專利名稱：一種具有廣譜殺蟲活性的蘇云金芽孢桿菌菌株及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有廣譜殺蟲活性的蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensisTm13-14菌株，還涉及該蘇云金芽孢桿菌菌株的制備方法。
背景技術(shù)：
蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis簡稱BT)是目前世界上應(yīng)用最廣泛、研究最深入的殺蟲微生物，因其能在產(chǎn)芽孢的同時產(chǎn)生對某些害蟲有特異毒殺性的伴孢晶體，而對人畜無毒、不傷害控制害蟲群體的天敵，且不污染環(huán)境，一直是生物防治的重要組成部分，BT殺蟲劑也是最廣泛的生物殺蟲劑。但是，不同的BT菌株對不同目的昆蟲具有毒殺特異性，1901年發(fā)現(xiàn)蘇云金芽孢桿菌以來，一直認(rèn)為僅對鱗翅目昆蟲有毒殺作用，直到1977年發(fā)現(xiàn)蘇云金芽孢桿菌以色列變種(subsp.israelensis)，對雙翅目蚊幼蟲有特異性敏感性。打破了長期以來認(rèn)為蘇云金芽孢桿菌只對鱗翅目昆蟲有效的固有觀點(diǎn)，不僅把應(yīng)用目標(biāo)擴(kuò)充到醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，還為研究不同毒力菌株的特異性提供了啟迪。以此為契機(jī)，對幾種鞘翅目幼蟲有毒效，而對鱗翅目和雙翅目無毒效的新菌株——擬步行甲亞種(subsp.tenebrionis)于1982年從聯(lián)邦德國分離出來。但是一個菌株對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目同時具有毒殺作用的廣譜殺蟲BT菌種尚未見到報道。這一殺蟲譜相對較窄的特性，在一定程度上制約BT殺蟲劑廣泛應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有廣譜殺蟲活性的蘇云金芽孢桿菌菌株，該菌株對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目具有毒殺作用，利用該菌株能開發(fā)出一種廣譜、高效的BT殺蟲劑。
本發(fā)明另一個目的在于提供一種制備蘇云金芽孢桿菌菌株的方法。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施從黃粉蟲(Tenebrio molitor)蟲尸分離的一株蘇云金芽孢桿菌。用發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，培養(yǎng)至伴孢晶體脫落。對小菜蛾、甜菜夜蛾、致倦庫蚊、馬鈴薯瓢蟲進(jìn)行生物測定，對上述供試?yán)ハx均顯示較強(qiáng)殺蟲作用。對該菌株進(jìn)行血清學(xué)、形態(tài)學(xué)、生理生化特征分析。其命名為蘇云金芽孢桿菌Bacillusthuringiensis Tm13-14。該菌株在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC NOM202004。
其步驟是
1.將蟲尸經(jīng)表皮消毒、研碎，置于裝有5ml的營養(yǎng)培養(yǎng)液中，經(jīng)75-80℃，水浴14-20分鐘，振蕩培養(yǎng)46-52小時。
2.將培養(yǎng)液稀釋至10-7-10-8倍，涂布到分離培養(yǎng)基上，28-30℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)3-4天，挑選產(chǎn)生晶體、芽孢單菌落。
3.將單菌落純化，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，至伴孢晶體脫落。
4.將發(fā)酵液稀釋，進(jìn)行靶標(biāo)昆蟲的生物測定。
5.菌株的形態(tài)學(xué)描述。
6.血清學(xué)及生理生化特征分析。
蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensis Tm13-14的性質(zhì)根據(jù)上述實施方法，得到一株對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目同時具有毒殺作用的蘇云金芽孢桿菌菌株，命名為蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensisTm13-14，該菌株于2002年1月31日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC NOM202004。
1.蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensis Tm13-14菌株的殺蟲活性該菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)至伴孢晶體脫落，發(fā)酵液稀釋800-2000倍，對鱗翅目昆蟲小菜蛾(Plutella xylostella)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigue)、雙翅目昆蟲致倦庫蚊(Culex pipiens quinquefasciatces)和鞘翅目昆蟲馬鈴薯瓢蟲(Epilachnaniponica)，致死率為70-90％。顯示出較強(qiáng)的毒殺作用。
2.蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensis Tm13-14菌株的形態(tài)特征營養(yǎng)細(xì)胞桿狀，兩端鈍圓，周身鞭毛、芽孢囊不膨大，芽孢橢圓形，端生。伴孢晶體呈球形、不規(guī)則形、方形和棱形。
3.蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensis Tm13-14菌株的血清學(xué)及生理生化特征鞭毛抗原分析屬H1血清型。V.P反應(yīng)+；卵磷脂酶+；精氨酸脫羧酶+；尿酶-；菌膜+；幾丁質(zhì)-；蛋白質(zhì)水解酶+；淀粉水解酶++；水楊苷+；七葉靈+++；蔗糖+；甘露糖+。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明選擇了鱗翅目主要害蟲(小菜蛾、甜菜夜蛾)，雙翅目主要害蟲(致倦庫蚊)，鞘翅目主要害蟲(馬鈴薯瓢蟲)為靶標(biāo)昆蟲，蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensis Tm13-14同時對上述3個目的主要害蟲，均具有較強(qiáng)的毒殺作用。具有農(nóng)業(yè)上的重要性，既有經(jīng)濟(jì)意義也有廣泛的市場需求，有利于廣譜BT殺蟲劑產(chǎn)品的開發(fā)、生產(chǎn)及推廣。目前市場上BT殺蟲劑產(chǎn)品僅對單一目昆蟲有效，即或者對鱗翅目、或者對雙翅目、或者對鞘翅目昆蟲有效，同時對3個目昆蟲有效的BT殺蟲劑產(chǎn)品尚未見報道。
1.菌種分離、培養(yǎng)將蟲尸經(jīng)表皮消毒、研碎，置于裝有5ml的營養(yǎng)培養(yǎng)液中，經(jīng)78℃，水浴15分鐘，振菌培養(yǎng)48小時。將培養(yǎng)液稀釋至10-7-10-8倍，涂布到分離培養(yǎng)基上，30℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)3天，鏡檢挑選產(chǎn)生伴孢晶體的單菌落。
營養(yǎng)培養(yǎng)液蛋白胨1％ 牛肉膏0.3％ NaCl0.5％ PH7.5。
分離培養(yǎng)基蛋白胨1％ 牛肉膏0.3％ NaCl0.5％ 瓊脂2％ PH7.5。
2.菌種搖瓶發(fā)酵將分離純化菌株用發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，500ml的搖瓶裝量80ml，搖床轉(zhuǎn)速為230rpm，培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)時間72小時。取樣涂片顯微鏡觀察，伴孢晶體脫落50％，無污染且菌株生長良好的發(fā)酵液用于生物測定。
發(fā)酵培養(yǎng)基淀粉2％ 豆粕3％ 酵母粉0.3％ CaCO30.1％ PH8.5。
3.生物測定將發(fā)酵液稀釋至800-2000倍，放入一定量的靶標(biāo)昆蟲，置入26℃溫箱中，72小時后計算供試?yán)ハx死亡率。
權(quán)利要求
1.一種具有廣譜殺蟲活性的蘇云金芽孢桿菌菌株，其特征在于蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensis Tm13-14，CCTCC NOM202004。
2.一種實現(xiàn)權(quán)利要求1所述的蘇云金芽孢桿菌菌株的制備方法，包括下列步驟A、將蟲尸經(jīng)表皮消毒、研碎，置于裝有5ml的營養(yǎng)培養(yǎng)液中，經(jīng)75-80℃，水浴14-20分鐘，振蕩培養(yǎng)46-52小時；B、將培養(yǎng)液稀釋至10-7-10-8倍，涂布到分離培養(yǎng)基上，28-30℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)3-4天，挑選產(chǎn)生伴孢晶體的單菌落；C、將單菌落純化，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，至伴孢晶體脫落；D、將發(fā)酵液稀釋，進(jìn)行靶標(biāo)昆蟲的生物測定。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種具有廣譜殺蟲活性的蘇云金芽孢桿菌菌株的制備方法，其特征在于營養(yǎng)培養(yǎng)液為蛋白胨1％、牛肉膏0.3％、NaCl0.5％、PH7.5。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種具有廣譜殺蟲活性的蘇云金芽孢桿菌菌株的制備方法，其特征在于分離培養(yǎng)基為蛋白胨1％、牛肉膏0.3％、NaCl0.5％、瓊脂2％、PH7.5。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種具有廣譜殺蟲活性的蘇云金芽孢桿菌菌株的制備方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基為淀粉2％、豆粕3％、酵母粉0.3％、CaCO30.1％、PH8.5。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種具有廣譜殺蟲活性的蘇云金芽孢桿菌菌株的制備方法，其特征在于將發(fā)酵液稀釋至800-2000倍，放入靶標(biāo)昆蟲，置入26℃溫箱中，72小時后計算昆蟲死亡率。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有廣譜殺蟲活性的蘇云金芽孢桿菌菌株及制備方法,蘇云金芽孢桿菌Bacillusthuringiensis Tm13－14,CCTCC NO:M202004。首先對蟲尸經(jīng)表皮消毒、研碎,置于營養(yǎng)培養(yǎng)液中,振蕩培養(yǎng)一定時間;其次是將培養(yǎng)液稀釋,涂布到分離培養(yǎng)基上,恒溫箱中倒置培養(yǎng);再是將單菌落純化,接種于發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶發(fā)酵,至伴孢晶體脫落;第四是將發(fā)酵液稀釋,進(jìn)行靶標(biāo)昆蟲的生物測定。本發(fā)明具有殺蟲譜廣,殺蟲活性較高,對小菜蛾、甜菜夜蛾、致倦庫蚊、馬鈴薯瓢蟲等昆蟲均具有毒殺作用。
文檔編號C12N1/20GK1368549SQ02115580
公開日2002年9月11日 申請日期2002年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月6日
發(fā)明者閻建平, 鄭大勝, 袁志明, 羅紹彬, 王惠杰 申請人:中國科學(xué)院武漢病毒研究所