專利名稱：一種可使其產(chǎn)物分泌到細(xì)胞外的嵌合殺蟲(chóng)蛋白基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬植物基因工程領(lǐng)域，涉及用化學(xué)方法合成了由蘇云金芽孢桿菌(Bt)殺蟲(chóng)蛋白CrylAb(N端編碼331個(gè)氨基酸)和CrylAc部分(C端編碼284個(gè)氨基酸)組成的融合蛋白基因Btlm的1848個(gè)堿基對(duì)序列，合成的基因在植物中表達(dá)后可賦于轉(zhuǎn)基因植物高抗蟲(chóng)性。為了使植物中表達(dá)的Btlm殺蟲(chóng)蛋白能分泌到細(xì)胞外的細(xì)胞間隙以提高殺蟲(chóng)蛋白的穩(wěn)定性，同時(shí)減輕Bt殺蟲(chóng)蛋白對(duì)植物細(xì)胞正常功能的干擾作用，有利于篩選到農(nóng)藝性狀變化不大的抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植物，本發(fā)明在合成了上述殺蟲(chóng)蛋白基因Btlm基礎(chǔ)上又在其5′端連接了一個(gè)人工合成的編碼煙草致病相關(guān)蛋白PRlb信號(hào)肽的核苷酸序列，從而組建成一個(gè)1947bp的嵌合殺蟲(chóng)蛋白基因BtSlm。用Btlm和BtSlm構(gòu)建植物表達(dá)載體后轉(zhuǎn)化了煙草和棉花，從轉(zhuǎn)化再生植株中可選到高效抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植物，轉(zhuǎn)基因煙草的蟲(chóng)試結(jié)果表明表達(dá)BtSlm的植株抗蟲(chóng)性高于表達(dá)Btlm的。
蘇云金芽孢桿菌(Bt)的晶體蛋白可作為生物農(nóng)藥特異地毒殺某些昆蟲(chóng)，該晶體蛋白被昆蟲(chóng)攝取后，在昆蟲(chóng)腸道的堿性條件下溶解產(chǎn)生130KD左右的前毒素分子。經(jīng)腸道蛋白酶水解前毒素的C端被降解，最后產(chǎn)生由N端65-70KD組成的毒蛋白。該毒蛋白的N端一段殘基(就CrylA而言為28個(gè))也要被腸蛋白酶加工去掉才能形成完全活化的毒蛋白?；罨亩镜鞍着c敏感昆蟲(chóng)中腸上皮細(xì)胞上的受體結(jié)合，插入到中腸細(xì)胞膜上形成0.5-1.0nm的小空或離子通道，引起胞內(nèi)離子的外滲及水的內(nèi)滲，結(jié)果細(xì)胞溶漲破裂，大量細(xì)胞遭到破壞，使幼蟲(chóng)停止進(jìn)食而死亡。已證明Bt晶體蛋白對(duì)人體無(wú)毒性作用，所以Bt制劑已作為一種無(wú)公害的天然的微生物殺蟲(chóng)劑在農(nóng)業(yè)、林業(yè)及環(huán)境衛(wèi)生等方面應(yīng)用了五十多年，Bt制劑的產(chǎn)量也在逐年增加。但由于在自然條件下Bt晶體蛋白穩(wěn)定性差，不能滲透到組織內(nèi)部以及殺蟲(chóng)譜窄等因素的限制使該生物殺蟲(chóng)劑的發(fā)展一直受到很大的制約，所以目前對(duì)農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)的防治主要還是靠化學(xué)殺蟲(chóng)劑。八十年代中期隨著植物基因工程技術(shù)的成熟、Bt基因克隆的成功及對(duì)Bt晶體蛋白殺蟲(chóng)劑機(jī)制研究的深入，使人們有可能將Bt基因轉(zhuǎn)入植物獲得可表達(dá)殺蟲(chóng)蛋白的抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植物。目前，全世界已有二十六種以上的Bt轉(zhuǎn)基因植物，包括棉花，玉米，水稻、馬鈴薯等主要農(nóng)作物。這些轉(zhuǎn)基因植物都獲得了明顯的抗蟲(chóng)性。
野生型Bt晶體蛋白基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)量非常低。在CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下其表達(dá)量約占總可溶性蛋白的0.001％左右，所以不能使轉(zhuǎn)基因植物獲得毒殺多數(shù)對(duì)Bt毒蛋白不太敏感的昆蟲(chóng)的能力，如很多農(nóng)作物的主要鱗翅目害蟲(chóng)。
Perlark等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 883324-3328，1991)根據(jù)植物基因的密碼子使用頻率及可能影響植物mRNA穩(wěn)定性的基序在保持原Bt基因編碼的氨基酸序列不變前提下，對(duì)Bt晶體蛋白基因Cryl Ab和CrylAc進(jìn)行了部分改造或全部重新合成。部分改造和重新合成的基因在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的殺蟲(chóng)蛋白量比野生型基因的表達(dá)量分別提高了約10倍和100倍。然而，Bt基因在植物中的表達(dá)調(diào)控有許多問(wèn)題仍待進(jìn)一步研究，Bt轉(zhuǎn)基因植物的實(shí)際應(yīng)用中在有些方面還需要很大改進(jìn)。譬如，目前合成的Bt基因在植物中表達(dá)后都是停留在細(xì)胞內(nèi)的，外源蛋白在細(xì)胞內(nèi)的高表達(dá)必然對(duì)細(xì)胞自身的生理功能產(chǎn)生一定干擾，使轉(zhuǎn)基因植物的原始性狀受到一定影響。如在抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植物選育過(guò)程中往往發(fā)現(xiàn)，抗蟲(chóng)性高的轉(zhuǎn)基因植物其農(nóng)藝性較差，影響其產(chǎn)量和品質(zhì)，而農(nóng)藝性狀與原始品種相似的植株抗蟲(chóng)性卻不夠理想。引起這些問(wèn)題的原因是多方面的，如轉(zhuǎn)化再生過(guò)程中可能引起體細(xì)胞的變異，外源基因在植物染色體上插入的位置不同可能會(huì)激活或干擾某些植物基因的表達(dá)等都可能導(dǎo)致農(nóng)藝性狀的改變。外源基因產(chǎn)物在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的積累，特別是在高水平表達(dá)時(shí)外源蛋白在植物細(xì)胞中的積累，可能對(duì)細(xì)胞的正常生理功能造成很大干擾，最后導(dǎo)致植物某些特狀的改變。另外外源基因表達(dá)產(chǎn)物在胞內(nèi)環(huán)境下，很易于與胞內(nèi)各種蛋白酶接觸，使其穩(wěn)定性下降。所以在胞內(nèi)大量積累外源蛋白對(duì)植物本身和外源基因產(chǎn)物兩方面都會(huì)有不利的影響。
為了克服上述存在的問(wèn)題，本發(fā)明考慮到Bt蛋白分泌到胞外會(huì)提高其穩(wěn)定性，從而提高其在植物中的積累量，最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植物殺蟲(chóng)活性的提高，同時(shí)也可減輕表達(dá)產(chǎn)物對(duì)植物細(xì)胞功能的干擾。目前，已有證據(jù)表明來(lái)自煙草的PRlb蛋白的信號(hào)肽不但可以使病原相關(guān)蛋白分泌至胞外(Cornelissen等EMBOJ.537-40，1986)，而且也可以使外源蛋白分泌至胞外(Denecke等1990 The Plant Cell 251-59)。所以，基于以上已有的研究背景，本發(fā)明合成了從N端第一個(gè)氨基酸殘基開(kāi)始至第331個(gè)及第332至615個(gè)氨基酸組成的CrylAb與CrylAc融合基因，最后構(gòu)建成的這個(gè)嵌合Bt基因命名為Btlm。在Btlm基礎(chǔ)上又將合成的一個(gè)分泌信號(hào)肽PRlb-s編碼序列與Btlm連接以形成一個(gè)嵌合蛋白基因BtSlm，分別構(gòu)建了這兩個(gè)基因的植物表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化了煙草和棉花。轉(zhuǎn)基因植物的蟲(chóng)試結(jié)果表明這兩個(gè)合成的殺蟲(chóng)蛋白基因都可在植物中高效表達(dá)Bt蛋白的抗蟲(chóng)活性，BtSlm植株的抗蟲(chóng)性略高于Btlm的轉(zhuǎn)基因植株，所以根據(jù)不同目的這兩個(gè)基因在植物抗蟲(chóng)基因工程的研究與開(kāi)發(fā)中都是非常有運(yùn)用價(jià)值的抗蟲(chóng)基因。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，具體采取如下的技術(shù)步驟通過(guò)Bt CrylA融合蛋白基因(Btlm)寡核苷酸引物的合成；Btlm基因片段的合成及克隆(附

圖1)；Btlm基因的組裝得到編碼CrylA融合蛋白基因克隆pSKBtlm(附圖2)；Btlm基因序列與信號(hào)肽編碼序列的連接，構(gòu)建帶有信號(hào)肽編碼序列的BtSlm基因克隆pSlm(附圖3)；Btlm和嵌合BtSlm基因插入二元表達(dá)載體pBin438構(gòu)成植物表達(dá)載體pBlm和pBSlm(附圖6)，并將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌或土壤農(nóng)桿菌[Agrobacterium tumefaciens]LBA4404；pBlm和pBSlm或它們的根癌土壤農(nóng)桿菌LBA4404轉(zhuǎn)化子應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)化，獲得農(nóng)藝性狀好、具有高抗蟲(chóng)性的轉(zhuǎn)基因植物。
為了更好地理解本發(fā)明，結(jié)合下列附圖對(duì)本發(fā)明予以詳細(xì)說(shuō)明附圖1.CrylA基因片段的合成及亞克隆構(gòu)建示意中縮寫(xiě)PI-1～PV-9不同寡核苷酸引物的編號(hào)，編號(hào)后面括號(hào)內(nèi)的數(shù)字為引物的堿基數(shù)；SKpBluescriptIISK+；KLKlenow enzyme；AmAmpicillin抗性基因；Kb千堿基對(duì)；BmBamHI；H3HindIII；R1EcoRI；RVEcoRV；ScSacI；SLSalI。
A.第一區(qū)段(BamH1-EcoR1)亞克隆pBtfsI的構(gòu)建B.第二區(qū)段(EcoR1-EcoRv)亞克隆pBtsII的構(gòu)建C.第三區(qū)段(EcoRV-EcoR1)亞克隆pBtfslII的構(gòu)建D.第四區(qū)段(EcoRI-SacI)亞克隆pBtsIV的構(gòu)建E.第五區(qū)段(SacI-salI) 亞克隆pBtfsV的構(gòu)建附圖2.CrylA融合殺蟲(chóng)蛋白基因克隆pSKBtlm的構(gòu)建附圖3.帶分泌信號(hào)肽編碼序列的嵌合Bt基因BtSlm的重組質(zhì)粒pSlm構(gòu)建附圖4.合成的含分泌信號(hào)肽編碼序列的嵌合殺蟲(chóng)蛋白基因BtSlm的核苷酸序列及氨基酸序列附圖5.合成的Btlm融合殺蟲(chóng)蛋白編碼區(qū)DNA序列與野生型相應(yīng)部分DNA序列的比較。
W(上行)……野生型基因序列；M(下行)……合成的融合殺蟲(chóng)蛋白基因Btlm基因序列。方框內(nèi)的堿基為W和M序列相同的堿基附表1.改造前后融合殺蟲(chóng)蛋白基因Btlm編碼區(qū)密碼子使用頻率的變化及與植物密碼子使用頻率的比較。
※密碼子百分比指該密碼子在該基因編碼區(qū)內(nèi)與編碼相同氨基酸的密碼子總數(shù)的比例；植物密碼子使用頻率％指在雙子葉植物中的使用頻率(Murray EE.et al.Nucleic Acid Res.17477-499 1989)；aa-氨基酸代碼。附圖6.融合Bt基因Btlm及嵌合Bt基因BtSlm的植物表達(dá)載體的構(gòu)建Amp氨芐青霉素抗性；NPTII新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因；Kn卡那霉素抗性基因；DE-35SP帶雙增強(qiáng)子的CaMV35S啟動(dòng)子；RB和LB分別為T-DNA的右邊界和左邊界序列。附圖7.轉(zhuǎn)化再生煙草植株的PCR檢測(cè)引物35S正向引物、Bt反向引物1入-Ecot 14I Marker2陽(yáng)性對(duì)照(pBlm質(zhì)粒)3陰性對(duì)照(非轉(zhuǎn)基因煙草)4-13泳道4-10為pBlm轉(zhuǎn)基因植株的PCR結(jié)果；泳道11-13為pBSlm轉(zhuǎn)基因植株的PCR結(jié)果。引物為35S+和Re-Bt-。附圖8.轉(zhuǎn)基因煙草植株的Southern blot分析(HindIII單酶切)與Btlm基因探針雜交結(jié)果泳道1.pSKBtlm質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照泳道2.泳道2、3、4為三株pBlm轉(zhuǎn)基因植株；5、6為兩株pBSlm轉(zhuǎn)基因植株泳道7.非轉(zhuǎn)基因煙草作為對(duì)照附圖9.轉(zhuǎn)基因煙草的蛋白免疫分析泳道1. 大腸桿菌表達(dá)的CrylAc蛋白(68KD)泳道2. 非轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)照泳道3-9.不同轉(zhuǎn)基因煙草植株(3-5為pBlm轉(zhuǎn)基因植株；6-8為pBSlm轉(zhuǎn)基因植株附圖10.轉(zhuǎn)基因煙草植株的ELISA檢測(cè)結(jié)果用于分析的植株數(shù)分別為對(duì)照6株；pBlm轉(zhuǎn)基因植株8株；pBSlm轉(zhuǎn)基因植株22株。附圖11.不同基因結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化再生植株對(duì)棉鈴蟲(chóng)的抗性分布各基因結(jié)構(gòu)后面所注的括號(hào)內(nèi)數(shù)字表示總的參試植株數(shù)附表2.轉(zhuǎn)基因煙草植株子代的遺傳分析實(shí)施例一帶信號(hào)肽序列的嵌合殺蟲(chóng)蛋白基因BtSlm的合成1.蘇云金桿菌CrylA融合殺蟲(chóng)活性蛋白基因Btlm的合成1.1 CrylA融合蛋白基因Btlm寡核苷酸引物的合成寡核苷酸引物由中科院微生物研究所新技術(shù)中心用Applied Biosystem的DNA合成儀合成，經(jīng)OPC(寡核苷酸純化柱)或聚丙烯酰胺凝膠電泳純化后即可用于雙鏈DNA的合成。為了克隆方便，根據(jù)CrylAb和CrylAc基因內(nèi)存在的內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，將該基因的毒性區(qū)分為五個(gè)區(qū)段進(jìn)行引物合成。第一區(qū)段(PI)共6個(gè)引物(BamH1-EcoR1)，它們的序列如下PIf-1(+)5′ACGGATCCACC ATG GAC AAC CCAATC AAC GAA TGC ATT CCA TAC AAC TGC TTGAGT AAC CCA GAA GTT 68merPIf-2(-)5′GGA GAT GTC GAT TGG AGT GTA ACC GGT TTC GAT GCG TTC TCC ACC AAGTAC TTC AAC TTC TGG GTT66merPIf-3-5′GAA CTC GCT GAG CAG AAA CTG TGT CAA GGA CAA GGA GATGTC GAT 48merPI-2(-)5′ACC CCA GAT GAT GTC AAC TAG TCC GAG CAC GAA CCC AGC ACC TGG CACGAA CTC GCT GAG 60merPI-3(+)5′ATC ATC TGG GGT ATC TTT GGT CCA TCC CAA TGG GAC GCA TTC CTG45merPI-4(-)5′GC GAA TTC TTC GAT CCT CTG GTT GAT GAG CTG TTC AAT TTG AAC CAG GAATGC GTC第二區(qū)段(PII)共8個(gè)引物(EcoR1-EcoRV)，它們的序列如下PII-1(+)5′AA GAA TTC GCT AGG AAC CAG GCC ATC TCT AGG TTG GAA GGA CTC AGCAAT CTC TAC CAA ATC TAT 65merPII-2(-)5′CTC CCT GAG AGC TGG GTT AGT AGG ATC GGC CTC CCA TTC TCT GAA AGACTC TC ATA GAT TTG GTA 66merPII-3(+)5′T CTC AGG GAG GAG ATG CGT ATT CAA TTC AAC GAT ATG AAC AGC GCCTTG ACC ACT GCT ATC CCA T 65merPII-4(-)5′TT AGC GGC TTG AAC GTA CAC GGA CAA GAG AGG CAC CTG GTA GTT CTGGAC TGC GAA CAA TGG GAT AGC 68merPII-5(+)5′CAA GCC GCT AAT CTT CAT CTC AGC GTG CTT CGA GAC GTT TCA GTG TTTGGA CAG AGG TGG GGA TTC G67merPII-6(-)5′C GGT GTA GTT TCC AAT GAG CCT AGT AAG GTC GTT GTA TCT GCT ATT GATGGT TGC AGC ATC GAA TCC CCA 70merPII-7(+)5′AAC TAC ACC GAC CAC GCT GTT CGT TGG TAC AAC ACT GGT TTG GAG CGTGTC TGG GGT CCT GAT AGC AGA 69merPII-8(-)5′AC GAT ATC CAA CAC TGT AAG GGT CAA TTC TCT CCT GAA CTG GTT GTATCT AAT CCA ATC TCT GCT ATC AG 70mer第三區(qū)段( )共6個(gè)引物(EcoRV-EcoR1)，它們的序列如下PIII-1(+)5′TTG GAT ATC GTG TCT CTC TTC CCG AAC TAT GAC TCC AGA ACCTAC CCT ATC CGT ACA GTG60merPIII-2(-)5′AAG AAC TGG GTT AGT ATA GAT TTC TCT GGT AAG TTG GGA CACTGT ACG GAT AGG 54merPIII-3(+)5′ACT AAC CCA GTT CTT GAG AAC TTC GAC GGT ACG TTC CGT GGTTCT GCC CAA GGT ATC GAA GGC 63merPIII-4(-)5′GAT AGT TAT GCT GTT CAA GAT GTC CAT CAA GTG TGG GCT CCTGAT GGA GCC TTC GAT ACC 60merPIII-5(+)5′AAC ACG ATA ACT ATC TAC ACC GAT GCT CAC AGA GGA GAG TATTAC TGG TCT GGA CAC CAG ATC 63merPIII-6(-)5′GGT GAA TTC GGG CCC GCT GAA TCC AAC TGG AGA GGC CATGAT CTG GTG TCC AGA第四區(qū)段(PIV)共6個(gè)引物(EcoR1-SacI)，其序列如下PIV-1(+)5′CC GAA TTC ACC TTC CCT CTC TAT GGA ACT ATG GGT AAC GCC GCT CCACAA CAA AGG ATC GTT GCT CA 67merPIV-2(-)5′GAA TGG CCT TCT GTA CAA AGT GGA AGA CAA GGT TCT GTA GAC ACC CTGACC TAG TTG AGC AAC GA65merPIV-3(+)5′A AGG CCA TTC AAT ATC GGT ATC AAC AAC CAG CAA CTT TCC GTT CTCGAT GGA ACA GAG TTC GCC TAT 67merPIV-4(-)5′A GCT AGC AAC GGT TCC GGA CTT TCT GTA AAC AGC GGA TGG CAA GTTAGA AGA GGT TCC ATA GGC GGA C68merPIV-5(+)5′GTT GAT AGC TTG GAC GAA ATT CCA CCA CAG AAC AAC AAT GTG CCA CCCAGG CAA GGA TTC AGC CAC AGG T 70merPIV-6(-)5′AGG AGC TCT GAT GAT GCT CAC GCT ACT GTT GCT GAA ACC GGA ACG GAACAT GGA CAC ATG GCT CAA CCT GTG GCT72mer第五區(qū)段(PV)共9個(gè)引物(SacI-SalI)，其序列如下PV-1(+)5′TC AGA GCT CCT ATG TTC TCT TGG ATA CAT CGT AGT GCT GAG TTC AACAAT ATC ATT GCA TCC GAT AGC ATC 71merPV-2(-)5′CC TGA AAT GAC TGA ACC ATT GAA GAG AA GTT TCC CTT AAC TGC AGGAAT TTG AGT GAT GCT ATC G 66merPV-3(+)5′TC ATT TCA GGA CCA GGA TTC ACA GGA GGA GAC CTC GTT AGA CTC AACAGC ACT GGA AAT AAC ATC 65merPV-4(-)5′ATA TCT GGT AGA GTT CGT GTG AGG TAT GCT TCT GTG ACT CCT ATT CATCTC AAC GTT AAT TGG GGT 67merPV-5(+)5′T ACC AGA TAT AGA GTT CGT GTG AGG TAT GCT TCT GTG ACT CCTATT CATCTCAAC GTT AAT TGG GGT 67merPV-6(-)5′GAG GTT ATC CAA GGA GGT AGC TGT AGC TGG AAC TGT GTT GCT GAA GATAGA TGA ATT ACC CCA ATT A 67merPV-7(+)5′G GAT AACCTC CAA TCC AGC GAC TTC GGA TAC TTT GAG AGC GCC AAT GCTTTC ACA TCT TCA CTC GGC AAC 70merPV-8(-)5′T CAC ACC TGC AGT TC ACT AA GTT TCT AAC ACC CAC TAT GTT GCC GAG T50merPV-9(-)5′CA GTC GAC TCA TTC ATC CTC GAG TGT TGC AGT AAC TGG AAT GAA CTCAAA TCT GTC TAT GAT CAC ACC TGC AGT 72mer1.2 CrylA融合基因片段的合成及克隆取各個(gè)區(qū)段中兩個(gè)相鄰引物各20pmol(10μl)混合，在70℃變性10min，自然冷卻后加入10X Klenow酶緩沖液(100mmol/L Tris-Cl PH7.5，0.5mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，50mmol/L DTT)2μl，Klenow DNA聚合酶1單位，加dNTP至0.1mmol/L在總體積20μl內(nèi)37℃保溫lh，反應(yīng)產(chǎn)物與另一個(gè)經(jīng)Klenow酶聚合反應(yīng)產(chǎn)生的相鄰大片段混合變性后，在兩端引物存在下進(jìn)行PCR擴(kuò)增以產(chǎn)生更大的DNA片段。PCR反應(yīng)在20或50μl體積中由50mmol/L KCl，10mmol/L，Tris-HCl pH8.8，1.5mmol/LMgCl2，0.1mg/ml BSA，0.2mmol/L dNTP，5′端和3′端引物各1μmol/L，0.05U/μl Taq DNA polymerase，1μl/每個(gè)反應(yīng)來(lái)自Klenow或PCR反應(yīng)的產(chǎn)物作為模板組成的反應(yīng)混合物以94℃變性4min然后94℃，1min；40-50℃(退火溫度根據(jù)引物與模板配對(duì)的堿基數(shù)確定)，1min；72℃，1min共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。每個(gè)區(qū)段的PCR最終產(chǎn)物經(jīng)相應(yīng)的內(nèi)切酶酶解后與用同樣酶解的克隆載體pBluecriptIISK+或pSP71連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含X-gal和IPTG的LB平板上選取白色菌落，經(jīng)質(zhì)粒提取、質(zhì)粒的酶切分析及DNA序列分析后即可選到CrylA基因片段的亞克隆pBtSI(第一區(qū)段)，pBtSII(第二區(qū)段)，pBtSIII(第三區(qū)段)，pBtSIV(第四區(qū)段)和pBtfSV(第五區(qū)段)。這五個(gè)亞克隆的構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)圖1A-1E。以上的DNA酶切、載體的制備、連接反應(yīng)、感受態(tài)細(xì)胞的制備、轉(zhuǎn)化、克隆的篩選都按照《分子克隆》一書(shū)(Sambrook J.et al.《Molecular Cloning》2nd ed.CSH Laboratory Press，1989)所述方法進(jìn)行。DNA序列分析按Pharmacia公司T7DNA sequencing Kit提供的方法進(jìn)行。1.3融合殺蟲(chóng)蛋白CrylAc基因的組裝經(jīng)序列分析證明各個(gè)亞克隆中Bt基因片段的序列正確后，用常規(guī)的重組DNA技術(shù)按各亞克隆的酶切位點(diǎn)彼此按次序連接后即得到編碼CrylA融合蛋白Btlm的基因克隆pSKBtlm構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)圖2.1.4融合殺蟲(chóng)蛋白基因序列的矯正在對(duì)每個(gè)亞克隆進(jìn)行序列分析后發(fā)現(xiàn)在有些克隆中有堿基的缺失或置換。為了獲得完全正確的基因序列，在亞克隆基礎(chǔ)上用按Clontech公司的定點(diǎn)突變盒說(shuō)明書(shū)的方法對(duì)有誤的堿基處進(jìn)行定點(diǎn)突變。突變的選擇引物為Stu/ScaI5′GTGGACTGGTGAAGTACTCAACCAAGTC或AflIII/BglII引物5′CAGGAAAGAAGATCTGAGCAAAAG。突變引物由需改變的堿基與兩端10-15個(gè)堿基組成的寡核苷酸組成。突變引物應(yīng)與選擇引物在同一條DNA鏈上。
對(duì)亞克隆pBtfS12中Bt基因片段中EcoRI左右出現(xiàn)的堿基錯(cuò)誤則用兩對(duì)引物通過(guò)PCR方法進(jìn)行了改正，為便于篩選突變的轉(zhuǎn)化子，同時(shí)將此EcoRI位點(diǎn)去除。兩對(duì)引物分別為①PI-1+mI-
mI-5′ CCTAGCGAACTCTTCGATCCTCTGGTTGATGAG 33mer②PII-8+mII+mII+ 5′ ATCGAAGAGTTCGCCAGGAACCAGGCCATCTCTAGG 36mer對(duì)pBtfS12改造后的重組質(zhì)粒定名為pBtfS12PCR反應(yīng)條件及克隆方法同前所述。1.5帶有分泌信號(hào)肽編碼序列的嵌合殺蟲(chóng)蛋白基因克隆pSlm的構(gòu)建(a)分泌信號(hào)肽編碼序列的合成及克隆為了使Bt融合殺蟲(chóng)蛋白基因在植物中表達(dá)后其蛋白產(chǎn)物不在胞內(nèi)集累而分泌到胞外的細(xì)胞間隙，本發(fā)明首次將人工合成的煙草PRlb蛋白的信號(hào)肽編碼序列PRlbS與上述合成的CrylA融合蛋白基因Btlm連接后得到帶有分泌信號(hào)肽編碼序列的嵌合殺蟲(chóng)蛋白基因BtSlm。BtSlm基因的重組質(zhì)粒pSlm的構(gòu)建過(guò)程如附圖3所示。其中合成的PRlb分泌信號(hào)肽的編碼區(qū)序列如下Slb-15′CAT CTA GAT CT ACC ATG GGA TTT TTC CTT TTT TCT CAA ATG CCA TCC TTCTTT CTC GTG TCC ACT51merSlb-25′TAG TCG ACA CGC GTG AGA GGA GTG AGA GAT AAT CAG GAA AAG GAG AAGAGT GGA CAC GAG60mer以上兩個(gè)各取20pmol，在50ml klenow酶反應(yīng)體系中(如上1.2中所述)37℃反應(yīng)1h后，加苯體積酚/氯仿(1∶1)抽取一次，取上層水溶液加入2倍體積乙醇及5ml 3M NaAc，混勻后置一70℃沉淀DNAlhr，12000rpm離心10分鐘收集沉淀，70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于20ml無(wú)菌水中，按“分子克隆”所述方法對(duì)上述DNA及PUC19質(zhì)粒DNA進(jìn)行XbaI和SalI酶解，酶解后通過(guò)6％聚丙烯酰胺凝膠電泳分離純化Slb DNA片段，并與用用樣酶酶解的pUC19連接即得到含Slb的重組質(zhì)粒pUSP，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5A后即可在含Xgal和IPTG平板上篩選到含有該重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子，經(jīng)酶切分析和DNA序列分析證明分泌信號(hào)肽Slb的序列正確，但在張的BglII酶切位點(diǎn)序列在合成時(shí)發(fā)生了錯(cuò)誤由AGATCT變?yōu)锳GATTC由于該位點(diǎn)的錯(cuò)誤不會(huì)影響Slb信號(hào)肽的表達(dá)，所以在pUSP中仍保留了這一序列pUSP的構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)附圖3所示。為了適當(dāng)提高Slb序列中的GC含量及避免一些植物中罕見(jiàn)的密碼子在合成時(shí)對(duì)其中的15個(gè)密碼子進(jìn)行了改變，但其編碼的氨基酸未發(fā)生變化。(b)帶有分泌信號(hào)肽編碼序列的嵌合殺蟲(chóng)蛋白基因Btlm克隆pSlm的構(gòu)建按“分子克隆”一書(shū)所述的重組DNA方法用MluI酶解質(zhì)粒pUSP然后用Klenow酶補(bǔ)平末端再用SalI酶解與用BamH1酶解，Klenow酶補(bǔ)平并用SalI酶解pSKBtlm后分離到的1.8kb融合殺蟲(chóng)蛋白基因片段連接后即得到含有分泌信號(hào)肽編號(hào)序列的嵌合殺蟲(chóng)蛋白基因BtSlm的克隆pSlm(詳見(jiàn)附圖3)。序列分析表明BtSlm基因的序列與原設(shè)計(jì)一致，其DNA序列和編碼的氨基酸序列見(jiàn)權(quán)利要求1和2以及附圖4。合成的嵌合殺蟲(chóng)蛋白基因BtSlm全長(zhǎng)1947bp，其中第1-第90核苷酸編碼分泌信號(hào)肽Slb；91-99為由酶切位點(diǎn)形成的三個(gè)密碼子；第100-1092和1093-1947分別編碼CrylAb第1-331氨基酸和CrylAc第332-616氨基酸(包括一個(gè)終子密碼子)，即Btlm基因。Btlm基因與相應(yīng)野生型基因核苷酸序列的比較見(jiàn)附圖5，Btlm基因的GC比由野生型的37％增加到47.4％，其密碼子使用頻率的變化更有利于該基因在植物中的表達(dá)。Btlm基因密碼子使用頻率與野生型基因的比較見(jiàn)附表1。2、融合基因Btlm及嵌合基因BtSlm的植物表達(dá)載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化二元表達(dá)載體pBin438含有由帶雙增強(qiáng)子的CaMV 35S啟動(dòng)子(DE35Sp)、TMV-RNA cDNA的Ω片段-來(lái)自pBR322的BamHI-SalI片段及Nos轉(zhuǎn)錄終止序列組成的外源基因表達(dá)框架(李太元等，中國(guó)科學(xué)(B輯)24276-282，1995)。用BamHI和SalI將pSKBtlm中的融合基因Btlm切出后插入到pBin438的BamHI和SalI位點(diǎn)之間構(gòu)建成植物表達(dá)載體pBlm。用XbaI酶解pSlm，然后用Klenow酶將末端補(bǔ)平，再用SalI酶解，在Agarose膠上電泳回收1.9kb的BtSlm基因片段與用BamH1酶解，Klenow補(bǔ)平，SalI酶解后的pBin438建連接則構(gòu)建成BtSlm的植物表達(dá)載體pBSlm。以上連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5A后，挑選抗Kanamycin克隆經(jīng)酶切分析證明構(gòu)建正確后用凍融法(An et al，Methods inEnzymology 153293，1987)將以上表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化到土壤農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)LB4404中，經(jīng)卡那霉素篩選，質(zhì)粒分析證明pBS29K結(jié)構(gòu)完全正確后即可用于植物轉(zhuǎn)化。這個(gè)植物表達(dá)載體的具體構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)附圖3。實(shí)施例二抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植物的獲得1.煙草的轉(zhuǎn)化用無(wú)菌培養(yǎng)的煙草NC89的葉片通過(guò)與根癌土壤桿菌共培養(yǎng)的葉盤法(Horch et al.Science 2271229-1231，1985)將以上構(gòu)建的pBlm和pBSlm中的T-DNA(包括NPTII基因和相應(yīng)的抗蟲(chóng)基因)轉(zhuǎn)入到煙草染色體上分別獲得了一批抗卡那霉素的抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因煙草植株。2.轉(zhuǎn)化再生煙草植株的分析2.1轉(zhuǎn)化再生植株的PCR檢測(cè)煙草DNA提取和轉(zhuǎn)基因煙草的PCR檢測(cè)按李太元等所述方法(中國(guó)科學(xué)B輯24276-282，1994)進(jìn)行，PCR引物為35S+5′CTGACGTAAGGGATGACGC 19merRe-Bt 5′TTGAATTGAATACGCATCTCC21mer用這兩個(gè)引物進(jìn)行PCR所得產(chǎn)物約500bP。部分抗卡那霉素的再生植株的PCR結(jié)果見(jiàn)附圖7。這些PCR結(jié)果表明Btlm或BtSlm抗蟲(chóng)基因可能已整合到所檢測(cè)的7株和3煙草的染色體上。2.2 Southern雜交分析(1)植物DNA的提取取2克葉片在液氮中研磨成粉后按Paterson等報(bào)導(dǎo)的方法(PlantMol.Bol.Rep，11(2)122-127，1993)提取細(xì)胞核DNA。DNA的定量用紫外測(cè)定法，即1OD260＝50μg/ml或在Agarose電泳后用EB染色比較確定。(2)植物DNA的酶解和電泳取20μgDNA加入150單位的HindIII和20μl 10×限制性內(nèi)切酶緩沖液，加無(wú)菌重蒸水至總體積為200μl，37℃保溫過(guò)夜。然后加入20μl 3M NaAcPH5.5及2倍體積的95％乙醇，混勻后置-70℃ 15min，12000rpm離心5min沉淀DNA，用70％乙醇洗沉淀一次，將DNA沉淀真空干燥后溶于適量TE(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA PH8.0)，在0.8％Agarose膠上以80V電泳分離DNA。(3)DNA的轉(zhuǎn)膜、引物標(biāo)記及雜交反應(yīng)均參照分子克隆一書(shū)(Sambrook et al.CSHL Press，1989)所述進(jìn)行，所用探針為用α-32P-dCTP和Ready To Go DNA標(biāo)記試劑盒標(biāo)記的EcoRV和XhoI酶解的S29K基因片段(1.1Kb)。對(duì)部分植株的Southern雜交結(jié)果(見(jiàn)附圖8C)證明BT基因和API-BA基因已整合到所檢測(cè)的煙草染色體中，而且在所檢測(cè)的植株中都是單拷貝插入。2.3轉(zhuǎn)基因煙草中的Bt殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)檢測(cè)(a)轉(zhuǎn)基因煙草中Bt蛋白的酶聯(lián)免疫檢測(cè)(ELISA)煙草葉片50mg左右，液氮研磨后加入提取緩沖液(50mM Na2CO3，pH9.5，1uM Leupeptin，lmM PMSF，0.05％(v/v))Tween-20，0.1％(w/v)NaCl，0.05％(v/v)巰基乙醇)，10,000rpm離心10min。取上清用于ELISA檢測(cè)。采取雙抗夾心法，用包被液(50mM Na2CO3，0.02％(w/v)NaN3)包被一抗，一抗為雞抗B.t.血清(1∶2500)，二抗用鼠抗B.t.血清(1∶1000)，酶聯(lián)抗體用羊抗鼠的堿性磷酸酯酶標(biāo)記的IgG，抗體稀釋用磷酸緩沖液PBST(40g/L NaCl，4.4g/L KH2PO4，29.11g/L Na2HPO412H2O，0.5ml/L Tween-20，pH 7.2-7.4)，用lmg/mL對(duì)硝基苯磷酸二鈉( -Nitrophenyl Phoshate Disodium(pNPP))(Sigma公司產(chǎn)品)顯色15-30min，405nm測(cè)紫外線吸收值。用Bio-Rad protein assay kit測(cè)定蛋白濃度，對(duì)照用空白轉(zhuǎn)化的植株葉片，用Bt晶體蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算Bt蛋白的表達(dá)量。
對(duì)8株轉(zhuǎn)Btlm的抗蟲(chóng)植株及22株轉(zhuǎn)BtSlm的抗蟲(chóng)植株進(jìn)行ELISA檢測(cè)結(jié)果歸納為附圖10，結(jié)果初步表明轉(zhuǎn)Btlm的植株中Bt殺蟲(chóng)蛋白平均表達(dá)量為葉片總可溶性蛋白的0.07％而轉(zhuǎn)BtSlm基因植株中的Bt殺蟲(chóng)蛋白平均表達(dá)量可達(dá)0.23％，雖然檢測(cè)中對(duì)照的本底反應(yīng)較高，但總的比較看后者的表達(dá)量是前者的三倍，這種跡象表明加了分泌信號(hào)肽后可能改變了Bt蛋白的細(xì)胞定位，從而增加了Bt蛋白的穩(wěn)定性有利于Bt蛋白的集累。(b)Westernblot分析取100mg新鮮葉片，液氮研磨后加入100μl 2×上樣緩沖液，100℃煮3-5min，12000rpm離心5min后，所得上清即可用于電泳分析。取上述蛋白提取液20μl，在10％SDS-PAGE膠上，用Tris-甘氨酸緩沖體系(PH8.3)，電壓60V，電泳4-6hr。電泳結(jié)束后，用Bio-Rad半干轉(zhuǎn)移儀恒壓9伏，30min將蛋白轉(zhuǎn)移至用甲醇預(yù)處理的PVDF膜上。然后將膜置于溶液III中封閉未結(jié)合蛋白的位置，室溫下?lián)u1hr或4℃過(guò)夜；將膜轉(zhuǎn)入一抗反應(yīng)液(溶液I+1％BSA，ProteinA Spharose6B柱純化過(guò)的免抗CrylAc抗體，1∶500倍稀釋)中，室溫?fù)u1hr；用溶液I洗3次，每次3-5min；將膜置于顯色液(10ml溶液II+33μlNBT+66μlBCIP)中顯色。Western blot所用溶液如下2×上樣緩沖液125mM Tris-HCl PH6.8，20％甘油，4％SDS，0.2％溴酚藍(lán)，2％巰基乙醇半干轉(zhuǎn)移緩沖液48mmol/L Tris，39 mmol/L甘氨酸，0.0375％SDS，20％甲醇溶液I20mmol/L Tris-HCl PH7.4，0.15 mol/L NaCl，1 mmol/LEDTA，0.1％Tween-20溶液II0.1mol/L Tris，0.1mol/L NaCl，5mmol/L MgCl2(PH9.5)溶液III含5％脫脂牛乳粉的溶液I。部分植株的定性Western blot分析結(jié)果見(jiàn)附圖9，結(jié)果表明改造后的Btlm或BtSlm基因在轉(zhuǎn)基因植株中有明顯的表達(dá)。特異免疫反應(yīng)的蛋白分子量與1.8KbBtlm基因片段在大腸桿菌中表達(dá)產(chǎn)物(泳道1)大小一致，表明這兩個(gè)Bt基因都能在植物中正確表達(dá)殺蟲(chóng)蛋白，而且BtSlm表達(dá)的嵌合殺蟲(chóng)蛋白上的信號(hào)肽已被正確加工除去。但對(duì)有關(guān)信號(hào)肽是否發(fā)揮了其應(yīng)有的功能及其加工情況尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明。2.4轉(zhuǎn)基因煙草的抗蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)及子代遺傳分析取轉(zhuǎn)基因煙草或非轉(zhuǎn)基因煙草的新鮮葉片用無(wú)菌水沖洗干凈并用紗布將葉上的水吸干后放入小塑料盒內(nèi)，每盒放一頭人工飼養(yǎng)的棉鈴蟲(chóng)(Heliothisarmigera Hübner)，每株煙草做6～12頭蟲(chóng)。蟲(chóng)試盒加蓋后，在25℃放置3天或5天后統(tǒng)計(jì)幼蟲(chóng)死亡率?？瓜x(chóng)試驗(yàn)重復(fù)三次。轉(zhuǎn)化再生煙草蟲(chóng)試結(jié)果歸納為附圖11。
蟲(chóng)試結(jié)果結(jié)果表明轉(zhuǎn)Btlm和轉(zhuǎn)BtSlm基因的植株中都可選到高抗蟲(chóng)性的植株，具有50％以上的試蟲(chóng)死亡率的植株分別占總參試植株數(shù)的76％和85％，這一結(jié)果與Bt蛋白的表達(dá)水平一致，又一次表明轉(zhuǎn)帶有信號(hào)肽編碼序列的BtSlm基因的轉(zhuǎn)基因植株可能更易于選到高抗蟲(chóng)性植株。
為了了解Btlm和BtSlm基因在轉(zhuǎn)基因植株中的遺傳穩(wěn)定性，對(duì)部分植株的自交一代植株的卡那霉素抗性及抗蟲(chóng)性進(jìn)行檢測(cè)。取轉(zhuǎn)基因植株自交一代的種子(T1)按做無(wú)菌苗的操作方法，將滅菌后的種子轉(zhuǎn)移到含有200mg/ml卡那霉素的MS0平板培養(yǎng)基上，置光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待幼苗長(zhǎng)出一對(duì)真葉后不抗卡那霉素的植株很快變?yōu)榘咨?，而抗卡那霉素的小苗仍保持綠色，計(jì)各個(gè)株系的綠苗數(shù)和白苗數(shù)，統(tǒng)計(jì)卡那霉素抗的分離比。同時(shí)對(duì)子代植株進(jìn)行抗蟲(chóng)試驗(yàn)，方法同上所述，統(tǒng)計(jì)抗蟲(chóng)性在子一代中的分離情況?？敲顾乜剐缘慕y(tǒng)計(jì)分計(jì)結(jié)果見(jiàn)附表2所示子代分析結(jié)果表明由表達(dá)載體帶到植物染色體上的NPTII基因(卡那霉素抗性基因)在轉(zhuǎn)基因植株子代基本是按單基因分離的，所以應(yīng)是遺傳穩(wěn)定的，可以從子代中選到轉(zhuǎn)基因純合系，而且與NPTII緊密連鎖的Bt基因的抗蟲(chóng)性也顯示出3∶1的分離特點(diǎn)，初步表明合成的Bt基因Btlm和BtSlm在轉(zhuǎn)基因植株后代也可以穩(wěn)定遺傳。
用pBlm和pBSlm的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子已轉(zhuǎn)化了棉花的生產(chǎn)品種冀合321并經(jīng)PCR檢查及抗棉鈴蟲(chóng)試驗(yàn)初步選到了高效抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植株，所以本發(fā)明提供的Bt融合殺蟲(chóng)蛋白基因Btlm和BtSlm可用于植物的抗蟲(chóng)基因工程研究與開(kāi)發(fā)。
附表1 改造前后融合殺蟲(chóng)蛋白基因Btlm編碼區(qū)密碼子使用頻率的變化及與植物密碼子使用頻率的比較
附表2.轉(zhuǎn)基因煙草植株子代的遺傳分析H00-T＝0，α＝0.05，df＝1，x20.05＝3.841當(dāng)x2＜x20.05，卡那霉素的抗性比率符合典型的3∶1分離比
權(quán)利要求
1.一種由分泌信號(hào)肽編碼序列和蘇云金芽孢桿菌殺蟲(chóng)蛋白的核苷酸序列構(gòu)成的嵌合蛋白基因BtSlm，全長(zhǎng)1947bp，其核苷酸序列如下9 1827 36 45545′ATG GGA TTT TTC CTT TTT TCT CAA ATG CCA TCC TTC TTT CTC GTG TCC ACT CTT63 7281 90 99108CTC CTT TTC CTC ATT ATC TCT CAC TCC TCT CAC GCG GAT CCG ACC ATG GAC AAC117126 135144 153162AAC CCA AAC ATC AAC GAA TGC ATT CCA TAC AAC TGC TTG AGT AAC CCA GAAGTT171180 189198 207216GAA GTA CTT GGT GGA GAA CGC ATC GAA ACC GGT TAC ACT CCA ATC GAC ATCTCC225234 243252 261270TTG TCC TTG ACA CAG TTT CTG CTC AGC GAG TTC GTG CCA GGT GCT GGG TTCGTG279288 297306 315324CTC GGA CTA GTT GAC ATC ATC TGG GGT ATC TTT GGT CCA TCC CAA TGG GACGCA333342 351360 369378TTC CTG GTT CAA ATT GAA CAG CTC ATC AAC CAG AGG ATC GAA GAG TTC GCTAGG387396 405414 423432AAC CAG GCC ATC TCT AGG TTG GAA GGA CTC AGC AAT CTC TAC CAA ATC TATGCA441450 459468 477486GAG TCT TTC AGA GAA TGG GAG GCC GAT CCT ACT AAC CCA GCT CTC AGG GAGGAG495504 513522 531540ATG CGT ATT CAA TTC AAC GAT ATG AAC AGC GCC TTG ACC ACT GCT ATC CCA TTG549558 567576 585594TTC GCA GTC CAG AAC TAC CAG GTG CCT CTC TTG TCC GTG TAC GTT CAA GCCGCT603612 621630 639648AAT CTT CAT CTC AGC GTG CTT CGA GAC GTT TCA GTG TTT GGA CAG AGG TGGGGA657666 675684 693702TTC GAT GCT GCA ACC ATC AAT AGC AGA TAC AAC GAC CTT ACT AGG CTC ATTGGA711 720 729738 747756AAC TAC ACC GAC CAC GCT GTT CGT TGG TAC AAC ACT GGT TTG GAG CGT GTCTGG765 774 783792 801810GGT CCT GAT AGC AGA GAT TGG ATT AGA TAC AAC CAG TTC AGG AGA GAA TTGACC819 828 837846 855864CTT ACA GTG TTG GAT ATC GTG TCT CTC TTC CCG AAC TAT GAC TCC AGA ACC TAC873 882 891900 909918CCT ATC CGT ACA GTG TCC CAA CTT ACC AGA GAA ATC TAT ACT AAC CCA GTTCTT927 936 945954 963972GAG AAC TTC GAC GGT AGC TTC CGT GGT TCT GCC CAA GGT ATC GAA GGC TCCATC981 990 999 1008 1017 1026AGG AGC CCA CAC TTG ATG GAC ATC TTG AAC AGC ATA ACT ATC TAC ACC GATGCT1035 1044 1053 1062 1071 1080CAC AGA GGA GAG TAT TAC TGG TCT GGA CAC CAG ATC ATG GCC TCT CCA GTTGGA1089 1098 1107 1116 1125 1134TTC AGC GGG CCC GAA TTC ACC TTC CCT CTC TAT GGA ACT ATG GGT AAC GCCGCT1143 1152 1161 1170 1179 1188CCA CAA CAA AGG ATC GTT GCT CAA CTA GGT CAG GGT GTC TAC AGA ACC TTGTCT1197 1206 1215 1224 1233 1242TCC ACT TTG TAC AGA AGG CCA TTC AAT ATC GGT ATC AAC AAC CAG CAA CTTTCC1251 1260 1269 1278 1287 1296GTT CTC GAT GGA ACA GAG TTC GCC TAT GGG ACC TCT TCT AAC TTG CCA TCCGCT1305 1314 132313321341 1350GTT TAC AGA AAG TCC GGA ACC GTT GAT AGC TTG GAC GAA ATT CCA CCA CAGAAC1359 1368 1377138613951404AAC AAT GTG CCA CCC AGG CAA GGA TTC AGC CAC AGG TTG AGC CAT GTG TCCATG1413 1422 1431144014491458TTC CGT TCC GGT TTC AGC AAC AGT AGC GTG AGC ATC ATC AGA GCT CCT ATGTTC1467 1476 1485149415031512TCT TGG ATA CAT CGT AGT GCT GAG TTC AAC AAT ATC ATT GCA TCC GAT AGC ATC1521 1530 1539154815571566ACT CAA ATT CCT GCA GTT AAG GGA AAC TTT CTC TTC AAT GGT TCT GTC ATT TCA1575 1584 1593 1602 1611 1620GGA CCA GGA TTC ACA GGA GGA GAC CTC GTT AGA CTC AAC AGC AGT GGA AATAAC1629 1638 1647 1656 1665 1674ATC CAG AAT AGA GGG TAT ATT GAA GTT CCA ATT CAT TTC CCT TCC ACA TCT ACC1683 1692 1701 1710 1719 1728AGA TAT AGA GTT CGT GTG AGG TAT GCT TCT GTG ACT CCT ATT CAT CTC AAC GTT1737 1746 1755 1764 1773 1782AAT TGG GGT AAT TCA TCT ATC TTC AGC AAC ACA GTT CCA GCT ACA GCT ACCTCC1791 1800 1809 1818 1827 1836TTG GAT AAC CTC CAA TCC AGC GAC TTC GGA TAC TTT GAG AGC GCC AAT GCTTTC1845 1854 1863 1872 1881 1890ACA TCT TCA CTC GGC AAC ATA GTG GGT GTT AGA AAC TTT AGT GGA ACT GCAGGT1899 1908 1917 1926 1935 1944GTG ATC ATA GAC AGA TTT GAG TTC ATT CCA GTT ACT GCA ACA CTC GAG GCTGAATGA 3′
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的BtSlm基因，它是由人工合成的由蘇云金芽孢桿菌殺蟲(chóng)蛋白CrylAb的一部分(331個(gè)氨基酸)和CrylAc的一部分(284個(gè)氨基酸)組成的融合蛋白基因Btlm以及在其N端融合一段編碼分泌信號(hào)肽(30個(gè)氨基酸)的核苷酸序列后形成的嵌合蛋白基因BtSlm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的BtSlm基因核苷酸序列，其編碼的氨基酸序列為1 18M G F F L F S Q M P S F F L V S T L L L F L I I S H S S H A D P T M D N37 54N P N I N E C I P Y N C L S N P E V55 72E V L G G E R I E T G Y T P I D I S73 90L S L T Q F L L S E F V P G A G F V91 108L G L V D I I W G I F G P S Q W D A109 126F L V Q I E Q L I N Q R I E E F A R127 144N Q A I S R L E G L S N L Y Q I Y A145 162E S F R E W E A D P T N P A L R E E163 180M R I Q F N D M N S A L T T A I P L181 198F A V Q N Y Q V P L L S V Y V Q A A199 216N L H L S V L R D V S V F G Q R W G217 234F D A A T I N S R Y N D L T R L I G236 252N Y T D H A V R W Y N T G L E R V W254 270G P D S R D W I R Y N Q F R R E L T271 288L T V L D I V S L F P N Y D S R T Y289 306P I R T V S Q L T R E I Y T N P V L307 324E N F D G S F R G S A Q G I E G S I325 342R S P H L M D I L N S I T I Y T D A342 360H R G E Y Y W S G H Q I M A S P V G361 378 F S G P E F T F P L Y G T M G N A A379 396P Q Q R I V A Q L G Q G V Y R T L S397 414S T L Y R R P F N I G I N N Q Q L S415 432V L D G T E F A Y G T S S N L P S A433 450V Y R K S G T V D S L D E I P P Q N451 468N N V P P R Q G F S H R L S H V S M469 486F R S G F S N S S V S I I R A P M F487 504S W I H R S A E F N N I I A S D S I505 522T Q I P A V K G N F L F N G S V I S523 540G P G F T G G D L V R L N S S G N N541 558I Q N R G Y I E V P I H F P S T S T559 576R Y R V R V R Y A S V T P I H L N V577 394N W G N S S I F S N T V P A T A T S595 612L D N L Q S S D F G Y F E S A N A F613 630T S S L G N I V G V R N F S G T A G631 648V I I D R F E F I P V T A T L E A E
4.一種含有Btlm基因的重組質(zhì)粒pSKBtlm。
5.一種含有BtSlm基因的重組質(zhì)粒pSlm。
6.一種重組微生物，含有權(quán)利要求4或5所述的重組質(zhì)粒pSKBtlm或pSlm。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種微生物是大腸桿菌〔Escherichia coli(Migula)〕DH5α。
8.一種能在植物中組成型表達(dá)外源抗蟲(chóng)基因的重組質(zhì)粒，其特征在于二元表達(dá)載體pBin438與Bt殺蟲(chóng)蛋白基因Btlm或BtSlm相連接，該植物表達(dá)載體定名為pBlm或pBSlm。
9.一種重組微生物，含有權(quán)利要求8所述的植物表達(dá)載體pBlm或pBSlm。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組微生物，它們分別是大腸桿菌〔Escherichiacoli(Migula)〕DH5α和根癌土壤桿菌〔Agrobacterium tumefaciens(Smithet Townsend)Conn〕LBA4404。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中所述的基因或表達(dá)載體或重組微生物其中任選一項(xiàng)，在轉(zhuǎn)基因植物或植物抗蟲(chóng)基因工程中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種人工合成的蘇云金芽孢桿菌(Bt)的嵌合殺蟲(chóng)蛋白基因Btlm，適于在高等植物中高效表達(dá)；在該基因的5′端加上一個(gè)編碼分泌信號(hào)肽的核苷酸序列形成一個(gè)融合蛋白基因BtSlm，該基因在植物中表達(dá)的Bt殺蟲(chóng)蛋白可分泌到細(xì)胞間隙，有助于提高殺蟲(chóng)蛋白的穩(wěn)定性和減輕殺蟲(chóng)蛋白對(duì)細(xì)胞正常功能的干擾。
文檔編號(hào)C12N15/74GK1393561SQ01129519
公開(kāi)日2003年1月29日 申請(qǐng)日期2001年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月22日
發(fā)明者田穎川, 秦紅敏, 郭洪年 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所