專利名稱：用固定化的寡核苷酸純化三股螺旋體結(jié)構(gòu)的制作方法
參照相關(guān)申請本申請要求2000年5月26日申請的美國申請第09/580 923號的優(yōu)先權(quán)利益。后者是1997年6月9日申請的美國申請第08/860 038號的部分繼續(xù)申請，而美國申請08/860,038是1995年11月8號申請的PCTFR95/01468的美國國家階段申請，其內(nèi)容作為根據(jù)并引為參考文獻(xiàn)。
背景技術(shù)：
這個發(fā)明涉及新的DNA純化方法。根據(jù)本發(fā)明的方法可以迅速純化藥用雙螺旋DNA。更具體地，根據(jù)本發(fā)明的方法包括DNA序列和寡核苷酸的特異性雜交。
基因和細(xì)胞治療目前正經(jīng)歷著顯著的發(fā)展。但是，這些技術(shù)要求可能生產(chǎn)大量藥用純度的DNA。實際上，在這些新的療法里，藥劑本身經(jīng)常含有DNA，關(guān)鍵是能夠生產(chǎn)合適的量，分離和以適合人體治療使用的方式純化。
近年來，注射質(zhì)粒DNA用于基因治療或疫苗接種已被大量的報告證明可行，這些報告證明DNA表達(dá)載體可以被多種細(xì)胞類型吸收，而且接著可以表達(dá)這些質(zhì)粒編碼的基因(Ledley，1995 Hum.GeneTher.6，1129).
基因治療和疫苗接種應(yīng)用中的目的基因可能包括，例如，腫瘤抑制基因， 自殺基因或者反義序列。它們也可編碼蛋白，比如，甲胎蛋白AFP(Morinaga，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80，4604)，酶，激素，細(xì)胞因子，生長因子如FGF(Jounanneau等，1991，Proc，Natl.Acad.Sci.USA，88，2893)或者VEGFB(Olofsson B等，1996，Proceedings 93，576)，凝血因子如B缺失因子VIII(Truett等，1985，DNA 4，333)，載脂蛋白，神經(jīng)遞質(zhì)，神經(jīng)營養(yǎng)因子，天然或嵌合免疫球蛋白。也使用了報告基因，例如編碼大腸桿菌β-半乳糖苷酶的lacZ。
使用質(zhì)粒DNA作為人體基因傳送載體的主要挑戰(zhàn)是1)此藥品的制造和2)純度。最近發(fā)展了一些技術(shù)用于在大腸桿菌宿主中產(chǎn)生高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體。目前使用的質(zhì)粒要么是ColE1衍生質(zhì)粒，比如pBR322，pUC或者pBluescript(Lahijani等，1996，Hum.Gene.Ther.，7，1971)，或者pCOR質(zhì)粒(Soubrier等，1999，Gene Therapy，6，1482)。
使用質(zhì)粒DNA作為基因治療載體所產(chǎn)生的第二個考慮事項是質(zhì)粒載體本身的純度。目前的純化方法，比如氯化銫梯度超離心或者層析，在去除宿主基因組DNA和RNA或蛋白質(zhì)污染時效率低下。特別是，化學(xué)結(jié)構(gòu)和質(zhì)粒DNA非常接近的宿主基因組DNA，使用常規(guī)層析極難去除。常規(guī)層析法制備的質(zhì)粒中有典型濃度達(dá)0.5％到1％的宿主基因組DNA。因此，為了發(fā)展作為用于人類基因治療的安全載體的質(zhì)粒DNA，需要純化技術(shù)可以降低宿主基因組DNA的含量到很低的水平，典型為0.1％，甚至0.01％或者更低。
本發(fā)明描述簡單而特別有效的DNA純化新方法。特別是，它使獲得高產(chǎn)量高純度成為可能。根據(jù)本發(fā)明的方法本質(zhì)上是基于要純化的DNA中所插入的序列和由天然或修飾過的堿基組成的寡核苷酸的特異性相互作用。
最近表明一些寡核苷酸能夠在DNA雙螺旋的大溝特異性地相互作用而局部形成三股螺旋，導(dǎo)致目的基因的轉(zhuǎn)錄被抑制(Helene et，Toulme，Biochim.Biophys.Acta 1049(1990)99)。這些寡核苷酸在寡嘌呤-寡嘧啶序列選擇性地識別DNA雙螺旋，也就是這樣的區(qū)域一條鏈?zhǔn)枪燕堰市蛄?，而互補鏈?zhǔn)枪燕奏ば蛄?，從而在那里形成局部三股螺旋。第三條鏈(寡核苷酸)的堿基與Watson-Crick堿基對的嘌呤形成氫鍵(Hoogsteen鍵或反Hoogsteen鍵)。
現(xiàn)有技術(shù)里已經(jīng)描述了這種相互作用在分離質(zhì)粒中的用途。Ito等(PNAS 89(1992)495)描述了能夠識別質(zhì)粒的特定序列從而與之形成三股螺旋的生物素化的寡核苷酸的用途。然后讓這樣形成的復(fù)合體與鏈親和素包被的磁珠接觸。生物素和鏈親和素之間的作用使得能夠通過磁分離磁珠然后洗脫而將質(zhì)粒分離出來。然而，這個方法有一些缺點。尤其是，需要兩個連續(xù)的特異性相互作用，第一在寡核苷酸和質(zhì)粒之間，而第二在生物素化的復(fù)合體和鏈親和素的珠子之間。并且，最后的溶液可能被生物素化的寡核苷酸所污染，這樣就不能用于藥物組合物。
發(fā)明概述本發(fā)明描述了新的改進的利用這種相互作用的DNA純化方法。更具體的是，本發(fā)明的方法使用共價偶聯(lián)于支持物的寡核苷酸。這個方法極為快速，且導(dǎo)致特別高的產(chǎn)量和純度。而且，它能夠從復(fù)雜混合物中純化DNA，特別是當(dāng)復(fù)雜混合物含有其他核酸，蛋白質(zhì)，內(nèi)毒素(如脂多糖)，核酸酶，等等。另外，支持物可以方便再生，且得到的DNA表現(xiàn)改進的藥用安全的性質(zhì)。最后，與現(xiàn)有技術(shù)相比，這個方法只需一步。
因此，本發(fā)明的首要主題是用于純化雙鏈DNA的方法，根據(jù)這個方法，含有混有其它組分的上述DNA的溶液流經(jīng)共價偶聯(lián)寡核苷酸的支持物，而這段寡核苷酸能夠和上述DNA中的特定序列雜交形成三股螺旋。這段特定序列可以是雙螺旋DNA中天然存在的序列，也可以是人工引入其中的合成序列。
本發(fā)明中使用的寡核苷酸是直接與雙鏈DNA雜交的寡核苷酸。這些寡核苷酸可以包括以下堿基-胸腺嘧啶脫氧核苷(T)，能夠與雙鏈DNA的A.T對形成三體(Rajagopal等，Biochem 28(1989)7859)；-腺嘌呤(A)，能夠與雙鏈DNA的A.T對形成三體；-鳥嘌呤(G)，能夠與雙鏈DNA的C.G對形成三體；-質(zhì)子化胞嘧啶(C+)，能夠與雙鏈DNA的G.C對形成三體(Rajagopal等)；-尿嘧啶(U)，能夠與A.T堿基對或A.U堿基對形成三體；優(yōu)選地，使用的寡核苷酸含有富含胞嘧啶的單一嘧啶(homopyrimidine)序列，而DNA中的特定序列是單一嘌呤(homopurine)-單一嘧啶序列。胞嘧啶的存在使得可以具有在性pH值下胞嘧啶質(zhì)子化時是穩(wěn)定的，而在堿性pH值下胞嘧啶中性時不穩(wěn)定的三股螺旋。
為了允許通過雜交形成三股螺旋，寡核苷酸和DNA中的特定序列互補是很重要的。在這種關(guān)系中，為了得到最好的產(chǎn)率和最好的選擇性，在本發(fā)明的方法中使用完全互補的寡核苷酸和特定序列。具體的，這些可以是寡核苷酸聚(CTT)和特定序列聚(GAA)。作為一個例子，可能會提到這樣的寡核苷酸序列5’-GAGG C TT C TT C TT C TT C TT CTT C TT-3’(GAGG(CTT)7；SEQ ID NO1)，其中堿基GAGG并不形成三股螺旋但使寡核苷酸可以從偶聯(lián)臂上分開；序列(CTT)7(SEQ ID NO26)也可能提到。這些寡核苷酸能夠跟含有互補單元(GAA)的特定序列形成三股螺旋。特別是，討論中的序列可以是含有7，14，17個GAA單元的區(qū)域，如實施例中所述。
另一段特別有用的序列是5’-AAGGGAGGGAGGAGAGGAA-3’(SEQIDNo5)，這段序列與寡核苷酸5’-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3’(SEQ IDNo6)或者5’-TTGGTGTGGTGGGTGGGTT-3’(SEQ ID NO7)形成三股螺旋.
在這個例子里，寡核苷酸以反平行方向結(jié)合聚嘌呤鏈。這些三股螺旋只有在存在鎂離子(Mg2+)時才穩(wěn)定(Vasquez等，Biochemistry，1995，34，7243-7251；Beal和Dervan，Science，1991，251，1360-1363).
正如以上所述，特定序列可以是雙鏈DNA中天然存在的序列，也可以是人工引入到雙螺旋DNA中的合成序列。尤其有利的是使用和雙鏈DNA中比如在質(zhì)粒的復(fù)制起始點或在標(biāo)記基因中天然存在的序列形成三股螺旋的寡核苷酸。因此，本申請人進行了質(zhì)粒序列分析，且能夠表明這些DNA的一些區(qū)域，尤其在復(fù)制起始處，有單一嘌呤-單一嘧啶區(qū)域。能夠跟這些天然的單一嘌呤-單一嘧啶區(qū)域形成三股螺旋的寡核苷酸的合成可以有利地將本發(fā)明的方法應(yīng)用于未經(jīng)修改的質(zhì)粒，尤其是pUC，pBR322，pSV之類的商品質(zhì)粒。在雙螺旋DNA里天然出現(xiàn)的單一嘌呤-單一嘧啶序列，可提到大腸桿菌質(zhì)粒ColE1的復(fù)制起始處存在的序列，它包含以下序列的全部或者部分5-CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3’(SEQ ID NO2)。在此情況下，形成三股螺旋的寡核苷酸有以下序列5-GAAGGGCTTCCCTCTTTCC-3’(SEQ IDNO3)，并且根據(jù)Beal和Dervan(J.Am.Chem.Soc.1992，114，4976-4982)與Jayasena和Johnston(Nucleic Acids.Res.1992，20，5279-5288)的敘述，它也可以跟雙螺旋的兩條鏈結(jié)合?？赡芤矔岬絧BR322質(zhì)粒的β-內(nèi)酰胺酶基因(Duval-Valentin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1992，89，504-508)中的序列5’-GAAAAAGGAAGAG-3’(SEQ ID NO4)。
在ColE1和pCOR的復(fù)制起始處已經(jīng)鑒定了另兩個目的序列，它們可以跟特定寡核苷酸形成三體結(jié)構(gòu)。ColE1的衍生質(zhì)粒含有一段12堿基的單一嘌呤序列(5’-AGAAAAAAAGGA-3’)(SEQ ID NO27)，這段序列位于與質(zhì)粒復(fù)制有關(guān)的RNA-II轉(zhuǎn)錄的上游(Lacatena等，1981，Nature，294，623)。這一序列與互補的12堿基寡核苷酸5’-TCTTTTTTTCCT-3’(SEQ ID NO28)形成穩(wěn)定的三體結(jié)構(gòu)。pCOR骨架含有14個非重復(fù)的堿基的單一嘌呤區(qū)域(5’-AAGAAAAAAAAGAA-3’)(SEQ ID NO29)，此區(qū)域位于pCOR復(fù)制子的γ復(fù)制起始點的富含A+T的部分(Levchenko等，1996，Nucleic Acids Res.，24，1936)。這一序列與互補的14堿基寡核苷酸5’-T TCTTTTTTTTCTT-3’(SEQ ID NO30)形成穩(wěn)定的三體結(jié)構(gòu)。相應(yīng)的寡核苷酸5’-TCTTTTTTTCCT-3’(SEQ ID，NO28)和5’-TTCTTTTTTTTCTT-3’(SEQ ID NO30)有效并特異的靶向它們各自位于ColE1 ori或者pCOR(oriγ)的復(fù)制起點中的互補序列。事實上，單個非規(guī)范的三聯(lián)體(T*GC或C*AT)就可能導(dǎo)致三體結(jié)構(gòu)的完全去穩(wěn)定。
尤其有利的是使用能夠與復(fù)制起始或標(biāo)記基因中的序列形成三股螺旋的寡核苷酸，因為它使得用相同的寡核苷酸可能純化任何含有上述復(fù)制起始或標(biāo)記基因的DNA。這樣就不必修飾質(zhì)?；蛘唠p鏈DNA以向其中加入人工特異序列。
盡管優(yōu)選完全互補的序列，但是可以理解，如果并不導(dǎo)致親和力的太大損失則可以容忍寡核苷酸和DNA中的序列之間的一些錯配。可提到大腸桿菌β-內(nèi)酰胺酶基因中的序列5’-AAAAAAGGGAATAAGGG-3’(SEQ ID NO8)。在此例中，打斷聚嘌呤序列的胸腺嘧啶可以被第三條鏈的鳥嘌呤所識別，從而形成G*TA三聯(lián)體，如果兩翼是兩個T*AT三聯(lián)體時，它就是穩(wěn)定的(Kiessling等，Biochemistry，1992，31，2829-2834)。
根據(jù)特定的實施方案，本發(fā)明中的寡核苷酸包含序列(CTT)n，序列(CT)n，或者序列(CTT)n，其中n表示1到15(包括1和15)的整數(shù)。特別有利的是使用(CT)n或者(CTT)n類型的序列。實際上，本申請人表明，純化產(chǎn)率受到寡核苷酸中C的含量的影響。具體，如實施例7中所示，當(dāng)寡核苷酸含有較少的胞嘧啶時，純化產(chǎn)量增加?？梢岳斫獾氖牵景l(fā)明中的寡核苷酸同樣可以聯(lián)合(CTT)，(CT)或者(CTT)單元。
使用的寡核苷酸可以是天然的(由未修飾的天然堿基組成)或者是化學(xué)修飾過的。具體地，寡核苷酸具有某些化學(xué)修飾可能是有利的，這使得它可以抵抗或抵御核酸酶，或者提高對特定序列的親和力。
根據(jù)本發(fā)明，可以理解的是，寡核苷酸指的是任何相連的核苷酸連續(xù)體，它經(jīng)歷過目的是使它更能抵抗核酸酶的骨架修飾。在可能的修飾里，可能會提到可以和DNA形成三股螺旋的硫代磷酸寡核苷酸(Xodo等，Nucleic Acids Res.，1994，22，3322-3330)，以及有formacetal或膦酸甲酯(methylphosphonate)骨架的寡核苷酸(Matteucci等，J.Am.Chem.Soc.，1991，113，7767-7768)。也可能使用由核苷酸的α異頭物合成的寡核苷酸，它也可以跟DNA形成三股螺旋(Le Doan等，Nucleic Acids Res.，1987，15，7749-7760)。骨架的另一種修飾是氨基磷酸酯鍵。例如，可能提到Gryaznov和Chen描述的N3’-P5’核苷酸間的氨基磷酸酯鍵，那將得到跟DNA形成特別穩(wěn)定三股螺旋的寡核苷酸(J.Am.Chem.Soc.，1994，116，3143-3144)。在其它的骨架修飾中，使用核糖核苷酸，2’-0-甲基核糖，磷酸二脂等等(Sun和Helene，Curr.Opinion Struct.Biol.，116，3143-3144)，也可被提到。最后，磷基礎(chǔ)的骨架在PNAs(肽核酸)中可能被聚酰胺骨架所替代，這樣也可以形成三股螺旋(Nielsen等，Science，1991，254，1497-1500；Kim等，J.Am.Chem.Soc.，1993，115，6477-6481)；或者如在DNGs(脫氧核糖核酸胍，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1995，92，6097-6101)中被胍基礎(chǔ)的骨架所替代，或者被DNA的聚陽離子類似物所代替，這樣也可形成三股螺旋。
第三鏈的胸腺嘧啶也可能被5’-溴尿嘧啶所代替，后者提高了寡核苷酸跟DNA的親和力(Posic和Devan，J.Am.Chem.Soc.，1989，111，3059-3061)。第三條鏈還可能含有非天然堿基，當(dāng)中有將會提到的7-脫氮-2’-脫氧黃嘌呤核苷(Milligan等，Nucleic AcidsRes.，1993，21，327-333)，1-(2-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-3-甲基-5-氨基-1H-吡唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮(Koh和Dervan，J.Am.Chem.Soc.，1992，114，1470-1478)，8-氧代腺嘌呤，2-氨基嘌呤，2’-0-甲基假異胞嘧啶，或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他任何修飾(綜述見Sun和Helene，Curr.Opinion Struct.Biol.，1993，3，345-356)。
另一類寡核苷酸的修飾目的更特別，是提高寡核苷酸和特定序列的相互作用或/和親和力。具體的，根據(jù)本發(fā)明的最有利的修飾包括甲基化寡核苷酸中的胞嘧啶(參看實施例5)，這樣甲基化的寡核苷酸表現(xiàn)了這樣值得注意的特性在接近中性的pH值(≥5)下跟特定序列形成穩(wěn)定的三股螺旋。這樣就有可能在比現(xiàn)有技術(shù)的pH值高的情況下作用，也就是說，在導(dǎo)致質(zhì)粒DNA降解的風(fēng)險更低的PH值下。
本發(fā)明中的方法所使用的寡核苷酸的長度是至少3個堿基，且優(yōu)選5到30個。長度大于10的寡核苷酸用起來比較有利。長度由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)每個單獨案例調(diào)整以適合相互作用需要的選擇性和穩(wěn)定性。
根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸可以由任何已知技術(shù)合成。具體地，可以由核酸合成儀制備。顯然本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法都是可以用的。
為了允許它共價偶聯(lián)于支持物，寡核苷酸通常都官能化。這樣，可以在5’或者3’位置用硫醇，胺或羧基末端基團來修飾它。具體地，另加的硫醇，胺或羧基基團使得寡核苷酸可以偶聯(lián)于帶有二硫化物，馬來酰亞胺，胺，羧基，酯，環(huán)氧化物，溴化氰或乙醛官能基的支持物。這些偶聯(lián)通過在寡核苷酸和支持物之間建立二硫鍵，硫醚，酯，酰胺或胺鍵而形成。也可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的任何其他方法，例如，雙功能偶聯(lián)劑。
而且，為了改善與偶聯(lián)的寡核苷酸的雜交，寡核苷酸含有“手臂”和“間隔區(qū)”堿基序列是有利的。實際上，使用手臂可以在選定的與支持物的距離上結(jié)合寡核苷酸，使得跟DNA相互作用的條件得到改善。手臂最好是由線性碳鏈(它含有1到18個，優(yōu)選6或者12個(CH2)基團)及允許結(jié)合于柱子的胺組成。手臂連接于寡核苷酸的磷酸酯，或者是含有不干擾雜交的堿基的間隔區(qū)的磷酸酯。這樣，間隔區(qū)可以含有嘌呤堿基。一個例子是，間隔區(qū)可以含有GAGG序列。手臂最好是由含6或者12個碳原子的線性碳鏈構(gòu)成。
為實施本發(fā)明，可以使用不同類的支持物。這些可以是官能化的層析支持物，散裝或者預(yù)裝于柱中，官能化的塑料表面或者官能化的膠乳珠，磁性的或者其它的。優(yōu)選使用層析支持物。例如，可以使用的層析支持物是瓊脂糖，丙烯酰胺，葡聚糖以及它們的衍生物(如Sephadex，Sepharose，Superose等)，聚合物如聚(苯乙烯/二乙烯基苯)，或者接枝或非接枝二氧化硅(silica)。層析柱可以擴散或灌注模式操作。
為了獲得更好的純化產(chǎn)量，特別有利的是質(zhì)粒上使用含有幾個跟寡核苷酸雜交的位置的序列。實際上，幾個雜交位置的存在促進了上述序列和寡核苷酸的相互作用，這導(dǎo)致純化產(chǎn)量的提高。這樣，對于含有(CCT)，(CT)或者(CTT)基元的n個重復(fù)的寡核苷酸，優(yōu)選使用最少含n個互補基元，優(yōu)選n+1個互補基元的DNA序列。含有n+1個互補基元的序列可以提供兩個跟寡核苷酸雜交的位置。有利的是，DNA序列含有多達(dá)11個雜交位置，也就是說，n+10個互補基元。
根據(jù)本發(fā)明的方法可以用于純化任何類型的雙鏈DNA。比如環(huán)狀DNA如質(zhì)粒，通常帶有一或更多有治療意義的基因。這個質(zhì)粒也可能帶有復(fù)制起點，標(biāo)記基因或者類似的東西。本發(fā)明的方法可以直接用于細(xì)胞裂解液。在這個實施方案中，通過轉(zhuǎn)化然后培養(yǎng)細(xì)胞來擴增得到的質(zhì)粒，可以在細(xì)胞裂解后直接純化。本發(fā)明的方法也可用于澄清的裂解液，亦即細(xì)胞裂解液中和，離心后得到的上清。顯然它也可應(yīng)用于以已知方法預(yù)純化過的溶液。此方法也可從含有不同序列DNA的混合物中純化帶有重要序列的線性或環(huán)狀DNA。根據(jù)本發(fā)明的方法也可用于純化雙鏈DNA。
細(xì)胞裂解液可以是原核細(xì)胞或者是真核細(xì)胞的裂解液。
對于原核細(xì)胞，可提到細(xì)菌大腸桿菌，枯草桿菌，鼠傷寒沙門氏菌或鏈霉菌屬作為實例。對于真核細(xì)胞，可提到動物細(xì)胞，酵母，真菌等等，尤其是克魯維氏酵母屬或糖酵母屬酵母或者COS，CHO，C127，NIH3T3等細(xì)胞。
本發(fā)明的方法特別有利，因為它能夠快速簡單地獲得高純度的質(zhì)粒DNA。特別是，如實施例所示，此方法有效地將討論的質(zhì)粒跟如染色體DNA片段，內(nèi)毒素，蛋白質(zhì)，核酸酶等污染組分分離，更特別的是，本發(fā)明中的方法可以制備雙鏈DNA，尤其是質(zhì)粒起源的，得到少于或等于0.5％的染色體DNA含量。更優(yōu)選，獲得的DNA制備物的染色體DNA含量少于或等于0.2％。本發(fā)明因此描述含可藥用的質(zhì)粒DNA的組合物，尤其用于基因或細(xì)胞治療。這樣，本發(fā)明的主題也是含有根據(jù)上述方法制備的線性或質(zhì)粒起源的雙鏈DNA的藥用組合物。
本發(fā)明也涉及染色體DNA含量少于或等于0.5％的質(zhì)粒DNA制備物，所述含量優(yōu)選少于或等于0.2％，更優(yōu)選少于或等于0.1％，且更優(yōu)選少于或等于0.01％。正如以下示例，三體親和相互作用步驟與常規(guī)層析步驟的下游純化過程相整合。此親和步驟極大提高了質(zhì)粒制備物的純度，無論其起始純度如何。寡核苷酸(共價結(jié)合于層析支持物)與要純化的目標(biāo)質(zhì)粒之間三體結(jié)構(gòu)的形成依賴于質(zhì)粒上存在可以和寡核苷酸形成三體結(jié)構(gòu)的序列。這個三體結(jié)構(gòu)只有在酸性pH值下穩(wěn)定，這時寡核苷酸的胞嘧啶是質(zhì)子化的。然后，簡單的將pH值提高到中性就能將質(zhì)粒DNA從柱上洗脫。
這些組合物包含的質(zhì)粒DNA可以是“裸露的”，也可以是與如脂質(zhì)體，微顆粒，陽離子脂，多聚物，重組病毒或蛋白質(zhì)等轉(zhuǎn)運載體組合的。
在一個實施方案里，根據(jù)本發(fā)明的方法可以用來從含有2或更多的不同類和序列的雙鏈DNA的混合物中純化出一種雙鏈DNA。這種方法可以直接用于細(xì)胞裂解液，其中通過細(xì)胞培養(yǎng)而擴增的雙鏈DNA可以在裂解培養(yǎng)的細(xì)胞之后被純化。本方法也可用于澄清的裂解液，亦即細(xì)胞裂解液中和，離心后得到的上清。這個方法也可應(yīng)用于已經(jīng)預(yù)純化的溶液。
更確切的，從含有第一和第二雙鏈DNA的溶液中純化第一雙鏈DNA的方法包含i)使溶液流經(jīng)第一支持物，此支持物共價偶聯(lián)有能夠通過跟第二雙鏈DNA中的特定序列雜交從而與之形成三股螺旋的寡核苷酸，ii)回收流經(jīng)第一支持物的溶液，它富集有未結(jié)合的第一雙鏈DNA，和iii)將回收的溶液流經(jīng)第二支持物，此支持物共價偶聯(lián)有能夠通過跟上述第一雙鏈DNA中的特定序列雜交從而與之形成三股螺旋的寡核苷酸。接著是可選的淋洗步驟，然后可以從第二支持物上洗脫第一雙鏈DNA。使用這個雙純化方法，第一雙鏈DNA可以從第二支持物中回收而不含任何可檢測水平的第二雙鏈DNA。
在本發(fā)明特定的實施方案里，第一雙鏈DNA分子是pCOR分子，它有特定序列5’-AAGAAAAAAAAGAA-3’(SEQ ID NO29)，并與含有序列5’-TTCTTTTTTTTCTT-3’(SEQ IN NO30)的寡核苷酸形成三股螺旋。第二雙鏈DNA分子是ColE1衍生質(zhì)粒，含有特異序列5’-AGAAAAAAAGGA-3’(SEQ ID NO27)，并與含有序列5’-TCTTTTTTTCCT-3’(SEQ IN NO28)的寡核苷酸形成三股螺旋。相應(yīng)的，通過使用根據(jù)本發(fā)明的雙純化方法，有利地從含有其它質(zhì)粒比如ColE1衍生質(zhì)粒的溶液中純化pCOR質(zhì)粒。
將通過下面的實施例更加詳細(xì)的描述本申請，這些實施例用于說明而非限制發(fā)明詳述克隆和分子生物學(xué)的一般方法傳統(tǒng)的分子生物學(xué)方法，比如限制性內(nèi)切酶消化，凝膠電泳，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，核酸沉淀等等，文獻(xiàn)中已有敘述(Maniatis等，T.，E.F.Fritsch，和J.Sambrook，1989.Molecular Cloningalaboratory mannual，第二版，冷泉港實驗室，冷泉港實驗室出版社，紐約；Ausubel F.M，R.Brent，R.E.Kinston，D.D.Moore，J.A.Smith，J.G.Seidman和K.Struhl.1987.Current protocols in molecularbiology 1987-1988.John Willey and Sons，紐約)。用末端終止法根據(jù)已發(fā)表的流程(Ausubel等，1987)確定核酸序列。
限制性內(nèi)切酶由New England Biolabs，Beverly，MA(biolabs)提供。
為了進行連接，在含50mM Tris-HCl pH7.4，10mM MgCl2，10mM DTT，2mM ATP的緩沖液中，有噬菌體T4 DNA連接酶(Biolabs)存在時孵育DNA片段。
寡核苷酸的合成使用Biosearch自動DNA合成儀，根據(jù)生產(chǎn)商的建議，采用亞磷酰胺化學(xué)，其中由氰乙基在β位保護亞磷酰胺(Sinha，N.D.，J.Biernat，J.McManus和H.Koster，1984.Polymersupport oligonucleotide synthesis，XVIII；Use of β-cyanoethyl-N，N-dialkylamino-/N-morpholino phosphoramidite ofdeoxynucleosides for the synthesis of DNA fragments simplifyingdeprotection and isolation of the final product.Nucl.AcidsRes.，12，4539-4557Giles，J.W.1985.Advances in automated DNAsynthesis.Am.Biotechnol.，Nov./Dec)。
連接好的DNA或用于測試轉(zhuǎn)化效率的DNA轉(zhuǎn)化下面的感受態(tài)細(xì)胞株大腸桿菌DH5α(E.coliDH5α)[F/endA1，hsdR17，supE44，thi-1，recA1，gyrA96，relA1，Δ(lacZYA-arqF)U169，deoR，80dlac(lacZΔM15)](用于任何ColE1質(zhì)粒)，或者大腸桿菌XAC-pir(用于任何pCOR衍生質(zhì)粒)。
根據(jù)Klein等1980的方法小量制備質(zhì)粒DNA.
大腸桿菌的生長使用LB培養(yǎng)基(Maniatis，等，1982)。細(xì)菌在37℃下培養(yǎng)。細(xì)菌涂布于補充有合適抗生素的LB培養(yǎng)基的平板。
實施例11.1柱子制備設(shè)備柱子使用1ml經(jīng)NHS(N-羥基琥珀酰亞胺，Pharmacia)活化的HiTrap柱，與蠕動泵(流速小于1ml/mim)相連。使用的特異性寡核苷酸5’末端有NH2基團，其序列如下5’-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3’(SEQID NO1)此實施例中的緩沖液是偶聯(lián)緩沖液0.2M NaHCO3，0.5M NaCl，pH8.3.
緩沖液A0.5M 乙醇胺，0.5M NaCl，pH8.3.
緩沖液B0.1M 醋酸，0.5M NaCl，pH4.方法6毫升1mM HCl洗柱，用偶聯(lián)緩沖液稀釋后的寡核苷酸(1ml中含50nmol)上柱，室溫下放置30分鐘。然后用6ml緩沖液A和緩沖液B連續(xù)洗柱3次。這樣寡核苷酸就通過CONH鍵與柱子共價結(jié)合。柱子存于4℃在PBS，0.1％NaN3中，可以最少使用4次。1.2質(zhì)粒構(gòu)建合成下面兩段寡核苷酸。寡核苷酸48175’-GATCCGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGG-3’(SEQ ID NO9)寡核苷酸48185’-AATTCCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCG-3’(SEQ ID NO10)這些寡核苷酸，當(dāng)被雜交并克隆于一個質(zhì)粒時，如前所述，將單一嘌呤-單一嘧啶序列(GAA)17(SEQ ID NO33)導(dǎo)入相應(yīng)的質(zhì)粒。
將這兩個雜交的寡核苷酸的對應(yīng)序列克隆到質(zhì)粒pBKS+的多克隆位點(Stratagene Cloning System，La Jolla，CA)，此質(zhì)粒帶有氨芐青霉素抗性基因。最后，這些寡核苷酸通過以下方式雜交1μg兩種寡核苷酸共同置于40ml含50mM Tis-HCl pH7.4，10mM MgCl2的終緩沖液中?；旌衔锛訜岬?5℃，然后置于室溫讓溫度逐漸下降。200ng經(jīng)BamHI和EcoRI消化的pBKS+質(zhì)粒(Stratagene Cloning System，LaJolla，CA)與10ng雜交后的寡核苷酸混合物在終體積30μl中連接。連接之后，部分用于轉(zhuǎn)化DH5α。轉(zhuǎn)化混合物涂平板于有氨芐青霉素(50mg/l)和X-gal(20mg/l)的L培養(yǎng)基。重組克隆在此培養(yǎng)基上應(yīng)該表現(xiàn)沒有藍(lán)色，相反，原質(zhì)粒(pBKS+)允許大腸桿菌的β-半乳糖苷酶的ω片段的α-互補。從6個克隆中小量制備質(zhì)粒DNA，它們都表現(xiàn)出位于pBKS+的BamHI和EcoRI之間的PstI位點的消失，以及含多克隆位點的448bpPvuII條帶分子量增加。選出一個克隆并將相應(yīng)質(zhì)粒命名為pXL2563。使用質(zhì)粒pBKS+(Stratagene Cloning System，La Jolla(A)的引物-20(5’-TGACCGGCAGCAAAATG-3’(SEQ ID NO11))(VieraJ.和J.Messing.1982.The pUC plasmids，an M13mp7-derived systemfor insertion mutagenesis and sequencing with syntheticuniversal primers.Gene，19，259-268)測序鑒定克隆的序列。根據(jù)供應(yīng)商的推薦，使用Wizard Megaprep試劑盒(Promega Corp.Madison，WI)純化pXL2563質(zhì)粒。然后此質(zhì)粒DNA制備物用于下述例子。
1.3質(zhì)粒純化儀器如1.1中所述，從還含有pBKS+質(zhì)粒的溶液中，在偶聯(lián)寡核苷酸的HiTrap柱子上純化pXL2563質(zhì)粒(1.2中所述)。這步純化中使用的緩沖液是緩沖液F2M Nacl，0.2M醋酸鹽，pH4.5至5。
緩沖液E1M Tris-HCl，pH9，0.5mM EDTA。方法用6毫升緩沖液F洗柱，并將質(zhì)粒(400μl緩沖液F中含20μgpXL2563和20μg pBKS+)上柱，室溫下放置2小時。用10ml緩沖液F淋洗，然后用緩沖液E洗脫。在1％的瓊脂糖凝膠上電泳并用溴化乙錠染色來檢測質(zhì)粒。溶液中質(zhì)粒含量比例通過測量其對大腸桿菌的轉(zhuǎn)化活性來估計。
結(jié)果從含有30％的pXL2563和70％的pBKS+的混合物開始，從柱子出口回收了含100％的pXL2563，由260nm與280nm的OD值比估計的純度，從1.9上升至2.5，這表明此方法已去除了蛋白污染。
緩沖液E1M Tris-HCl，pH9，0.5mM EDTA.
用6毫升1mM緩沖液F洗柱，稀釋于400μl緩沖液F中的100ug的pXL2563質(zhì)粒上柱，室溫下放置2小時。柱子用10ml緩沖液F淋洗，然后用緩沖液E洗脫。通過測定260nm處的光密度來定量質(zhì)粒。
在此實施例中，結(jié)合用的緩沖液里NaCl的摩爾濃度從0到2M(緩沖液F)變化。當(dāng)NaCl的摩爾濃度下降時，純化產(chǎn)率下降。結(jié)合緩沖液的pH值可以從4.5到5變化，在4.5時純化產(chǎn)率較好。也可以用堿性pH下的其它洗脫緩沖液這樣用含50mM硼酸鹽，pH9，0.5mM EDTA的緩沖液洗脫.2.2如例1中所敘述，將寡核苷酸(5’-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3’(SEQ ID NO1))偶聯(lián)于柱上。根據(jù)供應(yīng)商的推薦，使用Wizard Megaprep試劑盒(PromegaCorp.Madison，WI)純化pXL2563質(zhì)粒。本實施例使用的緩沖液是緩沖液F0.1M NaCl，0.2M醋酸，pH5。
緩沖液E1M Tris-HCl，pH9，0.5mM EDTA.
6毫升1mM緩沖液F洗柱，且將稀釋于400μl緩沖液F中的100μg pXL2563質(zhì)粒上柱，室溫下放置1小時。柱子用10ml緩沖液F淋洗，然后用緩沖液E洗脫。測量流經(jīng)寡核苷酸柱之前和之后質(zhì)粒樣品中的大腸桿菌基因組或染色體DNA的含量?；蚪MDNA用PCR的方法定量，使用大腸桿菌galK基因中的引物。根據(jù)如下方法Debouck等對這些引物作過描述(Nucleic Acids Res.1985，13，1841-1853)5’-CCG AAT TCTGGG GAC CAA AGC AGT TTC-3’(SEQ ID NO24)和5’-CCA AGC TTC ACTGTT CAC GAC GGG TGT-3’(SEQ ID NO25).
反應(yīng)介質(zhì)包括，在25μlPCR緩沖液(Promega France，Charbonnieres)中1.5mM MgCl2；0.2mM dXTP(Pharmacia，Orsay)；0.5μM引物；20U/ml Taq酶(Promega)。反應(yīng)按以下順序進行-95℃ 5分鐘-95℃ 10秒60℃ 30秒78℃ 1分鐘 30循環(huán)-78℃ 10分鐘擴增的長度為124堿基對的DNA片段通過在有SybrGreenI(Molecular Probes，Eugene，USA)的3％的瓊脂糖上電泳而分離，然后以大腸桿菌菌株B的超純基因組DNA系列(Sigma，ref D4889)對比而定量。
上柱的樣品中有1％的染色體DNA，從寡核苷酸柱上純化后的樣品含0.2％的染色體DNA。
實施例3.清裂解液的實驗本實驗描述了從細(xì)菌培養(yǎng)物的清裂解液中純化質(zhì)粒DNA，規(guī)模是所謂的“小量制備”離心含有pXL2563質(zhì)粒的過夜培養(yǎng)的1.5ml DH5α菌株，重懸沉淀于100μl的50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl，pH8，10mMEDTA中。然后加上200μl的0.2M NaOH，1％SDS，顛倒管子以混合，接著加150μl的3M乙酸鉀，pH5，再顛倒管子以混合。離心之后，回收上清，上樣于實施例1所述的寡核苷酸柱。結(jié)合，淋洗，洗脫與實施例1所述一樣。從1.5ml培養(yǎng)物里可以大約回收1μg質(zhì)粒。得到并通過瓊脂糖電泳和溴乙錠染色分析的質(zhì)粒的形式是單一條帶的超螺旋環(huán)狀DNA。在此方法純化的質(zhì)粒中沒有發(fā)現(xiàn)高分子量DNA(染色體的)或RNA的痕跡。260nm與280nm的光密度比大于2。
實施例44.1本實施例敘述的質(zhì)粒DNA純化實驗，進行的條件跟實施例3一樣，但起點是20ml含有pXL2563質(zhì)粒的過夜培養(yǎng)的DH5α菌株。細(xì)菌沉淀重懸于1.5ml的50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl，pH8，10mM EDTA.裂解用2ml的0.2M NaOH，1％SDS，而中和用1.5ml的3M乙酸鉀，pH5。然后用3ml的2-異丙醇沉淀DNA，沉淀用0.5ml的0.2M乙酸鉀，pH5，0.1M NaCl懸浮，并上樣于例1所述得到的寡核苷酸柱。結(jié)合，淋洗，及洗脫與例1所述一樣，只是淋洗緩沖液中NaCl的摩爾濃度為0.1M.大約得到16μg的質(zhì)粒DNA。得到并通過瓊脂糖電泳和溴乙錠染色分析的質(zhì)粒的形式是單一條帶的超螺旋環(huán)狀DNA。在此方法純化的質(zhì)粒中沒有發(fā)現(xiàn)高分子量DNA(染色體的)或RNA的痕跡。用限制性酶消化質(zhì)粒得到單一條帶，位于預(yù)期的3kb的分子量處。樣品中的蛋白質(zhì)濃度從澄清裂解液中的125μg/ml下降到純化后質(zhì)粒中的少于1μg/ml(Micro-BCAassay，Pierce)。由LAL方法(Biosepra)估側(cè)的內(nèi)毒素濃度，與起始清裂解液相比，純化后質(zhì)粒中少了至少10倍。
4.2使用的質(zhì)粒含有含巨細(xì)胞病毒啟動子，編碼螢光素酶的基因，以及來自質(zhì)粒pXL2563的單一嘌呤-單一嘧啶序列(GAA)17(SEQ IDNO33)的盒。含有此質(zhì)粒的DH1菌株(Maniatis等，1989)在7L的發(fā)酵罐中培養(yǎng)，從200g細(xì)菌中制備清裂解液細(xì)菌沉淀重懸于2L的50mMglucose，25mMTris，pH6.8，10mM EDTA，然后加2L的0.2M NaOH，1％SDS。用加1L的3M乙酸鉀中和裂解液。滲濾之后，根據(jù)實施例1.1所述，4ml這樣的裂解液上樣于5ml偶聯(lián)以下寡核苷酸序列的HiTrap-NHS柱5’-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3’(SEQ ID NO1)。淋洗和洗脫也如實施例1所述進行?；厥沾蠹s400微克質(zhì)粒。按照實施例2.2中的技術(shù)測出的樣品中基因組DNA的含量是0.1％。
實施例5使用修飾過的寡核苷酸本實施例描述了使用有甲基化胞嘧啶的寡核苷酸。使用的寡核苷酸的序列如下5’-GAGGMeCTTMeCTTMeCTTMeCTTMeCTTMeCTTMeCTT-3’(SEQ IDNO12).
此寡核苷酸在5’端有NH2基團。MeC代表5-甲基胞嘧啶。在實施例1的條件下，使用pH5的結(jié)合緩沖液(這樣降低質(zhì)粒降解的風(fēng)險)，該寡核苷酸使pXL2563質(zhì)粒被純化。
實施例6在以上的實施例里，使用的寡核苷酸在5’端由胺基修飾，后者通過含6個碳原子的手臂NH2-(CH2)6結(jié)合磷酸。在此實施例中，氨基通過含12碳原子的手臂NH2-(CH2)12與5’端的磷酸結(jié)合。寡核苷酸偶聯(lián)和過柱按照實施例2所述進行，使用緩沖液F2M NaCl，0.2M醋酸，pH4.5。此寡核苷酸使得可以得到較好的純化產(chǎn)率達(dá)到53％，而使用含6個碳原子的寡核苷酸，在相同的條件下產(chǎn)率是約45％。
實施例7按照實施例1.2中敘述的克隆策略，構(gòu)建了另外兩個帶有單一嘌呤-單一嘧啶序列的質(zhì)粒含有序列(GGA)16(SEQ ID NO34)的質(zhì)粒pXL2725和含有序列(GA)25(SEQ ID NO35)的質(zhì)粒pXL2726。
實施例7.1質(zhì)粒構(gòu)建質(zhì)粒pXL2725和質(zhì)粒pXL2726跟質(zhì)粒pXL2563類似，按照實施例1.2所敘述的克隆策略構(gòu)建，使用了以下寡核苷酸對59865’GATCC(GA)25GGG-3’(SEQIDNO13)59875’-AATTCCC(TC)25G-3’(SEQIDNO14)59815’-GATCC(GGA)17GG-3’(SEQIDNO15)59825’-AATT(CCT)17CCG-3’(SEQIDNO16)使用寡核苷酸對5986和5987構(gòu)建質(zhì)粒pXL2726，方法是將寡核苷酸克隆至pBKS+(Stratagene Cloning System，La Jolla CA)的BamHI和EcoRI位點之間，使用寡核苷酸對5981和5982構(gòu)建質(zhì)粒pXL2725。使用構(gòu)建質(zhì)粒pXL2563相同的實驗條件，只是寡核苷酸對改變。相似地，克隆的序列通過質(zhì)粒測序來鑒定。可以看出質(zhì)粒pXL2725有跟預(yù)期序列相關(guān)的修飾不是GGA重復(fù)17次，而是GGAGA(GGA)15(SEQ ID NO17).
實施例7.2制備柱子和純化根據(jù)實施例1.1中敘述的技術(shù)，與這些單一嘌呤序列形成三股螺旋的寡核苷酸偶聯(lián)于HiTrap柱。純化質(zhì)粒pXL2725使用的寡核苷酸的序列是5’-AATGCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCT-3’(SEQ ID NO18)，而純化質(zhì)粒pXL2726使用的寡核苷酸的序列是5’-AGTGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT-3’(SEQ ID NO19).
根據(jù)實施例2中的技術(shù)，這樣得到的兩柱可以純化相應(yīng)的質(zhì)粒，使用以下的緩沖液
緩沖液F2M NaCl，0.2M醋酸，pH4.5。
緩沖液E1M Tris-HCl，pH9，0.5mM EDTA.
純化質(zhì)粒pXL2725和質(zhì)粒pXL2726的產(chǎn)率分別是23％和31％。
實施例8此例說明了質(zhì)粒中特定序列的長度對純化產(chǎn)率的影響。
實施例8.1質(zhì)粒構(gòu)建本實驗中使用的用于表明本發(fā)明組合物活性的報告基因是編碼螢光素酶的基因(Luc).
質(zhì)粒pXL2621有含661堿基對的巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子的盒，該盒通過用限制性酶MluI和HindIII酶切從pcDNA3(InvitrogenCorp.，San Diego，CA)中取出，然后克隆至載體pGL basic Vector的編碼螢光素酶的基因的上游的Ml1uI和HindIII位點。此質(zhì)粒的構(gòu)建使用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)。
質(zhì)粒pXL2727-1和質(zhì)粒pXL2727-2按照以下方法構(gòu)建2微克質(zhì)粒pXL2721質(zhì)粒用BamHI線性化；然后在65℃中處理10分鐘失活酶；同時按照質(zhì)粒pXL2563構(gòu)建的方法雜交寡核苷酸6006和6008。
60065’-GATCT(GAA)17CTGCAGATCT-3’(SEQIDNO20)60085’-GATCAGATCTGCAG(TTC)17A-3’(SEQIDNO21)雜交混合物克隆至質(zhì)粒pXL2621的BamHI末端，然后，在轉(zhuǎn)化DH5α后，使用PstI酶限制分析鑒定重組克隆，因為寡核苷酸引入PstI位點。挑選2個克隆，使用引物(6282，5’-ACAGTCATAAGTGCGGCGACG-3’(SEQ ID NO22)))作為測序反應(yīng)引物(Viera J.和J.Messing.1982.The pUC plasmids，an M13mp7-derived system for insertionmutagenesis and sequencing with synthetic universal primers.Gene，19，259-268)測序克隆片段的核苷酸序列。
第一克隆(pXL2727-1)含有GAA重復(fù)10次的序列，第二克隆(pXL2727-2)含有序列5’-GAAGAAGAG(GAA)7GGAAGAGAA-3’(SEQ IDNO23).
實施例8.2制備柱子和純化使用的柱子如實施例1中所敘述，并與寡核苷酸5’-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3’(SEQ ID NO1)偶聯(lián)。
質(zhì)粒pXL2727-1有序列GAA的14次重復(fù)。上述寡核苷酸，只含有相應(yīng)雜交序列CTT的7次重復(fù)，因此可以和該質(zhì)粒在8個不同位置上雜交。相反，質(zhì)粒pXL2727-2，有和結(jié)合于柱上的寡核苷酸相同長度的雜交序列(GAA)7(SEQID NO36)。這樣的寡核苷酸只能在一個位置上跟pXL2727-2雜交。
實驗與實施例2中的敘述一樣，使用以下緩沖液緩沖液F2M NaCl，0.2M醋酸，pH4.5。
緩沖液E1M Tris-HCl，pH9，0.5mMEDTA.
質(zhì)粒pXL2727-1的純化產(chǎn)率是29％，而pXL2727-2是19％。
實施例8.3體外轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞使用的細(xì)胞是NIH 3T3細(xì)胞，實驗前在24孔培養(yǎng)板上按照50000細(xì)胞/孔接種。質(zhì)粒用150mM NaCl稀釋，并與脂轉(zhuǎn)染物RPR115335混合。使用的脂轉(zhuǎn)染物正電荷與DNA負(fù)電荷的比等于6?；靹蚧旌衔铮覝叵路胖?0分鐘，用不含胎牛血清的培養(yǎng)基稀釋，然后加入到細(xì)胞中，比例是每個培養(yǎng)孔1μgDNA。37℃下2小時后，加入體積比為10％的胎牛血清，然后細(xì)胞在5％CO2下37℃培養(yǎng)48小時。細(xì)胞用PBS洗滌2次，根據(jù)所述方法(Promega試劑盒，Promega Corp.Madi son，WI)在LumatLB9501發(fā)光計上(EG and G Berthold，Evry)測量螢光素酶活性。按照實施例8.2純化的質(zhì)粒pXL2727-1給出的轉(zhuǎn)染效率是使用WizardMegaprep試劑盒(Promega Corp.Madison，WI)純化的那些質(zhì)粒的2倍。
實施例9純化pCOR衍生質(zhì)粒下面的例子論證使用三股螺旋親和層析純化pCOR衍生質(zhì)粒。表明此技術(shù)去除核酸污染(尤其是宿主基因組DNA和RNA)的水平是常規(guī)層析方法所達(dá)不到的。
使用Sephacryl S-1000 SF(Amersham-Pharmacia Biotech)作為層析基質(zhì)合成三體親和凝膠。首先使用溶于0.2M醋酸鈉(pH4.7)的m-高碘酸鈉(3mM，室溫，1小時)活化Sephacryl S-1000。然后按照前述偶聯(lián)蛋白質(zhì)的方法(Hornsey等，J.Immunol.Methods，1986，93，83-88)，通過在抗壞血酸存在(5mM)時的還原性氨基化，將寡核苷酸通過其5’-NH2末端部分偶聯(lián)到已活化的基質(zhì)的醛基上。這些實驗中的單一嘧啶寡核苷酸(來自Eurogentec，HPLC純)有這樣的序列跟出現(xiàn)于pCOR質(zhì)粒(Soubrier等，Gene Therapy，1999，6，1482-1488)的復(fù)制起點(oriγ)的短的14堿基單一嘌呤序列(5’-AAGAAAAAAAAGAA-3’)(SEQ IDNO29)互補。如上所討論，單一嘧啶寡核苷酸的序列是5’-TTCTTTTTTTTCT-3’(SEQ ID NO30)。
層析了以下質(zhì)粒pXL3296(無轉(zhuǎn)基因的pCOR，2.0kbp)，pXL3179(pCOR-FGF，2.4kbp)，pXL3579(pCOR-VEGFB，2.5kbp)，pXL3678(pCOR-AFP，3.7kbp)，pXL3227(pCOR-lacZ，5.4kbp)和pXL3397(pCOR-Bdeleted FVIII，6.6kbp)。所有的質(zhì)粒從實施例4中所述得到的清裂解液中經(jīng)過二步陽離子交換層析而純化。也研究了pBKS+(pBluescript II KS+來自Stratagene)質(zhì)粒，它是一種ColE1衍生質(zhì)粒，用氯化銫超離心純化。所有使用的質(zhì)粒都是在其超螺旋(＞95％)的拓?fù)錉顟B(tài)。
在每個質(zhì)粒DNA純化實驗中，溶于6毫升的2M NaCl，0.2M乙酸鉀(pH5.0)中的300μg質(zhì)粒DNA以30cm/h的流速上樣于含有上面所提寡核苷酸5’-TTCTTTTTTTTCTT-3’(SEQ ID NO30)的親和柱。用5倍體積的相同緩沖液淋洗之后，用1M Tris-HCl，0.5mM EDTA，pH9.0洗脫結(jié)合的質(zhì)粒，并用UV(260nm)和Millipore Gen-Pak柱(Marquet等，BioPharm，1995，8，26-37)離子交換層析定量。收集的部分中質(zhì)?；厥帐?07μg pXL3296；196μg pXL3179；192μg pXL3579；139μgpXL3678；97μg pXL3227和79μg pXL3397。
用此柱層析pBKS時，檢測不到質(zhì)粒結(jié)合(＜3μg)。這表明寡核苷酸5’-TTCTTTTTTTCTT-3’(SEQ ID NO30)與pCOR(oriγ)中出現(xiàn)的互補的14堿基序列5’-AAGAAAAAAAAGAA-3’(SEQ ID NO29)形成穩(wěn)定的三體結(jié)構(gòu)，但與pBKS中出現(xiàn)的很相關(guān)的序列5’-AGAAAAAAAGGA-3’(SEQ ID NO27)卻不然。這表明引入單一非規(guī)范的三聯(lián)體(此例中是T*GC)導(dǎo)致三體結(jié)構(gòu)的完全去穩(wěn)定。
作為對照，當(dāng)用在非常相近的條件但是沒有寡核苷酸的空的柱子上層析pXL3179時，沒有觀察到質(zhì)粒結(jié)合(＜1μg)。
在此報告的條件下操作這個親和層析柱，對于制備pXL3296，宿主基因組DNA的污染水平從2.6％降低到0.07％。與此類似，對于制備pXL3179，當(dāng)樣品用相同的親和柱層析時，宿主基因組DNA的污染水平從0.5％降低到0.008％。而且，當(dāng)用此親和純化柱制備pXL3179時，RNA的污染水平從43％大大減少到0.2％。
除此之外，當(dāng)親和柱上寡核苷酸5’-TTCTTTTTTTTCTT-3’(SEQ IDNO30)被寡核苷酸5’-TTTTTTTTCTT-3’(SEQ ID NO31)替換時，質(zhì)粒pXL3579的回收率小于8％。盡管SEQ ID NO31中的寡核苷酸與pXL3579中的VEGFB的部分序列互補(即相對于ATG的核苷酸379到389)，沒有明顯的三體親和出現(xiàn)。這表明此親和純化需要非隨機的單一嘌呤-單一嘧啶DNA序列。實施例10純化ColE1衍生質(zhì)粒下面的例子論證了使用三股螺旋親和層析純化ColE1衍生質(zhì)粒。表明此技術(shù)去除核酸污染(尤其是宿主基因組DNA和RNA)的水平是常規(guī)層析方法所達(dá)不到的。
三體親和凝膠的合成是偶聯(lián)具有序列5’-TCTTTTTTTCTT-3’(SEQID NO28)的寡核苷酸到高碘酸鹽氧化的Sephacryl S-1000 SF上，如質(zhì)粒pXL3296(無轉(zhuǎn)基因的pCOR)和質(zhì)粒pBKS，ColE1衍生質(zhì)粒，在實施例9所述的條件下，在1ml的含寡核苷酸5’-T CTTTTTTTCCT-3’(SEQ ID NO28)的柱上層析。收集部分中質(zhì)粒回收是pBKS 175μg和小于1ug的pXL3296。這表明寡核苷酸5’-TCTTTTTTTCCT-3’(SEQ IDNO28)與pBKS中出現(xiàn)的互補的12堿基序列(5’-AGAAAAAAAGGA-3’)(SEQ ID NO27)形成穩(wěn)定的三體結(jié)構(gòu)，但與pCOR中出現(xiàn)的很相關(guān)的12堿基序列(5’-AGAAAAAAAAGA-3’(SEQ ID NO32)則不形成。這表明引入單一非規(guī)范的三聯(lián)體(此例中是C*AT)導(dǎo)致三體結(jié)構(gòu)的完全去穩(wěn)定。
實施例11雙純化方法下面的實施例闡述，用三股螺旋親和層析，從含另一種超螺旋雙鏈分子如pBSK的混合物中，純化超螺旋雙鏈DNA分子，如pXL3296。兩個超螺旋雙鏈DNA雙鏈分子可以有相似的大小，但是每個DNA分子含有能與不同的目的序列形成三股螺旋的獨特序列。正如以上所討論，pXL3296之類的分子含有序列5’-AAGAAAAAAAAGAA-3’(SEQ ID NO29)，但是不含序列5’-AGAAAAAAAGGA-3’(SEQ ID NO27)。相反的，pBSK之類的分子含有SEQ ID NO27，但是不含SEQ ID NO29。
在第一步里，含pXL3296和pBKS的混合物上樣于有寡核苷酸5’-TCTTTTTTTCCTT-3’(SEQ ID NO28)的第一親和柱，如實施例10中所述柱子。含有未結(jié)合的DNA分子的溶液流經(jīng)第一柱。在第二步里，第一步中未結(jié)合的DNA分子上樣于有寡核苷酸5’-TTCTTTTTTTTCTT-3’(SEQID NO30)的第二親和柱，如實施例9中所敘述柱子。然后淋洗此柱并洗脫下結(jié)合的分子，如實施例9中所敘述。只有pXL3296分子從第二柱中洗脫。在第二柱的洗脫液中(即，從柱上洗脫的溶液)沒有檢測到pBKS分子。
序列表<110>AVENTIS PHARMA S.A.
CROUZET，JoelSCHERMAN，DanielWILS，PierreCAMERON，BeatriceBLANCHE，F(xiàn)rancis<120>用固定化的寡核苷酸純化三股螺旋體結(jié)構(gòu)<130>3804.1381304<140>
<141>
<150>09/580，923<151>2000-05-26<160>36<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>1gaggcttctt cttcttcttc ttctt 25<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>2cttcccgaag ggagaaagg 19<210>3<211>19<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>3gaagggcttc cctctttcc 19<210>4<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>4gaaaaaggaa gag13<210>5<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>5aagggaggga ggagaggaa 19<210>6<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>6aaggagagga gggagggaa 19<210>7<211>19<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>7ttggtgtggt gggtgggtt 19<210>8<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>8aaaaaaggga ataaggg17<210>9<211>58<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>9gatccgaaga agaagaagaa gaagaagaag aagaagaaga agaagaagaa gaagaagg 58<210>10<211>58<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>10aattccttct tcttcttctt cttcttcttc ttcttcttct tcttcttctt cttcttcg 55<210>11<211>17<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>11tgaccggcag caaaatg17<210>12<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<220>
<223>序列中所有的胞嘧啶都是甲基化的<400>12gaggcttctt cttcttcctc ttctt 25<210>13<211>58<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>13gatccgagag agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag agagaggg 58<210>14<211>58<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>14aattccctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctcg 58
<210>15<211>58<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>15gatccggagg aggaggagga ggaggaggag gaggaggagg aggaggagga ggaggagg 58<210>16<211>58<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>16aattcctcct cctcctcctc ctcctcctcc tcctcctcct cctcctcctc ctcctccg 58<210>17<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>17ggagaggagg aggaggagga ggaggaggag gaggaggagg aggaggagga50<210>18<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>18aatgcctcct cctcctcctc ctcct 25
<210>19<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>19agtgctctct ctctctctct ctctct 26<210>20<211>66<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>20gatctgaaga agaagaagaa gaagaagaag aagaagaaga agaagaagaa gaagaactgc 60agatct66<210>21<211>66<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>21gatcagatct gcagttcttc ttcttcttct tcttcttctt cttcttcttc ttcttcttct 60tcttca66<210>22<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>22
acagtcataa gtgcggcgac g 21<210>23<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>23gaagaagagg aagaagaaga agaagaagaa ggaagagaa39<210>24<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>24ccgaattctg gggaccaaag cagtttc 27<210>25<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>25ccaagcttca ctgttcacga cgggtgt 27<210>26<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>26
cttcttcttc ttcttcttct t 21<210>27<211>12<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>27agaaaaaaag ga 12<210>28<211>12<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>28tctttttttc ct 12<210>29<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>29aagaaaaaaa agaa 14<210>30<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>30
ttcttttttt tctt 14<210>31<211>11<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>31ttttttttcc t 11<210>32<211>12<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>32agaaaaaaaa ga 12<210>33<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>33gaagaagaag aagaagaaga agaagaagaa gaagaagaag aagaagaaga a 51<210>34<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>34
ggaggaggag gaggaggagg aggaggagga ggaggaggag gaggagga 48<210>35<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>35gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga50<210>36<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>36gaagaagaag aagaagaaga a 2權(quán)利要求
1.從含混有其它組分的雙鏈DNA的溶液中純化雙鏈DNA的方法，包括使溶液流經(jīng)含有共價偶聯(lián)的寡核苷酸的支持物，該寡核苷酸能通過與雙鏈DNA中特定的序列雜交而與雙鏈DNA形成三股螺旋，其中共價偶聯(lián)的寡核苷酸含有序列TCTTTTTTTCCT(SEQ ID NO28)或TTCTTTTTTTTCTT(SEQ ID NO30)。
2.從含混有其它組分的雙鏈DNA的溶液中純化雙鏈DNA的方法，包括使溶液流經(jīng)含有共價偶聯(lián)的寡核苷酸的支持物，該寡核苷酸能通過與雙鏈DNA中特定的序列雜交而與雙鏈DNA形成三股螺旋，其中雙鏈DNA中特定的序列含有序列AGAAAAAAAGGA(SEQ ID NO27)或AAGAAAAAAAAGAA(SEQ ID NO29)。
3.從含有第一雙鏈DNA和第二雙鏈DNA的溶液中純化第一雙鏈DNA的方法，包括(i)使溶液流經(jīng)第一支持物，此支持物含有共價偶聯(lián)的寡核苷酸，它能通過與上述的第二雙鏈DNA中的特定序列雜交而與之形成三股螺旋，(ii)回收流經(jīng)第一支持物的溶液，(iii)使回收的溶液流經(jīng)第二支持物，此支持物含有共價偶聯(lián)的寡核苷酸，它能通過與上述的第一雙鏈DNA中的特定序列雜交而與之形成三股螺旋，其中上述第一雙鏈DNA中的特定序列包含序列AAGAAAAAAAAGAA(SEQ IDNO29)，而上述第二雙鏈DNA中的特定序列包含序列AGAAAAAAAGGA(SEQ ID NO27)。
4.從含有第一雙鏈DNA和第二雙鏈DNA的溶液中純化第一雙鏈DNA的方法，包括(i)使溶液流經(jīng)第一支持物，此支持物含有共價偶聯(lián)的寡核苷酸，它能通過與上述的第二雙鏈DNA中的特定序列雜交而與之形成三股螺旋，(ii)回收流經(jīng)第一支持物的溶液，(iii)使回收的溶液流經(jīng)第二支持物，此支持物含有共價偶聯(lián)的寡核苷酸，它能通過與上述的第一雙鏈DNA中的特定序列雜交而與之形成三股螺旋，其中能與上述第一雙鏈DNA形成三股螺旋的寡核苷酸包含序列TTCTTTTTTTTCTT(SEQ ID NO30)，而能與上述第二雙鏈DNA形成三股螺旋的寡核苷酸包含序列TCTTTTTTTCCT(SEQ ID NO28)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1，2，3或4的方法，其中溶液是細(xì)胞裂解液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中細(xì)胞裂解液是澄清的裂解液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1，2，3或4的方法，其中雙鏈DNA是預(yù)先純化的。
8.根據(jù)權(quán)利要求1，2，3或4的方法，其中特定序列是人工引入雙鏈DNA的。
9.根據(jù)權(quán)利要求1，2，3或4的方法，其中特定序列天然存在于雙鏈DNA中。
10.根據(jù)權(quán)利要求1，2，3或4的方法，其中寡核苷酸通過二硫鍵，硫醚鍵，酯鍵，酰胺鍵或胺鍵偶聯(lián)于支持物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中寡核苷酸通過含碳鏈(CH2)n的手臂結(jié)合到柱上，其中n是1到18的整數(shù)，包括1和18，并且其中手臂通過磷酸酯連接到寡核苷酸，而通過酰胺鍵連接到柱上。
12.根據(jù)權(quán)利要求1，2，3或4的方法，其中寡核苷酸至少有一個化學(xué)修飾，使得它能夠抵抗或抵御核酸酶，或者增加它對特定序列的親和力。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中寡核苷酸至少有一個胞嘧啶被甲基化。
14.根據(jù)權(quán)利要求1，2，3或4的方法，其中雙鏈DNA是環(huán)狀DNA。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中環(huán)狀DNA是質(zhì)粒。
16.根據(jù)權(quán)利要求1，2，3或4的方法，其中雙鏈DNA中存在的特定序列含有幾個和寡核苷酸雜交的位點。
17.根據(jù)權(quán)利要求1，2，3或4的方法，其中支持物是官能化的層析支持物，官能化的塑料表面或官能化的膠乳珠。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中支持物是官能化的層析支持物。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中純化的雙鏈DNA里的染色體DNA含量少于或等于0.5％。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中純化的雙鏈DNA里的染色體DNA含量少于或等于0.01％。
21.從含混有其它組分的雙鏈RNA的溶液中純化雙鏈RNA的方法，包括將溶液流經(jīng)含有共價偶聯(lián)的寡核苷酸的支持物，該寡核苷酸能通過與雙鏈RNA中的特定序列雜交而與雙鏈RNA形成三股螺旋，其中寡核苷酸含有序列TCTTTTTTTCCT(SEQ ID NO28)或TTCTTTTTTTTCTT(SEQ IDNO30)。
22.根據(jù)權(quán)利要求1或3的方法，其中共價偶聯(lián)的寡核苷酸含有序列TCTTTTTTTCCT(SEQ ID NO28)。
23.根據(jù)權(quán)利要求1或3的方法，其中共價偶聯(lián)的寡核苷酸含有序列TTCTTTTTTTTCTT(SEQ ID NO30)。
24.根據(jù)權(quán)利要求2或4的方法，其中雙鏈DNA中存在的特定序列含有序列AGAAAAAAAGGA(SEQ ID NO27)。
25.根據(jù)權(quán)利要求2或4的方法，其中雙鏈DNA中存在的特定序列含有序列AAGAAAAAAAAGAA(SEQ ID NO29)。
全文摘要
本發(fā)明公開了純化雙鏈DNA的方法，通過此方法，含有混合其它組分的上述DNA的溶液流經(jīng)其上共價偶聯(lián)了寡核苷酸的支持物，此寡核苷酸能夠與上述DNA中的特異序列雜交形成三股螺旋。
文檔編號C12N15/09GK1446258SQ01810168
公開日2003年10月1日 申請日期2001年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2000年5月26日
發(fā)明者J·克羅賽特, D·施爾曼, P·維爾斯, F·布蘭徹, B·喀莫隆 申請人:甘瑟爾股份有限公司