專利名稱：采用兩套重組系統(tǒng)刪除特定外源基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，具體的說，本發(fā)明涉及的是利用一種兩套不同來源的位點特異性重組系統(tǒng)的協(xié)同作用使特定的外源基因在轉(zhuǎn)基因植物的雜交后代中刪除的方法。
目前已通過基因工程的方法獲得了能夠抵抗病蟲害，除草劑以及適應(yīng)各種極端環(huán)境(如抗旱，抗寒)的轉(zhuǎn)基因作物，其中相當(dāng)一部分已進(jìn)入田間試驗并進(jìn)行大規(guī)模的商業(yè)應(yīng)用。與此同時，對轉(zhuǎn)基因作物后代中外源基因的控制也越來越為人們所重視。一方面為了保護(hù)生物技術(shù)公司的利益，促使農(nóng)戶使用攜帶優(yōu)良性狀基因的商業(yè)化種子和種子的更新，使得制種部門始終能夠在種子質(zhì)量上保持優(yōu)勢。另一方面是出于對轉(zhuǎn)基因作物安全性的考慮，比如控制抗蟲基因在轉(zhuǎn)基因棉花子代中的行為，我們既要保證子一代棉花大田生產(chǎn)中抗蟲基因在適當(dāng)啟動子的控制下高效表達(dá)，將蟲害的威脅降至最低程度。又要使這種轉(zhuǎn)基因棉花的群體在以后的世代中會逐步刪除其中的抗蟲基因，從而降低棉花群體的抗蟲性。由此可見，對轉(zhuǎn)基因作物后代中外源基因的控制對于轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)業(yè)化和種子的商業(yè)化具有重要的應(yīng)用價值。到目前為止，國內(nèi)還沒有報道能夠特異地刪除轉(zhuǎn)基因植物后代中特定的外源基因的有效的方法。本發(fā)明提供的就是一種能夠把特定外源基因從轉(zhuǎn)基因作物的雜交后代中直接刪除的分子方法。這在國內(nèi)來說尚屬首創(chuàng)。
美國USDA和D&P公司于1998年共同申請的專利US 5723765公開了一種控制植物基因表達(dá)的方法，即將三個DNA序列導(dǎo)入一種植物細(xì)胞，其中第一個DNA序列含有一個致死基因和一個在晚期胚胎發(fā)生中活化的啟動子，致死基因和晚期胚胎發(fā)生中活化的啟動子功能性相互連接，但由一個兩端具有特異切除序列的阻斷序列分隔開，阻斷序列的存在阻止了致死基因的表達(dá)。第二個DNA序列含有位于一個阻抑型啟動子調(diào)控下的重組酶基因，該重組酶特異于第一個DNA序列中阻斷序列兩端的特異切除序列。第三個DNA序列含有編碼特異于第二個DNA序列的阻抑型啟動子的阻遏物的基因。對外源基因的控制既可以通過施加外部刺激物而獲得，也可以通過雜交獲得。該專利描述了利用一種位點特異性重組系統(tǒng)控制植物基因表達(dá)的分子生物學(xué)方法，比如可以通過造成雜交種子的敗育以達(dá)到對轉(zhuǎn)基因植物后代中基因的控制。但其中并沒有涉及到對轉(zhuǎn)基因作物的后代中外源基因進(jìn)行直接的刪除和控制。
本發(fā)明的優(yōu)點就在于利用兩套不同的位點特異性重組系統(tǒng)的協(xié)同作用，通過轉(zhuǎn)基因親本植株之間的雜交而直接刪除其后代中特定的基因。從技術(shù)的角度來說，本發(fā)明使用的方法具有明顯的創(chuàng)新性。而且由于所選用的定位重組系統(tǒng)的嚴(yán)格的特異性，外源基因的刪除只發(fā)生在特定的兩種轉(zhuǎn)基因植株之間，它不會因為花粉的傳播造成其它植株中基因的丟失或者種子的敗育，從保護(hù)生物多樣性這一點上說，本發(fā)明相對于國外的種子終止技術(shù)也具有明顯的優(yōu)越性。
來源于噬菌體P1的Cre/lox系統(tǒng)，酵母2u質(zhì)粒的FLP/FRT系統(tǒng)，酵母PSR1質(zhì)粒的R/RS系統(tǒng)和噬菌體Mu的Gin/gix系統(tǒng)是目前研究的較清楚的四種定位重組系統(tǒng)。這些定位重組系統(tǒng)都由重組酶和特異識別位點組成(Odell，《Recombination and Gene Silencing in Plants》，J.Paszkowski(ed.)，219-270(1994))。其中Cre，F(xiàn)LP，R和Gin分別編碼重組酶，重組酶由單個多肽構(gòu)成，它們的蛋白序列之間有很大的差異，但C端都有一個40個氨基酸的同源區(qū)域。其中有三個保守的氨基酸序列His-Arg-Tyr，可能是它們的活性位點。loxP，F(xiàn)RT，RS和gix是分別被上述四種重組酶所識別的特異序列。重組酶的靶位點都含有約12-13bp的倒置重復(fù)序列，中間隔以2-8bp的間隔區(qū)，間隔區(qū)的方向決定了重組酶介導(dǎo)的重組的方向性。如果兩個識別位點的方向相反，中間的DNA序列會發(fā)生倒位。兩個識別位點的方向相同則會切除中間的DNA片段，如果兩個識別位點分別位于兩個DNA分子上，則會發(fā)生整合反應(yīng)。除了Gin需要一個大腸桿菌宿主的輔助因子外，其它的幾種重組系統(tǒng)都可以獨立的行使功能，不需要任何其它的輔助因子。到目前為止，定位重組系統(tǒng)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動植物中外源基因的失活或活化，從而控制生物體的發(fā)育和表型特征。其中以Cre/loxP和FLP/FRT應(yīng)用最為廣泛，研究也最深入。FLP/FRT在果蠅中應(yīng)用較多而Cre/loxP則在小鼠中廣泛使用，而且這兩套系統(tǒng)都已分別應(yīng)用于高等植物中外源基因的控制以及染色體研究。但現(xiàn)有技術(shù)并沒有描述兩套不同的定位重組系統(tǒng)結(jié)合使用在植物基因工程方面的應(yīng)用，也沒有描述在它在轉(zhuǎn)基因作物后代中外源基因的控制和刪除方面的應(yīng)用。
本發(fā)明提供一種能把特定的外源基因從轉(zhuǎn)基因植物的雜交后代中刪除的方法。包括從以下兩個不同的重組DNA序列穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中所述的第一個重組DNA序列包括兩端接有第一種能被特異性識別和剪接序列的編碼一種能改善植物某種性狀的蛋白質(zhì)的核苷酸序列，而且所述的第一個重組DNA序列還包括編碼能識別第二個重組DNA序列中能被特異性識別和剪接的第二種位點特異性重組酶的核苷酸序列。其中所述的第二個重組DNA序列包括兩端接有第二種能被特異性識別和剪接序列的編碼與第一個重組DNA序列中相同或者不同種能改善植物某種性狀的蛋白質(zhì)的核苷酸序列，而且所述的第二個重組DNA序列還包括編碼能識別第一個重組DNA序列中能被特異性識別和剪接的第一種位點特異性重組酶的核苷酸序列。并由此植物細(xì)胞再生得到的完整植株。當(dāng)這兩種轉(zhuǎn)基因植株發(fā)生雜交以后，兩種重組酶基因都在啟動子的驅(qū)動下表達(dá)，由于和它們的識別切割位點在空間上的靠近，兩種重組酶就能夠切割和刪除它們各自識別位點之間的特定的核苷酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，其中所說的第一個重組DNA序列中的第二種位點特異性重組酶的核苷酸序列不但包括它的蛋白質(zhì)編碼序列，并且還包括其編碼序列上游5’端非編碼區(qū)的啟動子序列以及下游3’端的終止子序列。
根據(jù)本發(fā)明的這一實施方案，其中所說的第二種位點特異性重組酶選自于包含Cre，F(xiàn)LP，R編碼的位點特異性重組酶中的一種。
根據(jù)本發(fā)明的這一個實施方案，其中所說的第二種位點特異性重組酶的編碼序列上游的組成型啟動子序列包括但并不僅限于35S啟動子序列。
根據(jù)本發(fā)明的這一個實施方案，其中所說的第一種能被特異性識別和剪接的核苷酸序列選自于包含能分別被Cre，F(xiàn)LP，R所識別并剪接的特異性DNA序列中的一種。它們分別為loxP，F(xiàn)RT和RS。
根據(jù)本發(fā)明的這一個實施方案，其中所說的第一種能被特異性識別和剪接的核苷酸序列不能被第一個重組DNA序列中編碼的第二種位點特異性重組酶所識別并剪接。
根據(jù)本發(fā)明的這一個實施方案，其中所說的一種能改善植物某種形狀的蛋白質(zhì)可以是一種與抗蟲，抗除草劑或者可以抵抗各種不良環(huán)境等有關(guān)的的蛋白質(zhì)。包括但并不僅限于來源于蘇云金桿菌的Bt抗蟲基因。
根據(jù)本發(fā)明的這一個實施方案，其中所說的一種能改善植物某種形狀的蛋白質(zhì)的核苷酸序列不但包括該蛋白質(zhì)的編碼序列，還包括其編碼序列上游5’端非編碼區(qū)的啟動子序列和一些起表達(dá)調(diào)控功能的序列，以及下游3’端非編碼區(qū)的表達(dá)調(diào)控元件。
根據(jù)本發(fā)明的這一個實施方案，其中所說的第二個重組DNA序列中的第一種位點特異性重組酶的核苷酸序列不但包括它的蛋白質(zhì)編碼序列，并且還包括其編碼序列上游5’端非編碼區(qū)的啟動子序列以及下游3’端的終止子序列。
根據(jù)本發(fā)明的這一個實施方案，其中所說的第一種位點特異性重組酶選自于包含Cre，F(xiàn)LP，R編碼的位點特異性重組酶中的一種。但不同于第一個重組DNA序列中的第二種位點特異性重組酶。
根據(jù)本發(fā)明的這一個實施方案，其中所說的第一種位點特異性重組酶的編碼序列上游的組成型啟動子序列包括但并不僅限于35S啟動子序列。
根據(jù)本發(fā)明的這一個實施方案，其中所說的第二種能被特異性識別和剪接的核苷酸序列選自于包含能分別被Cre，F(xiàn)LP，R所識別并剪接的特異性DNA序列中的一種。它們分別為loxP，F(xiàn)RT和RS。
根據(jù)本發(fā)明的這一個實施方案，其中所說的第二種能被特異性識別和剪接的核苷酸序列不能被第二個重組DNA序列中編碼的第一種位點特異性重組酶所識別并剪接。
根據(jù)本發(fā)明的這一個實施方案，其中所說的被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或植株是某個植物種分別被第一個和第二個重組DNA序列轉(zhuǎn)化的兩個親本植物細(xì)胞或植株。所說的外源基因的刪除是由含有兩個不同的重組DNA序列的轉(zhuǎn)基因種子發(fā)育成的完整植株進(jìn)行雜交而得到的。
所說的第一個重組DNA序列按5’→3’的順序包括編碼能識別第二個重組DNA序列中能被特異性識別和剪接的第二種位點特異性重組酶的核苷酸序列，兩端接有第一種能被特異性識別和剪接序列的編碼一種能改善植物某種性狀的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。所說的第二個重組DNA序列按5’→3’的順序包括編碼能識別第一個重組DNA序列中能被特異性識別和剪接的第一種位點特異性重組酶的核苷酸序列，兩端接有第二種能被特異性識別和剪接序列的編碼與第一個重組DNA序列中相同或者不同種能改善植物某種性狀的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
在上述的這個實施方案中，用所說的兩個重組DNA質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化的植株均攜帶有Bt抗蟲基因，它可以在5’端35S啟動子的驅(qū)動下表達(dá)，使兩種轉(zhuǎn)基因植株都表現(xiàn)出抗蟲性。雖然兩種植株均攜帶有一種重組酶的核苷酸編碼序列以及兩個同向的重組酶識別位點序列，但由于第一個重組DNA序列中編碼的重組酶是特異于第二個重組DNA序列中的識別序列的，而第二個重組DNA序列中編碼的重組酶則特異于第一個重組DNA序列中的識別序列。它們之間不能發(fā)生相互識別和切割，所以在兩個相對獨立的轉(zhuǎn)基因植株中抗蟲基因不會被刪除。如果兩種轉(zhuǎn)基因植株之間發(fā)生相互傳粉，而且異株的花粉往往更優(yōu)先參與受精過程，將會發(fā)生以下的過程由第一個重組DNA序列轉(zhuǎn)化的植株上的重組酶基因進(jìn)入由第二個重組DNA序列轉(zhuǎn)化的植株的胚胎中，或者由第二個重組DNA序列轉(zhuǎn)化的植株上的重組酶基因進(jìn)入由第一個重組DNA序列轉(zhuǎn)化的植株的胚胎中，由于空間上的靠近，兩種重組酶都在CaMV35S啟動子的驅(qū)動下表達(dá)，識別其相對應(yīng)的識別序列并切除基因組中的35S/Bt結(jié)構(gòu)。從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株雜交后代中Bt基因的刪除。
本發(fā)明用于靶植物的實際轉(zhuǎn)化方法對本發(fā)明不是關(guān)鍵，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的各種不同的轉(zhuǎn)化技術(shù)將重組DNA序列導(dǎo)入待轉(zhuǎn)化的靶植物細(xì)胞。這些方法包括但并不僅限于農(nóng)桿菌侵染法，微粒轟擊法，顯微注射法，共沉淀法，電穿孔法，以及子房注射植物受精胚囊法等。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過參考有關(guān)文獻(xiàn)得到詳情。最好使被轉(zhuǎn)化的序列穩(wěn)定的整合到靶植物細(xì)胞的基因組中，從而使其在傳代的過程中不被丟失。另外，用于轉(zhuǎn)化靶植物的核苷酸序列可以以線性，環(huán)形或其它重組載體的形式如人工染色體的形式存在。
用于將轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生成整個植株的方法對本發(fā)明不是關(guān)鍵，可以使用任何對靶植物合適的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過參考有關(guān)文獻(xiàn)得到詳情。
給出以下實施例的目的是舉例詳細(xì)描述本發(fā)明，但并不構(gòu)成對本發(fā)明待批權(quán)利范圍的限制。在本發(fā)明技術(shù)特征和待批權(quán)利要求范圍內(nèi)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作出某些等同的改動和顯而易見的改進(jìn)。
所有實施例中的細(xì)菌培養(yǎng)和DNA操作均參考《分子克隆實驗室操作指南》(金冬雁等譯，科學(xué)出版社，北京(1993))和《精編分子生物學(xué)指南》(顏子穎等譯，科學(xué)出版社，北京(1998))。分子操作中的工具酶如限制性內(nèi)切酶均購自Promega公司，New EnglandBiolabs公司。


圖1為攜帶35S/Cre-FRT-35S/Bt-FRT的雙元表達(dá)載體pBFC的構(gòu)建流程。圖2為攜帶35S/FLP-loxP-35S/Bt-loxP的雙元表達(dá)載體pBLF的構(gòu)建流程。
實施例1釀酒酵母Sacchromyces Cerevesiea中克隆FLP重組酶基因根據(jù)已發(fā)表的釀酒酵母菌株2μ質(zhì)粒中FLP重組酶的核苷酸序列設(shè)計并合成下列一對寡核苷酸引物引物1GAG AAG ATC TAAGCA TGC CAC AAT TTG G(SEQ ID NO1)和引物2GAG GTCACC GCG TAC TTA TAT GCG TCT(SEQ ID NO2)。
將釀酒酵母菌株A364a接種于50mlYEPD液體培養(yǎng)基，28℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，以6000rpm/min離心5分鐘收集菌體，每管加入1ml蒸餾水重懸細(xì)胞，再加入100μl的0.5MEDTA(PH8.0)和40μl巰基乙醇，混勻后在室溫下放置5分鐘。以6000rpm/min離心5分鐘，去上清，加入500μl檸檬酸磷酸鹽緩沖溶液(PH5.8，含1M山梨醇)和200μl蝸牛酶溶液(15mg/ml)，混勻后于37℃搖床振搖1小時。以5000rpm/min離心5分鐘，去上清，每管加入1ml檸檬酸磷酸鹽緩沖溶液(PH5.8，含1M山梨醇)重懸和洗滌，重復(fù)三遍。每管加入400μl檸檬酸磷酸鹽緩沖溶液，輕輕振蕩，重懸細(xì)胞，緩慢加入40μl 20％SDS溶液，混勻后于65℃水浴30分鐘。加入200μl 5MKac溶液，冰上放置1小時。以12000rpm/min離心10分鐘，取上清，加入等體積的酚；氯仿∶異戊醇(25；24；1)，混勻后以10000rpm/min離心5分鐘。將上相轉(zhuǎn)移至另一離心管中，重復(fù)抽提一遍。加入2倍體積無水乙醇沉淀DNA以12000rpm/min離心10分鐘，每管加入20μl蒸餾水溶解DNA沉淀。
取1μl 2μ質(zhì)粒DNA作為模板，利用上述的引物1和引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)94℃預(yù)變性10分鐘；94℃變性1分鐘，48℃退火45秒，72℃延伸1分鐘，30個循環(huán)后72℃繼續(xù)延伸10分鐘。從瓊脂糖凝膠上回收1260bp的特異條帶。按3∶1的比例使回收產(chǎn)物與pGEM-T-easy載體(Promega公司)連接過夜。用連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，于37℃培養(yǎng)過夜。挑取白色菌落提取質(zhì)粒，經(jīng)過限制性內(nèi)切酶酶切和PCR鑒定，將所得到的重組質(zhì)粒命名為pFLP-T2。經(jīng)核苷酸序列分析，所克隆的DNA片段的核苷酸序列與已發(fā)表的編碼FLP重組酶的核苷酸序列完全相同。實施例2 攜帶FRT-35S/Bt-FRT的重組載體的構(gòu)建pSVpaZ11質(zhì)粒攜帶有兩個同向FRT位點，pGΩ4AB質(zhì)粒則含有35S啟動子調(diào)控下的蘇云金桿菌Bt毒蛋白基因。用HindIII酶切消化pGΩ4AB質(zhì)粒，從中切出一個含有35S/Bt基因的3.0kb片段，將該片段連接至同樣用HindIII酶切消化的pSVpaZ11質(zhì)粒中。經(jīng)過限制性內(nèi)切酶酶切和PCR鑒定，得到攜帶兩端含有兩個同向的FRT位點35S/Bt基因的重組質(zhì)粒pBt-FRT。實施例3 攜帶35S/Cre-FRT-35S/Bt-FRT的表達(dá)載體的構(gòu)建用HindIII和SacI消化pMM23質(zhì)粒，從中切出1.8kb含有35S/Cre的片段，將該片段連接至同樣用HindIII和SacI酶切消化的雙元表達(dá)載體pGPTV-bar中。經(jīng)過限制性內(nèi)切酶酶切和PCR鑒定，得到含有35S/Cre的表達(dá)載體pCre-bar。
用PvuII消化實施例2中所述的重組質(zhì)粒pBt-FRT，回收3.0kb含有FRT-35S/Bt-FRT的片段，連接HindII-XmnI adaptor(SEQ ID NO9和SEQ ID NO10)后將該片段連接至用HindIII消化的表達(dá)載體pCre-bar中，經(jīng)過限制性內(nèi)切酶酶切和PCR鑒定，得到含有35S/Cre-FRT-35S/Bt-FRT的雙元表達(dá)載體pBFC。用凍融法將其轉(zhuǎn)入土壤農(nóng)桿菌LBA4404中，經(jīng)PCR鑒定后保存菌種備用。實施例4 攜帶loxP-35S/Bt-loxP的重組載體的構(gòu)建用HindIII酶切消化pGΩ4AB質(zhì)粒，回收含有35S/Bt基因的3.0kb片段。加入dGTP和dATP后用klenow DNA聚合酶將其粘末端部分補平，得到只有兩個堿基的粘性末端。用XbaI酶切消化pGlGUS18質(zhì)粒，回收含有兩個同向的loxP位點的3.1kb的載體片段。加入加入dCTP和dTTP后用klenow DNA聚合酶將其粘末端部分補平，得到只有兩個堿基的粘性末端。將上述的經(jīng)過部分補平的載體和片段連接，經(jīng)過限制性內(nèi)切酶酶切和PCR鑒定，得到含有l(wèi)oxP-35S/Bt-loxP的重組質(zhì)粒pBt-loxP。實施例5 攜帶35S/FLP-loxP-35S/Bt-loxP的表達(dá)載體的構(gòu)建用SalI和PvuII消化實施例4中所述的重組質(zhì)粒pBt-loxP，回收含有l(wèi)oxP-35S/Bt-loxP的3.1kb的片段。將該片段連接到用SalI消化的雙元表達(dá)載體pCAMBIA1301中，經(jīng)過限制性內(nèi)切酶酶切和PCR鑒定，得到含有l(wèi)oxP-35S/Bt-loxP的表達(dá)質(zhì)粒pBt-loxP-1301。
用BglII和BstEII酶切消化表達(dá)質(zhì)粒pBt-loxP-1301，回收12.8kb的載體片段。同樣用BglII和BstEII酶切消化實施例1中所述的pFLP-T2重組質(zhì)粒，回收1.2kb的編碼FLP重組酶的片段，將上述的回收的載體和片段連接，即將FLP重組酶基因置換表達(dá)質(zhì)粒pBt-loxP-1301中GUS基因，使FLP重組酶基因置于35S啟動子的調(diào)控之下。經(jīng)過限制性內(nèi)切酶酶切和PCR鑒定，得到含有35S/FLP-loxP-35S/Bt-loxP的雙元表達(dá)載體pBLF。用凍融法將其轉(zhuǎn)入土壤農(nóng)桿菌LBA4404中，經(jīng)PCR鑒定后保存菌種備用。實施例6 含35S/Cre-FRT-35S/Bt-FRT的土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草取實施例3中所述的pBFC轉(zhuǎn)化的土壤農(nóng)桿菌LBA4404菌種，接種到含有200mg/l鏈霉素，50mg/l利福平和50mg/l卡那霉素的20ml的液體YEB培養(yǎng)基中，于28℃振蕩培養(yǎng)20-24個小時。用此培養(yǎng)物按Horsch的方法(Science，2271229-1231)進(jìn)行煙草的葉盤法轉(zhuǎn)化。取上述土壤農(nóng)桿菌培養(yǎng)物1ml按1∶20的比例稀釋到20ml液體MS培養(yǎng)基中。把在25℃下生長4-6周的煙草無菌苗幼嫩葉片剪成1平方厘米大小，在土壤農(nóng)桿菌稀釋液中浸泡5分鐘后取出用無菌濾紙吸去多余菌液。將這些葉片放置到含1mg/l 6BA的MS固體培養(yǎng)基上于25℃下暗培養(yǎng)兩天，然后轉(zhuǎn)移到含有500mg/l羧芐青霉素和10mg/l PPT的固體MS培養(yǎng)基上，于25℃下按14小時白天，14小時黑夜的光周期培養(yǎng)。約3周以后，將生長至1厘米以上的小苗轉(zhuǎn)移到含有500mg/l羧芐青霉素和5mg/l PPT的固體MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，約兩周后可見根的形成。從而得到完整的再生植株。將生長至5厘米左右的完整植株從培養(yǎng)瓶中取出，洗去殘留的MS培養(yǎng)基，移栽到花盆中在溫室中繼續(xù)生長。取溫室中生長的再生煙草葉片按Saghai-Maroof等人(PNAS，818014-8018，1996)的方法，微量提取總DNA。取2μl總DNA，分別用引物3(SEQ ID NO3)和引物4(SEQ ID NO4)，引物5(SEQ ID NO5)和引物6(SEQ ID NO6)，引物7(SEQ ID NO7)和引物8(SEQ ID NO8)進(jìn)行PCR反應(yīng)。結(jié)果擴(kuò)增到1.0kb，0.4kb，0.9kb的分別特異于Cre，bar和Bt基因的片段。取上述提取的總DNA 10μl，用Bt基因片段做探針，用BoehringerMannheim的非放射性標(biāo)記和檢測試劑盒進(jìn)行Southern印記檢測，證明已經(jīng)得到所需的轉(zhuǎn)基因植物。實施例7 含35S/FLP-loxP-35S/Bt-loxP的土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草取實施例5中所述的pBLF轉(zhuǎn)化的土壤農(nóng)桿菌LBA4404菌種，接種到含有200mg/l鏈霉素，50mg/l利福平和50mg/l卡那霉素的20ml的液體YEB培養(yǎng)基中，于28℃振蕩培養(yǎng)20-24個小時。用此培養(yǎng)物按Horsch的方法(Science，2271229-1231)進(jìn)行煙草的葉盤法轉(zhuǎn)化。取上述土壤農(nóng)桿菌培養(yǎng)物1ml按1∶20的比例稀釋到20ml液體MS培養(yǎng)基中。把在25℃下生長4-6周的煙草無菌苗幼嫩葉片剪成1平方厘米大小，在土壤農(nóng)桿菌稀釋液中浸泡5分鐘后取出用無菌濾紙吸去多余菌液。將這些葉片放置到含1mg/l 6BA的MS固體培養(yǎng)基上于25℃下暗培養(yǎng)兩天，然后轉(zhuǎn)移到含有500mg/l羧芐青霉素和25mg/l潮霉素的固體MS培養(yǎng)基上，于25℃下按14小時白天，14小時黑夜的光周期培養(yǎng)。約3周以后，將生長至1厘米以上的小苗轉(zhuǎn)移到含有500mg/l羧芐青霉素和15mg/l潮霉素的固體MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，約兩周后可見根的形成。從而得到完整的再生植株。將生長至5厘米左右的完整植株從培養(yǎng)瓶中取出，洗去殘留的MS培養(yǎng)基，移栽到花盆中在溫室中繼續(xù)生長。取溫室中生長的再生煙草葉片按Saghai-Maroof等人(PNAS，818014-8018，1996)的方法，微量提取總DNA。取2μl總DNA，分別用引物1(SEQ ID NO1)和引物2(SEQ ID NO2)，引物7(SEQ ID NO7)和引物8(SEQ ID NO8)，進(jìn)行PCR反應(yīng)。結(jié)果擴(kuò)增到1.2kb和0.9kb的分別特異于FLP和Bt基因的片段。取上述提取的總DNA 10μl，用Bt基因片段做探針，用Boehringer Mannheim的非放射性標(biāo)記和檢測試劑盒進(jìn)行Southern印記檢測，證明已經(jīng)得到所需的轉(zhuǎn)基因植物。實施例8 轉(zhuǎn)基因植株子代中Bt基因的刪除將實施例6中所述的含有35S/Cre-FRT-35S/Bt-FRT結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)基因植株和實施例7中所述的含有35S/FLP-loxP-35S/Bt-loxP結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)基因植株分別作為父本和母本進(jìn)行雜交，雜交種子再生得到的子代植株。取溫室中生長的子代植株煙草葉片按Saghai-Maroof等人(PNAS，818014-8018，1996)的方法，微量提取總DNA。取2μl總DNA，分別用引物1(SEQ ID NO1)和引物2(SEQ ID NO2)，引物3(SEQID NO3)和引物4(SEQ ID NO4)，引物5(SEQ ID NO5)和引物6(SEQ ID NO6)，進(jìn)行PCR反應(yīng)。結(jié)果擴(kuò)增到1.2kb，1.0kb，0.4kb的分別特異于FLP，Cre和bar基因的片段。取上述提取的總DNA，分別用Cre基因和FLP基因片段做探針，用Boehringer Mannheim的非放射性標(biāo)記和檢測試劑盒進(jìn)行Southern印記檢測，證明已經(jīng)得到所需的雜交子代植株。取上述溫室中生長的煙草葉片提取總RNA取總RNA10ug，分別用Cre和FLP基因片段做探針用BoehringerMannheim的非放射性標(biāo)記和檢測試劑盒進(jìn)行Northern印記分析，證明兩種重組酶在子代植株中具有組成型轉(zhuǎn)錄活性。通過設(shè)計不同的PCR引物組合，可以證明Cre/loxP和FLP/FRT系統(tǒng)都在子代雜交植株中發(fā)揮作用，兩個loxP或兩個FRT之間的35S/Bt基因結(jié)構(gòu)已經(jīng)被刪除掉。
表1 酵母YEPD培養(yǎng)基成分 每升含量(克)酵母提取物 5.0蛋白胨 10.0葡萄糖 10.0瓊脂(固體培養(yǎng)基用) 10.0表2 農(nóng)桿菌YEB培養(yǎng)基成分 每升含量(克)牛肉膏提取物5.0酵母提取物 1.0蛋白胨 5.0蔗糖5.0MgSO4.7H2O0.5瓊脂(固體培養(yǎng)基用) 10表3 煙草組織培養(yǎng)用MS培養(yǎng)基成分 每升含量(分化培養(yǎng)基)10x MS大量元素母液 100ml100xMS微量元素母液 10ml100x鐵鹽母液10ml100x維生素母液 10ml1mg/ml 6-芐基腺嘌呤1.0ml1mg/ml 萘乙酸 0.1ml瓊脂9克PH5.8(生根培養(yǎng)基)10x MS大量元素母液 100ml100xMS微量元素母液 10ml100x鐵鹽母液10ml100x維生素母液 10ml瓊脂9克PH5.8
此專利涉及的兩個菌種已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，單位地址中國北京中關(guān)村，該微生物分類名稱為大腸桿菌(E.coli DH5α)，保藏代號分別為pBFC、pBLF，保藏編號分別為CGMCC NO.0430、CGMCC NO.0431，保藏日期為1999年12月14日。
(1) 一般信息(I) 申請人林忠平(II) 發(fā)明名稱采用兩套重組系統(tǒng)刪除特定外源基因的方法(III)序列數(shù)11(IV) 通訊地址(1)聯(lián)系人林忠平(2)街道海淀區(qū)頤和園路5號(3)城市北京(4)國家中華人民共和國(5)郵政編碼100871(V) 計算機(jī)可讀形式(1)介體類型3.5英寸軟盤(2)計算機(jī)IBM Pentium II(3)操作系統(tǒng)Windows 98(4)軟件Word 97(VI) 電訊信息(1)電話86-10-62753062(2)傳真86-10-62751843(2)SEQ ID NO1的信息(I) 序列特征(1)長度28個堿基(2)類型核酸(3)鏈型單鏈(4)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(II)分子類型DNA(III)序列GAG AAG ATC TAA GCA TGC CAC AAT TTG G(3)SEQ ID NO2的信息(I) 序列特征(1)長度27個堿基(2)類型核酸(3)鏈型單鏈(4)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(II) 分子類型DNA(IV)序列GAG GTC ACC GCG TAC TTA TAT GCG TCT(4)SEQ ID NO3的信息(I) 序列特征
(1)長度26個堿基(2)類型核酸(3)鏈型單鏈(4)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(II)分子類型DNA(III)序列AAA TGT CCA ATT TAC TGA CCG TAC AC(5)SEQ ID NO4的信息(I)序列特征(1)長度20個堿基(2)類型核酸(3)鏈型單鏈(4)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(II)分子類型DNA(III)序列GGC TAA TCG CCA TCT TCC AG(6)SEQ ID NO5的信息(I)序列特征(1)長度24個堿基(2)類型核酸(3)鏈型單鏈(4)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(II)分子類型DNA(III)序列ATC GTC AAC CAC TAC ATC GAG ACA(7)SEQ ID NO6的信息(I)序列特征(1)長度22個堿基(2)類型核酸(3)鏈型單鏈(4)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(II)分子類型DNA(III)序列CTG AAG TCC AGC TGC CAG AAA C(8)SEQ ID NO7的信息(I)序列特征(1)長度21個堿基(2)類型核酸(3)鏈型單鏈(4)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(II)分子類型DNA(III)序列TGC TTG AGT AAC CCA GAA GTT(9)SEQ ID NO8的信息
(I)序列特征(1)長度21個堿基(2)類型核酸(3)鏈型單鏈(4)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(II)分子類型DNA(III)序列GCT GAA TCC AAC TGG AGA GGC(10)SEQ ID NO9的信息(I)序列特征(1)長度16個堿基(2)類型核酸(3)鏈型單鏈(4)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(II)分子類型DNA(III)序列AGC TCG AAG GGG TTC G(11)SEQ ID NO10的信息(I)序列特征(1)長度12個堿基(2)類型核酸(3)鏈型單鏈(4)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(II)分子類型DNA(III)序列CGA ACC CCT TCG
權(quán)利要求
1.獲得能在雜交后代中特異地刪除外源基因的轉(zhuǎn)基因植物的制備方法。包括從以下兩個不同的重組DNA序列穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。其中所述的第一個重組DNA序列包括兩端接有第一種能被特異性識別和剪接序列的編碼一種能改善植物某種性狀的蛋白質(zhì)的核苷酸序列，而且所述的第一個重組DNA序列還包括編碼能識別第二個重組DNA序列中能被特異性識別和剪接的第二種位點特異性重組酶的核苷酸序列。其中所述的第二個重組DNA序列包括兩端接有第二種能被特異性識別和剪接序列的編碼與第一個重組DNA序列中相同或者不同種能改善植物某種性狀的蛋白質(zhì)的核苷酸序列，而且所述的第二個重組DNA序列還包括編碼能識別第一個重組DNA序列中能被特異性識別和剪接的第一種位點特異性重組酶的核苷酸序列。并由此植物細(xì)胞再生得到的完整植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法。其中所說的第一個重組DNA序列中的第二種位點特異性重組酶的核苷酸序列不但包括它的蛋白質(zhì)編碼序列，并且還包括其編碼序列上游5’端非編碼區(qū)的啟動子序列以及下游3’端的終止子序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法。其中所說的第二種位點特異性重組酶選自于包含Cre，F(xiàn)LP，R編碼的位點特異性重組酶中的一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的方法。其中所說的第二種位點特異性重組酶的編碼序列上游的啟動子序列包括但并不僅限于35S啟動子序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法。其中所說的第一種能被特異性識別和剪接的核苷酸序列選自于包含能分別被Cre，F(xiàn)LP，R所識別并剪接的特異性DNA序列中的一種。它們分別為loxP，F(xiàn)RT和Rs。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法。其中所說的第一種能被特異性識別和剪接的核苷酸序列不能被第一個重組DNA序列中編碼的第二種位點特異性重組酶所識別并剪接。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法。其中所說的一種能改善植物某種形狀的蛋白質(zhì)可以是一種與抗蟲，抗除草劑或者可以抵抗各種不良環(huán)境等有關(guān)的的蛋白質(zhì)。包括但并不僅限于來源于蘇云金桿菌的Bt抗蟲基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法。其中所說的一種能改善植物某種形狀的蛋白質(zhì)的核苷酸序列不但包括該蛋白質(zhì)的編碼序列，還包括其編碼序列上游5’端非編碼區(qū)的啟動子序列和一些起表達(dá)調(diào)控功能的序列，以及下游3’端非編碼區(qū)的表達(dá)調(diào)控元件。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法。其中所說的啟動子序列包括但并不僅限于35S啟動子序列，所說的起表達(dá)調(diào)控功能的序列包括但并不僅限于Ω序列和Kozark序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法。其中所說的第二個重組DNA序列中的第一種位點特異性重組酶的核苷酸序列不但包括它的蛋白質(zhì)編碼序列，并且還包括其編碼序列上游5’端非編碼區(qū)的啟動子序列以及下游3’端的終止子序列。
全文摘要
本發(fā)明提供一種利用兩套位點特異性重組系統(tǒng)的協(xié)同作用獲得能在后代中特異地刪除外源基因的轉(zhuǎn)基因植物的制備方法。包括，從以下兩個不同的重組DNA序列穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞并由此再生得到的完整植株。其中所述的第一個重組DNA序列包括兩端接有第一種能被特異性識別和剪接序列的編碼一種能改善植物某種性狀的蛋白質(zhì)的核苷酸序列，而且所述的第一個重組DNA序列還包括編碼能識別第二個重組DNA序列中能被特異性識別和剪接的第二種位點特異性重組酶的核苷酸序列。其中所述的第二個重組DNA序列包括兩端接有第二種能被特異性識別和剪接序列的編碼與第一個重組DNA序列中相同或者不同種能改善植物某種性狀的蛋白質(zhì)的核苷酸序列，而且所述的第二個重組DNA序列還包括編碼能識別第一個重組DNA序列中能被特異性識別和剪接的第一種位點特異性重組酶的核苷酸序列。
文檔編號C12N15/82GK1392260SQ0211969
公開日2003年1月22日 申請日期2002年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月16日
發(fā)明者林忠平, 陳楊堅, 倪挺, 胡鳶雷, 丁偉, 高音 申請人:林忠平