專利名稱：海帶種質(zhì)鑒定試劑及使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及海洋生物技術(shù)，具體地說是一種海帶種質(zhì)鑒定試劑及使用方法。
海帶是中國重要的經(jīng)濟(jì)海藻，目前，海帶的品種選育及雜交育種主要是靠感官上的性狀來進(jìn)行，但是，由于受環(huán)境條件的影響，海帶成體的性狀往往變化較大，因此，憑表觀等特征不能有效地鑒別種間、種內(nèi)的差異，也很難跟蹤某些性狀在后代的連續(xù)表現(xiàn)。從生產(chǎn)角度看，僅用感官指標(biāo)會(huì)引起盲目和混亂，因此，建立一套快速、有效的海帶種質(zhì)檢測(cè)技術(shù)十分必要。海帶種質(zhì)檢測(cè)方法有形態(tài)學(xué)水平即形態(tài)外表特征的鑒定，染色體水平即細(xì)胞中染色體鑒定，同工酶水平即生化蛋白質(zhì)大分子的鑒定，和近年來脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)水平的研究鑒定技術(shù)。
從分子標(biāo)記方法角度看，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)脫氧核糖核酸(RAPD)、限制性片斷長度多態(tài)性(RFLP)、擴(kuò)增片斷長度多態(tài)性(AFLP)、間隔簡單重復(fù)序列(ISSR)等技術(shù)不斷出現(xiàn)，這些高技術(shù)在藻類方面的應(yīng)用剛剛開始。國外已對(duì)海帶、紫菜、單細(xì)胞藻、馬尾藻、江籬屬的一些種，開展了分子遺傳標(biāo)記的研究，主要目的是闡述海藻的分子、生化水平的進(jìn)化關(guān)系。
海洋生物領(lǐng)域中的分子標(biāo)記技術(shù)，目前僅局限在RAPD、RFLP水平。RAPD方法雖然成本低，相對(duì)技術(shù)簡單，但實(shí)驗(yàn)室的可交流性差；RFLP方法要求的DNA質(zhì)量高，但要使用放射性同位素，具有一定危險(xiǎn)性。目前，國內(nèi)一些研究單位在DNA提取、擴(kuò)增反應(yīng)條件等方面，一般實(shí)驗(yàn)室主要采用RAPD技術(shù)作了探索，但隨引物、模板的差異其結(jié)果有較大的不同，可重復(fù)性差，難以形成統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，因此，受到許多限制，如果發(fā)明具有分子標(biāo)記作用的鑒定試劑，對(duì)經(jīng)濟(jì)海藻種質(zhì)檢測(cè)、雜交鑒定、病害診斷等可以進(jìn)行應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是提供一種能提高海帶種質(zhì)鑒定的特異性和標(biāo)準(zhǔn)性的海帶種質(zhì)鑒定試劑及使用方法，它具有可重復(fù)性、有效性，能在原有的RAPD擴(kuò)增基礎(chǔ)上，再進(jìn)一步使用ITS序列方法對(duì)海帶細(xì)胞系作更嚴(yán)格的鑒定。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是海帶種質(zhì)鑒定試劑，其組分為按濃度計(jì)，取三羥甲基氨基甲烷鹽酸(Tris.HCl)6～15mM，乙二胺四乙酸(Ethlenediaminetetra-acetic acid縮寫EDTA)1.8～2.2mM，氯化鈉(NaCl)1.2～1.5M；按體積百分比計(jì)，取1.5～2.5％十六烷基三甲基溴化銨(Cetyl trimethyl ammonium bromide)，1.5～2.5％十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate縮寫SDS)；所述三羥甲基胺基甲烷鹽酸pH值為8.0～8.3。
其使用方法，按如下步驟操作a.海帶配子體DNA的提取，海帶配子體研磨，離心，用所述試劑溶解液，在30～70℃保溫，60～75分鐘時(shí)間范圍內(nèi)裂解；用氯仿∶異戊醇抽提，上清液加入0.2～0.25倍于上清液體積的1.0～1.5％十二烷基硫酸鈉(SDS)水溶液和0.3～0.4倍于上清液體積的3.5～4.5M乙酸鉀(KAc)水溶液，置于冰中10～15分鐘，用氯仿∶異戊醇再抽提，上清液加入0.6～0.8倍于上清液體積的異丙醇水溶液，冰中置30～50分鐘，離心10～15分鐘；離心后試管里的沉淀物用70％乙醇洗1～3次，抽干，用0.8～1.3mL三羥甲基氨基甲烷乙二胺四乙酸(Tris.EDTA)緩沖液溶解沉淀；加2～3μl核糖核酸(RNA)酶，35～38℃保溫1～1.5小時(shí)，用等體積的氯仿∶異戊醇抽提1～3次，加0.1～0.3倍上清液體積的醋酸鈉水溶液，1.5～2.5倍上清液體積的無水乙醇，-4～-5℃沉淀，離心15～20分鐘；用70～80％乙醇清洗，抽干，用1～2倍于上清液體積的Tris.EDTA緩沖液溶解沉淀，取2～4μl脫氧核糖核酸(DNA)樣品在0.7～0.9％的瓊脂糖膠(Agarose)電泳，溴化乙錠(EtBr)染色，與標(biāo)準(zhǔn)Lamda DNA對(duì)照，估算DNA濃度；b.所述海帶配子體DNA的純化DNA粗提物，與350～550μl溶膠液、10～15μl玻璃奶(Glassmilk)混勻，冰上放置10～20分鐘，中間輕搖2～3次；離心30～50秒，去上清液，其沉淀用350～550μl漂洗液漂洗2～4次，吹干；用500～1000μl H2O或1～3倍于上清液體積的500～1000μl Tris.EDTA緩沖液在55～75℃范圍內(nèi)保溫5～10分鐘，離心1～3分鐘，上清液保存?zhèn)溆茫籧.RAPD反應(yīng)10μl反應(yīng)體積中含有50～65mM Tris.HCl，2～5mM氯化鎂(MgCl2)，0.2～0.5mM二磷酸多苷(DNTP)，0.7～1.0％富可400(Ficoll 400)，1～3mM酒石磺(Tartarzine)，3～6μm牛肉血壓清蛋白(BSA)，30～50ng引物，3～10ng模板DNA，0.5～0.8單位Taq聚合酶；多聚循環(huán)反應(yīng)(PCR)參數(shù)條件94℃60秒，退火38±2℃，10～15秒，72±2℃，15～22秒，2～5個(gè)循環(huán)；94℃2秒，退火38±2℃，10～15秒，72±2℃，60～70秒，35～45個(gè)循環(huán)；70～75℃保溫4～6分鐘；PCR反應(yīng)后，產(chǎn)物直接在1.5％Agarose膠上進(jìn)行電泳分離，然后，EtBr染色，紫外照相記錄結(jié)果；d.ITS(內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔序列)反應(yīng)及DNA測(cè)序0.7～1.0mM，10xPCR緩沖液，0.3～0.8mM二磷酸多苷dNTP，0.8～1.0％ Ficoll 400，10～40ng引物，5～10ng模板DNA，0.5～0.8單位Taq聚合酶，3～6μl蒸餾三次的水；ITS(內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔序列)反應(yīng)參數(shù)條件96℃1分鐘；94℃60秒，退火60±2℃，10～15秒，72±2℃，50～60秒，2～4個(gè)循環(huán)；94℃5～8秒，退火60±2℃，10～15秒，72±2℃，50～60秒，30～38個(gè)循環(huán)；70～75℃保溫4～6分鐘；擴(kuò)增產(chǎn)物用1％的Agarose電泳檢測(cè)，其電泳結(jié)果處理與PCR反應(yīng)相同，根據(jù)ABI DNA測(cè)序儀說明書的要求，進(jìn)行樣品處理及測(cè)序；所述氯仿∶異戊醇比例為24∶1；步驟a中所述醋酸鈉pH值在5.0～5.4范圍內(nèi)；所述Tris.HCl pH值在8.0～8.5范圍內(nèi)；所述dNTP為二磷酸腺苷(dATP)、二磷酸胞苷(dCTP)、二磷酸胸苷(dTTP)和二磷酸鳥苷(dGTP)；優(yōu)化反應(yīng)條件所述引物為ITS1、ITS4；所述EDTA的pH值在8.0～8.5范圍內(nèi)。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)由于本發(fā)明簡化了海帶DNA的提取步驟，采用Glassmilk進(jìn)行純化DNA，用PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化了反應(yīng)條件，同時(shí)使用ITS保守序列鑒定海帶，具有可重復(fù)性、穩(wěn)定性，鑒定效率高的特點(diǎn)。本發(fā)明屬分子標(biāo)記的商品試劑，可以應(yīng)用于海帶種質(zhì)鑒定，有效地區(qū)分海帶或非海帶材料，及海帶不同細(xì)胞系的差異，對(duì)海帶生產(chǎn)單位選擇育種有重要作用。另外，在區(qū)別具有同一感官特征的海帶配子體時(shí)，也可以進(jìn)行分子標(biāo)記鑒定，區(qū)別出具有不同遺傳背景的海帶細(xì)胞系，為海帶混雜的區(qū)分提供一種有效的方法。
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
實(shí)施例1海帶種質(zhì)鑒定試劑按濃度計(jì)，取11mmol L-1Tris.HCl，pH值為8.0，2.0mmol L-1EDTA，1.5M NaCl；按體積百分比計(jì)，取2.0％Cetyl trimethylammonium bromide，2.0％SDS。
所述試劑的使用具體操作如下
1.海帶配子體DNA的提取海帶配子體與硅膠及液氮混合研磨，研磨的粉末轉(zhuǎn)移到50mL離心管，通過含有15mL所述試劑溶解液，65℃保溫65min，將細(xì)胞充分裂解。用等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提1次，上清液加入0.2倍于上清液體積的1.0％SDS水溶液和1/3倍于上清液體積的4M KAc水溶液，置于冰中10分鐘，用等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提2次，上清液加入0.6倍于上清液體積的異丙醇水溶液，冰中置30分鐘，12000rpm離心15分鐘；離心后試管里的沉淀物用70％乙醇洗一次，抽干乙醇，用1mL Tris.EDTA緩沖液(10mM Tris HCl，pH8.0，1mM EDTA，pH8.0)溶解沉淀；加2μl RNA酶，在37℃情況下保溫1小時(shí)，用等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提1次，加0.1倍上清液體積的醋酸鈉水溶液(pH5.2)，2倍上清液體積的無水乙醇，-5℃沉淀2小時(shí)以上，12000rpm離心10分鐘；用70％乙醇洗一次，抽干除去多余的乙醇，用200μl、1倍于上清液體積的Tris.EDTA溶解沉淀，取2μl DNA樣品在0.8％的Agarose膠電泳，EtBr染色，與標(biāo)準(zhǔn)Lamda DNA對(duì)照，估算DNA濃度；2.用提純DNA試劑Glassmilk純化DNA在1.5ml Eppendorf管中加入100μl DNA粗提物，與400μl溶膠液、10μl Glassmilk混勻，冰上放置10分鐘，中間輕搖3次；1000rpm離心30秒，去上清液，其沉淀用350μl漂洗液漂洗3次，吹干；用500ulH2O漂洗，于60℃溫度下保溫5分鐘，12000rpm離心1分鐘，上清保存?zhèn)溆茫?br> 3.RAPD反應(yīng)10μl反應(yīng)體積中含有55mM Tris HCl(pH8.3)，2.0mM MgCl2，0.3mM dATP、0.3mMdCTP、0.3mM dTTP和0.3mM dGTP，0.8％Ficoll 400，2mM Tartarzine，3μm BSA，30ng引物ITS1、ITS4，5ng模板DNA，0.5單位Taq DNA聚合酶；多聚循環(huán)反應(yīng)(PCR)參數(shù)條件94℃60秒，退火38℃ 11秒，72℃ 18秒，3個(gè)循環(huán)；94℃2秒，退火38℃ 10秒，72℃ 65秒，36個(gè)循環(huán)；72℃保溫5分鐘；PCR反應(yīng)后，產(chǎn)物直接在1.5％ Agarose膠上進(jìn)行電泳分離，EtBr染色，紫外照相記錄結(jié)果；4.ITS(內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔序列)反應(yīng)及DNA測(cè)序0.8mM，10x PCR緩沖液、0.3mM dATP、0.3mM dCTP、0.3mM dTTP和0.3mM dGTP，0.8％ Ficoll 400，30ng引物ITS1、ITS4，5ng模板DNA，0.6單位Taq DNA聚合酶，5μl蒸餾三次的水；反應(yīng)參數(shù)條件96℃1分鐘；94℃60秒，退火60℃ 10秒，72℃ 60秒，2個(gè)循環(huán)；94℃5秒，退火60℃ 10秒，72℃ 60秒，32個(gè)循環(huán)；72℃保溫4分鐘；
擴(kuò)增產(chǎn)物用1％的Agarose電泳檢測(cè)，其電泳結(jié)果處理與PCR反應(yīng)相同，根據(jù)ABI DNA測(cè)序儀說明書的要求，進(jìn)行樣品的處理及測(cè)序。
實(shí)施例2海帶種質(zhì)鑒定試劑按濃度計(jì)，取8mmol L-1Tris.HCl，pH值為8.1，2.0mmol L-1EDTA，1.5M NaCl；按體積百分比計(jì)，取1.5％ Cetyl trimethylammonium bromide，1.5％ SDS。
所述試劑的使用具體操作如下1.海帶配子體DNA的提取海帶配子體及硅膠及液氮研磨，研磨的粉末轉(zhuǎn)移到50mL離心管，通過含有15mL所述試劑溶解液，50℃保溫60min，將細(xì)胞充分裂解。用等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提1次，上清液加入0.23倍于上清液體積的1.0％ SDS水溶液和0.36倍于上清液體積的3.5M KAc水溶液，置于冰中13分鐘，用等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提2次，加入0.8倍于上清液體積的異丙醇水溶液，冰中置40分鐘，12000rpm離心15分鐘；離心后試管里的沉淀物用70％乙醇洗2次，抽干乙醇，用0.8mL Tris.EDTA緩沖液(10mM Tris HCl，pH8.5，1mM EDTA，pH8.2)溶解沉淀；加2.5μl RNA酶，在38℃情況下保溫1.5小時(shí)，用等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提2次，加0.2倍于上清液體積的醋酸鈉水溶液(pH5.0)，1.5倍于上清液體積的無水乙醇，-5℃沉淀2小時(shí)以上，12000rpm離心18分鐘；用75％乙醇洗一次，抽干乙醇，用300μl、1.5倍于上清液體積的Tris.EDTA溶解沉淀，取3μl DNA樣品在0.7％的Agarose膠電泳，EtBr染色，與標(biāo)準(zhǔn)Lamda DNA對(duì)照，估算DNA濃度；2.用提純DNA試劑Glassmilk純化DNA在1.5ml Eppendorf管中加入100μl DNA粗提物，與450μl溶膠液、12μl Glassmilk混勻，冰上放置15分鐘，中間輕搖2次；1000rpm離心40秒，去上清液，其沉淀用450μl漂洗液漂洗3次，吹干；用2倍于上清液體積的1000μl Tris.EDTA漂洗，在55℃溫度下保溫8分鐘，12000rpm離心2分鐘，上清液保存?zhèn)溆茫?.RAPD反應(yīng)10μl反應(yīng)體積中含有60mM Tris HCl(pH8.5)，3mM MgCl2，0.5mM dATP、0.5mM dCTP、0.5mM dTTP和0.5mM dGTP，1.0％Ficoll 400，2mM Tartarzine，4μmBSA，35ng引物ITS1、ITS4，8ng模板DNA，0.6單位Taq DNA聚合酶；多聚循環(huán)反應(yīng)(PCR)參數(shù)條件94℃60秒，退火38℃ 10秒，72℃ 20秒，5個(gè)循環(huán)；94℃2秒，退火38℃ 10秒，72℃ 70秒，36個(gè)循環(huán)；72℃保溫5分鐘；PCR反應(yīng)后，產(chǎn)物直接在1.5％ Agarose膠上進(jìn)行電泳分離，EtBr染色，紫外照相記錄結(jié)果。
4.ITS(內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔序列)反應(yīng)及DNA測(cè)序0.8mM，10x PCR緩沖液、0.4mM dATP、0.4mM dCTP、0.4mM dTTP和0.4mM dGTP，1.0％ Ficoll 400，40ng引物ITS1、ITS4，10ng模板DNA，0.7單位Taq DNA聚合酶，5μl蒸餾三次的水；反應(yīng)參數(shù)條件96℃1分鐘；94℃60秒，退火60℃ 11秒，72℃ 50秒，4個(gè)循環(huán)；94℃8秒，退火60℃ 10秒，72℃ 60秒，30個(gè)循環(huán)；70℃保溫6分鐘；擴(kuò)增產(chǎn)物用1％的Agarose電泳檢測(cè)，其電泳結(jié)果處理與PCR反應(yīng)相同，根據(jù)ABI DNA測(cè)序儀說明書的要求，進(jìn)行樣品的處理及測(cè)序。
本發(fā)明應(yīng)用于大連海帶養(yǎng)殖所使用配子體的篩選及鑒定試驗(yàn)，有效地鑒別出良種海帶，并對(duì)混雜的海帶可以有效地區(qū)分。
實(shí)施例3海帶種質(zhì)鑒定試劑按濃度計(jì)，取8mmol L-1Tris.HCl，pH值為8.3，2.0mmol L-1EDTA，1.4M NaCl，按體積百分比計(jì)，取2.5％ Cetyl trimethylammonium bromide，2.5％ SDS。
所述試劑的使用具體操作如下1.海帶配子體DNA的提取海帶配子體及硅膠及液氮研磨，研磨的粉末轉(zhuǎn)移到50mL離心管，通過含有15mL所述試劑溶解液，35℃保溫60min，將細(xì)胞充分裂解。用等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提1次，上清液加入0.25倍于上清液體積的1.5％SDS水溶液和0.3倍于上清液體積的4.0M KAc水溶液，置于冰中15分鐘，用等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提2次，上清液加入0.7倍于上清液體積的異丙醇水溶液，冰中置50分鐘，12000rpm離心13分鐘；離心后試管里的沉淀物用70％乙醇洗3次，抽干乙醇，用1.2mL Tris.EDTA緩沖液(10mM Tris HCl，pH8.2，1mM EDTA，pH8.5)溶解沉淀；加3μl RNA酶，在35℃情況下保溫1.5小時(shí)，用等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提3次，加0.3倍于上清液體積的醋酸鈉水溶液(pH5.4)，2.5倍于上清液體積的無水乙醇，-5℃沉淀2小時(shí)以上，12000rpm離心20分鐘；用80％乙醇洗一次，抽干乙醇，用300μl、1倍于上清液體積的Tris.EDTA溶解沉淀，取4μl DNA樣品在0.9％的Agarose膠電泳，EtBr染色，與標(biāo)準(zhǔn)Lamda DNA對(duì)照，估算DNA濃度；2.用提純DNA試劑Glassmilk純化DNA在1.5ml Eppendorf管中加入100μl DNA粗提物，與400μl溶膠液、10μl Glassmilk混勻，冰上放置20分鐘，中間輕搖3次；1000rpm離心50秒，去上清液，其沉淀用400μl漂洗液漂洗3次，吹干；用700μl的H2O漂洗，于70℃溫度下保溫10分鐘，12000rpm離心3分鐘，上清液保存?zhèn)溆茫?.RAPD反應(yīng)10μl反應(yīng)體積中含有60mM Tris HCl(pH8.0)，5mM MgCl2，0.3mM dATP、0.3mM dCTP、0.3mM dTTP和0.3mM dGTP，0.9％ Ficoll 400，3mM Tartarzine，5μmBSA，40ng引物，10ng模板DNA，0.7單位Taq DNA聚合酶；多聚循環(huán)反應(yīng)(PCR)參數(shù)條件
94℃60秒，退火38℃ 10秒，72℃ 15秒，2個(gè)循環(huán)；94℃2秒，退火38℃ 10秒，72℃ 60秒，35個(gè)循環(huán)；72℃保溫5分鐘；PCR反應(yīng)后，產(chǎn)物在1.5％ Agarose膠上進(jìn)行電泳分離，EtBr染色，紫外照相記錄結(jié)果；4.ITS(內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔序列)反應(yīng)及DNA測(cè)序0.7mM，10x PCR緩沖液、0.4mM dATP、0.4mM dCTP、0.4mM dTTP和0.4mM dGTP，1.0％ Ficoll 400，20ng引物ITS1、ITS4，8ng模板DNA，0.5單位Taq DNA聚合酶，5μl蒸餾三次的水；反應(yīng)參數(shù)條件96℃1分鐘；94℃60秒，退火60℃ 10秒，72℃ 50秒，3個(gè)循環(huán)；94℃5秒，退火60℃ 10秒，72℃ 60秒，30個(gè)循環(huán)；75℃保溫5分鐘；擴(kuò)增產(chǎn)物用1％的Agarose電泳檢測(cè)，其電泳結(jié)果處理與PCR反應(yīng)相同，根據(jù)ABI DNA測(cè)序儀說明書的要求，進(jìn)行樣品的處理及測(cè)序。
本發(fā)明在對(duì)山東海帶養(yǎng)殖種質(zhì)的篩選試驗(yàn)中，有效地鑒別出生產(chǎn)使用的海帶配子體，并區(qū)分出海帶的目標(biāo)種質(zhì)資源。
權(quán)利要求
1.一種海帶種質(zhì)鑒定試劑，其特征在于組分為按濃度計(jì)，取三羥甲基氨基甲烷鹽酸6～15mM，乙二胺四乙酸1.8～2.2mM，氯化鈉1.2～1.5M；按體積百分比計(jì)，取1.5～2.5％十六烷基三甲基溴化銨，1.5～2.5％十二烷基硫酸鈉。
2.按照權(quán)利要求1所述海帶種質(zhì)鑒定試劑，其特征在于所述三羥甲基胺基甲烷鹽酸pH值為8.0～8.3。
3.一種按照權(quán)利要求1所述海帶種質(zhì)鑒定試劑的使用方法，其特征在于按如下步驟操作a.海帶配子體脫氧核糖核酸的提取海帶配子體研磨，離心，用所述試劑溶解液，在30～70℃保溫，60～75分鐘時(shí)間范圍內(nèi)裂解；用氯仿∶異戊醇抽提，上清液加入0.20～0.25倍于上清液體積的1.0～1.5％十二烷基硫酸鈉水溶液和0.3～0.4倍于上清液體積的3.5～4.0M乙酸鉀水溶液，置于冰中10～15分鐘，用氯仿∶異戊醇再抽提，上清液加入0.6～0.8倍于上清液體積的異丙醇水溶液，冰中置30～50分鐘，離心10～15分鐘；離心后試管里的沉淀物用70％乙醇清洗1～3次，抽干，用0.8～1.3mL三羥甲基氨基甲烷乙二胺四乙酸緩沖液溶解沉淀；加2～3μl核糖核酸酶，35～38℃保溫1～1.5小時(shí)，用等體積的氯仿∶異戊醇抽提1～3次，加0.1～0.3倍于上清液體積的醋酸鈉水溶液，1.5～2.5倍于上清液體積的無水乙醇，-4～-5℃沉淀，離心15～20分鐘；用70～80％乙醇清洗，抽干，用1～2倍于上清液體積的三羥甲基氨基甲烷乙二胺四乙酸緩沖液溶解沉淀，取2～4μl脫氧核糖核酸樣品在0.7～0.9％的瓊脂糖膠電泳，溴化乙錠染色，與標(biāo)準(zhǔn)Lamda脫氧核糖核酸對(duì)照，估算脫氧核糖核酸濃度；b.所述海帶配子體脫氧核糖核酸的純化脫氧核糖核酸粗提物，與350～500μl溶膠液、10～15μl玻璃奶混勻，冰上放置10～20分鐘，中間輕搖2～3次；離心30～50秒，去上清液，其沉淀用350～550μl漂洗液漂洗2～4次，吹干；用500～1000μlH2O或1～3倍于上清液體積的500～1000μl三羥甲基氨基甲烷乙二胺四乙酸緩沖液在55～75℃范圍內(nèi)保溫5～10分鐘，離心1～3分鐘，上清液保存?zhèn)溆茫籧.隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)脫氧核糖核酸反應(yīng)10μl反應(yīng)體積中含有50～65mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸，2～5mM氯化鎂，0.2～0.5mM二磷酸多苷，0.7～1.0％富可400，1～3mM酒石磺，3～6μm牛肉血壓清蛋白，30～50ng引物，3～10ng模板脫氧核糖核酸，0.5～0.8單位Taq聚合酶；多聚循環(huán)反應(yīng)參數(shù)條件94℃ 60秒，退火38±2℃，10～15秒，72±2℃，15～22秒，2～5個(gè)循環(huán)；94℃ 2秒，退火38±2℃，10～15秒，72±2℃，60～70秒，35～45個(gè)循環(huán)；70～75℃保溫4～6分鐘；多聚循環(huán)反應(yīng)反應(yīng)后，產(chǎn)物直接在1.5％瓊脂糖膠上進(jìn)行電泳分離，溴化乙錠染色，紫外照相記錄結(jié)果；d.內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔序列反應(yīng)及脫氧核糖核酸測(cè)序0.7～1.0mM，10x反應(yīng)緩沖液，0.3～0.8mM二磷酸多苷，0.8～1.0％富可400，10～40ng引物，5～10ng模板脫氧核糖核酸，0.5～0.8單位Taq聚合酶，3～6μl蒸餾三次的水；內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔序列反應(yīng)參數(shù)條件96℃1分鐘；94℃60秒，退火60±2℃，10～15秒，72±2℃，50～60秒，2～4個(gè)循環(huán)；94℃5～8秒，退火60±2℃，10～15秒，72±2℃，50～60秒，30～38個(gè)循環(huán)；70～75℃保溫4～6分鐘；擴(kuò)增產(chǎn)物用1％的瓊脂糖膠電泳檢測(cè)，其電泳結(jié)果處理與多聚循環(huán)反應(yīng)相同，根據(jù)DNA測(cè)序儀說明書的要求，進(jìn)行樣品的處理及測(cè)序。
4.按照權(quán)利要求3所述海帶種質(zhì)鑒定試劑的使用方法，其特征在于所述氯仿∶異戊醇比例為24∶1。
5.按照權(quán)利要求3所述海帶種質(zhì)鑒定試劑的使用方法，其特征在于步驟a中所述醋酸鈉pH值在5.0～5.4范圍內(nèi)。
6.按照權(quán)利要求3所述海帶種質(zhì)鑒定試劑的使用方法，其特征在于所述三羥甲基氨基甲烷鹽酸pH值在8.0～8.5范圍內(nèi)。
7.按照權(quán)利要求3所述海帶種質(zhì)鑒定試劑的使用方法，其特征在于所述二磷酸多苷為二磷酸腺苷、二磷酸胞苷、二磷酸胸苷和二磷酸鳥苷。
8.按照權(quán)利要求3所述海帶種質(zhì)鑒定試劑的使用方法，其特征在于優(yōu)化反應(yīng)條件所述引物為ITS1、ITS4。
9.按照權(quán)利要求3所述海帶種質(zhì)鑒定試劑的使用方法，其特征在于所述乙二胺四乙酸pH值在8.0～8.5范圍內(nèi)。
全文摘要
一種海帶種質(zhì)鑒定試劑及使用方法。試劑組分為按濃度計(jì)，三羥甲基氨基甲烷鹽酸6～15mM，乙二胺四乙酸1.8～2.2mM，氯化鈉1.2～1.5M；按體積百分比計(jì)，1.5～2.5％十六烷基三甲基溴化銨，1.5～2.5％二烷基硫酸鈉；使用方法是通過海帶配子體DNA提取、玻璃奶技術(shù)路線純化DNA，得高純度海帶DNA；PCR擴(kuò)增、RAPD檢測(cè)，得初級(jí)鑒定圖譜；使用ITS鑒定技術(shù)，可以對(duì)海帶不同細(xì)胞系的分析，得到清晰和重復(fù)的多態(tài)圖譜。使用純化后的模板DNA，其擴(kuò)增產(chǎn)物反應(yīng)重復(fù)性高，可有效鑒定海帶種質(zhì)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1393566SQ0111419
公開日2003年1月29日 申請(qǐng)日期2001年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月4日
發(fā)明者段德麟, 赫英俊, 夏鵬 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院海洋研究所