專利名稱：經(jīng)過密碼子最優(yōu)化的乳頭狀瘤病毒序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在治療和預(yù)防人類乳頭狀瘤病毒感染以及與其相關(guān)的癥狀和疾病中有用的方法和組合物。
已發(fā)現(xiàn)在多種物種，包括綿羊，狗，兔子，猴子，牛和人中有乳頭瘤病毒的感染。人乳頭瘤病毒(HPV)已分出超過80個(gè)型別(Epideminlogy andBiology of Cervical Cancer.Seminars in Surgical Oncology 1999 16203-211)。如果L1基因與以前鑒定的型別的L1序列的同一性低于90％，那么這種型別可確定為新的型別，如果L1序列同一性是在90到98％之間則為亞型，同一性在98％以上為變體(與原型(親代類型)相比)。乳頭瘤病毒通常感染上皮細(xì)胞，但不同型別的HPV引起不同的疾病。例如，1-4，7，10和26-29型的乳頭瘤病毒引起良性皮下疣，16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59和68型的乳頭瘤病毒與宮頸癌有關(guān)，6和11型的乳頭瘤病毒與尖銳濕疣(生殖道的非惡性濕疣)有關(guān)。
大部分尖銳濕疣(＞90％)包含HPV基因型6和11。然而，HPV-6是在單純感染中鑒定出來的最常見的基因型，HPV-6和HPV-11偶爾發(fā)生在同一損傷中。疣通常發(fā)生在受感染個(gè)體的多個(gè)部位，并且60％以上的配偶有尖銳濕疣的患者發(fā)生損傷，潛伏期平均為3個(gè)月。目前對(duì)其有多種方法進(jìn)行治療。然而，它們依賴切除或脫落和/或局部應(yīng)用凝膠制劑和膏劑。它們引起疼痛，可能需要頻繁就醫(yī)，但效力有很大不同。疾病的復(fù)發(fā)仍是有效控制該種疾病所面臨的顯著問題。
尖銳濕疣可自然退化，退化的主要原因可能是細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。自然退化高發(fā)生率提示宿主的細(xì)胞免疫可解決該種臨床疾病，從而使免疫治療成為治療或預(yù)防尖銳濕疣的一種選擇。控制該種疾病的目標(biāo)是特異性針對(duì)病毒的治療，所述治療是無痛的，僅需要極少次的診治，具有很高的疾病治愈率和可降低疾病的復(fù)發(fā)/使疾病極少?gòu)?fù)發(fā)。
已證明HPV在組織培養(yǎng)中很難生長(zhǎng)，所以沒有傳統(tǒng)的活的或減毒的病毒疫苗。由于缺乏適當(dāng)?shù)脑谄渲醒芯咳瞬《镜膭?dòng)物模型，所以HPV疫苗的開發(fā)滯后。因?yàn)樗霾《臼歉叨确N屬特異性的，所以不可能用人乳頭瘤病毒感染具有免疫力的動(dòng)物，而這正是疫苗第一次在人體內(nèi)試用之前進(jìn)行安全檢測(cè)所必需的。
乳頭瘤病毒具有編碼“早期”和“晚期”基因(稱為E1到E7，L1和L2)的DNA基因組。所述早期基因序列已顯示具有如下功能與病毒DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄有關(guān)，與逃避宿主的免疫有關(guān)，與正常宿主細(xì)胞周期的改變有關(guān)以及與其它過程有關(guān)。例如E1蛋白是一種ATP依賴的DNA解旋酶，參與病毒DNA復(fù)制過程的起始，E2是一種調(diào)控蛋白，控制病毒基因的表達(dá)和DNA的復(fù)制。E2通過其既結(jié)合E1又結(jié)合病毒復(fù)制起點(diǎn)的作用，使E1在所述起點(diǎn)局部聚集，從而，刺激病毒DNA的復(fù)制起始。E4蛋白具有多種沒確定的功能，但結(jié)合宿主細(xì)胞骨架屬于上述功能，E5延遲內(nèi)體的酸化，導(dǎo)致細(xì)胞表面的EGF受體表達(dá)增加，已知E6和E7各自都能結(jié)合細(xì)胞蛋白p53和pRB。E6和E7蛋白形成與宮頸癌有關(guān)的HPV型別，是已知的致癌基因。L1和L2編碼兩種病毒結(jié)構(gòu)(衣殼)蛋白。
疫苗在歷史上一直被視為預(yù)防病原體感染的一種方式，如果發(fā)生感染，疫苗可激發(fā)免疫系統(tǒng)，以識(shí)別并中和病原體。疫苗包含一種或多種來自病原體的抗原通常是已滅活的或減毒的完整生物體，或者是來自所述生物體的特定抗原肽。當(dāng)將免疫系統(tǒng)暴露于抗原時(shí)，產(chǎn)生使個(gè)體終生保持對(duì)所述抗原免疫“記憶”的細(xì)胞。再次接觸相同抗原(例如感染所述病原體時(shí))刺激特異性免疫應(yīng)答，從而清除感染的病原體或使感染的病原體失活。
有兩種武器進(jìn)行免疫應(yīng)答，即體液(抗體)應(yīng)答和細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答。衍生自細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的病原體(病毒和某些細(xì)菌)的蛋白抗原在受感染的宿主細(xì)胞內(nèi)加工，釋放短肽，然后這些短肽與I類主要組織相容性分子(MHC-I)結(jié)合并展示在受感染的細(xì)胞表面。當(dāng)該MHC I肽結(jié)合復(fù)合物與抗原特異性CD8+T細(xì)胞相遇時(shí)，所述T細(xì)胞被活化，獲得細(xì)胞毒活性。這些細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTLs)能裂解已被感染的宿主細(xì)胞，從而限制感染病原體的復(fù)制和傳播。免疫應(yīng)答的另一重要武器受控于CD4+T細(xì)胞。衍生自病原體的抗原釋放到細(xì)胞外環(huán)境，然后被專職抗原呈遞細(xì)胞(APCs)攝取，和MHC II類分子結(jié)合并共同展示在這些細(xì)胞表面。對(duì)該復(fù)合物中抗原的識(shí)別刺激CD4+T細(xì)胞分泌可溶性因子(細(xì)胞因子)，它們調(diào)節(jié)其它T細(xì)胞的效應(yīng)機(jī)制。B細(xì)胞產(chǎn)生抗體?？乖c分泌型抗體的結(jié)合可中和病原體的感染性。抗原與B細(xì)胞表面膜結(jié)合型抗體的結(jié)合可刺激B細(xì)胞的分裂，從而擴(kuò)大B細(xì)胞的應(yīng)答。通常，對(duì)控制病原體的感染而言，抗體和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(CD8+和CD4+)都是需要的。
據(jù)信，甚至在發(fā)生病原體感染之后，利用免疫系統(tǒng)滅活或清除病原體從而控制和消除感染都是可能的。盡管體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答都能被激發(fā)，但這種免疫治療(也可以稱為“治療性”疫苗或免疫治療物)更需要細(xì)胞免疫應(yīng)答來發(fā)揮作用。
已發(fā)現(xiàn)(Benvenisty，N and Reshaf，L.PNAS 83 9551-9555)用硫酸鈣沉淀的DNA接種小鼠可引起由該DNA編碼的肽的表達(dá)。隨后，觀察小鼠肌肉內(nèi)注射未經(jīng)沉淀的質(zhì)粒DNA，發(fā)現(xiàn)所述DNA被攝入到所述肌肉細(xì)胞中，并表達(dá)所編碼的蛋白。因?yàn)镈NA的表達(dá)導(dǎo)致宿主細(xì)胞中所編碼的病原體蛋白的產(chǎn)生(如天然感染的狀況)，這種機(jī)制可以刺激免疫治療或治療性免疫接種所需的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，因此基于DNA的藥物可用作預(yù)防性疫苗或免疫治療。對(duì)DNA疫苗的描述參考WO 90/11092(Vical，Inc.)。
DNA疫苗除了肌肉內(nèi)注射外，可用多種機(jī)制傳輸。例如可傳輸?shù)狡つw內(nèi)，該種傳輸利用了在這些作為感染屏障的皮膚和粘膜等組織中免疫機(jī)制高度活化的優(yōu)勢(shì)。皮膚內(nèi)傳輸可通過注射，使用噴射式注射器(在壓力下強(qiáng)迫液體進(jìn)入皮膚，或下面的組織包括肌肉)或利用粒子轟擊(particlebombardment)，其中將DNA以足夠的密度包被到粒子上以便穿過上皮(美國(guó)專利5371015)。例如，將核苷酸序列摻入質(zhì)粒中，所述質(zhì)粒被包被到金粒上，然后將該金粒在高壓下給藥到表皮，如Haynes等所述J.Biotechnology4437-42(1996)。將這些粒子發(fā)射到皮膚中，導(dǎo)致表皮細(xì)胞和表皮朗罕氏細(xì)胞的直接轉(zhuǎn)染。朗罕氏細(xì)胞是抗原呈遞細(xì)胞(APC)，其攝取DNA，表達(dá)所編碼的肽并進(jìn)行加工，展示在細(xì)胞表面MHC蛋白上。被轉(zhuǎn)染的朗罕氏細(xì)胞遷移到淋巴結(jié)，在那兒它們將所展示的抗原片段呈遞給淋巴細(xì)胞，引發(fā)免疫應(yīng)答。通過粒子介導(dǎo)的皮膚內(nèi)傳輸僅需要極少量的DNA(少于1μg，通常少于0.5μg)便能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，這與直接肌肉注射后產(chǎn)生免疫應(yīng)答所需的毫克量的DNA形成對(duì)比。
在轉(zhuǎn)染后的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如HeLa，293，或CHO細(xì)胞中表達(dá)和檢測(cè)HPV蛋白已證明通常是困難的，為進(jìn)行那些需要能檢測(cè)蛋白表達(dá)的生物化學(xué)和免疫學(xué)研究，或?yàn)閷?duì)純蛋白進(jìn)行定量，通常使用大腸桿菌，桿狀病毒或酵母蛋白表達(dá)系統(tǒng)。在這些系統(tǒng)中，蛋白產(chǎn)量足夠進(jìn)行功能性分析和純化，以及隨后的生物化學(xué)和免疫學(xué)研究。然而，直接的蛋白檢測(cè)法(例如Western印跡)通常不能檢測(cè)感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中E1蛋白的表達(dá)，甚至在使用具有強(qiáng)啟動(dòng)子如CMV或SV40的載體時(shí)也不能如此。對(duì)方法進(jìn)行設(shè)計(jì)以增加哺乳動(dòng)物細(xì)胞中E1蛋白的表達(dá)，所述方法包括克隆E1基因的5’側(cè)翼序列(Remm et al.J.Virol 1999 73，3062-3070)和在轉(zhuǎn)染后擴(kuò)增轉(zhuǎn)染的E1質(zhì)粒載體(Zou et al.J.Virol 1998 72，3436-3441)。通過轉(zhuǎn)染后的復(fù)制來擴(kuò)增輸入的載體質(zhì)粒具有增加細(xì)胞中E1基因拷貝數(shù)的最終作用，如此可提高蛋白水平，從而便于蛋白的檢測(cè)(通過Western印跡)。因?yàn)镋1蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)和檢測(cè)是難以解決的，所以有作者已經(jīng)求助于用兔網(wǎng)織紅細(xì)胞系統(tǒng)(Promega)，用35S標(biāo)記的蛋氨酸，通過體外的轉(zhuǎn)錄-翻譯檢測(cè)所述蛋白的表達(dá)(Gopalakrishnan et al.Virology 1999 256，330-339.，Safari et al. Virology1995 211，385-396)。然而，這是一種無細(xì)胞系統(tǒng)，其需要應(yīng)用修飾的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子包含來自噬菌體T7的結(jié)合RNA聚合酶的序列。
E1蛋白的表達(dá)還可通過檢測(cè)體外質(zhì)粒DNA的復(fù)制而間接檢測(cè)，所述質(zhì)粒包含HPV的DNA復(fù)制起點(diǎn)?？蓪搹?fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒作為E1(和E2)蛋白表達(dá)的替代物來檢測(cè)(Gopalakrishnan et al.，Virolugy 1999 256，330-339.，Lu et al.J.Virol 1993 67，7131-7139 and Del Vecchio et al J.Virol1992 66，5949-5958)。HPV起點(diǎn)的復(fù)制既需要E1又需要E2，用包含編碼E1和E2基因的質(zhì)粒對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，再加入攜帶HPV的DNA復(fù)制起點(diǎn)的第三種質(zhì)粒，如果E1蛋白(和E2蛋白)表達(dá)成功(即使不能被標(biāo)準(zhǔn)蛋白檢測(cè)法(Western印跡)檢測(cè)出來)，將僅僅能使攜帶起點(diǎn)的質(zhì)粒復(fù)制。
DNA代碼有4種(A，T，C和G)，用它們可拼出三個(gè)字母的“密碼子”，這些密碼子代表生物體的基因所編碼的蛋白的氨基酸。沿DNA分子線性排列的密碼子被翻譯成所述基因所編碼的蛋白質(zhì)中氨基酸的線性序列。密碼子有高度的簡(jiǎn)并性，61種密碼子編碼20種天然氨基酸，3種密碼子代表“終止”信號(hào)。因此，大部分氨基酸由一種以上的密碼子編碼-實(shí)際上數(shù)種氨基酸由4種或更多種不同的密碼子編碼。
當(dāng)有一種以上的密碼子編碼一種特定的氨基酸時(shí)，已發(fā)現(xiàn)生物體密碼子的使用模式是極不隨機(jī)的。不同物種在密碼子的選擇方面顯示不同的偏好，且密碼子的使用在單一物種的高水平表達(dá)和低水平表達(dá)的基因之間也有顯著的不同。這種偏好在病毒，植物，細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中是不同的，一些物種比其它物種有更強(qiáng)的偏好。例如，人和其它哺乳動(dòng)物不如某些細(xì)菌或病毒偏好強(qiáng)?；谶@些原因，在大腸桿菌中表達(dá)的哺乳動(dòng)物基因或在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的病毒基因具有對(duì)于有效的表達(dá)來說不適當(dāng)?shù)拿艽a子分布。然而，具有適合大腸桿菌表達(dá)的密碼子使用模式的基因也可在人體中有效表達(dá)。可以相信，如果異源DNA序列中存在即將在其中進(jìn)行表達(dá)的宿主中罕見的密碼子簇，那么所述異源基因在所述宿主中的低水平異源表達(dá)是可預(yù)料的。
已發(fā)現(xiàn)數(shù)例以下情況將宿主中罕見的密碼子更改為宿主優(yōu)選的密碼子(“密碼子最優(yōu)化”)提高了異源表達(dá)水平，例如，已有人針對(duì)哺乳動(dòng)物密碼子使用模式而將BPV(牛乳頭瘤病毒)晚期基因L1和L2的密碼子最優(yōu)化，結(jié)果顯示出，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞(Cos-1)培養(yǎng)中，表達(dá)水平超過了野生型HPV序列(Zhou et al.J.Virol 1999.73，4972-4982)。在該項(xiàng)工作中，每種在BPV中比在哺乳動(dòng)物中出現(xiàn)頻率高兩倍(使用比例＞2)的BPV密碼子，以及使用比例大于1.5的大部分密碼子被保守替代為優(yōu)先使用的哺乳動(dòng)物密碼子。在WO 97/31115，WO 97/48370和WO 98/34640(Merck & Co.，Inc.)中，將已經(jīng)過密碼子最優(yōu)化的序列在作為最優(yōu)化依據(jù)的宿主哺乳動(dòng)物中用作DNA疫苗時(shí)，HIV基因或其片段的密碼子最優(yōu)化使蛋白表達(dá)增加，并且提高了免疫原性。在該項(xiàng)工作中，所述序列完全由最優(yōu)化的密碼子組成(除了會(huì)因此引入不期望的限制性位點(diǎn)，內(nèi)含子剪切位點(diǎn)等的部位)，因?yàn)獒槍?duì)所選宿主的優(yōu)化的密碼子保守取代了每種病毒密碼子。
依照第一方面，本發(fā)明提供了一種多核苷酸序列，該序列編碼HPV氨基酸序列，其中多核苷酸序列的密碼子使用模式與高表達(dá)的哺乳動(dòng)物基因的密碼子使用模式相似。優(yōu)選，所述多核苷酸序列是DNA序列。期望所述多核苷酸序列的密碼子使用模式與高表達(dá)的人基因的密碼子使用模式相似。理想的是，所述多核苷酸序列的密碼子使用模式與高表達(dá)的大腸桿菌基因的密碼子使用模式也相似。所述多核苷酸序列可以是DNA序列，例如雙鏈DNA序列。優(yōu)選所述多核苷酸序列編碼與宮頸癌，良性皮疣或尖銳濕疣有關(guān)的HPV型或亞型的HPV多肽，所述型別例如1-4，6，7，10，11，16，18，26-29，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59和68，優(yōu)選的型別有6，11，16，18，33或45，它們具體與宮頸癌和尖銳濕疣有關(guān)，最優(yōu)選HPV11，6a或6b。
因此，本發(fā)明提供了一種合成基因，該基因包含一組密碼子，它們?cè)谝黄鹂删幋aHPV氨基酸序列，其中通過選擇使可能用于編碼所述氨基酸序列的密碼子類似哺乳動(dòng)物的優(yōu)化密碼子，以使在合成基因中密碼子的使用頻率極類似于高表達(dá)的哺乳動(dòng)物基因，而不是乳頭瘤病毒基因。優(yōu)選，所述密碼子使用模式實(shí)際上與高表達(dá)的人類基因相同。
在某些實(shí)施例中，所編碼的氨基酸序列是野生型HPV氨基酸序列。在另外的實(shí)施方案中，所編碼的氨基酸序列是突變的HPV氨基酸序列，包含具有氨基酸改變的野生型序列，例如所述氨基酸改變是足以使所述多肽的一種或多種天然生物功能減低或失活的點(diǎn)突變。突變的氨基酸序列優(yōu)選保持野生型多肽的免疫原性。
所編碼的HPV多肽可包含早期基因產(chǎn)物，如E1，E2或E7，或其片段，類似物或融合體，或可以是晚期基因產(chǎn)物如L1或L2，或其片段，類似物或融合體。本發(fā)明的多肽可以，例如編碼如下融合體兩種或多種HPV早期基因產(chǎn)物之間，HPV早期基因產(chǎn)物和HPV晚期基因產(chǎn)物之間，或兩種或多種晚期基因產(chǎn)物之間，或HPV基因產(chǎn)物的一種或多種片段之間，或HPV基因產(chǎn)物(或其片段)和衍生自除HPV外的其它來源(例如佐劑或靶向肽，或多肽，如HBV核心肽)的多肽之間的融合體。所述融合體可以是衍生自同一或不同病毒型別或亞型的HPV基因產(chǎn)物之間的融合體。這種融合體將優(yōu)選保留被融合的肽成分的免疫原性。優(yōu)選，所編碼的HPV多肽包含早期基因產(chǎn)物的全部或一部分，最優(yōu)選E1或E2。在一具體的實(shí)施方案中，所述多核苷酸序列編碼如

圖1所示的HPV 6b野生型E1多肽，或其片段或類似物。在另外的實(shí)施方案中，多核苷酸序列編碼以下一種或多種物質(zhì)圖2所示的突變的HPV6b E1的氨基酸序列；圖3所示的HPV11或6a或6b的野生型E2氨基酸序列；圖4b所示的突變的HPV6b E2氨基酸序列；圖4a所示的突變的HPV11 E2序列，或其片段，類似物或融合體，其中所編碼的多肽保留免疫原性。
依照本發(fā)明，多核苷酸的密碼子使用模式優(yōu)選排除靶生物體的高表達(dá)基因中RSCU值小于0.2的密碼子。相對(duì)同義密碼子應(yīng)用(RSCU，relatvesynonymous codon usage)值是觀察到的密碼子數(shù)除以所期望的數(shù)(如果該氨基酸的所有密碼子的使用頻率相同)。本發(fā)明的多核苷酸對(duì)高表達(dá)的人基因來說將通常有一個(gè)大于0.3的密碼子使用系數(shù)(如下定義)，優(yōu)選大于0.4，最優(yōu)選大于0.5但小于1。期望所述多肽對(duì)高表達(dá)的大腸桿菌基因來說也有一個(gè)大于0.5的密碼子使用系數(shù)，優(yōu)選大于0.6，最優(yōu)選大于0.7。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了如圖5或圖6所示的多核苷酸序列，或保持了它們的密碼子使用模式的其片段或類似物。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了互補(bǔ)于圖5或圖6所示的序列的多核苷酸序列。
本發(fā)明的第二方面提供了表達(dá)載體，其包含本發(fā)明第一方面的多核苷酸序列并能夠指導(dǎo)該多核苷酸序列的表達(dá)，該多核苷酸序列編碼HPV氨基酸序列，其中所述多核苷酸序列的密碼子使用模式類似于高表達(dá)的哺乳動(dòng)物基因，優(yōu)選高表達(dá)的人基因。所述載體適合驅(qū)動(dòng)異源DNA在細(xì)菌，昆蟲或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，特別是在人細(xì)胞中表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體是p7313PLc(圖7)。
本發(fā)明的第三方面提供了一種宿主細(xì)胞，該細(xì)胞包含本發(fā)明第一方面的多核苷酸序列，或第二方面的表達(dá)載體。所述宿主細(xì)胞可以是細(xì)菌細(xì)胞，例如大腸桿菌，可以是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如人，或者可以是昆蟲細(xì)胞。包含本發(fā)明載體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以是體外轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)細(xì)胞，或者可以是通過將載體給予哺乳動(dòng)物而體內(nèi)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
本發(fā)明第四方面提供了一種藥用組合物，其包含本發(fā)明第一方面的多核苷酸序列。優(yōu)選所述組合物包含本發(fā)明第二方面的DNA載體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述組合物包含一組粒子，優(yōu)選金粒子，它們用包含編碼多核苷酸序列的載體的DNA包被，所述多核苷酸序列編碼HPV氨基酸序列，其中，多核苷酸序列的密碼子使用模式類似于高表達(dá)的哺乳動(dòng)物基因，特別是人基因。在另外的實(shí)施方案中，所述組合物包含可藥用的賦形劑和本發(fā)明第二方面的DNA載體。所述組合物也可以包含佐劑。
本發(fā)明另一方面提供了制備上述藥用組合物的方法，其包括如下步驟改變野生型HPV核苷酸序列的密碼子使用模式，或人工合成一種多核苷酸序列，以產(chǎn)生具有如下特征的序列該序列的密碼子使用模式類似于高表達(dá)的哺乳動(dòng)物基因，并且該序列編碼野生型HPV氨基酸序列或突變的HPV氨基酸序列(其包含具有改變的氨基酸的野生型氨基酸序列，所述改變足以滅活所述多肽的一種或多種天然功能)。
本發(fā)明還提供了本發(fā)明第一方面的多核苷酸，或本發(fā)明第二方面的載體在治療或預(yù)防HPV感染中的用途，優(yōu)選所述感染由與宮頸癌，良性皮疣，或尖銳濕疣有關(guān)的HPV型或亞型(例如1-4，6，7，10，11，16，18，26-29，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59和68型)所致，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了本發(fā)明第一方面的多核苷酸，或本發(fā)明第二方面的載體在治療或預(yù)防6，11，16，18，33或45型HPV感染中的用途，這些型的HPV具體與宮頸癌和尖銳濕疣有關(guān)，最優(yōu)選HPV11，6a或6b。本發(fā)明還提供了本發(fā)明第一方面的多核苷酸，本發(fā)明第二方面的載體或本發(fā)明第四方面的藥用組合物的用途，所述用途是治療或預(yù)防皮疣，尖銳濕疣，意義未確定的非典型性鱗狀細(xì)胞(ASCUS)，宮頸發(fā)育異常，頸上皮內(nèi)瘤形成(CIN)或?qū)m頸癌。因此，本發(fā)明還提供了本發(fā)明第一方面的多核苷酸，或本發(fā)明第二方面的載體的用途，所述用途是制備治療或預(yù)防如下任一種或多種型別的HPV感染或與所述型別有關(guān)的任何癥狀或疾病的藥物，所述HPV型別為1-4，6，7，10，11，16，18，26-29，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59和68型。
本發(fā)明還提供了治療或預(yù)防HPV感染，具體是由如下任一種或多種HPV型所導(dǎo)致的感染，或與所述型有關(guān)的任何癥狀或疾病的方法，所述HPV型為1-4，6，7，10，11，16，18，26-29，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59和68型，該方法包含給藥有效量的本發(fā)明第一方面的多核苷酸，本發(fā)明第二方面的載體或本發(fā)明第四方面的藥用組合物。所述藥用組合物可以以一劑或多劑的方式給藥，例如，以“初次免疫-加強(qiáng)免疫(prime-boost)”的治療性接種方案給藥。在某些情況下，“初次免疫”的接種可以通過本發(fā)明多核苷酸的粒子介導(dǎo)型DNA傳輸實(shí)現(xiàn)，優(yōu)選本發(fā)明的多核苷酸摻入了質(zhì)粒衍生的載體，所述“加強(qiáng)免疫”通過給藥包含相同多核苷酸序列的重組病毒載體進(jìn)行。
在本發(fā)明的說明書和權(quán)利要求中，術(shù)語“包含”和“包括”都解釋為包含在內(nèi)。即這些詞意指可能包含上下文允許但沒有具體描述的其它成分或整體。
術(shù)語“類似物”是指一種多核苷酸，它與本發(fā)明的另一多核苷酸編碼相同的氨基酸序列，但由于遺傳密碼子的豐余性而具有不同的核苷酸序列，但密碼子使用模式可保持相同，例如具有相同的密碼子使用系數(shù)或密碼子使用系數(shù)為所述另一多核苷酸的0.1之內(nèi)，優(yōu)選在0.05之內(nèi)。
術(shù)語“密碼子使用模式”是指所述核苷酸序列，一個(gè)或一類基因(例如高表達(dá)的哺乳動(dòng)物基因)中所有密碼子的平均頻率。可在文獻(xiàn)中找到哺乳動(dòng)物包括人的密碼子使用模式(參見例如Nakamura et al.Nucleic Acids Research1996，24214-215)。
在本發(fā)明的多核苷酸中，人乳頭瘤病毒典型的密碼子使用模式被改變?yōu)楦咏诎猩矬w的偏好，所述生物體例如大腸桿菌或哺乳動(dòng)物，尤其是人。“密碼子使用系數(shù)”是衡量給定多核苷酸序列與目標(biāo)物種的多核苷酸序列的相似程度的一個(gè)指標(biāo)。密碼子的頻率可參考有關(guān)多種物種的高表達(dá)基因的文獻(xiàn)(參見例如Nakamura et.al.Nucleic Acids Research 1996，24214-215)。將61種密碼子中每種密碼子的頻率(表示為在所選的一類基因中每1000個(gè)密碼子中的出現(xiàn)次數(shù))針對(duì)20種天然氨基酸中每種氨基酸進(jìn)行校對(duì)，以便針對(duì)每種氨基酸來說，將最常用的密碼子的值設(shè)定到1，將不太常用的密碼子的頻率設(shè)定在0和1之間。這樣，靶物種的高表達(dá)基因的61種密碼子中每種密碼子都設(shè)定了一個(gè)值，該值是1或低于1。為計(jì)算特定多核苷酸相對(duì)于該物種的高表達(dá)基因的密碼子使用系數(shù)，記錄該特定多核苷酸的每種密碼子的設(shè)定值，然后計(jì)算所有這些值的幾何平均值(是將這些值的自然對(duì)數(shù)的總和除以密碼子總數(shù)，然后取反對(duì)數(shù))。所述系數(shù)介于0到1之間，系數(shù)越高，所述多核苷酸中將有更多的密碼子是頻繁使用的密碼子。如果某一多核苷酸序列的密碼子使用系數(shù)是1，對(duì)于靶物種的高表達(dá)基因來說，所有的密碼子都是“最常用的”的密碼子。
較短的多核苷酸序列也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，本發(fā)明的多核苷酸可編碼HPV蛋白的片段。編碼長(zhǎng)度為至少8個(gè)氨基酸，例如8-10個(gè)氨基酸，或者20，50，60，70，80，100，150或200個(gè)氨基酸的片段的多核苷酸被認(rèn)為落入本發(fā)明的范圍之內(nèi)，只要所述多核苷酸具有類似于高表達(dá)的哺乳動(dòng)物基因的密碼子使用模式，并且所編碼的寡肽或多肽經(jīng)證實(shí)具有HPV抗原性。具體地，但不是獨(dú)有地，本發(fā)明的這一方面包括以下情況所述多核苷酸編碼完整HPV蛋白序列的片段，且代表該蛋白的一種或多種不連續(xù)的表位。
本發(fā)明的多核苷酸在大腸桿菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)高于編碼同一氨基酸序列的相應(yīng)的野生型序列。不受任何理論的限制，一般認(rèn)為這種情況至少有兩種原因。第一，因?yàn)樗鲂蛄芯哂信c宿主細(xì)胞的序列較接近的密碼子使用模式，所以所述序列更容易受到細(xì)胞翻譯機(jī)制的加工。第二，因?yàn)楹塑账嵝蛄兄卸噙_(dá)30％(或更多)的部分與野生型序列不同，所以干擾轉(zhuǎn)錄或翻譯的位點(diǎn)(如蛋白結(jié)合位點(diǎn))將會(huì)被除去或改變。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸的密碼子使用模式類似于大腸桿菌和哺乳動(dòng)物(例如，人)基因。這特別有利于在哺乳動(dòng)物接種和在體外用大腸桿菌細(xì)胞制備大量抗原蛋白(例如，用于檢測(cè)，如免疫檢測(cè)以判斷在哺乳動(dòng)物或人組織中的表達(dá)水平)時(shí)使用序列的情況。
如上所述，本發(fā)明包括包含本發(fā)明核苷酸序列的表達(dá)載體。所述表達(dá)載體按照分子生物學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)來構(gòu)建，例如，可使用質(zhì)粒DNA和適當(dāng)?shù)钠鹗济艽a子，啟動(dòng)子，增強(qiáng)子以及其它元件，例如必要的聚腺苷酸化信號(hào)，并且將它們以正確的方向放置，以便實(shí)現(xiàn)蛋白的表達(dá)。其它適當(dāng)?shù)妮d體對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的。關(guān)于這方面的其它實(shí)例可參考Sambrooket.al.，Molecular Cloninga Laborotory Manual.2ndEditon.CSH LaboratoryPress.(1989)。
本發(fā)明的多核苷酸，或在本發(fā)明載體中應(yīng)用的多核苷酸，優(yōu)選可操作地連接于調(diào)控序列，所述調(diào)控序列能使宿主細(xì)胞表達(dá)該編碼序列，即所述載體是一種表達(dá)載體。術(shù)語“可操作地連接”是指一種毗連關(guān)系，其中，所述成分所處的關(guān)系允許它們以預(yù)計(jì)的方式起作用。調(diào)控序列，例如啟動(dòng)子“可操作地連接”編碼序列是指，在與調(diào)控序列相容的條件下啟動(dòng)子所處的位置能實(shí)現(xiàn)所述編碼序列的表達(dá)。
所述載體可以是(例如，質(zhì)粒，人工染色體(例如BAC，PAC，YAC)，病毒或噬菌體載體，其帶有復(fù)制起點(diǎn)，任選還帶有可用于多核苷酸表達(dá)的啟動(dòng)子并任選帶有啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)物。所述載體可以包含一種或多種可供選擇的標(biāo)記基因，例如氨芐青霉素或卡那霉素抗性基因(在細(xì)菌質(zhì)粒的情況下)，或真菌載體的抗性基因。所述載體可以體外應(yīng)用，例如用于制備DNA或RNA或用于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞)，例如制備由載體編碼的蛋白。也可以修飾所述載體以在體內(nèi)應(yīng)用，例如用于DNA接種方法中或用于基因治療方法中。
可選擇啟動(dòng)子和其它表達(dá)調(diào)控信號(hào)以使其與進(jìn)行表達(dá)的宿主細(xì)胞相容。例如哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子包括金屬硫蛋白啟動(dòng)子(其能被重金屬例如鎘誘導(dǎo))，β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。也可使用病毒啟動(dòng)子例如SV40大T抗原啟動(dòng)子，人巨細(xì)胞病毒(CMV)立即早期(IE)啟動(dòng)子，勞斯肉瘤病毒LTR啟動(dòng)子，腺病毒啟動(dòng)子，或HPV啟動(dòng)子，特別是HPV上游調(diào)控區(qū)(URR)。所有這些啟動(dòng)子都在本領(lǐng)域內(nèi)有詳細(xì)的描述并可很容易地得到。
適當(dāng)?shù)牟《据d體的實(shí)例包括單純皰疹病毒載體，痘苗病毒或α病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，包括慢病毒，腺病毒和腺伴隨病毒。使用這些病毒進(jìn)行的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體例如可以用于將本發(fā)明的多核苷酸穩(wěn)定地整合到宿主基因組中，盡管所述重組不是優(yōu)選的。復(fù)制缺陷的腺病毒載體是附加體形式，所以可進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)?？梢允褂媚茉诶ハx細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)表達(dá)的載體(例如桿狀病毒載體)，或在人細(xì)胞或細(xì)菌中能驅(qū)動(dòng)表達(dá)的載體，以產(chǎn)生大量的由本發(fā)明多核苷酸所編碼的的HPV蛋白，例如用作亞單位疫苗或在免疫檢測(cè)中應(yīng)用的蛋白。
由于能表達(dá)所編碼的蛋白，本發(fā)明的多核苷酸可用于制備中，所述表達(dá)可在體外，體內(nèi)或回體(ex vivo)進(jìn)行。所述多核苷酸因此可參與重組蛋白的合成，例如，能增加產(chǎn)量，或?qū)嶋H上本身可用作治療劑，在DNA接種技術(shù)中應(yīng)用。本發(fā)明的多核苷酸用于在體外或回體制備所編碼的蛋白時(shí)，可對(duì)細(xì)胞，例如細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)胞進(jìn)行修飾以使其包含將被表達(dá)的多核苷酸。所述細(xì)胞包括瞬時(shí)的，或優(yōu)選穩(wěn)定的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。細(xì)胞的具體實(shí)例是可通過插入編碼本發(fā)明多肽的載體進(jìn)行修飾的細(xì)胞，包括哺乳動(dòng)物HEK293T，CHO，HeLa，293和COS細(xì)胞。優(yōu)選所選擇的細(xì)胞系不僅是穩(wěn)定的，還可進(jìn)行成熟糖基化和進(jìn)行多肽的細(xì)胞表面表達(dá)。表達(dá)可以在轉(zhuǎn)化的卵母細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)。多肽可以在轉(zhuǎn)基因的非人動(dòng)物，優(yōu)選小鼠的細(xì)胞中由本發(fā)明的多核苷酸表達(dá)。從本發(fā)明的多核苷酸表達(dá)多肽的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的多核苷酸用作治療劑時(shí)，例如在DNA接種中，可將所述核酸給藥將接受接種的哺乳動(dòng)物，例如人。所述核酸，例如RNA或DNA，優(yōu)選DNA以可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的載體(如以上描述的那些)的形式提供?？梢匀魏慰衫玫募夹g(shù)給藥所述多核苷酸。例如，可以通過針注射將所述核酸導(dǎo)入，優(yōu)選皮內(nèi)，皮下或肌肉內(nèi)?；蛘撸瑢⑺龊怂嵬ㄟ^核酸傳輸裝置，如粒子介導(dǎo)的DNA傳輸(PMDD)將所述核酸直接傳輸?shù)狡?nèi)。在該方法中，惰性粒子(例如金粒)用核酸包被，并被加速至足以能使它們穿過受試者的表面(例如皮膚)，例如利用發(fā)射裝置的高壓來加速。(用本發(fā)明核酸分子包被的粒子在本發(fā)明的范圍內(nèi)，載有所述粒子的傳輸裝置也在本發(fā)明的范圍內(nèi))。期望所述組合物包含平均粒徑0.5-5μm的金粒，優(yōu)選約2μm。在優(yōu)選實(shí)施方案中，將所包被的金粒裝載到管中，用作藥筒，這樣每個(gè)藥筒中包含用0.1-5μg，優(yōu)選約0.5μgDNA/藥筒包被的0.1-1mg，優(yōu)選0.5mg金。
將裸露的多核苷酸或載體導(dǎo)入患者的適當(dāng)技術(shù)包括適當(dāng)載體的局部應(yīng)用。所述核酸可以局部給藥到皮膚，或粘膜表面，例如通過鼻內(nèi)，口腔，陰道內(nèi)或直腸內(nèi)給藥。所述裸露的多核苷酸或載體可以與可藥用賦形劑，例如磷酸鹽緩沖液(PBS)一起存在。應(yīng)用促進(jìn)劑如丁哌卡因(bupivacaine)(或分開應(yīng)用或包含在DNA制劑中)可進(jìn)一步促進(jìn)DNA的攝取。將所述核酸直接給藥于受體的其它方法包括超聲，電刺激，電穿孔和顯微種植(在US-5,697,901中描述)。
多種已知的轉(zhuǎn)染技術(shù)可用來提高核酸構(gòu)建體的攝取，所述技術(shù)例如包括應(yīng)用轉(zhuǎn)染制劑的那些技術(shù)。所述制劑的實(shí)例包括陽(yáng)離子制劑，例如磷酸鈣和DEAE-Dextran和脂質(zhì)轉(zhuǎn)染劑，例如lipofectam和transfectam。核酸的給藥劑量可以改變。通常核酸的給藥劑量在1pg到1mg的范圍內(nèi)，對(duì)于粒子介導(dǎo)的基因傳輸優(yōu)選的劑量在1pg到10μg，其它的途徑優(yōu)選的劑量為10μg到1mg。
本發(fā)明的核酸序列也可以通過在基因治療中專用的傳輸載體給藥。基因治療的方法描述于例如Verme et al，Nuture 1997，389239-242中。病毒和非病毒載體系統(tǒng)都可以應(yīng)用?；诓《镜南到y(tǒng)包括基于逆轉(zhuǎn)錄病毒，慢病毒，腺病毒，腺伴隨病毒，皰疹病毒，金絲雀痘病毒和痘苗病毒的系統(tǒng)?；诜遣《镜南到y(tǒng)包括直接給藥核酸，微球體膠囊化技術(shù)(聚(丙交酯-共-乙交酯)和基于脂質(zhì)體的系統(tǒng)。當(dāng)初次接種后，期望給予加強(qiáng)注射時(shí)可以將病毒和非病毒傳輸系統(tǒng)相結(jié)合，例如，用非病毒載體如質(zhì)粒進(jìn)行“初次免疫”的DNA接種，然后用病毒載體或基于非病毒的系統(tǒng)進(jìn)行一次或多次的“加強(qiáng)免疫”接種。
也可將本發(fā)明的核酸序列通過轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方式給藥。所述細(xì)胞包括從受試者收獲的細(xì)胞。可將本發(fā)明的裸露多核苷酸或載體在體外導(dǎo)入上述細(xì)胞中，之后再使所述轉(zhuǎn)化的細(xì)胞返回受試者。本發(fā)明的多核苷酸通過同源重組摻入到細(xì)胞已有的核酸中。必要時(shí)，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以在體外培養(yǎng)，然后將一或多個(gè)所得細(xì)胞用于本發(fā)明中?？捎靡阎耐饪茖W(xué)或顯微外科學(xué)技術(shù)(例如，移植，顯微注射等)將所述細(xì)胞提供到適當(dāng)?shù)牟课弧?br> 適當(dāng)?shù)募?xì)胞包括抗原呈遞細(xì)胞(APC)，如樹突細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，B細(xì)胞，單核細(xì)胞和能被改造成有效的APC的其他細(xì)胞?？梢?但不是必須)將所述細(xì)胞進(jìn)行基因修飾以增強(qiáng)呈遞抗原的能力，改善對(duì)T細(xì)胞應(yīng)答的活化和/或維持，具備抗腫瘤，例如抗宮頸癌的作用和/或與受者在免疫學(xué)上相容(即HLA單體型匹配)。通?？梢詮亩喾N生物體液和器官，包括腫瘤和腫瘤周圍組織的任何一種中分離APC，所述APC可以是自體的，同種異體的，同基因的或異種的細(xì)胞。
本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案中使用了樹突細(xì)胞或它們的先祖作抗原呈遞細(xì)胞，用來進(jìn)行體外轉(zhuǎn)化并返回給患者，或作為在疫苗中所運(yùn)輸?shù)暮塑账岬捏w內(nèi)靶，例如通過粒子介導(dǎo)的DNA傳輸。樹突細(xì)胞是高效APC(Banchereau and Steinman，Nature 392245-251，1998)，并且作為一種生理佐劑已顯示出可有效引發(fā)預(yù)防性或治療性的抗腫瘤免疫(參見Timmermanand Levy，Ann.Rev.Med.50507-529，1999)。樹突細(xì)胞具有典型的形狀(原位放射狀(stellate in situ)，具有體外可視的顯著的胞質(zhì)隆起(樹突))，它們高效攝取、加工和呈遞抗原，它們活化初始T細(xì)胞應(yīng)答，通?？梢愿鶕?jù)這些對(duì)其進(jìn)行鑒定。當(dāng)然，可對(duì)樹突細(xì)胞進(jìn)行改造，使其在體內(nèi)或回體表達(dá)樹突細(xì)胞中不常見的特異性細(xì)胞表面受體或配體，例如本發(fā)明構(gòu)建體編碼的抗原，這種修飾的樹突細(xì)胞包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。作為樹突細(xì)胞的替代物，負(fù)載分泌泡抗原的樹突細(xì)胞(也稱為外來體)可用在疫苗中(參見Zitvogel etal.，Nature Med.4594-600，1998)。
可從外周血，骨髓，腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞，浸潤(rùn)腫瘤周圍組織的細(xì)胞，淋巴結(jié)，脾臟，皮膚，臍帶血或其他適當(dāng)?shù)慕M織或體液中獲得樹突細(xì)胞和先祖。例如，通過將細(xì)胞因子如GM-CSF，IL-4，IL-13和/或TNF的組合加入到收獲自外周血的單核細(xì)胞培養(yǎng)物中可回體分化樹突細(xì)胞?；蛘?，將GM-CSF，IL-3，TNF，CD40配體，脂多糖LPS，flt3配體(在專職抗原呈遞細(xì)胞，特別是樹突細(xì)胞的產(chǎn)生方面重要的細(xì)胞因子)和/或誘導(dǎo)樹突細(xì)胞分化，成熟和增殖的其他化合物的組合加入到培養(yǎng)介質(zhì)中，可使收獲自外周血，臍帶血或骨髓的CD34陽(yáng)性細(xì)胞分化成樹突細(xì)胞。
通常用編碼具有抗原性的HPV氨基酸序列的多核苷酸，如本發(fā)明密碼子最優(yōu)化的多核苷酸轉(zhuǎn)染APC。所述轉(zhuǎn)染可回體實(shí)現(xiàn)，然后可將包含所述轉(zhuǎn)染細(xì)胞的組合物或疫苗用于治療目的，如本發(fā)明所述?；蛘?，可將靶向樹突細(xì)胞或其他抗原呈遞細(xì)胞的基因傳輸載體給藥患者，從而在體內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)染。樹突細(xì)胞的體內(nèi)和回體轉(zhuǎn)染，例如通?？捎帽绢I(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行，參照WO 97/24447所述方法，或Mahvi et al.，Immunology and CellBiology 75456-460，1997描述的粒子介導(dǎo)的方法。
疫苗和藥用組合物可存在于單劑或多劑容器中，如密封的安瓶或小瓶中。所述容器優(yōu)選密封封閉的，以保持所用制劑的無菌狀態(tài)直至使用時(shí)。通常，制劑以懸浮液，溶液或乳液的形式儲(chǔ)存在油性或水性載體中。或者，疫苗或藥用組合物以凍干的狀態(tài)儲(chǔ)存，僅需在即將使用前加入無菌液體狀載體。包含即將通過粒子介導(dǎo)的傳輸來給藥的核苷酸序列的疫苗可以是適于用壓縮氣體傳輸裝置給藥的藥筒，在這種情況下，所述藥筒由空管構(gòu)成，其內(nèi)表面涂有攜帶疫苗核苷酸序列的粒子，選擇地，還存在其他的可藥用成分。
本發(fā)明的可藥用組合物可包含佐劑化合物或用來調(diào)整或提高由所述DNA編碼的蛋白誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的其他物質(zhì)。這些物質(zhì)可由DNA編碼，為單獨(dú)的形式，或與抗原形成的融合體，或作為制劑中的非DNA成分?？砂诒景l(fā)明制劑中的佐劑類物質(zhì)的實(shí)例包括遍在蛋白，溶酶體相關(guān)膜蛋白(LAMP)，乙型肝炎病毒核心抗原，flt3-配體和其他細(xì)胞因子如IFN-γ和GMCSF。
市售的其他合適的佐劑如，例如，弗氏不完全佐劑和完全佐劑(DifcoLaboratories，Detroit，MI)；Imiquimod(3M，St.Paul，MN)；Resimiquimod(3M，St.Paul，MN)；Merck佐劑65(Merck and Company，Inc.，Rahway，NJ)；AS-2(SmithKline Beecham，Philadelphia，PA)；鋁鹽如氫氧化鋁膠(alum)或磷酸鋁；鈣鹽，鐵鹽或鋅鹽；酰化酪氨酸的不溶性懸浮液；?；?；陽(yáng)離子或陰離子衍生的多糖；聚磷腈；可生物降解的微球體；單磷酰脂質(zhì)A和quilA。細(xì)胞因子，如GM-CSF或白細(xì)胞介素2，7或12也可用作佐劑。
在本發(fā)明的制劑中，優(yōu)選佐劑組合物誘導(dǎo)以Th1型為主的免疫應(yīng)答。因此，所述佐劑可用來把對(duì)DNA編碼抗原所產(chǎn)生的以Th2型為主的免疫應(yīng)答向Th1型為主的免疫應(yīng)答方向調(diào)整。Th1-型細(xì)胞因子(如IFN-，TNF，IL-2和IL-12)的高水平趨向于對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的針對(duì)所給藥抗原的免疫應(yīng)答有利。以Th1型為主要應(yīng)答的優(yōu)選實(shí)施方案中，Th1型細(xì)胞因子的水平提高的程度比Th2型細(xì)胞因子的水平高。這些細(xì)胞因子的水平可用標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)法很容易地檢測(cè)。對(duì)細(xì)胞因子家族的綜述可參見Mosnann and Coffman，Ann.Rev.Immunol.7145-173，1989。
因此，引發(fā)以Th1型為主的應(yīng)答所用的適當(dāng)佐劑包括，例如，單磷?；|(zhì)A，優(yōu)選3-脫-O-?；膯瘟柞；|(zhì)A(3D-MPL)與鋁鹽的組合。其他已知的優(yōu)先誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答的佐劑包括包含CpG的寡核苷酸。所述寡核苷酸的特征在于CpG二核苷酸是非甲基化的。所述寡核苷酸是已知的并描述于，例如，WO 96/02555。對(duì)免疫刺激性DNA序列也有描述，例如，Sato et al.，Science 273352，1996。包含CpG的寡核苷酸可在同一或不同的多核苷酸構(gòu)建體中與乳頭瘤抗原分別編碼，或它們之間是緊鄰的，例如它們是融合體?；蛘?，包含CpG的寡核苷酸可分別給藥，即不作為包含編碼抗原組合物的一部分。CpG寡核苷酸可單獨(dú)應(yīng)用或與其他佐劑聯(lián)合應(yīng)用。例如，增強(qiáng)的系統(tǒng)涉及包含CpG的寡核苷酸與皂苷衍生物的組合，尤其是WO 00/09159和WO 00/62800中公開的CpG和QS21的組合。優(yōu)選所述制劑另外含有水包油乳劑和/或生育酚。
另一優(yōu)選佐劑是皂苷，優(yōu)選QS21(Aquila Biopharmaceuticals Inc.，F(xiàn)ramingham，MA)，其可單獨(dú)應(yīng)用或與其他佐劑組合應(yīng)用。例如，一種提高的系統(tǒng)涉及單磷酰基脂質(zhì)A和皂苷衍生物的組合(如QS21和3D-MPL的組合，描述在WO 94/00153中)，或較弱的反應(yīng)原性組合物(其中QS21用膽固醇淬滅，這在WO 96/33739中有描述)。其他優(yōu)選的制劑包括水包油乳劑和生育酚。在水包油乳劑中包含QS 21，3D-MPL和生育酚的特別強(qiáng)效的佐劑制劑描述于WO 95/17210中。
其他優(yōu)選佐劑包括Montanide ISA 720(Seppic，F(xiàn)rance)，SAF(Chiron，California，United States)，ISCOMS(CSL)，MF-59(Chiron)，Detox(Ribi，Hamilton，MT)，RC-529(Corixa，Hamilton，MT)和其他氨烷基氨基葡糖苷4-磷酸酯(AGP)。
其他優(yōu)選的佐劑包括通式(I)的佐劑分子通式(I)HO(CH2CH2O)n-A-R其中，n是1-50，A是一種化學(xué)鍵或-C(O)-，R是C1-50烷基或苯基C1-50烷基。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案由包含通式(I)的聚氧乙烯醚的制劑組成，其中n為1-50，優(yōu)選4-24，最優(yōu)選9；R成分是C1-50，優(yōu)選C4-C20烷基，最優(yōu)選C12烷基，A是一種化學(xué)鍵。聚氧乙烯醚的濃度應(yīng)在0.1-20％范圍內(nèi)，優(yōu)選0.1-10％，最優(yōu)選在0.1-1％的范圍內(nèi)。優(yōu)選聚氧乙烯醚選自聚氧乙烯基-9-月桂基醚，聚氧乙烯基-9-steoryl醚，聚氧乙烯基-8-steoryl醚，聚氧乙烯基-4-月桂基醚，聚氧乙烯基-35-月桂基醚，聚氧乙烯基-23-月桂基醚。聚氧乙烯基醚如聚氧乙烯基月桂基醚在Merck索引(第12版，查詢號(hào)7717)中有描述。這些佐劑分子在WO 99/52549中描述。上述通式(I)的聚氧乙烯醚如果需要可與另一佐劑組合。例如，優(yōu)選的佐劑組合是優(yōu)選與正在審理的英國(guó)專利申請(qǐng)GB 9820956.2中描述的CpG組合。
當(dāng)疫苗包括佐劑時(shí)，疫苗制劑可以以兩部分給藥。例如，通過皮下或肌肉注射，或通過皮內(nèi)粒子介導(dǎo)的傳輸首先給藥包含編碼抗原的核苷酸構(gòu)建體的制劑部分，然后立即或間隔適當(dāng)時(shí)間后給藥包含佐劑的制劑部分，這對(duì)疫苗領(lǐng)域有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師來說是顯而易見的。在這些情況下，所述佐劑可以與抗原制劑按同樣的途徑給藥或通過另外的途徑給藥。在其他實(shí)施方案中，所述制劑的佐劑部分可在抗原部分給藥前給藥。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述佐劑作為一種局部制劑，給藥于編碼抗原的核苷酸序列的粒子介導(dǎo)性傳輸部位的皮膚，可以是在粒子介導(dǎo)的傳輸之前或之后進(jìn)行。
以下實(shí)施例參考附圖用以進(jìn)一步描述本發(fā)明其中圖1顯示來自HPV型11，6a和6b的E1的原型野生型氨基酸序列，來源于Genbank；圖2顯示圖1(6b-e1)所示HPV6b E1的原型野生型氨基酸序列，與包含用于除去生物活性的點(diǎn)突變的HPV6b E1氨基酸序列(6b-e1 mut)的比對(duì)；圖3顯示來自HPV型11，6a和6b的E2的原型野生型氨基酸序列，來源于Genbank；圖4a顯示圖3(Hpv-11e2-wt)所示HPV11 E2的原型野生型氨基酸序列，與包括用于除去生物活性的點(diǎn)突變的HPV11 E2氨基酸序列(Hpv-11e2-mut)，以及與圖6(Hpv-11e2-comut)所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列的比對(duì)；圖4b顯示圖3(Hpv-6be2-wt)所示HPV6b E2的原型野生型氨基酸序列，與包括用于除去生物活性的點(diǎn)突變的HPV6b E2氨基酸序列(Hpv-6be2-mut)的比對(duì)；圖5顯示一種核苷酸序列，該序列具有類似于高表達(dá)的人基因的密碼子使用模式，所述核苷酸序列編碼圖2中突變的HPV6b E1氨基酸序列；圖6顯示一種核苷酸序列，其具有類似于高表達(dá)的人基因的密碼子使用模式，所述核苷酸序列編碼圖4中突變的HPV11 E2氨基酸序列；圖7顯示DNA載體p7313-PLc；圖8表示來自實(shí)施例4的細(xì)胞裂解物樣品在丙烯酰胺凝膠上電泳并染色的結(jié)果，以此顯示與所表達(dá)的E1蛋白結(jié)合的抗體；圖9顯示用本發(fā)明的多核苷酸免疫小鼠后對(duì)抗原攻擊所產(chǎn)生的細(xì)胞應(yīng)答(實(shí)施例6)；和圖10表示來自實(shí)施例7的細(xì)胞裂解物在丙烯酰胺凝膠上電泳并染色的結(jié)果，以此顯示與所表達(dá)的E2蛋白結(jié)合的抗體。
實(shí)施例1 HPV6bE1的密碼子最優(yōu)化HPV6bE1的野生型原型氨基酸序列，從Genbank獲得，顯示在圖1中(底部序列)。該圖顯示HPV病毒11，6a和6b型中所述蛋白的原型序列之間的高度同源性。類似地，圖3顯示HPV11，6a和6b的E2蛋白的野生型原型氨基酸序列。預(yù)計(jì)用HPV6b序列進(jìn)行的免疫治療(治療性疫苗)將發(fā)生交叉反應(yīng)，以提供預(yù)防或治療性的抗所有三種病毒型別的免疫應(yīng)答。
將HPV6bE1序列的密碼子使用與高表達(dá)的人和大腸桿菌基因進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)物種的密碼子使用系數(shù)都低。對(duì)每個(gè)氨基酸殘基來說只應(yīng)用最豐富的密碼子也會(huì)導(dǎo)致不對(duì)稱的密碼子使用模式，因?yàn)閷?duì)給定氨基酸來說，沒有生物體僅用其最優(yōu)選的密碼子。因此，可用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分配密碼子，從而得到合成基因，并使其密碼子頻率接近于在大腸桿菌和人中高表達(dá)的基因的天然密碼子頻率。
用稱為Calcgene的Visual Basic程序(由R.S.Hale和G Thompson撰寫)可分配合成基因中的密碼子(Protein Expression and Purification Vol.12 pp.185-188(1998))。對(duì)原始序列中的每一氨基酸殘基，基于其在高表達(dá)的大腸桿菌基因中出現(xiàn)的概率來分配密碼子。所述程序在微軟Windows3.1環(huán)境下運(yùn)行的詳細(xì)情況可從作者處獲得。因?yàn)樵摮绦驊?yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法給合成基因分配密碼子，所以不是所有得到的密碼子都是靶生物體中最常用的。當(dāng)然，靶生物體中常用和不常用密碼子的比例通過以正確的比例分配密碼子而反映在合成序列中。然而，因?yàn)闆]有嚴(yán)格的規(guī)則確定序列中具體位置上的具體密碼子，所以，盡管每次都使用相同的密碼子使用模式并且每次都編碼同樣的氨基酸序列，但每次運(yùn)行該程序都會(huì)產(chǎn)生不同的合成基因。如果對(duì)于給定氨基酸序列和給定靶生物體將上述程序運(yùn)行數(shù)次，將產(chǎn)生數(shù)種不同的核苷酸序列，它們?cè)谙拗菩晕稽c(diǎn)的數(shù)目，類型和位置方面，內(nèi)含子剪切信號(hào)等方面不同，其中有一些可能是不期望的。在這些特征基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員能選擇適當(dāng)?shù)男蛄袘?yīng)用于多肽的表達(dá)。
進(jìn)一步地，因?yàn)槊艽a子是按照統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算而隨機(jī)分配的，所以在靶生物體中二個(gè)或二個(gè)以上的相對(duì)罕用的密碼子可能(盡管也許未必)極為接近并成簇。據(jù)信，這些簇可能會(huì)干擾翻譯機(jī)制，導(dǎo)致特別低的表達(dá)率，所以在最優(yōu)化基因中選擇密碼子的算法排除了對(duì)高表達(dá)基因來說RSCU值小于0.2的任何密碼子，目的是防止偶然選擇出任何罕見密碼子簇。然后將剩余密碼子的分布依照高表達(dá)的大腸桿菌基因的頻率分派，以使合成基因中總體分布類似于大腸桿菌基因(系數(shù)＝0.85)，還類似于高表達(dá)的人基因(系數(shù)＝0.50)。用類似的過程獲得密碼子最優(yōu)化的HPV11 E2核苷酸序列，不同的是應(yīng)用Syngene(Peter Ertl，未公開)，這是Calcgene程序更新的版本，它能排除將被選的罕用密碼子，使用該程序能依照高表達(dá)的人基因的密碼子頻率模式分派密碼子。不象為E1選派密碼子，其不排除罕用密碼子。同時(shí)，改變一種寡核苷酸，以編碼K111A的氨基酸變更，如下描述。
將突變引入密碼子最優(yōu)化的E1和E2基因以產(chǎn)生E1(K83G，R84G和G483D)和E2(K111A)氨基酸序列中的點(diǎn)突變。所述突變基因的氨基酸序列顯示在圖2(HPV6bE1)和圖4(HPV6bE2和HPV11E2)中(與野生型原型序列相比對(duì))。HPV6bE1的密碼子最優(yōu)化的且突變的核苷酸序列顯示在圖5。HPV11E2的密碼子最優(yōu)化的且突變的核苷酸序列顯示在圖6。圖4給出了通過密碼子最優(yōu)化的且突變的HPV11E2基因的表達(dá)獲得的多肽的氨基酸序列，其與原型野生型和突變的野生型序列相比對(duì)，以此顯示核苷酸序列的密碼子最優(yōu)化不改變所編碼的氨基酸序列(其與突變的野生型序列相同)。
實(shí)施例2構(gòu)建密碼子最優(yōu)化的HPV6b E1多核苷酸序列基因設(shè)計(jì)用上述最優(yōu)化軟件，從最優(yōu)化的序列中計(jì)算出重疊的40體寡核苷酸。包含限制性位點(diǎn)的末端寡核苷酸是60體。所述寡核苷酸從Life TechnologiesLtd定購(gòu)，濃度是50nmole，是去保護(hù)的和非磷酸化的。
寡核苷酸的組裝將每種寡核苷酸溶于雙蒸水中，至最終濃度為100微摩爾(μm)，制備所有96種寡核苷酸的等量混合物，濃度為100微摩爾。用來自RocheBoehringer的Pwo聚合酶(目錄號(hào)為1 644 955)如下進(jìn)行合成。
雙蒸水86μlPwo 10X緩沖液 10μldNTP混合物1μl(100mM dNTP等量混合)寡核苷酸混合物1μl(100μM寡核苷酸等量混合)Pwo聚合酶 2μl在Trio Thermoblock(Biometra)上，用以下條件對(duì)上述反應(yīng)混合物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)1.40℃ 2分鐘2.72℃ 10秒鐘3.94℃ 15秒鐘4.40℃ 30秒鐘5.72℃ 20秒鐘+每個(gè)循環(huán)2秒鐘6.4℃ 8在第3步和第5步之間循環(huán)重復(fù)25次。
25個(gè)循環(huán)之后，從每個(gè)管中取出10μl的等份試樣在0.8％的Tris醋酸(TAE)瓊脂糖凝膠上電泳，并在長(zhǎng)波的紫外光下觀察。合成的E1 DNA的期望大小應(yīng)該約2Kb。
基因的回收合成的基因通過用聚合酶進(jìn)行PCR來回收，所用的兩種末端寡核苷酸為合成的寡核苷酸，其中N末端寡核苷酸包含Not1限制性位點(diǎn)，C末端寡核苷酸包含BamH1位點(diǎn)。
雙蒸水65μlPwo10X緩沖液 10μldNTP混合物1μl(100mM dNTP等量混合)裝配混合物20μl(來自先前的PCR)N末端寡核苷酸 1μl(100μM)C末端寡核苷酸 1μl(100μM)Pwo聚合酶 2μl
1.94℃ 45秒鐘2.72℃ 2分鐘+每500個(gè)bp 1分鐘3.72℃ 10分鐘4.4℃ 8在第2步和第1步之間循環(huán)重復(fù)25次。
然后將PCR產(chǎn)物用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen目錄號(hào)為28104)進(jìn)行純化，之后將DNA重新懸浮在總量為50μl的試劑盒洗脫緩沖液中。將10μl等份試樣用Not1和BamH1限制性內(nèi)切酶(來自Life Technologies Ltd，3 Fountain Drive，Inchinnan Business Park，Paisley，Scotland)在37℃消化2小時(shí)。然后將該消化物在0.8％的TAE瓊脂糖凝膠上進(jìn)行凝膠純化，切割并用QIAquick Gel提取試劑盒(Qiagen目錄號(hào)為28704)提取2Kb的DNA產(chǎn)物。將最終被消化的純DNA片段洗脫在總量為50μl的試劑盒洗脫緩沖液中。
將該P(yáng)CR片段克隆到載體p7313PLc(圖7)中，(Powderject Vaccines Inc.，參見以下詳述)并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)JM109細(xì)胞(Promega分類號(hào)為P9751)中。用Nco1-BamH1和Nco1-EcoR1消化對(duì)來自所選擇克隆的質(zhì)粒DNA進(jìn)行限制性酶核對(duì)。篩選出5個(gè)具有2Kb片段插入片段的正確克隆，對(duì)插入片段DNA進(jìn)行測(cè)序。選擇出一個(gè)具有僅含3個(gè)點(diǎn)突變的插入片段的克隆進(jìn)一步使用。通過與來自其它克隆的同源小片段進(jìn)行的連接交換修正三個(gè)點(diǎn)突變。
用限制性酶消化對(duì)修正后的克隆再次進(jìn)行核對(duì)，并將插入的DNA完全測(cè)序。該克隆被稱為p6bE1c/o。同時(shí)，為進(jìn)行比較表達(dá)和免疫研究，野生型HPV-6b E1基因和野生型HPV-11 E1基因PCR擴(kuò)增自HPV-6b基因組克隆(EMBO J，2(12)2314-2318 1983)和HPV-11基因組克隆(Virology 151，124-130 1986)，然后將各自的片段克隆到Not1-BamH1消化的載體p7313PLc中。這些克隆分別稱為p6bE1w/t和p11E1w/t。
將克隆p6bE1c/o和p6bE1w/t中的E1基因進(jìn)一步突變以引入氨基酸改變K83G，R84G和G438D。經(jīng)測(cè)序的匹配的3’和5’寡核苷酸引物具有核苷酸取代(用于引入所需的突變)，用這些引物以及QuickChange定點(diǎn)突變?cè)噭┖?Stratagene分類號(hào)為200518)中的其它制劑一起，按說明書所述方法進(jìn)行PCR反應(yīng)。將突變的p6bE1c/o和p6bE1w/t克隆分別命名為p6bE1c/o mut和p6bE1w/t mut。
實(shí)施例3 構(gòu)建密碼子最優(yōu)化的HPV11 E2多核苷酸序列對(duì)E2密碼子最優(yōu)化的基因的設(shè)計(jì)，組裝和回收如對(duì)E1所描述的那樣，但重疊的寡核苷酸是60個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，而不是40個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，具有18個(gè)核苷酸的重疊。與E1的過程不同，一個(gè)包含K1114A氨基酸突變的克隆密碼子最優(yōu)化的E2基因克隆同時(shí)產(chǎn)生，方式是用2種60體寡核苷酸(它們合并包含產(chǎn)生K111A改變所需的核苷酸取代)取代上述二者的相應(yīng)野生型序列寡核苷酸。
質(zhì)粒p7313-PLc的組成該質(zhì)粒用pUC4K的包含卡那霉素抗性基因的EcoRI片段(Amersham-Pharmacia)取代包含pUC19的包含β-內(nèi)酰胺酶基因的Eaml 1051-Pst1片段(可從Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd.，AmershamPlace，Little Chalfont，Bucks，HP7 9NA獲得)，然后用T4 DNA聚合酶使二種片段鈍端化。人巨細(xì)胞病毒IE1啟動(dòng)子/增強(qiáng)子，內(nèi)含子A衍生自質(zhì)粒JW4303(從Dr Harriet Robinson，University of Massachusetts獲得)，作為Xho1-Sal1片段插入到pUC19的Sal1位點(diǎn)，摻入牛生長(zhǎng)激素的聚腺苷酸化信號(hào)。使所述啟動(dòng)子的5’Sal1-Banl片段缺失，產(chǎn)生可應(yīng)用于載體的最小啟動(dòng)子(WO 00/23592-Powderject Vaccines Inc.)。HBV表面抗原的3’UTR衍生自載體pAM6中的乙型肝炎病毒(adw血清型)(Moriarty et al.，Proc.Natl.Acad.Sxi.USA，78，2606-2610，1981)。pAM6(pBR322基礎(chǔ)上的載體)從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心獲得，目錄號(hào)為ATCC 45020。3’UTR以1.4Kb的BamH1片段的形式插入到聚腺苷酸化信號(hào)的5’側(cè)，鈍端化以便通過插入以除去BamH1位點(diǎn)。在一系列步驟中(包括用BglI消化，Klenow聚合酶處理，用BstXI消化，用NcoI消化，用綠豆核酸酶處理以除去突出端和用BstXI進(jìn)一步消化)，對(duì)HBV S抗原基因的3’非翻譯區(qū)的增強(qiáng)子區(qū)和bGHpA信號(hào)之間的區(qū)域進(jìn)行修飾，以除去在X基因啟動(dòng)子和bGHpA信號(hào)之間的所有大于5個(gè)密碼子的開放讀框。這導(dǎo)致缺失X蛋白可翻譯部分(9個(gè)氨基酸)的編碼序列和X基因的起始密碼子。然而，X基因的弱增強(qiáng)子/啟動(dòng)子區(qū)被保留，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)該區(qū)增強(qiáng)CMV啟動(dòng)子控制下的HBsAg的表達(dá)。用兔β珠蛋白聚腺苷酸化信號(hào)取代牛生長(zhǎng)激素聚腺苷酸化信號(hào)。切出S抗原的5’非編碼和編碼序列，用寡核苷酸接頭取代，以提供所示的多克隆位點(diǎn)，以產(chǎn)生質(zhì)粒p7313-PL。Hind -- - NotI--- -EcoRV --NdeI- -BamHIAGCTTGCGGCCGCTAGCGATATCGGTACCATATGTCGACGGATCC........ACGCCGGCGATCGCTATAGCCATGGTCTACAGCTGCCTAGGCCGG--NheI --KpnI---SaII-- ΔNotIColE1 cer序列從質(zhì)粒pDAH212(來自David Hodgeson，WarwickUniversity)的亞克隆獲得，并用引物通過PCR擴(kuò)增，以便在該序列末端放置EcoRI限制性位點(diǎn)。然后將所述cer序列插入p7313-PL的Eco RI位點(diǎn)，產(chǎn)生質(zhì)粒p7313-PLc(圖7)。對(duì)照Genbank登錄號(hào)M11411證實(shí)擴(kuò)增后的cer序列。
實(shí)施例4 在哺乳動(dòng)物293T細(xì)胞中表達(dá)E1蛋白將哺乳動(dòng)物293T細(xì)胞培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，6孔ComingCostarTM(Coming Science Products，10 The ValleyCentre，Gordon Road，HighWycombe，Bucks，UK)組織培養(yǎng)板的每孔中細(xì)胞的最終濃度為2×105，在5％的CO2中37℃過夜。制備如下轉(zhuǎn)染混合物并混合25分鐘2μg質(zhì)粒DNA(載體，p6bE1c/o，p6bE1w/t)溶于16μl無菌雙蒸水中其中加入OPTI-memTM(Gibco BRL，Paisley，Scotland) 8μlLipofectamineTM(GibcoBRL)6μl用OPTI-memTM對(duì)每孔細(xì)胞單層小心洗滌二次。然后將800μlOPTI-memTM加入到每孔中。將200μl OPTI-memTM加入到每種轉(zhuǎn)染的混合物中，混合并輕輕加入到所述細(xì)胞單層。將培養(yǎng)板在5％CO2中37℃溫育5小時(shí)，之后將轉(zhuǎn)染混合物和OPTI-memTM棄掉。用細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基輕輕洗滌細(xì)胞單層二次，最后將轉(zhuǎn)染細(xì)胞在5％CO2中37℃，在包含10％胎牛血清和29.2mg/ml L谷氨酰胺的Dulbecco’s改良型Eagle培養(yǎng)基中溫育24小時(shí)。將所述細(xì)胞刮入微量管中，用PBS洗二次，離心后將細(xì)胞團(tuán)重懸在SDS PageLaemmli染料中。將所述細(xì)胞團(tuán)煮沸并上樣至10％的SDS Page凝膠上，在1X Tris甘氨酸SDS緩沖液中電泳。電泳后，將凝膠印跡至硝酸纖維素膜(Amersham)上并進(jìn)行Westem印跡。用5％MarvelTM(Premier Beverages，Knighton，Adbaston，Stafford，UK)的PBS溶液將硝酸纖維素膜室溫下封閉30分鐘，然后用PBS和0.1％的Tween20洗二次。將在兔中制備的抗HPV6bE1的C末端蛋白序列(蛋白序列CSSSLDIQDSEDEEDGSNSQAFR)的多克隆抗體在5％MarvelTM的PBS溶液中進(jìn)行稀釋，然后加到硝酸纖維素膜上。在室溫下輕輕搖動(dòng)溫育1小時(shí)。將所述稀釋的抗體除去，用PBS和0.1％的Tween20洗膜三次。將第二種偶聯(lián)物，豬抗兔辣根過氧化物酶(HRP)(DAKO)在PBS和0.1％的Tween20中進(jìn)行1∶20000稀釋。將其加到上述洗過的膜上并在室溫下輕輕搖動(dòng)溫育1小時(shí)。然后將該膜用PBS和0.1％的Tween20徹底洗滌。用Chemiluminescent HRP試劑盒(Amersham)檢測(cè)膜上的轉(zhuǎn)移蛋白。
結(jié)果E1翻譯蛋白的預(yù)測(cè)大小是68kDa-72kDa。結(jié)果(圖8)顯示由包含密碼子最優(yōu)化的HPV6bE1的p7313-PLc表達(dá)的正確蛋白大小(泳道4)。包含野生型E1的載體在泳道3，其顯示在人細(xì)胞中沒有檢測(cè)到野生型核苷酸序列表達(dá)的E1。同樣在泳道2(空載體)和泳道1(未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞)沒有檢測(cè)到E1。在泳道1-4的大約60kD的帶是一種未確定的細(xì)胞蛋白，其與抗E1抗體交叉反應(yīng)。該帶在各泳道的強(qiáng)度大致恒定，表明各泳道樣品的上樣是一致的。
實(shí)施例5構(gòu)建表達(dá)HPVE1和HPVE2蛋白的重組痘苗病毒表達(dá)HPV-6bE1蛋白的痘苗病毒在Glaxo Wellcome，Stevenage，UK制備。表達(dá)HPV-11 E1和HPV11 E2的痘苗病毒由Jeff Engler，University ofAlabama at Birmingham，US惠贈(zèng)。
簡(jiǎn)言之，將來自p6bE1w/t的E1基因克隆到痘苗病毒載體pTM3中，然后對(duì)重組載體進(jìn)行限制性酶核對(duì)和DNA測(cè)序并用于轉(zhuǎn)染HTk-細(xì)胞。分離重組痘苗病毒并進(jìn)行噬斑純化。用肽抗血清通過Western印跡對(duì)E1蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，所述抗血清是在用表達(dá)HPV-6bE1的重組病毒和表達(dá)噬菌體T7 RNA聚合酶的第二種痘苗病毒(vTF7-3)感染允許細(xì)胞后制備的。為直接表達(dá)來自HPV-11E1和E2重組痘苗病毒的E1和E2蛋白，需與痘苗病毒vTF7-3共感染細(xì)胞。痘苗病毒株WR用在陰性對(duì)照試驗(yàn)中。載體pTM3和病毒vTF7-3來自National Institute of Health，Maryland，US。
實(shí)施例6對(duì)HPV抗原細(xì)胞應(yīng)答的免疫學(xué)檢測(cè)除非另有說明，所有試劑都來自Gibco BRL，Paisley，Scotland or Sigma，Poole，Dorset。
A.免疫方案用1.0-2.0μg DNA(或者p6bE1c/o，p6bE1w/t，p6bE1c/o mut，p6bE1w/t mut或者是空載質(zhì)粒p7313PLc)通過PMDD對(duì)雌性C57BL/6小鼠進(jìn)行免疫，14天后用同樣劑量進(jìn)行加強(qiáng)免疫。脫頸處死所述動(dòng)物，取脾研究對(duì)HPV抗原的細(xì)胞應(yīng)答。
B.制備脾細(xì)胞的單細(xì)胞懸液在毛面玻璃片(BDH)之間“搗碎”脾臟，將紅細(xì)胞裂解(155mM NH4Cl，10mM KHCO3，0.1mM EDTA)，并將細(xì)胞重懸于完全RPMI(補(bǔ)充了10％胎牛血清(FCS)，2mM谷氨酰胺，100單位/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素和5×10-5M2-巰基乙醇的RPMI-1640培養(yǎng)基)中。
C.感染MC57靶細(xì)胞衍生自HPV抗原的免疫顯性表位仍然未明確，所以在體外對(duì)抗原特異性應(yīng)答的檢測(cè)依賴于對(duì)靶細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的整個(gè)抗原的加工，所述靶細(xì)胞已用表明整個(gè)蛋白的cDNA轉(zhuǎn)染。MC57細(xì)胞(Kb陽(yáng)性)用表達(dá)HPV-6bE1，HPV-11E2或HPV-11E1的重組痘苗病毒以感染復(fù)數(shù)5在37℃感染1小時(shí)。將過多的病毒洗掉，并將所述細(xì)胞重懸在包含50ng/ml重組人IL-2(GlaxoWellcome，Geneva)的完全RPMI中。
D.ELISPOT用大鼠抗小鼠IFNγ(Pharmingen 1818D)以在PBS中15μg/ml的濃度包被ELISPOT板(96孔，Millipore MAIP S 4510)，4℃過夜，之后添加從試驗(yàn)組獲得的4×10e5個(gè)脾細(xì)胞。通過添加1×10e4個(gè)重組痘苗病毒感染的MC57細(xì)胞實(shí)現(xiàn)抗原的呈遞。野生型痘苗病毒W(wǎng)R用作陰性對(duì)照。將該分析在37℃溫育過夜(5％CO2)。
在檢測(cè)的第2天，用生物素化的大鼠抗小鼠IFNγ(Pharmingen18112D)(以1μg/ml的濃度)，鏈霉親和素堿性磷酸酶偶聯(lián)物(TCS BiologicalsSA 1008)(TCS biologicals SA 1008)(在PBS中以1/1000稀釋)檢測(cè)斑點(diǎn)形成細(xì)胞(blot forming cells)。用堿性磷酸酶底物試劑盒(Biorad 170-6432)觀察并用圖象分析進(jìn)行定量。所得結(jié)果顯示在圖9。
如圖9所示，當(dāng)用痘苗病毒載體(vacc.E1(11)或vacc.E1(6b))攜帶的E1進(jìn)行攻擊時(shí)，所有三只用編碼HPB-6b密碼子最優(yōu)化的E1序列的質(zhì)粒接種的小鼠都可觀察到強(qiáng)細(xì)胞應(yīng)答。當(dāng)這些小鼠用野生型痘苗病毒(vacc.WT)，或用表達(dá)HPV-11 E2的痘苗病毒(vacc.E2(11))進(jìn)行攻擊時(shí)，未觀察到應(yīng)答。相反，用編碼野生型E1序列的質(zhì)粒接種小鼠不產(chǎn)生T細(xì)胞應(yīng)答。來自這些小鼠的脾細(xì)胞不對(duì)攜帶E1基因的痘苗病毒的攻擊產(chǎn)生反應(yīng)，也不對(duì)任何其它的攻擊產(chǎn)生反應(yīng)(資料未顯示)。E1基因的突變不改變小鼠體內(nèi)細(xì)胞應(yīng)答。因?yàn)橛胮6bE1c/o和p6bE1c/o mut免疫的小鼠產(chǎn)生抗靶細(xì)胞(所述靶細(xì)胞用表達(dá)來自HPV-11的E1蛋白的痘苗病毒感染)的強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答，所以我們可以推測(cè)在HPV-6bE1和HPV-11E1之間有高水平的免疫交叉反應(yīng)。用空p7313-PLc載體接種的小鼠對(duì)任何攻擊顯示無應(yīng)答。
實(shí)施例7 HPV6bE2在哺乳動(dòng)物293T細(xì)胞中的表達(dá)用1μg每種質(zhì)粒(p6bw/t，p6bc/o，p6bw/t mut，p6bc/o mut)轉(zhuǎn)染24孔培養(yǎng)板中的293T細(xì)胞單層(80％匯合)，每次轉(zhuǎn)染依照標(biāo)準(zhǔn)方法使用2.5μlLipofectamine 2000(Life Technologies)(參見上述實(shí)施例4)。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，收獲細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液洗滌并用抗HPV-6b N末端氨基酸序列MEAIAKRLDACQEQLLELYEEC的抗E2肽抗血清(#1100)，通過SDS-PAGE和Western印跡進(jìn)行檢測(cè)(圖10)。
結(jié)果結(jié)果顯示在泳道3(密碼子最優(yōu)化的E2)和泳道5(密碼子最優(yōu)化且突變的E2)中有預(yù)計(jì)大小(40kD-45kD)的強(qiáng)蛋白帶。同樣大小的弱蛋白帶也顯示在泳道4中，這提示突變的野生型E2質(zhì)粒有極低水平的表達(dá)，但在泳道1(陰性對(duì)照)，或泳道2(野生型E2蛋白)中無表達(dá)。約25kd的交叉反應(yīng)性蛋白帶出現(xiàn)在所有泳道中，提示所有泳道蛋白裂解物的上樣量相等。E2的突變未顯示損及E2蛋白的表達(dá)，該蛋白的表達(dá)通過密碼子最優(yōu)化得到明顯改善。
權(quán)利要求
1.一種多核苷酸序列，其編碼人乳頭瘤病毒(HPV)的氨基酸序列，其中該多核苷酸序列的密碼子使用模式類似于高表達(dá)的哺乳動(dòng)物基因的密碼子使用模式。
2.依照權(quán)利要求1的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列的密碼子使用模式類似于高表達(dá)的人基因的密碼子使用模式。
3.依照權(quán)利要求1或2的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列的密碼子使用模式也類似于高表達(dá)的大腸桿菌基因的密碼子使用模式。
4.依照權(quán)利要求1-3的任一項(xiàng)的多核苷酸序列，其是DNA序列。
5.依照上述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的多核苷酸序列，其編碼與宮頸癌，良性皮疣或尖銳濕疣有關(guān)的HPV型或亞型的HPV多肽。
6.依照權(quán)利要求5的多核苷酸序列，其編碼1-4，6，7，10，11，16，18，26-29，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59和68型之一的HPV多肽。
7.依照權(quán)利要求6的多核苷酸序列，其編碼具體與宮頸癌或尖銳濕疣有關(guān)的HPV型或亞型的HPV多肽。
8.依照權(quán)利要求7的多核苷酸序列，其編碼6，11，16，18，33或45型之一的HPV多肽，或HPV病毒6，11，16，18，33或45型中一種或多種病毒的兩種或更多種多肽的融合體。
9.依照權(quán)利要求8的多核苷酸序列，其編碼選自HPV11，6a或6b的HPV型或亞型的HPV多肽。
10.依照上述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的多核苷酸序列，其編碼具有降低的生物功能的突變的HPV多肽。
11.依照權(quán)利要求10的多核苷酸序列，其編碼突變的HPV多肽，該多肽包含一種或多種點(diǎn)突變，從而使該多肽的一種或多種天然的生物功能被滅活。
12.依照上述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的多核苷酸序列，其中所編碼的HPV多肽包含HPV早期基因產(chǎn)物的全部或一部分。
13.依照權(quán)利要求12的多核苷酸序列，其中所編碼的HPV多肽包含E1或E2的全部或一部分，或E1或E2的全部或一部分與另一種HPV多肽的融合體。
14.依照上述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的多核苷酸序列，其具有高表達(dá)的人基因的密碼子使用系數(shù)，該系數(shù)大于0.3小于1。
15.依照上述權(quán)利要求14的多核苷酸序列，其具有高表達(dá)的人基因的密碼子使用系數(shù)，該系數(shù)大于0.4小于1。
16.依照上述權(quán)利要求15的多核苷酸序列，其具有高表達(dá)的人基因的密碼子使用系數(shù)，該系數(shù)大于0.5小于1。
17.依照上述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的多核苷酸序列，其具有高表達(dá)的大腸桿菌基因的密碼子使用系數(shù)，該系數(shù)大于0.6。
18.如圖5所示的多核苷酸序列或保持了其密碼子使用模式的其片段或類似物。
19.如圖6所示的多核苷酸序列或保持了其密碼子使用模式的其片段或類似物。
20.一種表達(dá)載體，其包含依照上述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的多核苷酸序列，該序列與調(diào)控序列可操作連接，所述調(diào)控序列能使宿主細(xì)胞表達(dá)該多核苷酸序列。
21.依照權(quán)利要求20的表達(dá)載體，其能指導(dǎo)所述多核苷酸序列在細(xì)菌，昆蟲或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)。
22.依照權(quán)利要求20或21的表達(dá)載體，其是p7313PLc。
23.一種宿主細(xì)胞，其包含依照權(quán)利要求1-19的任一項(xiàng)的多核苷酸序列。
24.一種宿主細(xì)胞，其包含依照權(quán)利要求20-22的任一項(xiàng)的表達(dá)載體。
25.依照權(quán)利要求23或24的宿主細(xì)胞，其是細(xì)菌細(xì)胞，哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞。
26.包含權(quán)利要求1-19的任一項(xiàng)的多核苷酸序列的藥物組合物。
27.包含權(quán)利要求20-22的任一項(xiàng)的載體的藥物組合物。
28.依照權(quán)利要求26或27的藥物組合物，其包含一組粒子，優(yōu)選金粒子，用DNA包被。
29.依照權(quán)利要求27的藥物組合物，其包含藥學(xué)上可接受的賦形劑和DNA載體。
30.依照權(quán)利要求26-29的任一項(xiàng)的藥物組合物，其進(jìn)一步包含佐劑。
31.依照權(quán)利要求30的藥物組合物，其中所述佐劑被編碼為與所述寡核苷酸編碼的HPV多肽的融合體。
32.依照權(quán)利要求1-19的任一項(xiàng)的多核苷酸在治療或預(yù)防HPV感染方面的用途。
33.依照權(quán)利要求20-22的任一項(xiàng)的載體在治療或預(yù)防HPV感染方面的用途。
34.依照權(quán)利要求26-31的任一項(xiàng)的疫苗組合物在治療或預(yù)防HPV感染方面的用途。
35.依照權(quán)利要求32-34的任一項(xiàng)的用途，其中HPV感染是HPV6，11，16或18型的感染。
36.依照權(quán)利要求1-19的任一項(xiàng)的多核苷酸，依照權(quán)利要求20-22的任一項(xiàng)的載體或依照權(quán)利要求26-31的任一項(xiàng)的藥物組合物，在治療或預(yù)防皮疣，尖銳濕疣，意義未確定的非典型鱗狀細(xì)胞(ASCUS)，宮頸發(fā)育異常，頸上皮內(nèi)瘤形成(CIN)或?qū)m頸癌方面的用途。
37.治療或預(yù)防HPV感染或與HPV感染有關(guān)的任何癥狀或疾病的方法，其包含給藥有效量的依照權(quán)利要求1-19的任一項(xiàng)的多肽，依照權(quán)利要求20-22的任一項(xiàng)的載體或依照權(quán)利要求26-31的任一項(xiàng)的藥物組合物。
38.治療或預(yù)防HPV感染或與HPV感染有關(guān)的任何癥狀或疾病的方法，其包含以初次免疫-加強(qiáng)免疫的給藥方案，用包含依照權(quán)利要求1-19的任一項(xiàng)的多核苷酸的重組病毒載體或基于非病毒的系統(tǒng)，給藥依照權(quán)利要求26-30的任一項(xiàng)的所述藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及在治療和預(yù)防人類乳頭狀瘤病毒感染以及與其相關(guān)的癥狀和疾病中有用的方法和組合物。具體地，本發(fā)明涉及編碼人乳頭狀瘤病毒(HPV)氨基酸序列的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列中的密碼子使用模式與高表達(dá)的哺乳動(dòng)物基因的密碼子使用模式相似。
文檔編號(hào)C12N1/21GK1462309SQ01816108
公開日2003年12月17日 申請(qǐng)日期2001年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月21日
發(fā)明者彼得·F·厄特爾, 杰拉爾德·W·高夫, 瓦尼塔·帕馬, 克里斯托弗·J·A·林, 薩拉·M·沃爾科特 申請(qǐng)人:葛蘭素集團(tuán)有限公司