專利名稱：日本酒曲霉及其用于制備降膽固醇產(chǎn)品的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及產(chǎn)生降膽固醇化合物的微生物以及這些微生物在制造具有降膽固醇性能的發(fā)酵食品比如生物水解物、大豆醬油或調(diào)味品中的用途。
生物水解物比如大豆醬油傳統(tǒng)上是通過兩步或三步法制造的第一步是制造日本酒曲。在該第一步中，將煮制大豆或脫脂豆粉與烤制小麥混合，以日本酒曲霉培養(yǎng)物接種該混合物，在需氧和間歇攪拌的條件下培養(yǎng)1～4天來制造日本酒曲。第二步包括通過向初始水解中添加水和鹽來制備醬醪。使該醬醪經(jīng)醬醪酵母發(fā)酵約6～8個月。最后一步是實現(xiàn)使液體醬油與固體分離。
在本發(fā)明全文中，術(shù)語“日本酒曲”指的是蛋白質(zhì)源和碳水化合物源的混合物經(jīng)日本酒曲培養(yǎng)物發(fā)酵的產(chǎn)物，更具體地是煮制豆類或油料種子與煮制或烤制谷物的混合物，比如煮制大豆或菜豆與煮制或烤制小麥或稻米的混合物。
在本發(fā)明全文中，日本酒曲培養(yǎng)物指的是市場上可以獲得的類型的培養(yǎng)物或日本酒曲霉孢子，特別是包含“黃曲霉”孢子。
發(fā)酵任何其他蛋白質(zhì)源可以獲得其他種類的生物水解物。這類優(yōu)選含有富谷氨酸蛋白質(zhì)的原料，比如油料種子餅、豆類或者谷蛋白，在脫水或液體湯、醬油和調(diào)味品組合物中以水解的形式廣泛用作起始原料。
制備液體調(diào)味品所用的這類生物水解物非常受人歡迎，因為它們具有強烈且濃香的口味，因此在許多膳食中都用作調(diào)味品。這些水解物也可用作食品或調(diào)味品工業(yè)的香味原料，因為它們的香味變化萬千。
現(xiàn)如今營養(yǎng)意識正引導(dǎo)著食品工業(yè)提供不僅具有最佳的風(fēng)味特性而且還具有加強的營養(yǎng)功效的食品。過高的血清膽固醇水平是導(dǎo)致冠狀動脈和外圍血管粥樣硬化的主要危害因素，這一重要性已為公眾所認識。深入的臨床研究得出結(jié)論，通過降低血清膽固醇水平可以減少罹患冠狀動脈疾病的風(fēng)險，特別是降低“低密度脂蛋白”的水平。因為身體中絕大部分的膽固醇都是經(jīng)由肝臟中的從頭生物合成過程而產(chǎn)生的，而通常僅有一小部分來自食物吸收，抑制膽固醇生物合成就成為降低高血漿膽固醇水平的特別引人注目的方法。
比如在亞洲國家，人們正在使用許多發(fā)酵產(chǎn)品，因為它們對健康有益。這些食品通常來自霉菌發(fā)酵的植物性原料。一個很好的例子是中國“Red-Yeast-Rice”，它是經(jīng)紅曲霉屬霉菌發(fā)酵過的稻米。該產(chǎn)品含有紅曲菌素類代謝產(chǎn)物，已表明其具有降膽固醇效果。這些紅曲菌素屬于“抑制素族”化合物，它們在膽固醇生物合成中起到酶抑制劑的作用，膽固醇的生物合成稱為HMG-CoA向甲羥戊酸(mevalonate)轉(zhuǎn)化的HMG-CoA還原酶感應(yīng)。抑制素已成功地以純形式應(yīng)用于藥品中，其主要功能就是降低LDL膽固醇(低密度脂蛋白膽固醇)的水平。該事實說明，HMG-CoA還原酶在膽固醇生物合成中起到關(guān)鍵酶的作用。因此，比如MERCK的產(chǎn)品MEVACOR含有從絲狀霉菌土曲霉分離和純化的洛伐他汀。該化合物也與抑制素族有關(guān)并且表現(xiàn)出抗HMG-CoA還原酶抑制活性。另一方面，PHARMANEX上市了“膳食補充品”Cholestin，它含有紅曲菌素族分子，并且其中活性代謝產(chǎn)物是通過絲狀霉菌紫色紅曲霉產(chǎn)生的。
但是，已發(fā)現(xiàn)紫色紅曲霉有可能會產(chǎn)生被稱為枯霉素的腎毒性和/或誘變性化合物(Sabater-Vilar M，Maas RF和Fink-Gremmels J.Mutat.Res.1999年7月21日；444(1)7-16)。因此，從法律、安全性和毒物學(xué)的觀點出發(fā)，含有該霉菌的膳食補充用品Cholestine以及其他所有任何可能的食品的地位在美國和歐洲國家正受到嚴厲的抨擊。土曲霉也會遇到同樣的問題，因為已知它也有產(chǎn)生枯霉素的可能。
因此，土曲霉或紫色紅曲霉并不是食品加工中適用的微生物，也不能直接用于食品中。因此，已知許多絲狀霉菌可以產(chǎn)生屬于抑制素族的化合物，但是這些霉菌不是“食品級”的，因為它們都有可能產(chǎn)生毒素并且因此而無法用于食品發(fā)酵方法中以及與此相關(guān)的食品中。
EP556699(NOVOPHARM)公開了通過引入土曲霉基因組DNA將不產(chǎn)洛伐他汀的曲霉菌株(米曲霉)轉(zhuǎn)變成產(chǎn)洛伐他汀的菌株。該專利教導(dǎo)可以利用基因改良方法作為獲得產(chǎn)抑制素絲狀霉菌的手段，該絲狀霉菌具有“食品級”的地位。該專利所要求的米曲霉種絲狀霉菌因而并非“天然的”而是來自重組體。
本發(fā)明的目的是提供天然的食品級微生物，以用于具有降膽固醇性能的發(fā)酵食品中。
作為天然或天然存在的微生物，應(yīng)理解為是未經(jīng)過基因改良并且可以從環(huán)境中篩選取得的微生物。
因此，本發(fā)明微生物是經(jīng)過分離的天然存在微生物，該微生物不能制造毒素而是產(chǎn)生至少一種能夠降低血清膽固醇濃度的化合物。
本發(fā)明的目的是提供天然存在的微生物，它不能制造毒素而是產(chǎn)生至少一種能夠降低血清膽固醇濃度的發(fā)酵食品用化合物。
不能制造毒素指的是無論在什么樣的環(huán)境和/或生長條件下該微生物均不具有制造毒素的能力。
本發(fā)明也涉及制造發(fā)酵食品比如蛋白質(zhì)水解物的方法，其包括這些步驟以本發(fā)明微生物接種含蛋白質(zhì)原料以產(chǎn)生日本酒曲，向所得到的制劑中添加水并且水解所得到的制劑，從而獲得水解物。
最后，本發(fā)明也涉及至少一種從本發(fā)明微生物產(chǎn)生的化合物在發(fā)酵食品中、在制造調(diào)節(jié)血清膽固醇水平用的食品或藥物中或者在治療與膽固醇有關(guān)的疾病中的用途。
因此，本發(fā)明的目的是提供具有降血清膽固醇性能的食品，其特征在于它含有至少一種從本發(fā)明微生物產(chǎn)生的化合物。
在本發(fā)明全文中，術(shù)語“發(fā)酵食品”指的是可食用產(chǎn)品，其制造方法包括至少一個與本發(fā)明至少一種微生物的應(yīng)用有關(guān)的發(fā)酵步驟。而且，術(shù)語“可食用產(chǎn)品”也應(yīng)該理解成攝入時對人體健康不產(chǎn)生毒害或毒副作用的產(chǎn)品。特別地，由于降膽固醇化合物的存在，這類“發(fā)酵食品”可提供有益健康的功效。實際上，本發(fā)明的微生物可以選自對人體攝入顯示出安全史的微生物。
值得注意的是，得益于使用本發(fā)明微生物而獲得的降膽固醇效果是通過抑制膽固醇生物合成來實現(xiàn)的。
在本發(fā)明特定的實施方案中，降膽固醇效果是通過抑制HMG-CoA還原酶來實現(xiàn)的。實際上，一種由本發(fā)明微生物所產(chǎn)生的降膽固醇化合物是洛伐他汀，該化合物能夠通過HMG-CoA還原酶抑制作用來降低膽固醇的濃度。
但是，本發(fā)明微生物可產(chǎn)生至少一種降膽固醇化合物，該化合物不是洛伐他汀并且也能抑制膽固醇的生物合成。HMG-CoA還原酶使HMG-CoA催化轉(zhuǎn)化成甲羥戊酸，但是該步驟只是整個膽固醇生物合成鏈中的一步。由本發(fā)明微生物所產(chǎn)生的至少一種化合物抑制了至少一個甲羥戊酸下游步驟。通過添加甲羥戊酸而跳過HMG-CoA/甲羥戊酸步驟，就可觀察到這種下游抑制作用。
本發(fā)明微生物的一個重要特性是它不能產(chǎn)生毒素，特別是不能產(chǎn)生黃曲霉毒素。
所述能夠產(chǎn)生至少一種降膽固醇化合物而不產(chǎn)生任何毒素的微生物是產(chǎn)品制造中所用的微生物，特別是絲狀霉菌比如紅曲霉、青霉并且更優(yōu)選比如屬于曲霉屬的霉菌，前提是選擇微生物時要基于它能夠合成降膽固醇化合物，并且不能產(chǎn)生毒素。因此，該微生物可以選自種類眾多的對人體攝入有安全史并且可用于制造食品或者可用于食品本身的微生物。
在本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方案中，通過應(yīng)用本發(fā)明微生物所制造的食品可以是液體調(diào)味品，比如大豆醬油、調(diào)味品醬或粉。
本發(fā)明的微生物可用于傳統(tǒng)的大豆醬油或調(diào)味品制造方法中。它也可以單獨或者與其他日本酒曲霉組合而應(yīng)用于任何方法中，比如EP0429760(制造調(diào)味劑用方法)、EP0829205(調(diào)味產(chǎn)品)或EP0824873(調(diào)味品制造方法)所述的方法。
本發(fā)明還一個目的是在制造調(diào)節(jié)血清低膽固醇水平用的發(fā)酵食品或藥品中或者在治療與膽固醇有關(guān)的疾病中應(yīng)用本發(fā)明的微生物。
本發(fā)明的另一個目的是在制造調(diào)節(jié)血清低膽固醇水平用的發(fā)酵食品或藥品中或者在治療與膽固醇有關(guān)的疾病中應(yīng)用至少一種從本發(fā)明微生物產(chǎn)生的化合物。
在所述方法的各個步驟中，具有特色的一步是采用至少一種本發(fā)明微生物來發(fā)酵植物原料，或比如采用至少一種本發(fā)明微生物與不產(chǎn)生降膽固醇化合物的傳統(tǒng)發(fā)酵微生物的組合。該第一日本酒曲步驟也可以在添加了比如不同來源的蛋白酶的情況下進行。
在該方法涉及制造液體調(diào)味品比如大豆醬油的優(yōu)選實施方案中，所述微生物是霉菌，比如優(yōu)選屬于曲霉屬的日本酒曲霉，該日本酒曲霉是從各種不同的現(xiàn)有日本酒曲霉菌株中選擇性篩選和分離出來的，基于其能夠產(chǎn)生至少一種降膽固醇化合物而無法產(chǎn)生毒素。為達到該目的并且針對該優(yōu)選的實施方案，根據(jù)布達佩斯條約于2000年6月14日和2000年7月27日在國立微生物保藏中心CNCM，CollectionNationale de Culture de Microorganismes，Institut Pasteur，Rue du Dr Roux，75724Paris，F(xiàn)rance保藏了12株曲霉屬菌株作為例示，被接收的是N°CNCM I-2489、CNCM I-2490、CNCM I-2525、CNCM I-2526、CNCM I-2527、CNCM I-2528、CNCM I-2529、CNCM I-2530、CNCM I-2531、CNCM I-2532、CNCM I-2533和CNCM I-2534。
在該優(yōu)選的實施方案中，含蛋白質(zhì)原料可以是植物原料比如小麥粒、大豆、稻米、玉米、油料種子或者植物原料的某部分，比如小麥面筋、麥麩，或者這些植物原料或植物原料部分的任何混合物。大豆醬油制造方法的不同步驟可以按照發(fā)酵醬油比如大豆醬油制造領(lǐng)域熟練人員的常規(guī)知識來實現(xiàn)。主要特征是使用或添加本發(fā)明的微生物，優(yōu)選日本酒曲霉。
將粉碎的大豆，即豆粉浸泡幾小時，然后使豆粉處于約120℃～140℃的溫度幾分鐘，以此來蒸煮大豆原料。煮制大豆粉可以與粉碎的烤制麥粒，即烤制麥粉混合。
冷卻后，以本發(fā)明的日本酒曲霉孢子或者這些霉菌孢子與比如來自供應(yīng)商的常規(guī)孢子的混合物接種該混合物。然后使該混合物在具備間歇攪拌和恒定曝氣的盤上或者專門為此目的而設(shè)計的工業(yè)設(shè)備中發(fā)酵。發(fā)酵步驟促使混合物中存在的日本酒曲霉制造蛋白酶，尤其促使混合物中存在的本發(fā)明霉菌制造至少一種能夠降低膽固醇濃度的化合物。
日本酒曲混合物比如可以通過與水混合而得以懸浮。水解步驟比如在30℃～60℃下可以進行幾個小時。
后續(xù)步驟可以按照本領(lǐng)域熟練人員已知的經(jīng)典方法進行。因此，醬醪步驟可以通過添加鹽和比如假絲酵母versatilis種或魯氏糖酵母種常規(guī)醬醪酵母來實現(xiàn)。使按此方式接種的醬醪比如在攪拌和曝氣下發(fā)酵幾天直至幾個月。
然后比如可以在壓濾機中壓制醬醪、除去不溶物并且將所獲得的液體進行巴氏殺菌處理。
因此，通過該特定方法有可能獲得發(fā)酵的液體調(diào)味品，比如大豆醬油，其口味和香味與通過傳統(tǒng)方法所獲得的發(fā)酵大豆醬油相當(dāng)。該大豆醬油的主要特色，除了其香味之外，是其健康功效，這是因為其中合有至少一種降膽固醇化合物而不存在著任何毒素，比如黃曲霉毒素。
因此，該發(fā)酵液體調(diào)味品可以用作調(diào)味品和/或降膽固醇膳食補充品。
本發(fā)明的微生物可以是任何的食品微生物，它適宜用于制備發(fā)酵食品，它能夠產(chǎn)生至少一種降膽固醇化合物但卻不能制造毒素，因此可用于任何發(fā)酵食品的生產(chǎn)制造中。本發(fā)明的微生物可以是發(fā)酵的加香產(chǎn)品(比如日本清米酒、大豆醬油、蔬菜調(diào)味品和花生醬油)制造中存在的或者所用的絲狀霉菌，前提是從所有天然存在的微生物中篩選和分離微生物時要基于其產(chǎn)生至少一種降膽固醇化合物而不產(chǎn)生毒素的能力。
因此，為了篩選和鑒別符合前述條件的微生物，可以將來自不同來源的不同種類的微生物進行核查并且經(jīng)一種篩選方法，比如按照以下實施例中所述的方法。以下實施例是為了說明鑒別本發(fā)明微生物的一種篩選方法而給出的。該特異性篩選方法包括這些步驟在生長培養(yǎng)基上培養(yǎng)微生物、制備并純化該培養(yǎng)物粗抽提物并且將后者進行洛伐他汀和毒素分析以及測定膽固醇合成抑制的試驗。這種方法可適用于任何一種微生物，以便核查它是否滿足所需的基準。而且，培養(yǎng)微生物、分離并檢測洛伐他汀和/或毒素、評價發(fā)酵抽提物對膽固醇生物合成的影響的其他任何等效方法均可用來鑒別該微生物是否滿足基準要求并且符合本發(fā)明微生物的特性。
如下實施例中描述了用以篩選本發(fā)明微生物的方法。該方法并不限于所篩選的微生物。毒素檢測和鑒別方法在這里只涉及黃曲霉毒素類化合物，但是可以對其進行改變和適應(yīng)性修改而用于任何種類的毒性化合物。
通過向1L含有200ml生產(chǎn)介質(zhì)(B)的無遮板錐形瓶中添加6ml初級種子培養(yǎng)物就可以制備次級培養(yǎng)物。
每升生產(chǎn)介質(zhì)(B)含有45g葡萄糖或乳糖、24g胨化牛奶、2.5g酵母抽提物和2.5g聚乙二醇P2000(pH為6.5)。將燒瓶在28℃下在200rpm的軌道式搖動器中振搖12天。抽提和純化發(fā)酵之后(280h)，將培養(yǎng)物(200ml)以80％甲醇(200ml)浸漬2h?；旌衔锿ㄟ^濾紙過濾并且蒸發(fā)濾液。以水回收粗的抽提物，以3N鹽酸(HCl)酸化該溶液并且調(diào)節(jié)pH值到3。以乙酸乙酯(按體積比)多次萃取該含水抽提物。以無水硫酸鈉干燥有機相并且在真空中蒸發(fā)之(30℃)以除掉有機溶劑。以10ml甲醇溶解殘余物，用于分析色譜(HPLC和TLC)、光譜(LC、MS和LC/MS/MS)和體外試驗(3-羥基-3-甲基戊二?；?輔酶A還原酶[HMG-CoA還原酶；甲羥戊酸NADP+氧化還原酶(CoA?；?，EC1.1.11.34]的酶抑制效果)，以鑒別并且定量洛伐他汀。通過HPLC來評價黃曲霉毒素的生成。洛伐他汀分析通過高效液相色譜(HPLC)和質(zhì)譜法來確定洛伐他汀。
HPLC分析采用Nucleosil 100-5 C18柱(250×4mm)(Macherey&Nagel)，以及后柱(Lichrospher100 RP-18，Merck)。溶劑A磷酸0.05％水溶液，溶劑B是乙腈。分離以線性梯度從95％A和5％B開始，然后在45min內(nèi)達到50％A和50％B，在46min內(nèi)達到30％A和70％B，然后在48min內(nèi)達到10％A和90％B，最后在50min內(nèi)達到0％A和100％B，然后繼續(xù)等度處理4min。將初始條件保持6min以使柱再平衡。流率是1ml/min。采用的檢測器是Hewlett Packard G1315A1100系列，檢測波長為λmax＝254nm。
HPLC/MS和HPLC/MS/MS分析分離采用Waters HPLC系統(tǒng)進行，該系統(tǒng)由757型自動取樣器、帶系統(tǒng)控制器的600-MS泵和486-MS型UV檢測器構(gòu)成。利用模擬輸入將258nm處的UV吸收記錄到質(zhì)譜儀數(shù)據(jù)系統(tǒng)中。采用Nucleosil 100-C18 HPLC柱(250mm×4mm內(nèi)徑，Macherey&Nagel)，以及質(zhì)譜儀之前的柱后1/10分流器。溶劑A是三氟乙酸0.1％水溶液，溶劑B是乙腈。流率采用1ml/min，分離以線性梯度從95％A和5％B開始，然后在30min內(nèi)達到50％A和50％B，在31min內(nèi)達到30％A和70％B，然后在33min內(nèi)達到10％A和90％B，最后在35min內(nèi)達到0％A和100％B，然后繼續(xù)等度處理5min。在5min內(nèi)達到了初始條件，并且將其保持5min以使柱再平衡。
質(zhì)譜儀是配備有電霧化電離源的Finnigan TSQ700三重四極質(zhì)譜儀(San Jose，CA，USA)。利用在Ultrix4.2A下運行的DECstation2100(Digital Equipment，USA)采用7.0版Finnigan軟件包ICIS2來采集數(shù)據(jù)。傳輸毛細管設(shè)為200℃并且噴霧設(shè)為4.2kV。通過在1s內(nèi)從m/z50掃描至m/z600以正模式獲得了全程掃描質(zhì)譜。按照試驗室體系采用壓力為1mTorr的氬作為碰撞氣體以-15eV的碰撞能獲得了m/z20～m/z450的子離子光譜。在選擇性反應(yīng)監(jiān)控來自質(zhì)子化m/z405母離子的m/z199、285和m/z303子離子之后，采用相同的條件來檢測洛伐他汀。通過LC/MS/MS來檢測這些結(jié)構(gòu)上密切相關(guān)的子離子，可實現(xiàn)樣品中洛伐他汀的特異性測定。黃曲霉毒素分析采用可在線檢測電化學(xué)所產(chǎn)生的溴的柱后衍生手段和熒光檢測通過等度HPLC法測定甲醇抽提物中每種黃曲霉毒素的濃度。采用反相ODS Hypersil柱(3μm，125mm×4.6mm內(nèi)徑)，連同ODS Hypersil保護柱(3μm，25mm×4.6mm內(nèi)徑)，均來自Metrohm-Bischoff AG(Leonberg，Germany)。流動相由水/乙腈/甲醇(體積比60∶5∶35)混合物構(gòu)成，每升流動相含有119mg溴化鉀和100μL 65％硝酸。以1.0ml/min的流率在室溫下進行洗脫。柱后衍生系統(tǒng)由具有可變控制電源的KOBRA電池(Rhne Diagnostics Technologies Ltd.，Galsgow，Scotland)構(gòu)成。電流設(shè)置值調(diào)整為100μA。以Waters470型掃描熒光檢測儀(激發(fā)波長365nm，發(fā)射波長428nm)監(jiān)控每種黃曲霉毒素。
通過按照Trucksess等人(1991)所述的程序采用基于免疫親合柱提純手段的選擇性更強的方法確證了正培養(yǎng)物上層清液中黃曲霉毒素的存在。將1ml甲醇抽提物等分部分以5 0ml蒸餾水稀釋并且施用至含有對黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2特異性的單克隆抗體的AflaTest-P免疫親合柱(Vicam，Watertown，MA，USA)。在柱上分離、純化并且濃縮毒素，利用純甲醇使其與抗體分開，并且通過具備柱后衍生和熒光檢測手段的反相HPLC定量之，其條件與之前所述相同。膽固醇合成抑制試驗
使人類肝T9A4細胞在不含血清的LCM介質(zhì)(Biofluids，Rockville，MD，USA)中在3.5％二氧化碳下在37℃生長。將這些細胞接種到24孔板中并且在不存在(對照)或存在發(fā)酵抽提物級分的情況下與1mM14C乙酸(acetate)(1mCi/mmol，Amersham)一起培育20h。細胞也與1.17mM14C甲羥戊酸(0.85mCi/mmol，Amersham)一起培育20h，以便評價由待測微生物所產(chǎn)生的化合物是否在HMG-CoA至甲羥戊酸的轉(zhuǎn)化步驟的下游中還具有抑制效果。
通過以己烷∶異丙醇(3∶2)在室溫下培育30min來進行兩次類脂抽提。組合的抽提物在氮氣下干燥、再次溶解在己烷中并且在己烷∶乙醚∶乙酸(75∶25∶1)溶劑混合物中進行高效薄層色譜(Merck，Darmstadt，Germany)分離。以瞬時成象設(shè)備(Camberra Packard，Zurich，Switzerland)測量向膽固醇中引入14C乙酸的程度來測定膽固醇的新合成情況，并且以占對照物百分數(shù)的形式表示之。
表1表示抽提物在14C乙酸存在下在人類肝T9A4細胞中的體外血膽固醇過少活性。很容易就可以看到，當(dāng)使由本發(fā)明微生物經(jīng)過發(fā)酵而獲得的抽提物與細胞一起培育時，減少了人類肝T9A4細胞中的膽固醇合成。因為從A4和A27菌株獲得的抽提物中洛伐他汀含量低于0.1μg/ml，因此所觀察到膽固醇合成抑制效果可歸因于抽提物中存在的洛伐他汀，但是還要歸因于由其他不產(chǎn)生洛伐他汀的菌株所產(chǎn)生的與此類似的其他化合物。
由菌株A12、A21、A34、A39、A45、A50、A51、A53、FJ2和FJ5所獲得的抽提物不含有任何量的洛伐他汀(MS圖譜未檢出)，但是從表1可以看出，盡管不含洛伐他汀，但這些抽提物顯示出強的膽固醇生物合成抑制活性。這表明，本發(fā)明的這些微生物產(chǎn)生了能夠降低血清膽固醇濃度的非洛伐他汀化合物，其起到抑制劑的作用，可抑制至少一個處于HMG-CoA還原酶催化步驟下游的步驟。


圖1表示以洛伐他汀標準物獲得的MS圖譜。圖2和圖3分別表示由本發(fā)明微生物菌株A-27和A-4經(jīng)過發(fā)酵而獲得的抽提物的MS圖譜。這些菌株所獲得的抽提物的洛伐他汀含量低于0.1μg/ml。
當(dāng)然，本發(fā)明微生物所獲得的抽提物均不含任何量的黃曲霉毒素。
表2顯示抽提物在14C甲羥戊酸存在下在人類肝T9A4細胞中的體外膽固醇合成抑制活性。此時可以看到，洛伐他汀的存在并未抑制住膽固醇的生物合成，而菌株A21、A34、A39、FJ2和FJ5所獲得的發(fā)酵抽提物卻顯示出明顯的膽固醇生物合成抑制效果。這說明，這些菌株產(chǎn)生了至少一種抑制至少一個甲羥戊酸下游步驟的化合物。
實施例2大豆日本酒曲發(fā)酵將175g脫脂大豆(75重量％)和烤制小麥(25重量％)的混合物在蓋嚴的高壓釜中在120℃下蒸汽蒸煮7min，然后冷卻到低于40℃。以109cfu本發(fā)明微生物(菌株A27)在SP2(20mM KH2PO4-HCl，pH值2.0，0.9％NaCl)中的分生孢子懸浮體接種該煮制大豆-小麥混合物。將該接種混合物轉(zhuǎn)移到3L蘑菇培育袋(孔隙率25cc/min，160mm濾器，Van Leer，United Kingdom)中并且在Lab-Term培養(yǎng)箱(Kühner，Switzerland)中在30℃下培養(yǎng)最長70h。監(jiān)測日本酒曲床的內(nèi)溫，使其不超過34℃。
所獲得的日本酒曲用以按照實施例1所用的方法從液體細胞培養(yǎng)物制備抽提物。
從表3很容易就可看到，從固體日本酒曲發(fā)酵所獲得的抽提物顯示出膽固醇合成抑制性能。
按照與前述類似的方法獲得抽提物。
從表3很容易就可看到，從固體日本酒曲發(fā)酵所獲得的抽提物顯示出膽固醇合成抑制性能。
aK大豆日本酒曲霉bWB麥麩日本酒曲霉
權(quán)利要求
1.經(jīng)過分離的天然存在的微生物，它不能產(chǎn)生毒素而是產(chǎn)生至少一種能夠降低血清膽固醇濃度的化合物。
2.天然存在的微生物，它不能產(chǎn)生毒素而是產(chǎn)生至少一種能夠降低血清膽固醇濃度的化合物，從而用于發(fā)酵食品。
3.權(quán)利要求1或2的微生物，其特征在于膽固醇降低效果是通過抑制膽固醇生物合成實現(xiàn)的。
4.權(quán)利要求1～3任一項的微生物，其特征在于膽固醇降低效果是通過抑制HMG-CoA還原酶來實現(xiàn)的。
5.權(quán)利要求1～4任一項的微生物，其特征在于能夠降低膽固醇濃度的化合物是洛伐他汀。
6.權(quán)利要求1～5任一項的微生物，其特征在于微生物不能產(chǎn)生黃曲霉毒素。
7.權(quán)利要求1～6任一項的微生物，選自以下屬曲霉、紅曲霉或青霉。
8.權(quán)利要求1或2的微生物，其特征在于能夠降低膽固醇濃度的化合物抑制了至少一個甲羥戊酸下游步驟。
9.前述權(quán)利要求任意一項的微生物在制造調(diào)節(jié)血清膽固醇水平用食品或藥物中或者在治療與膽固醇有關(guān)的疾病中的用途。
10.至少一種從權(quán)利要求1～8任一項的微生物產(chǎn)生的化合物在制造調(diào)節(jié)血清膽固醇水平用食品或藥物中或者在治療與膽固醇有關(guān)的疾病中的用途。
11.制造發(fā)酵食品的方法，包括以下步驟-以包含至少一種權(quán)利要求1或2的微生物的接種物接種糧食以實現(xiàn)發(fā)酵，-水解所得到的制劑以獲得水解物。
12.具有降血清膽固醇性能的食品，其特征在于它含有至少一種由權(quán)利要求1～8任一項的微生物產(chǎn)生的化合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及天然存在的日本酒曲霉，它不能產(chǎn)生毒素而是產(chǎn)生至少一種能夠降低血清膽固醇濃度的發(fā)酵食品用化合物。本發(fā)明也涉及這種霉菌在食品制造中的用途、通過以本發(fā)明霉菌接種糧食來制造顯示出降膽固醇性能的發(fā)酵食品的方法、含有由本發(fā)明霉菌所產(chǎn)生的化合物的具有降膽固醇性能的食品。
文檔編號C12N1/14GK1444659SQ01813553
公開日2003年9月24日 申請日期2001年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月28日
發(fā)明者J·－R·尼塞爾, H·哈雅, P·范登布雷克, P·尼德爾伯格, L·費, C·馬塞 申請人:雀巢制品公司