專利名稱：多核苷酸的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及包含天然不存在的遍在染色質開放元件(UCOE)的多核苷酸。本發(fā)明還涉及包含多核苷酸序列的載體、包含載體的宿主細胞以及將多核苷酸、載體或宿主細胞用于治療，或用于體外蛋白質表達。
背景技術：
當今高等真核生物的染色質結構模型假定基因構成了“結構域”1，2。染色質結構域設想的存在形式有縮合、“關閉”、轉錄沉默狀態(tài)，或解縮合、“開放”、轉錄感受態(tài)構型。建立開放染色質結構特征是提高DnaseI敏感度、DNA甲基化不足和組蛋白乙?；蛔?，被視為基因表達起始的前提條件。
染色質區(qū)域的開放和關閉性質反映在通過隨機整合到宿主細胞基因組的轉基因的行為中。當整合到小鼠基因組不同位置時，相同構建體顯示出不同組織特異的模式及發(fā)展階段特異的表達3-5。在給定轉基因小鼠組織內的花斑表達模式，叫做位置效應花斑(PEV)，也經?？梢杂^察到6。當外源基因體外整合到哺乳動物細胞培養(yǎng)物中的染色體時，許多整合事件導致轉基因快速沉默，而殘余基因在表達水平上有大幅度變化7，8。這些位置效應致使轉基因表達無效，牽連到基礎研究和生物技術應用。
基因組織的染色質結構域模型暗示能夠建立并維持轉錄感受態(tài)、開放染色質結構的遺傳控制元件與基因組活性區(qū)域有關。
基因座控制區(qū)(LCR)是具有長范圍染色質重塑能力的一類轉錄調控元件。通過賦予整合位點獨立的轉基因拷貝數(shù)依賴的、在順式連接的基因尤其是單拷貝轉基因上的生理表達水平的能力，對轉基因小鼠中的LCR作出功能性定義9，10。關鍵是，這種表達是組織特異性的。LCR能夠阻礙異源染色質的擴散，防止PEV6及由一系列DnaseI過敏(HS)的位點，這些位點可以位于它們調控的基因的5’或3’端10。
LCR似乎是由兩個分散的、盡管不必互相依賴的組分構成。首先是開放染色質結構域的建立，其次是授予轉基因拷貝數(shù)目依賴性表達的顯性轉錄活化能力9。LCR發(fā)揮作用的分子機制尚在爭論之中2，11-13。
培養(yǎng)哺乳動物細胞系后代來生產高水平的治療蛋白產物，這是一種主要發(fā)展產業(yè)。染色質位置效應使其方法變得困難、費時和昂貴。最常用的生產這種哺乳動物“細胞工廠”的方法依靠由抗藥基因的組合所誘導的基因擴增(例如DHFR，谷氨酰胺合成酶(Kaufman，1990，酶學方法，185537-566，在此引作參考))，以及維持嚴格選擇壓力。運用源自適當組織的細胞，含有來自高表達基因結構域的LCR的載體的應用大大簡化了程序(Needham等，1992，核酸研究，20997-1003；Needham等，1995，蛋白質表達和純化，6124-131，分別在此引作參考)。
然而，盡管在某些情況下LCR的組織特異性很有用，但是對許多應用卻是主要限制，例如，在需要表達的組織中LCR未知，或是在許多或所有組織中需要表達的情形下。
我們在此引作參考的在審專利申請PCT/GB/02357(WO00/05393)描述了負責建立橫跨基因座的開放染色質結構的元件，所述基因座唯一由遍在表達的持家基因所組成。這些元件不是來源于LCR。本發(fā)明提供了包含遍在染色質開放元件(UCOE)的多核苷酸，所述UCOE在開放狀態(tài)下打開染色質或維持染色質，并在至少兩種不同組織類型的細胞中促進可操作連接基因重復性表達，其中多核苷酸不是來源于基因座控制區(qū)。
無甲基化CpG島在本領域中是眾所周知的(Bird等(1985)Cell4091-99，Tazi和Bird(1990)Cell 60909-920)，并可稱作DNA的富含CpG區(qū)域，其具有平均含量以上(＞60％)的CpG二核苷酸，其中胞嘧啶殘基未甲基化，以及其沿著兩個緊密空間(0.1-3kb)背馳轉錄基因的5’末端延伸。DNA的這些區(qū)域在所有組織的發(fā)育過程中保持無甲基化(Wise和Pravcheva(1999)Genomics 60258-271)。它們與所有遍在表達基因以及估計40％表現(xiàn)組織限制的表達分布圖的基因的5’末端相關16，17，并已知是活性染色質的定位區(qū)域18。
延伸的無甲基化CpG島是這樣一種無甲基化CpG島，其延伸跨越了包含一種以上轉錄起始位點的區(qū)域和/或延伸超過300bp，以及優(yōu)選超過500bp。延伸的無甲基化CpG島的邊界通過對區(qū)域運用PCR結合限制性內切酶而被功能性限定，所述限制性內切酶在識別序列消化(切割)DNA上的能力對存在的任何CpG殘基的甲基化狀態(tài)敏感。一種這樣酶是HpaII，其識別和消化位點是在CCGG處，這在CpG島內普遍存在，但是只有當中央CG殘基未被甲基化時才可被識別和消化。這樣，如果DNA未被甲基化，由于HapII消化，用HapII消化的DNA以及對含有HapII位點的區(qū)域進行PCR，則不產生擴增產物。如果DNA被甲基化，則PCR將僅生成擴增產物。因此，除了無甲基化區(qū)域，HapII不能消化DNA，而觀察到PCR擴增產物，由此限定“延伸的無甲基化CpG島”的邊界。
我們已經證明跨越包括二重背馳轉錄啟動子的無甲基化CpG島的區(qū)域產生基因表達的重復性生理水平，所述啟動子，來源于人TATA結合蛋白(TBP)/蛋白體組分B1(PSMBI)和異源核糖核蛋白A2/B1(hnRNPA2)/異源染色質蛋白1Hsγ(HP1Hsγ)基因座，以及證明其能夠阻止花斑表達模式，并基因沉默，基因沉默經常與著絲粒異源染色質內的轉基因整合一起出現(xiàn)。
我們已經表明與活性轉錄啟動子相關的無甲基化CpG島具有重塑染色質的能力，并因此被認為在持家基因座中建立和維持開放結構域的首要決定因素。
UCOE提高了生產基因傳遞事件的比例，并提高了轉基因表達的水平和穩(wěn)定性。其具有重要的研究和生物技術應用，包括轉基因動物和培養(yǎng)細胞中重組蛋白產物的生成。我們已顯示了UCOE在CMV-EGFP報告構建體表達和分泌性有藥物價值的蛋白促紅細胞生成素方面的有益效果。UCOE的特性也暗示在基因治療方面的應用。其效果經常受到低頻率的生產性基因傳遞事件和不足的表達水平和持續(xù)時間的限制45。
由于這些有意義的提示和廣泛的應用范圍，有必要來進一步優(yōu)化轉基因表達水平并在長時間培養(yǎng)中實現(xiàn)基因表達的穩(wěn)定性的提高。
一個特殊需要是克服在一些天然存在的UCOE中所觀察的方向偏差。盡管UCOE賦予了在可操作連接的啟動子上的非位置依賴性轉錄的增強，這在某種程度上為方向依賴的(即UCOE在一種方向上比其它方向更顯著有效)。在一些情況下，如一種含有兩個背馳轉錄的UCOE位于其中的表達單元的表達載體，優(yōu)點在于能從兩個啟動子中獲得平衡的、高水平的表達，而天然UCOE則不可能。因此需要人工構建雙向有效的UCOE。
發(fā)明敘述本發(fā)明提供了含有UCOE的多核苷酸，其在開放狀態(tài)下打開染色質或維持染色質，并在至少兩種不同組織種類的細胞中促進可操作連接基因的重復性表達，其中UCOE的多核苷酸序列在天然中不存在。
含有來自至少兩個基因的調控序列的基因組區(qū)域結合后形成在長培養(yǎng)時間中顯著增強基因表達的嵌合UCOE。這樣一種嵌合UCOE組成了天然不存在的多核苷酸序列。因此，短語“天然不存在”是指這樣一個情況，其中組成UCOE的元件的核苷酸序列不象這樣天然存在，它是通過人造或人工構建，是天然存在和/或人工產生序列的組合。
在此處所用的術語“人工”、“人工構建”、“嵌合”等，參考UCOE在全篇可交換使用，表示UCOE或組成UCOE的元件在天然情況下不存在；即“天然不存在”。如果UCOE是天然存在的序列的組合，則正是它們排列或組織成UCOE是非天然的。通過非限制實施例，人工UCOE可由兩個天然存在的序列組成，所述序列通常分開(來自染色體不同區(qū)域、來自不同染色體、來自不同生物等)，以及被合并在非天然組織中，從而創(chuàng)建嵌合或人工UCOE。
在此處所用的術語“人工合成”和“人工產生”是參考UCOE的序列，指非天然序列；即，天然不存在并全部合成的序列。這類“人工合成”和“人工產生”的序列可結合到天然存在的序列上以組成或創(chuàng)建人工UCOE。
依據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供含有DNA序列的核酸分子，所述DNA序列選自1)圖2或圖7中表示的DNA序列；2)與圖2或圖7中表示的序列雜交的DNA序列，其編碼根據(jù)本發(fā)明所述的多肽。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中提供了分離的核酸分子，其在嚴格雜交條件下退火至圖2或圖7中代表的DNA序列上。
嚴格雜交/洗脫條件是本領域眾所周知的。例如，60℃下在0.1×SSC、0.1％SDS中清洗后核酸雜合物是穩(wěn)定的。本領域眾所周知的是如果核酸序列已知，最適雜交條件是可以計算的。例如，可以通過雜交核酸的GC含量確定雜交條件。請參見Sambrook等(1989)，分子克隆實驗室手冊。在規(guī)定同源性的核酸分子之間進行雜交所需的嚴格條件的計算通式為Tm＝81.5℃+16.6Log[Na+]+0.41[％G+C]-0.63(％甲酰胺).
優(yōu)選的是本發(fā)明多核苷酸非組織特異性地促進可操作連接基因的重復性表達。
優(yōu)選的是本發(fā)明多核苷酸在活性基因表達發(fā)生的所有組織類型中促進可操作連接基因的重復性表達。
優(yōu)選的是本發(fā)明多核苷酸在生理水平上促進可操作連接基因的表達。
優(yōu)選的是本發(fā)明多核苷酸包含延伸的無甲基化CpG島。
優(yōu)選的是本發(fā)明多核苷酸包含一種或多種與基因表達控制相關的天然存在的序列。
優(yōu)選的是本發(fā)明多核苷酸包含一種或多種天然存在的啟動子。
優(yōu)選的是本發(fā)明多核苷酸包含雙重或雙向背馳轉錄的啟動子。
優(yōu)選的是本發(fā)明多核苷酸包含人β-肌動蛋白CpG島/啟動子區(qū)域或其片段。
優(yōu)選的是本發(fā)明多核苷酸包含100bp-3.0kb的DNA片段，其跨越人β-肌動蛋白CpG島/啟動子區(qū)域或其片段。
優(yōu)選的是本發(fā)明多核苷酸包含人PDCD2 CpG島/啟動子區(qū)域或其片段。
優(yōu)選的是本發(fā)明多核苷酸包含100bp-3.0kb的DNA片段，其跨越人PDCD2 CpG島/啟動子區(qū)域或其片段。
優(yōu)選的是本發(fā)明多核苷酸包含100bp-3.0kb的DNA片段，其跨越人β-肌動蛋白CpG島/啟動子區(qū)域，以及包含100bp-3.0kb的DNA片段，其跨越人PDCD2 CpG島/啟動子區(qū)域。優(yōu)選的是所述片段直接與方向背馳的啟動子相鄰。
優(yōu)選的是本發(fā)明多核苷酸包含2kb的DNA片段，其跨越人β-肌動蛋白CpG島/啟動子區(qū)域，以及包含1.8kb的DNA片段，其跨越人PDCD2 CpG島/啟動子區(qū)域。優(yōu)選的是所述片段直接與方向背馳的啟動子相鄰。
在進一步優(yōu)選的實施方案中，多核苷酸包含圖2的序列或其片段，方向任意。
優(yōu)選的是多核苷酸包含人RNP CpG島/啟動子區(qū)域或其片段。
優(yōu)選的是多核苷酸包含跨越人RNP CpG島/啟動子區(qū)域的4kb的DNA片段。
優(yōu)選的是多核苷酸包括含有雙背馳啟動子的延伸的無甲基化CpG島，所述雙背馳啟動子與至少一種含有無甲基化CpG島的其他序列臨近。
優(yōu)選的是多核苷酸包含人RNP CpG島/啟動子區(qū)域和跨越人β-肌動蛋白CpG島/啟動子區(qū)域的范圍是100bp-3.0kb的DNA片段。
在進一步的優(yōu)選實施方案中，多核苷酸包括以任意方向插入的圖7的序列或其片段。優(yōu)選的是多核苷酸含有一種或多種啟動子序列。
本領域已知的是在一些情形下，上游啟動子的連讀轉錄抑制了轉錄起始(Youssoufian和Lodish(1993)，鼠紅細胞生成素受體基因受到上游重復元件的轉錄抑制，Mol Cell Biol 13(1)98-104)。因此本發(fā)明的一個實施方案包括本發(fā)明多核苷酸，其中一種或多種啟動子序列以這種方式突變而不能起始轉錄。
優(yōu)選的是啟動子選自CMV、EF-1a、RSV LTR或HIV2 LTR或源于其中的序列組合。更優(yōu)選的啟動子是CMV啟動子，最優(yōu)選的啟動子是小鼠CMV啟動子。
優(yōu)選的是本發(fā)明多核苷酸包括至少一種人工合成的序列。
本發(fā)明還提供含有本發(fā)明多核苷酸的載體。
優(yōu)選的是所述載體為適合于真核生物表達的表達載體。
通過實例而非通過限制方式，通常適應包括提供介導細胞/組織特異表達的轉錄控制序列(啟動子序列)。
啟動子和增強子是本領域中熟知的術語，包括下列僅由實施例而非限制方式提供的特征。啟動子是直接與轉錄起始連接的5’端順式作用調控序列。啟動子元件包括所謂的TATA盒和RNA聚合酶起始選擇(RIS)序列，其功能是選擇轉錄起始位點。這些序列也結合多肽，其功能特別是通過RNA聚合酶促進轉錄起始選擇。
增強子元件是常常在基因轉錄起始位點5’端找到的順式作用的核酸序列(在基因序列的3’端也可找到增強子，或其甚至位于內含子序列中，并因此為位置不依賴型。)增強子有提高與該增強子連接的基因的轉錄速率的功能。增強子活性是對反式作用轉錄因子(多肽)的反應，其已顯示出與增強子元件特異性結合。轉錄因子的結合/活性是對許多環(huán)境因素的反應，其通過實例而非限制方式包括中間代謝物(如葡萄糖)、環(huán)境效應子(如熱)(參見David S.Latchman，真核生物轉錄因子，Academic Press Ltd，SanDiego)。
適應也包括提供選擇性標記和自主復制序列，其促進真核細胞和原核生物宿主中所述載體的維持。自主維持的載體是指游離型載體。游離型載體是理想的，這是由于它們無需整合而自主復制和維持。W0/98/07876描述了這種類型的游離型載體。
促進載體編碼基因表達的適應包括提供轉錄終止/聚腺苷酸化序列。也包括提供內部核糖體進入位點(IRES)，其功能是最大化表達以雙順反子或多順反子的表達盒排列的載體編碼的基因。
這些適應也是本領域熟知的。有大量出版文獻是有關表達載體構建和一般DNA重組技術。請參見Sambrook等(1989)，分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約；Marston，F(xiàn)(1987)DNA克隆技術實用方法第3卷，IRL出版社，英國牛津；DNA克隆FMAusubel等，當前分子生物學方法，John Wiley & Sons有限公司，(1994)。
優(yōu)選的是載體包含與啟動子和多核苷酸可操作連接的可表達基因。
優(yōu)選的載體是游離型或整合型載體。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明載體為質粒。
或者，載體可以是病毒，如腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、牛痘病毒、慢病毒或其它反轉錄病毒。
優(yōu)選的可操作連接基因為治療性核酸序列。
優(yōu)選的是載體包含兩個待表達可讀框插入的位點，每一位點由不同的啟動子轉錄，所述啟動子排列后可背馳轉錄，并且兩個啟動子可操作連接到位于其間的人工構建UCOE上，以及其中所述UCOE已被構建為雙向有效的結構。這樣特別有利于生產含有兩條或多條肽鏈的蛋白質，包括但不限于免疫球蛋白。此載體中的插入位點可插入編碼不同目的多肽的核酸，包括但不限于編碼免疫球蛋白重鏈和免疫球蛋白輕鏈的可讀框。
優(yōu)選的是載體包含在適當控制元件下的圖2序列、CMV啟動子、多克隆位點、聚腺苷酸化序列和編碼可選擇性標記的基因。同樣，對本領域專業(yè)技術人員來說，人工UCOE可以雙向插入將是一目了然的。
優(yōu)選的載體包含人工UCOE，是圖3a中示意的CET500。
在另一實施方案中，載體為圖3b所示的CET501。
或者，任一項權利要求所述的載體包括在適當控制元件下的圖7序列、CMV啟動子、多克隆位點、聚腺苷酸化序列和編碼可選擇性標記的基因。同樣，對本領域專業(yè)技術人員來說，人工UCOE可以雙向插入將是顯然的。
在這選擇的優(yōu)選實施方案中，載體包括人工UCOE，已知為圖8a示意的CET600。
在進一步或選的實施方案中，載體是CET601，如圖8b所示意。
本發(fā)明還提供用本發(fā)明載體轉染的宿主細胞。
本發(fā)明還提供用于治療的多核苷酸、載體和宿主細胞。
本發(fā)明還提供多核苷酸、載體和宿主細胞在用于基因治療組合物制造中的應用。
本發(fā)明還提供治療方法，其包括給需要這種治療的病人施用藥物有效量的發(fā)明的多核苷酸、載體或宿主細胞。優(yōu)選的是病人正患有可由基因療法處理的疾病。
本發(fā)明還提供藥物組合物，其包括多核苷酸和/或載體和/或宿主細胞，任選與可藥用載體或稀釋劑混合，用于治療疾病或給特定組織的細胞提供有益的蛋白或功能。
本發(fā)明的多核苷酸、載體或宿主細胞或藥物組合物可以通過下列途徑施用，包括全身性肌內、靜脈內、氣溶膠、口服(固體或液體形式)、局部、眼、直腸、腹膜內和/或鞘內和局部直接注射。
確切的劑量方案當然需要由單個臨床醫(yī)師針對個別臨床患者來確定，而這反過來又受到目的基因表達的蛋白和正被靶向治療的組織類型的確切性質的控制。
劑量也將取決于疾病癥狀及施用路徑。劑量數(shù)將取決于疾病及臨床測試的功效數(shù)據(jù)。
依據(jù)本發(fā)明，有效基因治療所用的多核苷酸或載體DNA的量優(yōu)選范圍是在50ng-1000μg載體DNA/kg體重；以及更優(yōu)選范圍是在約1-100μg載體DNA/kg體重。
盡管根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選是給哺乳動物施用多核苷酸、載體或宿主細胞用于體內細胞吸收，但離體方法可采用，于是將細胞從動物中移出，用多核苷酸或載體轉導，然后重植入動物體內。例如，肝可由離體方法進行評價，所述離體方法是從動物體上移取肝細胞，體外轉導到肝細胞中，并將轉導的肝細胞重植入動物體內(如對兔的描述，Chowdhury等，Science 2541802-1805，1991，或在人體內，Wilson，Hum.Gene Ther.3179-222，992)。這些方法也可以有效傳遞到循環(huán)系統(tǒng)或淋巴系統(tǒng)的各種細胞群中，如紅細胞、T細胞、B細胞和造血干細胞。
本發(fā)明的另一實施方案提供運用本發(fā)明多核苷酸、載體或宿主細胞確定基因療效的哺乳動物模型。哺乳動物模型包括其細胞含有本發(fā)明載體的轉基因動物。制備轉基因小鼠的方法(Gordon等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 777380(1980)；Harbers等，Nature 293540(1981)；Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 785016(1981)；以及Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 786376(1981)，制備轉基因羊、豬、雞的方法(參見Hammer等，Nature 315680(1985))等是本領域眾所周知的，并依據(jù)本發(fā)明考慮使用。在人體臨床試驗前允許對這些動物進行測試。
含有本發(fā)明多核苷酸的轉基因動物也可用于長期生產目的蛋白。
本發(fā)明也提供在細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中運用多核苷酸，和/或載體，和或宿主細胞以獲得所需基因產物。合適的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)是本領域眾所周知的，并在本領域專業(yè)技術人員已知的文獻中詳細敘述。
本發(fā)明也提供運用多核苷酸來提高內源基因的表達，其包括在與內源基因可操作相關的位置上，將多核苷酸插入到細胞的基因組中由此提高基因表達水平。
本發(fā)明還提供本發(fā)明多核苷酸在生產轉基因植物中的應用。
提高產量、抗性等的轉基因植物的增殖對本領域那些專業(yè)人員是眾所周知的。本發(fā)明也提供含有本發(fā)明多核苷酸細胞的轉基因植物。一些或所有包含人工UCOE的細胞起源于植物。
本發(fā)明還提供含有本發(fā)明多核苷酸細胞的轉基因非人類動物。
本發(fā)明也涉及在功能性基因組應用中使用本發(fā)明多核苷酸。功能性基因組主要涉及特殊細胞類型或病態(tài)中特異性表達的基因序列，目前提供成千上萬種潛在的用于新藥發(fā)現(xiàn)和基因治療的新型基因序列。利用這些信息用于開發(fā)新型治療的主要問題在于如何確定這些基因的功能。為了確定基因序列的功能，在眾多功能性基因組應用中可使用UCOE。本發(fā)明的功能性基因組應用包括但不限于(1)運用本發(fā)明的多核苷酸來獲得基因序列或核酶剔除文庫的反義版本的持續(xù)表達，由此確定基因在細胞表型上滅活的效果。
(2)運用本發(fā)明的多核苷酸以制備基因序列的表達文庫，以便送遞到細胞中將導致基因序列可靠、重復、持久的表達。所得細胞表達基因序列可用于功能確定和新藥發(fā)現(xiàn)的各種方法中。例如，提供基因產物的中和抗體；基因本身蛋白產物的快速純化，用于結構、功能和藥物篩選研究中；或用在基于細胞的藥物篩選中。
(3)本發(fā)明多核苷酸在涉及小鼠胚胎干(ES)細胞和轉基因小鼠方法中的應用。最有效的功能性基因組方法之一包括在小鼠ES細胞中隨機插入基因，所述結構在插入表達基因后僅允許藥物選擇，并可容易地被拯救用于測序(G.Hick等，Nature Genetics，16，338-334)。然后，基因中敲除突變體的具有新型序列的轉基因小鼠可容易地被制備以探測到其功能。目前，此技術對小鼠ES細胞中很好表達的10％小鼠基因測定效果不錯。把UCOE摻入到整合結構中將使得此技術推廣應用到鑒別小鼠中所有表達基因。
本發(fā)明另外的實施方案提供生產依據(jù)本發(fā)明所述的多核苷酸的方法，其包括1)提供用依據(jù)本發(fā)明所述的核苷酸分子轉化/轉染的細胞；2)有利于生產所述肽的條件下使所述細胞生長；3)從所述細胞中或其生長環(huán)境中純化所述多核苷酸。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，所述核酸分子是根據(jù)本發(fā)明所述的核酸分子。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，所述載體編碼促進所述多肽純化的分泌信號，并且所述多肽由此信號提供。
或者，其它優(yōu)選的實施方案可包括進一步精制，以利于表達重組蛋白的純化，如親和標記或表位或酶切位點。發(fā)明詳述現(xiàn)在本發(fā)明將僅以實施例方式及參考附圖來描述，其中

圖1是人工UCOE NcoI片段的線性限制性圖譜。陰影箭頭表示PDCD2和肌動蛋白轉錄物，箭頭方向表示各自啟動子轉錄的方向。
圖2表示依據(jù)本發(fā)明所述的PDCD2/肌動蛋白人工UCOE NcoI片段的核苷酸序列。
圖3a和3b描述含有表達載體的PDCD2/肌動蛋白人工UCOE的質粒圖譜。
圖3a表示CET500，其含有CMV啟動子的PDCD2/肌動蛋白人工UCOE上游以及適于待表達可讀框插入的多克隆位點。在此特定的實施方案中，質粒骨架來源于pEGFPN-1，并攜帶卡那霉素/新霉素抗性基因。
圖3b表示CET501，其含有反向的PDCD2/肌動蛋白人工UCOE。
圖4表示穩(wěn)定轉染CHO細胞庫中報告轉基因(EGFP)的表達水平，在G418選擇下維持85天。表達單獨由CMV啟動子(CMV)，或與8kb RNP/HP-1(CET200)組合，或與人工PDCD2/肌動蛋白UCOECET510組合驅動，并通過FACS分析以中值熒光測定。
圖5表示在上述85天的實驗中，經FACS分析，以陽細胞％表示表達轉基因細胞的比例。
圖6是RNP/HP-1/肌動蛋白人工UCOE片段的線性限制性圖譜。陰影箭頭表示無甲基化島，箭頭方向表示各自啟動子轉錄的方向。
圖7表示依據(jù)本發(fā)明所述的RNP/HP-1/肌動蛋白人工UCOE片段的核苷酸序列。
圖8描述了含有RNP/HP-1/肌動蛋白人工UCOE的表達載體的質粒圖譜。
圖8a表示CET600，其包括CMV啟動子的RNP/HP-1/肌動蛋白人工UCOE上游以及適宜插入待表達可讀框的多克隆位點。在此特定的實施方案中，質粒骨架來自pEGFPN-1，并攜帶卡那霉素/新霉素抗性基因。
圖8b表示CET601，其包括反向的RNP/HP-1/肌動蛋白人工UCOE。
圖9表示在G418選擇下維持127天，穩(wěn)定轉染CHO細胞庫中報告轉基因(EGFP)的表達水平。表達由CMV啟動子(CMV)單獨，或與8kb RNP UCOE以正向(CET220)或反向(CET221)組合驅動，或通過RNP/HP-1/肌動蛋白人工UCOE以正向(CET610)或反向(CET611)驅動，并通過FACS分析以中值熒光測量?？梢岳斫鉃镃ET610相當于CET600，但是包含EGFP作為插入基因，以及CET611是含有相應EGFP的CET601的等同物。
圖10表示上述127天的實驗中，經FACS分析，以陽細胞％表示的表達轉基因細胞的比例。
圖11a-11d描述了用于免疫球蛋白表達的雙向UCOE載體的質粒圖譜。
實施例1UCOE片段的異源組合我們已經發(fā)現(xiàn)4.0CMV和8.0CMV構建體中的A2/HP1片段用TBP/B1基因座的可比較區(qū)域置換，給hCMV啟動子在EGFP表達的水平和穩(wěn)定性方面帶來了實質性提高。這些在組織培養(yǎng)細胞方面的發(fā)現(xiàn)，為包含延伸CpG島和背馳轉錄啟動子的DNA區(qū)域負責提高整合事件生存的比例、顯著提高轉基因表達以及抵抗甚至來自著絲點異源染色質內的轉錄沉默提供了證據(jù)。
包含持家基因的CpG島與單一啟動子相關的基因組區(qū)域被組合。此構建體包含人β-肌動蛋白基因375’末端2kb的CpG島，其連接到含有人PDCD2基因5’末端的CpG島的3.2kb片段上。啟動子是背馳轉錄的，并且它們的轉錄起始位點分開1.9kb。
然后把完整的5.2kb組合物連接到EGFP報告基因上。其由CMV啟動子(PDCD2/ACTIN)驅動。與此對照，僅僅β-肌動蛋白CpG島/啟動子區(qū)域也插入到CMV-EGFP表達載體(ACTIN)的上游。
材料和方法參考圖2，通過AseI和NheI消化，將CMV啟動子從pEGFP-N1中移出，接著用T4 DNA聚合酶鈍化并再連接產生pA-EGFP-N1。通過用BsmI和NcoI消化MA39(HSACCYBB)、分離適當片段并用T4DNA聚合酶鈍化，以構建β-肌動蛋白啟動子EGFP的融合。這一片段連接到已用AgeI消化、用T4 DNA聚合酶鈍化、然后用SmaI消化的pΔ-EGFP-N1上。這樣產生了β-肌動蛋白基因的第一密碼子與EGFP的框內融合，其表達受到β-肌動蛋白啟動子/MFI(無甲基化島)的驅動。該構建體p Actin-EGFP表現(xiàn)出在穩(wěn)定轉染CHOK1細胞中表達EGFP。
為了構建具有雙向啟動子和延伸的無甲基化島的載體，PDCD2基因及其某個啟動子要首先通過SwaI和BspEI消化從pCP2-TNN(大約160kbp pCYPAC-2中的TBP基因座)上移出，并亞克隆到已用EcoRV和XmaI消化的BluescriptKS+(pPDCD2-KS)中。由于此載體不包括整個PDCD2無甲基化島，同樣含有啟動子的PDCD2無甲基化島的殘余5’區(qū)域可利用如下引物從pCP2-TNN中經PCR獲得5’GCGGTACCAAGGGCATTCTGAAGTTAACC-3’，5-AGCTCCACAGGCCTGG-3’。然后PCR產物用KpnI(用PCR引物產生的位點)和StuI(內位點)消化，pActin-EGFP用SalI和KpnI消化，以及通過用SalI和StuI消化從pPDCD2-KS上移出PDCD2基因。所有三個片段連接在一起形成pPDCD2-Actin-EGFP。
含有pF-PDCD2-Actin-EGFP的無甲基化島的區(qū)域作為NcoI片段(約5.2kb)被移出，用T4 DNA聚合酶鈍化，然后以雙向連接到已用AseI消化并鈍化過的pEGFPN-1中。這些載體稱為CET510(UCOE正向)和CET511(UCOE反向)。相應的空表達載體沒有轉基因插入到多克隆位點，分別稱為CET500和CET501(參見圖3)。
構建體用PvuI線性化，轉染到CHO-K1細胞中，并在G418篩選物(0.6mg/ml)中篩選用于兩次實驗。
要理解的是本領域專業(yè)技術人員可改編這些程序以制備和測試本發(fā)明的其他多核苷酸。
結果如圖4和圖5所示，人工UCOE構建體給出報告基因表達水平，根據(jù)中值熒光，其與那些用8kb RNP/HP-1UCOE獲得的構建體是可比的，并根據(jù)實驗時間過程中表達的細胞比例，前者略好于后者。實施例2UCOE與無甲基化CpG島片段的異源組合材料和方法用NcoI消化后用KpnI鈍化，從pActin-EGFP上移出肌動蛋白無甲基化島。用KpnI和HindIII消化，從CET20上移出RNP 4kb片段。然后將這兩個片段連接到已用ClaI消化、鈍化并用HindIII切割過的pBKS上。這產生pBKS中的人工UCOE。
用SalI和HindIII消化，從pBKS上移出人工UCOE，鈍化并連接到已用AseI消化并鈍化過的pEGFP-N1上。將UCOE雙向插入以分別創(chuàng)建CET610和CET611。沒有轉基因插入到多克隆位點的相應表達載體分別稱為CET600和CET601(參見圖8)。
把構建體線性化，轉染到CHO-K1細胞中，并在實驗持續(xù)時間內G418篩選物(0.6mg/ml)中篩選。
結果人工UCOE(雙向)對于轉基因表達水平的影響通過與單獨用CMV啟動子，以及8kb RNP/HP-1UCOE(雙向)獲得的結果比較作出評價。圖9表明，在FACS分析中根據(jù)中值熒光，CMV啟動子單獨體現(xiàn)低表達水平。RNP UCOE(CET220)和UCOE(CET600)在正向均大大提高了表達(30-倍)，并且是可比的。然而，RNP UCOE表現(xiàn)出的方向偏愛與用人工UCOE比較不顯著，即反向時人工UCOE較好，盡管仍略遜色與正向UCOE。這對整體表達水平和維持長時間表達的能力是正確的。
根據(jù)細胞維持表達時間的比例對相同實驗進行分析時，兩種UCOE在兩個方向上均一致取得比單獨使用CMV較好的結果(約2倍于實驗早期中表達的細胞)。時間延長，差異更顯著。單獨使用CMV的群體漸進式喪失表達細胞，直到120天時，僅約10％細胞仍在表達。與之對照，正向兩種UCOE維持在約90％，以及實驗結束時反向上水平略低(75-85％)。實施例3同樣載體上兩種基因的共表達有效功能性抗體生產需要重鏈和輕鏈的適當平衡表達。在不同質粒上兩條鏈的轉染使得很難維持相等的拷貝數(shù)，并且如果基因組中載體整合彼此相互靠近，會帶來基因間潛在的轉錄干擾。
已經構建了一系列同樣載體上兩個基因共表達的新載體，用來比較neo對puro作為抗性標記，和hCMV、β-肌動蛋白或mCMV啟動子，以驅動輕鏈和重鏈表達(圖11)。
材料和方法通過引入含有退火寡Mfe.F，5’-AACAATTGGCGGC和Mfe.R，5’-GCCAATTGTTGCC的連接物分子，pORT1(Cobra)的兩個Sfi位點變?yōu)镸feI位點。
用引物TK.F，5’ACGCGTCGACGGAAGGAGACAATACCGGAAG，和TK.R，5’-CCGCTCGAGTTGGGGTGGGGAAAAGGAA，從pVg RXR(invitrogen)中擴增HSV TK聚腺苷酸化位點。把SalI到XhoI片段插入到SalI位點上。用引物mPGK.F，5’-CGGGATCCGCCTGAGAAAGGAAGTGAGCTG和mPGK.R，5’-GAAGATCTGGAGGAATGAGCTGGCCCTTA從雄性BALB/c基因組DNA(Clontech)擴增鼠PGK聚腺苷酸化位點，并將BamHI到BglII片段克隆到BamHI位點中。
含有neo表達盒的pcDNA3.1的AseI到SalI片段用T4 DNA聚合酶處理，連接到SpeI接頭(5’-GACTAGTC)上。然后將SpeI片段克隆到SpeI位點上以生成pORTneoF或把攜帶嘌呤霉素抗性盒的CET700(Cobra)的EcoRI到NotI片段用T4 DNA聚合酶處理，連接到XbaI接頭上，并將XbaI片段克隆到XbaI位點上以生成pORTpuroF。
將來自pCMVEGFPN-1(Cobra)的HindIII到BamHI鼠CMV啟動子片段亞克隆到BKS+(Cobra)中的雜交UCOE的HindIII到BamHI位點上。然后利用引物hCMVF，5’-CTCGAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCAT和hCMVR，5’-GTCGACGATCTGACGGTTCACTAAACCAGCTCT，從質粒pIRESneo(Clontech)上擴增CMV啟動子，并將XhoI到SalI片段克隆到SalI位點上。然后把BamHI到SalI片段克隆到pORTneoF的BamHI到SalI位點上以生成pBDUneoF100，或克隆到pORTuroF中以生成pBDUpuro300。
BKS+內雜交UCOE中的SalI克隆位點上游兩個ATG密碼子通過定點誘變而改變，將BamHI到SalI片段克隆到pORTneoF的BamHI到SalI位點上以生成pBDUneo200，或克隆到pORTpuroF以生成pBDUpuro400。
將人抗體輕鏈編碼序列克隆到所有四種雙向UCOE載體(pBDUneo100、pBDUneo200、pBDUpuro300和pBDUpuro400)的BamHI或SalI位點上，接著使免疫球蛋白重鏈編碼序列克隆到殘余BamHI或SalI克隆位點上以生成pBDUneo112、pBDUneo121、pBDUneo212、pBDUneo221、pBDUpuro112、pBDUpuro121、pBDUpuro212和pBDUpuro221。按照廠商說明，利用脂轉染試劑，把所有8種抗體表達構建體轉染到CHO-K1細胞中，并用500μg/ml G418(neo載體)或12.5μg/ml嘌呤霉素(puro載體)篩選。
篩庫后比較不同構建體間的抗體產生速率，以確定CHO細胞中抗體表達的最佳啟動子和可選擇標記。
結果表1證明，含有從鼠CMV啟動子中表達的輕鏈的載體表達抗體效果最好。在用含有G418或嘌呤霉素抗性盒的載體所獲得的生產速率之間未觀察到明顯差異。對單獨進行共轉染實驗的庫的生產速率進行比較。本庫分離出的克隆產生速率為3-18pg/細胞/天。然而，5pg/細胞/天以上的克隆不穩(wěn)定，在表達中迅速降低或停止產生。表達量約5pg/細胞/天的克隆用于初始發(fā)酵實驗。在從雙向UCOE載體轉染體中分離的克隆中可觀察到更高的產生速率，這些初步指征很鼓舞人心。
表1來自雙向UCOE載體的hAb1(IgG4)(CHO-K1庫)的表達。
CHO-K1庫載體 H3啟動子K1啟動子產生速率(pg/細胞/天)pBDUneo 112 鼠CMV 人CMV 0.3pBDUneo 121 人CMV 鼠CMV 1.5pBDUneo 212 鼠CMV 人β-肌動蛋白 0.06pBDUneo 221 人β-肌動蛋白 鼠CMV 1.3pBDUpuro 312 鼠CMV 人CMV 0.5pBDUpuro 321 人CMV 鼠CMV 1.4pBDUpuro 412 鼠CMV 人β-肌動蛋白 0.05pBDUpuro 421 人β-肌動蛋白 鼠CMV 2.3共轉染**人CMV 人CMV 0.7**用同樣抗體基因先進行共轉染，各抗體基因由4kb UCOE CMV載體驅動(hydro或neo選擇)參考文獻1.Dillon，N和Grosveld，F(xiàn).染色質結構域作為真核生物基因功能的潛能單位，Curr.Opin.Genet.4，260-264(1994)。
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權利要求
1.一種包含UCOE的多核苷酸，其在開放狀態(tài)下打開染色質或維持染色質，并促進至少兩種不同組織類型的細胞中的可操作連接基因的重復性表達，其中UCOE的多核苷酸序列在天然中不存在。
2.如權利要求1所述的多核苷酸，其非組織特異性地促進可操作連接基因的重復性表達。
3.如權利要求1所述的多核苷酸，其促進其中存在活性基因表達的所有組織種類中的可操作連接基因的重復性表達。
4.如前述權利要求中任一項所述的多核苷酸，其促進可操作連接基因在生理水平上的表達。
5.如前述權利要求中任一項所述的多核苷酸，其中UCOE包括延伸的無甲基化CpG島。
6.如前述權利要求中任一項所述的多核苷酸，其中UCOE包括一種或多種與基因表達控制相關的天然存在的序列。
7.如前述權利要求中任一項所述的多核苷酸，其中UCOE包括一種或多種天然存在的啟動子。
8.如前述權利要求中任一項所述的多核苷酸，其中UCOE包括雙重或雙向背馳轉錄的啟動子。
9.如前述權利要求中任一項所述的多核苷酸，其中UCOE包括人β-肌動蛋白CpG島/啟動子區(qū)域或其片段。
10.如權利要求9所述的多核苷酸，其中UCOE包括范圍為100bp-3.0kb的DNA片段，其跨越人β-肌動蛋白CpG島/啟動子區(qū)域或其片段。
11.如前述權利要求中任一項所述的多核苷酸，其中UCOE包括人PDCD2 CpG島/啟動子區(qū)域或其片段。
12.如權利要求11所述的多核苷酸，其中UCOE包括范圍為100bp-3.0kb的DNA片段，其跨越人PDCD2 CpG島/啟動子區(qū)域或其片段。
13.如前述權利要求中任一項所述的多核苷酸，其中UCOE包括范圍為100bp-3.0kb的跨越人β-肌動蛋白CpG島/啟動子區(qū)域的DNA片段以及范圍為100bp-3.0kb的跨越人PDCD2 CpG島/啟動子區(qū)域的DNA片段。
14.如前述權利要求中任一項所述的多核苷酸，其中UCOE包括跨越人β-肌動蛋白CpG島/啟動子區(qū)域的2.0kb DNA片段，以及跨越人PDCD2 CpG島/啟動子區(qū)域的1.8kb DNA片段。
15.如權利要求13或14所述的多核苷酸，其中啟動子為背馳方向。
16.如前述權利要求中任一項所述的多核苷酸，其中UCOE包括以任意方向插入的圖2序列或其片段。
17.如前述權利要求中任一項所述的多核苷酸，其中UCOE包括人RNP CpG島/啟動子區(qū)域或其片段。
18.如權利要求17所述的多核苷酸，其中UCOE包括跨越人RNPCpG島/啟動子區(qū)域的4kb DNA片段。
19.如前述權利要求中任一項所述的多核苷酸，其包括含有雙背馳啟動子的延伸的無甲基化CpG島，所述雙背馳啟動子與至少一種含無甲基化CpG島的其他序列相鄰。
20.如前述權利要求中任一項所述的多核苷酸，其中UCOE包括人RNP CpG島/啟動子區(qū)域，以及范圍為100bp-3.0kb的跨越人β-肌動蛋白CpG島/啟動子區(qū)域的DNA片段。
21.如權利要求20所述的多核苷酸，其中UCOE包括以任意方向插入的圖7序列或其片段。
22.如權利要求前面任一項所述的多核苷酸，其進一步含有啟動子。
23.如權利要求前面任一項所述的多核苷酸，其中UCOE包括一種或多種由于突變而失去起始轉錄能力的啟動子序列。
24.如權利要求22或23所述的多核苷酸，其中啟動子為CMV啟動子。
25.如權利要求24所述的多核苷酸，其中啟動子為小鼠CMV啟動子。
26.如權利要求前面任一項所述的多核苷酸，其中UCOE包括至少一種人工合成的序列。
27.一種載體，其包括前述權利要求中任一項所述的多核苷酸。
28.如權利要求27所述的載體，其另含有與啟動子可操作連接的可表達基因和多核苷酸。
29.如權利要求27或28所述的載體，其中載體是游離型或整合型載體。
30.如權利要求27-29中任一項所述的載體，其中載體是質粒。
31.如權利要求27-29中任一項所述的載體，其中載體是病毒。
32.如權利要求27-31中任一項所述的載體，其中可操作連接基因是治療性核酸序列。
33.如權利要求27-32中任一項所述的載體，其中載體含有兩個待表達可讀框的插入位點，各位點轉錄自不同的啟動子，所述啟動子排列后可背馳轉錄，并且兩個位點均可操作連接到位于它們中間的人工構建的UCOE，以及其中所述UCOE已被構建成在兩個方向均有效。
34.如權利要求33所述的載體，其中待表達可讀框兩個插入位點之一包括編碼免疫球蛋白重鏈的核酸，而另一位點含有編碼免疫球蛋白輕鏈的核酸。
35.如權利要求27-34中任一項所述的載體，其包含在適當控制元件下的圖2序列、CMV啟動子、多克隆位點、聚腺苷酸化序列和編碼可選擇標記的基因。
36.如權利要求27-34中任一項所述的載體，其包含在適當控制元件下的圖7序列、CMV啟動子、多克隆位點、聚腺苷酸化序列和編碼可選擇標記的基因。
37.如權利要求35或36中所述的載體，其中UCOE為反向插入。
38.載體CET500，如圖3a示意。
39.載體CET501，如圖3b示意。
40.載體CET600，如圖8a示意。
41.載體CET601，如圖8b示意。
42.一種宿主細胞，其轉染有權利要求27-41中任一項所述的載體。
43.如權利要求1-26中任一項所述的多核苷酸、如權利要求27-41中任一項所述的載體或如權利要求42所述的宿主細胞在治療上的應用。
44.如權利要求1-26中任一項所述的多核苷酸、如權利要求27-41中任一項所述的載體或如權利要求42所述的宿主細胞在制備用于基因治療的組合物中的應用。
45.一種治療方法，其包括給需要此治療的患者施用藥物有效量的如權利要求1-26中任一項所述的多核苷酸、如權利要求27-41中任一項所述的載體或如權利要求42所述的宿主細胞。
46.一種藥物組合物，其包括與可藥用賦形劑組合的如權利要求1-26中任一項所述的多核苷酸，和/或如權利要求27-41中任一項所述的載體，和/或如權利要求42所述的宿主細胞。
47.如權利要求1-26中任一項所述的多核苷酸，和/或如權利要求27-41中任一項所述的載體，和/或如權利要求42所述的宿主細胞在細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的應用，用于獲得所需基因產物。
48.如權利要求1-26中任一項所述的多核苷酸的用途，其用于提高內源基因的表達，所述內源基因包括在與內源基因有關的可操作位置上將多核苷酸插入到細胞的基因組中，由此提高基因的表達水平。
49.如權利要求1-26中任一項所述的多核苷酸在生產轉基因植物中的應用。
50.一種含有細胞的轉基因植物，所述細胞包含如權利要求1-26中任一項所述的多核苷酸。
51.一種含有細胞的轉基因非人類動物，所述細胞包含如權利要求1-26中任一項所述的多核苷酸。
52.如權利要求1-26中任一項所述的多核苷酸的用途，其用于獲得反義基因序列以使相應內源基因序列的表達失活。
53.如權利要求1-26中任一項所述的多核苷酸在制備表達文庫中的應用。
54.如權利要求1-26中任一項所述的多核苷酸在鑒別非人類動物可表達基因的方法中的應用，所述方法包括將含有多核苷酸的構建體插入到非人類動物的胚胎干細胞中，其中構建體在插入表達基因后僅允許藥物篩選。
55.一種含有DNA序列的核酸分子，所述DNA序列選自(1)圖2或圖7代表的DNA序列；(2)與圖2或圖7代表的序列雜交的DNA序列，其編碼本發(fā)明多肽。
56.一種分離的核酸分子，其在嚴格雜交條件下退火到圖2或圖7代表的序列。
57.一種生產依據(jù)本發(fā)明所述多肽的方法，其包括(1)提供用根據(jù)權利要求55或56所述的核酸分子轉化/轉導的細胞；(2)在利于生產所述多肽條件下使所述細胞生長；(3)從所述細胞或其生長環(huán)境中純化所述多肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含天然不存在的遍在染色質開放元件(UCOE)的多核苷酸。本發(fā)明還涉及包含多核苷酸序列的載體、包含載體的宿主細胞以及將多核苷酸、載體或宿主細胞用于治療，或用于體外蛋白質表達。
文檔編號C12N15/63GK1461343SQ0181599
公開日2003年12月10日 申請日期2001年9月20日 優(yōu)先權日2000年9月20日
發(fā)明者邁克爾·安東尼烏, 羅伯特·克龍比 申請人:Ml實驗室公開有限公司