專利名稱：St13基因5'端啟動功能區(qū)序列及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種DNA序列，更具體地，本發(fā)明涉及的序列包含有調(diào)控與其相接的基因的轉(zhuǎn)錄的功能。可構(gòu)件表達(dá)載體，用于基因功能研究與開發(fā)。
背景技術(shù)：
ST13(又名SNC6、HSU17714)是發(fā)明人對正常人腸粘膜組織和腸癌組織進(jìn)行減式雜交時克隆到的一個人類基因。ST13的全長cDNA已得到并進(jìn)行了序列分析，且登錄于GenBank(登錄號U17714)。該3145bp長的cDNA編碼一個由369個氨基酸殘基組成的孕激素受體相關(guān)分子伴侶，可以與Hsp70相互作用。發(fā)明人已將此基因定位于人染色體22q13。GenBank收錄的一個編號為Z98048的PAC克隆序列覆蓋了整個ST13基因。據(jù)此，發(fā)明人分析了ST13的基因組結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)ST13共有12個外顯子，編碼區(qū)跨度為32017bp(在Z98048序列中nt71529至nt39512)，作了進(jìn)一步的研究，推進(jìn)了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種DNA序列，具有調(diào)控與其相接的基因的轉(zhuǎn)錄的功能，可構(gòu)件各種哺乳動物的表達(dá)載體，用于基因功能的研究與基因工程的開發(fā)。
本發(fā)明提供的DNA序列，位于ST13基因5’端啟動功能區(qū)，該功能區(qū)位于1-1814片段，具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
本發(fā)明提供的DNA序列內(nèi)含有二個增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄功能區(qū)，分別位于1-471片段、1262-1478片段，含有一個抑制轉(zhuǎn)錄功能區(qū)，位于471-1262片段，還含有一個基本轉(zhuǎn)錄功能區(qū)，位于1478-1814片段。
本發(fā)明提供的DNA序列的部分或全部，或基于該DNA序列的部分或全部而改造的序列可構(gòu)建表達(dá)載體。
本發(fā)明提供的DNA序列內(nèi)含的二個增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄功能區(qū)的部分或全部序列，或者基于其改造的部分或全部序列可構(gòu)建表達(dá)載體。
本發(fā)明提供的DNA序列內(nèi)含的一個抑制轉(zhuǎn)錄功能區(qū)的部分或全部序列，或者基于其改造的部分或全部序列可構(gòu)建表達(dá)載體。
本發(fā)明提供的DNA序列該DNA序列內(nèi)含的一個基本轉(zhuǎn)錄功能區(qū)的部分或全部序列，或者基于其改造的部分或全部序列可構(gòu)建表達(dá)載體。
由本發(fā)明所提供的DNA序列及內(nèi)含的各功能區(qū)的DNA序列，以及基于這些序列而改造的部分或全部序列所構(gòu)建的表達(dá)載體，在基因治療和基因工程生產(chǎn)的藥物中的應(yīng)用。


圖1為ST13的基因組結(jié)構(gòu)順序。
圖2為啟動功能區(qū)DNA序列內(nèi)增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄功能區(qū)、抑制轉(zhuǎn)錄功能區(qū)及基本轉(zhuǎn)錄功能區(qū)。
圖3為用ST135’端區(qū)域片段構(gòu)建的熒光素酶報告載體。
圖4為ST13基因5’端不同片段轉(zhuǎn)染后熒光素酶活性分析。
具體實施例方式
通過以下實施例對本發(fā)明的技術(shù)特征作詳細(xì)描述。
實施例一大腸癌相關(guān)基因ST13(SNC6)的基因組結(jié)構(gòu)分析及其5′端區(qū)域的克隆一、材料大腸桿菌XL1-Blue，美國Stratagene公司產(chǎn)品。常規(guī)保存于含四環(huán)素LB平板。所有培養(yǎng)基，限制酶和其它工具酶均購自美國Life Technologies公司。
二、ST13(SNC6)的基因組結(jié)構(gòu)分析及其5′端區(qū)域的克隆應(yīng)用美國國立衛(wèi)生圖書館基因庫(NCBI)的Blast程序(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)，在人類染色體22q13(編號Z98048)的PAC克隆上(408N23)找到ST13(SNC6)的全長cDNA的同源序列。通過對ST13(SNC6)的基因組結(jié)構(gòu)順序的分析，根據(jù)ST13(SNC6)的全長cDNA的序列設(shè)計其5′端區(qū)域PCR引物如下5’-GGT ACC TTT AGT CAG GCT GGGGAG-3’(上游)，5’-CCT CGA GGT AGG GAG GTG GTG GGC GA-3’(下游)。提取正常人外周血淋巴細(xì)胞的基因組DNA作為PCR反應(yīng)模板，進(jìn)行擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物(1894 bp)克隆到pGEM-T-Easy載體(Promega，USA)上，經(jīng)限制性內(nèi)切酶KpnI，XhoI，EcoRI，MluI和SacI酶切產(chǎn)生不同大小的片段(見下文)。所有片段均亞克隆至熒光素酶報告載體pGL2-Basic，pGL2-Promoter andpGL2-Enhancer(Promega，USA)上。見SEQ ID NO 1核酸序列。
三、結(jié)果依據(jù)PAC克隆408N23(GenBank數(shù)據(jù)庫編號Z98048)對ST13(SNC6)的全長cDNA進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)ST13(SNC6)共有12個外顯子，在Z98048序列中覆蓋了32017bp(nt71529至nt39512)。參見表1和圖1。表1.ST13基因中外顯子和內(nèi)含子的分布長度(bp) 在Z98048中的位置exon184 71529-71345intron 555071344-65795exon58 65794-65737intron 245365736-63284exon76 63283-63208intron 338463207-59824exon71 59823-59753intron 414659752-55607exon67 55606-55540intron 473855539-50802exon85 50801-50717intron 131 50716-50585exon111 50584-50474intron 288850473-47586exon103 47585-47483intron 161147482-45871exon117 45870-45754intron 116445753-44589exon49 44588-44540intron 239644539-42144exon134 42143-42010intron429 42009-41581exon 207241580-39513用PCR法擴(kuò)增5′端1894bp長度的DNA片段(1至1894)，經(jīng)KpnI，XhoI，EcoRI，MluI和SacI酶切產(chǎn)生一系列片段。這些不同大小的片段亞克隆到pGL2熒光素酶報告載體上，并可在進(jìn)一步分析中用于轉(zhuǎn)染。參見圖2、圖3(其中1，7，13φX174/HaeIII分子量標(biāo)記；2pGL2-Basic載體；3pGL2-Basic-1894/KpnI+XhoI酶切；4pGL2-Basic-1423/KpnI+XhoI酶切；5pGL2-Basic-632/MluI+XhoI酶切；6pGL2-Basic-416/SacI+XhoI酶切；8pGL2-Enhancer載體；9pGL2-Enhancer-1894/KpnI+XhoI酶切；10pGL2-Enhancer-1423/KpnI+XhoI酶切；11pGL2-Enhancer-632/MluI+XhoI酶切；12pGL2-Enhancer-416/SacI+XhoI酶切；14pGL2-Promoter載體；15pGL2-Promoter-1894/KpnI+XhoI酶切；16pGL2-Promoter-1423/KpnI+XhoI酶切；17pGL2-Promoter-632/MluI+XhoI酶切；18pGL2-Promoter-416/SacI+XhoI酶切)。
實施例二ST13基因5’端啟動功能區(qū)序列及應(yīng)用研究一.材料ST13基因5’區(qū)域片段亞克隆至熒光素酶報告載體pGL2-Basic，pGL2-Promoter and pGL2-Enhancer(Promega，USA)上(見實施例一)，大腸癌細(xì)胞系SW620獲自ATCC，胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)液為Life Technologies，Inc.產(chǎn)品，轉(zhuǎn)染試劑SuperFect為美國QIAGEN公司產(chǎn)品，熒光素酶檢測系統(tǒng)為美國Promega公司產(chǎn)品，VICTORTM多功能酶標(biāo)儀為芬蘭Wallac Oy公司產(chǎn)品。
二、轉(zhuǎn)染大腸癌細(xì)胞系SW620在含10％胎牛血清的RPMI1640(100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素)中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前一天以2×105個/孔的細(xì)胞密度接種于24孔板。轉(zhuǎn)染當(dāng)天，在1.5ml eppendorf管中將各種熒光素酶報告載體質(zhì)粒DNA各2μg溶于RPMI1640(不含血清和抗生素)，終體積60μl，加入5μlSuperFect轉(zhuǎn)染試劑(QIAGEN，美國)，充分混勻。室溫放置7分鐘，加入350μl RPMI1640(含血清和抗生素)，充分混勻，用PBS洗滌24孔板上SW620細(xì)胞一次，加樣轉(zhuǎn)染復(fù)合物至細(xì)胞(每種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染3孔)。37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞3小時，每孔中加入500μl含血清和抗生素的RPMI1640，繼續(xù)培養(yǎng)至收獲。
三、熒光素酶檢測轉(zhuǎn)染后48小時收獲細(xì)胞，用熒光素酶檢測系統(tǒng)(Promega，美國)檢測熒光素酶活性。操作參照廠家提供的說明用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，每孔加1×裂解液50μl。將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)入1.5ml eppendorf管，13,000rpm離心30秒。收集上清貯存于-70℃。檢測時，在96孔板上迅速混勻20μl上清和100μl熒光素酶檢測試劑(二者均預(yù)溫至室溫)，在VICTORTM多功能酶標(biāo)儀(Wallac Oy，芬蘭)上讀取數(shù)據(jù)。
四、結(jié)果參見表2和圖4，所有轉(zhuǎn)染含上述5′端片段重組質(zhì)粒的SW620細(xì)胞均表現(xiàn)出熒光素酶活性。檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了三個含1894bp長度片段的pGL2載體的細(xì)胞熒光素酶活性最高，轉(zhuǎn)染了三個含416bp片段的pGL2載體的細(xì)胞活性最低，而轉(zhuǎn)染了含632bp片段的pGL2載體的細(xì)胞熒光素酶活性高于轉(zhuǎn)染了含1423bp片段的pGL2載體的細(xì)胞。這些數(shù)據(jù)提示ST13表達(dá)的基本轉(zhuǎn)錄起始因子(啟動子)位于1478至1814；兩個轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)因子(增強(qiáng)子)位于1至471和1262至1478；一個轉(zhuǎn)錄抑制因子(沉默子)位于471至1262的片段上。表2.不同重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的SW620細(xì)胞提取物熒光素酶活性

圖4中Blank無載體轉(zhuǎn)染對照；ControlpGL2-Control載體轉(zhuǎn)染；B1.9pGL2-Basic-1894載體轉(zhuǎn)染；B1.4pGL2-Basic-1423載體轉(zhuǎn)染；B0.6pGL2-Basic-632載體轉(zhuǎn)染；B0.4pGL2-Basic-416載體轉(zhuǎn)染；P1.9pGL2-Promoter-1894載體轉(zhuǎn)染；P1.4pGL2-Promoter-1423載體轉(zhuǎn)染；P0.6pGL2-Promoter-632載體轉(zhuǎn)染；P0.4pGL2-Promoter-416載體轉(zhuǎn)染；E1.9pGL2-Enhancer-1894載體轉(zhuǎn)染；E1.4pGL2-Enhancer-1423載體轉(zhuǎn)染；E0.6pGL2-Enhancer-632載體轉(zhuǎn)染；E0.4pGL2-Enhancer-416載體轉(zhuǎn)染。
通過利用本發(fā)明提供的DNA序列，可以構(gòu)建各種哺乳動物的表達(dá)載體，用于基因功能研究和基因工程的開發(fā)。
無需進(jìn)一步詳細(xì)闡述，相信采用前面所公開的內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員可最大限度地應(yīng)用本發(fā)明。因此，前面的優(yōu)選具體實施方案應(yīng)被理解為僅是舉例說明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。SEQ ID NO1GGCTCCTTTA GTCAGGCTGG GGAGAGCCTT TCAAATAAAA GCAAATTCCA GGCCTGGGGCGGTGGCTCAG AGAGGAGGGT GGATCGCTTG AGGCCAGGAG TTCGAGATCA GCTTGGCCAACGTGGCAAAA CCTGGTTTCT ACTACAATTA CAAAAATTAG CCAGGCGTGG TGGCACACGCCTATAATCCC AGCTACCTCG GGAGGCTGAG GCACGAGAAT TGCTTGAACT CAGGAGGCAGAGGTTGCAAA TGAGCAGAGA TTGCCACTGC ACTCCAGTCT GAGCAACAGA ATGAGAGCCTGTCTCAAAAA AAGACTGAAA AATTGCACAT CTTTCTTTTC ACCTAATCCC ACGGAGAGTTGTCTTTCTGC AGCTTTACTA TGAGAACTGA AGAACAAGTT CTGTGCACTG GACAATAACTTTTTATTTTT TATAGTAAGA AGTCGATGTA ATTAACATTC CATTTTAAAT GAATTCAAGTATATCAACAT AAACATATGC CAAGACATAG CTTTGATGTC AAATACCATA CGTTCTGGTTCACACATTGT TCATATATTG ACCCAAAAAA CTGAAATACG ATCCAATGGC AGATCCGCCTGCAAGGAAGG TGATTCAGTT TTCACTGATT AAGCTTTATG TTCATCAGAT TAATTGCTCGCAATAGAGGA CACCCTACAA AAAATTATTC TCCTTATCCT TCGTCTTGTC TTTGCAAACAGGACTTTCAG ACACAGAACG CCCCAGAAGT ATTTCGAAAC AGTTACCTCT CCTAAGAGGAGCTGCTGAAA GAATTTGTTA CTAAACATGC TTCGTGTATA TTCTGGAGCA AGCTCTCACGCCTAACAGAA ACAAGAGCTA CTTGATGTGA GACACTTTGT CACTTAAGTG TGATAATTGCCACAACTTCG GAGTCCGAGT AACTTGGAAG ACAGCCCCTC TGGGGGATGG CACACTTTTCTCTCTGCAGT CATTTCGGCT TCACAAAATA CCTCAACGGT AGAGAACACA CTGGGCCCACCCCTTTCCAG GAGCAGCCGG TATAGAAGAA ATCCGCGGAG CACAGAGGGT TGGGGAGCGGAGGCCCCACC AGGAGAAGGG TCAGCCGAAC CAGGGATCGC CTGAGACCAA CTTGGGTCCCTCCAGGGGAC ACCATGGGAG GAGACCGTGG GAGAAGAGTC TAACCTGAGA GGCCGCGGACGTTTGCTACA GCGGGAACCA GCTTGGGGGC TGAGAGCAGC CAAGGCATTA CGGCCTAACTCACGCGTCGG GAAGAGAAAG AGGGTAACGA CGGGGAACGC AACCGCCTGC AGGGCCGCGTCGCCAGGAAA CCGGGCCAGC CGCACCTCCC CTTCCGGCGG AGGCGGCTCG CGGGCCTTCCTTGCGCGGCG GCGCAGGTTG TGACGTCATG CCCCGAGCTG GGACCGACCC TCCGGCTCCACGCCCTTTTT TTTTTTTTTT TTTAGGTCCC GGGCGTTGAG CTCTACTCAG TGCACGCAGCCACACAATAT GCTCTTGGAC GTCGCCCCCT GGAGGGGATG TTATCTCCCG CCTCCTTGAAGTCGCCCATT TCTGGGGTTG CCCCATCCAG GGAGCTGGTT CCTAGTTAAG AATATGAGAATGTATGCGCA GGGAGGCAGG CAACAGCACG AACAGCCACG CTTCTAGAAG ATTCTAGGGAGCGCGCAGGA GCAGCGCAGA GGGAGTAGGA ATGAGCAGGC GGAGGACCCG AGGTCACGAGACCGTTGGGT GGGAGGAGCC AGCGGCCGGG GAGGTTCTAG TCTGTTCTGT CTTGCGGCAGCCGCCCCCTT CTGCGCGGTC ACGCCGAGCC AGCGCCTGGG CCTGGAACCG GGCCGTAGCCCCCCCAGTTT CGCCCACCAC CTCCCTACCA TGGA
權(quán)利要求
1.一種DNA序列，位于ST13基因5’端啟動功能區(qū)，其特征是該功能區(qū)位于1-1814片段，具有SEQ ID NO1的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA序列，其特征是該DNA序列含有二個增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄功能區(qū)，分別位于1-471片段、1262-1478片段，含有一個抑制轉(zhuǎn)錄功能區(qū)，位于471-1262片段，還含有一個基本轉(zhuǎn)錄功能區(qū)，位于1478-1814片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA序列，其特征是基于該DNA序列的部分或全部構(gòu)建的表達(dá)載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA序列，其特征是基于該DNA序列的部分或全部而改造的序列構(gòu)建的表達(dá)載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的DNA序列，其特征是它內(nèi)含的二個增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄功能區(qū)的部分或全部序列，或者基于其改造的部分或全部序列構(gòu)建的表達(dá)載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的DNA序列，其特征是基于它內(nèi)含的一個抑制轉(zhuǎn)錄功能區(qū)的部分或全部序列，或者基于其改造的部分或全部序列構(gòu)建的表達(dá)載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的DNA序列，其特征是它內(nèi)含的一個基本轉(zhuǎn)錄功能區(qū)的部分或全部序列，或者基于其改造的部分或全部序列構(gòu)建的表達(dá)載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-2所述的DNA序列，其特征是由這些功能區(qū)所構(gòu)建的表達(dá)載體在基因治療和基因工程生產(chǎn)藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種DNA序列，該序列位于ST13基因5’端啟動功能區(qū)。本發(fā)明提供的DNA序列內(nèi)含有二個增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄功能區(qū)，一個抑制轉(zhuǎn)錄功能區(qū)和一個基本轉(zhuǎn)錄功能區(qū)，具有調(diào)控與其相接的基因的轉(zhuǎn)錄的功能。可構(gòu)件表達(dá)載體，用于基因功能研究與基因工程開發(fā)。
文檔編號C12N15/11GK1434120SQ0211062
公開日2003年8月6日 申請日期2002年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月21日
發(fā)明者鄭樹, 曹江, 葉景佳, 耿禮義, 方永明 申請人:浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院