xì)胞單層，用PBS洗滌細(xì)胞，其特征在于將呂8株病毒液按1∶5-50的體積比接種在致密細(xì)胞單層上，置37℃吸附2小時(shí)，補(bǔ)充pH7.4-7.8的維持液，35-36℃培養(yǎng)傳代，1-2代次每代培養(yǎng)35天，3-6代次每代培養(yǎng)28天，7-26代次每代培養(yǎng)12-16天，收獲毒株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述毒株培養(yǎng)過程中，1-6代次每周更換維持液一次，維持液中含5-10％的小牛血清和80-100u/ml的卡那霉素。
全文摘要
本發(fā)明提供一種甲型肝炎滅活疫苗呂8快株的選育和制備方法，它將呂8株病毒液按1∶5－50的體積比接種在致密細(xì)胞單層上，置37℃吸附2小時(shí)，補(bǔ)充pH7.4－7.8的維持液，35－36℃培養(yǎng)傳代，1－2代次每代培養(yǎng)35天，3－6代次每代培養(yǎng)28天，7－26代次每代培養(yǎng)12－16天，收獲毒株。該毒株的抗原滴度和感染性滴度較高，經(jīng)狨猴毒力實(shí)驗(yàn)證明已由強(qiáng)毒株變異為弱毒株，用它生產(chǎn)甲肝滅活疫苗不僅對人體安全，有良好的免疫原性和保護(hù)效果，而且由于病毒繁殖的高峰期由35天縮短為12－16天，因此，有利于進(jìn)行大規(guī)模的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，因此，是一種生產(chǎn)甲肝滅活疫苗的理想毒株。
文檔編號C12N7/04GK1490053SQ0213392
公開日2004年4月21日 申請日期2002年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月17日
發(fā)明者陳統(tǒng)球, 褚嘉祐, 張華遠(yuǎn), 萬宗舉, 侯宗柳, 陽選祥, 譚順革, 曹逸云, 金煒翔, 龍潤?quán)l(xiāng), 李華, 楊凈思 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所