專利名稱：蚯蚓纖溶酶的提取方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其是蚯蚓纖溶酶的提取。
蚯蚓纖溶酶是一種絲氨酸蛋白酶，屬胰蛋白酶，類似于血纖維蛋白溶酶，它能水解蛋白質底物(如酪蛋白)、堿性氨基酸的酯(BAEE)及酰胺，并具有強烈的溶解血纖蛋白的作用。其主要應用是作為治療血栓類疾病的藥原。
目前，血栓病、心血管疾病是一種嚴重危害人類健康的多發(fā)性疾病。理想的溶栓藥物要求可迅速溶解血栓、無毒、無出血等副作用，給藥方便，價格便宜。尋找有效的治療藥物是國內外醫(yī)學界重點攻關的熱點之一。鑒于蚯蚓纖溶酶能溶解血栓，無毒副作用，可口服給藥，生產(chǎn)成本低廉，人們期望能將蚯蚓纖溶酶開發(fā)成一種新型的溶栓藥劑。當前，市售溶栓膠囊、地龍膠囊、“9.12”膠囊等只是蚯蚓凍干粉，酶的純度和比活較低，且為口服，易被分解見效慢，臨床應用效果較差。分離純化出純度高，比活力高的蚯蚓纖溶酶便成為重中之重。
本發(fā)明的目的在于提供一種蚯蚓纖溶酶的提取方法，制備出純度高，酶比活力高的蚯蚓纖溶酶，為該酶的更好實際應用打下基礎。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的(1)以環(huán)毛蚓為原料，用水將沖洗干凈(2)原料勻漿按1∶2(W/V)的比例加入0.1mol/L，pH7.5的磷酸緩沖液，勻漿；(3)抽提將勻漿置于4℃下，將環(huán)毛蚓中的纖溶酶抽提完全，4℃下10000r/min離心，棄沉淀，取上清；(4)熱變性將上清液于55℃水浴保溫30min，流水冷卻，在4℃下10000r/min離心，取上清；(5)分部鹽析在熱變性的上清液中加(NH4)2SO4達30％飽和度，在4℃下10000r/min離心，收集上清液；再加入(NH4)2SO4達70％飽和度，在4℃下10000r/min離心，收集沉淀；
(6)將沉淀溶于pH7.8，0.02mol/L的磷酸緩沖液中，透析時間為8～12小時以除去酶液中的(NH4)2SO4，在4℃下10000r/min離心，取上清液即為粗酶溶液；(7)Sephadex G-75洗脫；將粗酶溶液上Sephadex G-75柱層析，柱的規(guī)格為2.0cm×60.0cm，以pH7.8，0.02mol/L的磷酸緩沖液1ml/min的速度洗脫，收集活性峰酶液，每管4ml；(8)DEAE-Cellulose離子交換柱層析。將過Sephadex G-75的活性峰洗脫液上DEAE-Cellulose柱，柱的規(guī)格為3.0cm×30.0cm，以含0.1-0.6mol/LNaCl的pH7.8，0.02mol/L的磷酸緩沖液梯度洗脫，洗脫速度為0.4ml/min，收集活性峰洗脫液，每管4ml，透析時間為8～12小時以除去酶液中的NaCl，在4℃下10000r/min離心。收集上清液即為純化酶溶液。
蚯蚓纖溶酶的特征酶的相對分子量為2.3-3.3Kd。
酶蛋白等電點為pH3-4。
酶的酸堿穩(wěn)定性和作用最適pH分別為pH5.8-10.0和pH7.8。
酶的熱穩(wěn)定性和最適作用溫度分別為20-55℃和55℃。
貯藏穩(wěn)定性溶液酶在室溫下放置5個月活力基本沒變。
Km(BAEE)1.24×10-3mol/L。
酶活性抑制劑PMSF(苯甲磺酰氟)、Hg2+酶活力(底物為酪蛋白)2080U/mg蛋白質酶活力的測定方法(1)酪蛋白為底物稱取lg酪蛋白，加入100ml，0.05mol/L，pH7.8 Tris-HCl緩沖液，60℃水浴溶解，并定容至100ml，酪蛋白溶液濃度為1％。吸取0.5ml酶液于水溶上保溫10min，然后加入2ml在37℃預保溫的底物溶液，搖勻后保溫15min，立即加入2ml10％三氯乙酸溶液終止反應。室溫靜置30min后過濾。測定濾液在280nm波長下的光密度值。在上述條件下以280nm波長下光密度值變化0.001個單位的酶量定義為1個酶活力單位(U)。
(2)以BAEE為底物將底物BAEE溶于0.05mol/L，pH7.8 Tris-HCl緩沖液中，濃度為0.4×10-3mol/L，取BAEE溶液3ml于石英比色杯中，加30-100ul(視酶活力高低)待測酶液，立即攪勻，于室溫下，在253nm波長處測定其光密度。以1min內，于253nm波長下，光密度變化0.001個單位的酶量定義為1個酶活力單位(U)。
(3)對天然凝血塊的作用取兔血凝成血塊，切成小塊，用濾紙吸去表面水份，各稱50mg共6份，放于小試管中加酶液0.5ml(酶液濃度4mg/ml，蛋白含量為8mg/ml)，對照加等體積的上述緩沖液，37℃保溫12h。
蛋白質含量的的測定方法按Bradford法，并以牛血清蛋白作標準曲線。
蚯蚓纖溶酶的質量標準酶活力回收為19％，純化倍數(shù)為5.47倍，酶比活力為2080U/mg.蛋白質。
本發(fā)明的優(yōu)點(1)以蚯蚓為原料，原料來源容易，價廉，并且會帶動蚯蚓的綜合利用；(2)本發(fā)明的工藝生產(chǎn)設備投資少；(3)本產(chǎn)品相對分子量小，穩(wěn)定性高，能夠在常溫下操作；(4)水解血纖維蛋白能力強；(5)酶比活力高達2080U/mg.蛋白質。
實例100g新鮮環(huán)毛蚓流水沖洗2h，使其內污物盡量排出，取洗凈后的蚯蚓，吸干水份，按1∶2(W/V)的比例加入200ml，0.1mol/L，pH7.5的PBS，勻漿，置冰箱內抽提6h，然后以10000r/min，4℃離心10min，棄去沉淀，取上清，上清液于55℃水浴保溫30min，流水冷卻，10000r/min，4℃離心10min，取上清，在上清液中加硫酸銨達30％飽和度，10000r/min，4℃離心10min，收集上清液再加入硫酸銨達70％飽和度，10000r/min，4℃離心10min，收集沉淀。將沉淀溶解在pH7.8，0.02mol/L的磷酸緩沖液中，對上述溶液透析12h，透析液10000r/min，4℃離心10min，取上清液即為粗酶溶液。取20ml粗酶溶液過Sephadex G-75(2.0cm×60.0cm)柱層析，以pH7.8、0.02mol/L的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液洗脫(1ml/min，4ml/管)，收集活性峰洗脫液共60ml，取20ml上DEAE-纖維素柱層析(3.0cm×30.0cm，0.4ml/min，4ml/管)，以含0.1-0.6mol/L NaCl的pH7.8、0.02mol/L的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液離子強度線性梯度洗脫，收集活性峰洗脫液50ml，對上述緩沖液透析12小時，透析液即為純酶液，結果如下純化步 體積 總活力 總蛋白 比活力 純化倍 活力回驟 (ml) (U) (mg) (U/mg) 數(shù) 收(％)粗酶 200252000 657.6380 1100熱變性 200279600 401.8700 1.84 111鹽析 60 88700119.0750 1.97 35G-75 60 7670097.8 780 2.05 30DEAE-C 50 4760023.0 20805.47 19
權利要求
1.蚯蚓纖溶酶的提取方法，其特征在于(1)以環(huán)毛蚓為原料，將原料用水沖洗干凈；(2)原料勻漿按1∶2(W/V)的比例加入0.1mol/L，pH7.5的磷酸緩沖液，勻漿；(3)抽提將勻漿置于4℃下，將環(huán)毛蚓中的纖溶酶提取完全，4℃下10000r/min離心，棄沉淀，取上清；(4)熱變性將上清液于55℃水浴保溫30min，冷卻后，離心，取上清；(5)分部鹽析在熱變性的上清液中加(NH4)2SO4達30％飽和度，4℃下10000r/min離心，收集上清夜；再加入(NH4)2SO4達70％飽和度，4℃下10000r/min離心，收集沉淀；(6)將沉淀溶于pH7.8，0.02mol/L的磷酸緩沖液中，透析時間為8～14小時除去酶液中的(NH4)2SO4后，于4℃下10000r/min離心，取上清液即為粗酶溶液；(7)Sephadex G-75柱層析洗脫，將粗酶溶液過Sephadex G-75柱層析，以pH7.8，0.02mol/L的磷酸緩沖液洗脫，收集活性峰酶液，(8)DEAE-Cellulose離子交換柱層析，將過Sephadex G-75的活性峰洗脫液上DEAE-Cellulose柱，以含0.1-0.6mol/L NaCl的pH7.8，0.02mol/L的磷酸緩沖液離子強度線性梯度洗脫，收集活性峰，透析除去酶液中的NaCl后，于4℃下10000r/min離心，收集上清液即為純化酶溶液。
全文摘要
本發(fā)明是以蚯蚓為原料,流水沖洗干凈,勻漿離心,上清液經(jīng)熱變性、硫酸銨分部鹽析、透析、Sephadex G－75柱層析、DEAE－纖維素離子交換柱層析,收集酶液透析,濃縮成溶液酶。酶活力高達2080U/mg蛋白,活力回收為19%。環(huán)毛蚓纖溶酶不但能水解蛋白質底物(如酪蛋白)和酰胺及堿性氨基酸的酯(如BAEE),并且有強烈的溶解血纖維蛋白的作用。蚯蚓纖溶酶的成功提取,將為治療血栓類疾病開拓一條有效的新途徑。
文檔編號C12N9/76GK1332243SQ0112760
公開日2002年1月23日 申請日期2001年7月10日 優(yōu)先權日2001年7月10日
發(fā)明者徐鳳彩, 高向陽, 伍曉斌, 詹福建 申請人:華南農業(yè)大學