專利名稱：用酵母分泌表達(dá)重組水蛭素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬醫(yī)藥領(lǐng)域中的重組蛋白質(zhì)藥物。
水蛭素是由65或66個(gè)氨基酸殘基組成的低分子量的單鏈多肽，在醫(yī)用水蛭的唾液腺體中合成。研究表明，水蛭素是作用很強(qiáng)的凝血酶特異性抑制劑，具有抗凝、抗血栓等藥理作用。對(duì)多種具有高凝狀態(tài)的疾病療效良好。藥理學(xué)及臨床研究表明，水蛭素能有效地預(yù)防和治療靜、動(dòng)脈血栓的形成及彌散性內(nèi)血管凝結(jié)，是一種很有前途的溶栓藥物。但由于醫(yī)用水蛭來(lái)源有限，直接從中大量分離水蛭素供給治療需要是不可能的。隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的發(fā)展，使用基因工程方法合成大量重組水蛭素得以實(shí)現(xiàn)。
由于水蛭素分子量較小，且包含多對(duì)二硫鍵，用大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)其產(chǎn)量受限制。為了提高重組水蛭素的表達(dá)產(chǎn)率，我們用甲醇營(yíng)養(yǎng)酵母Pichia methanolica來(lái)分泌表達(dá)重組水蛭素。
本發(fā)明的原理是甲醇營(yíng)養(yǎng)酵母可以高效地表達(dá)酵母表達(dá)質(zhì)粒上的外源基因并將表達(dá)的外源蛋白分泌至細(xì)胞壁外的培養(yǎng)基中。這樣的表達(dá)產(chǎn)物具天然蛋白結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性。
本發(fā)明的目的使用甲醇營(yíng)養(yǎng)酵母高效表達(dá)重組水蛭素并使表達(dá)產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中，以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)正確、活性高的重組水蛭素產(chǎn)品，提高產(chǎn)率，降低生產(chǎn)成本。
技術(shù)方案水蛭素基因人工合成→表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建→轉(zhuǎn)化Pichiamethanolica→發(fā)酵表達(dá)→培養(yǎng)液分離→粗產(chǎn)物分離→二步層析純化→超濾濃縮→除菌過(guò)濾→制劑分裝→成品凍干。經(jīng)上述步驟，即可制備得到純度大于99％，比活性高于6800ATU/mg蛋白的重組水蛭素。
最佳實(shí)施例先用化學(xué)合成的方法合成全長(zhǎng)的水蛭素基因HV2。經(jīng)DNA序列測(cè)定證實(shí)其序列正確后，插入酵母表達(dá)質(zhì)粒pMETA。所構(gòu)建成的表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)酶切分析正確后，轉(zhuǎn)化入甲醇營(yíng)養(yǎng)酵母，即得到水蛭素的酵母工程菌。該工程菌在酵母培養(yǎng)基中生長(zhǎng)、誘導(dǎo)、表達(dá)，再將發(fā)酵液離心后，取上清液，加入(NH4)2SO4至50-80％飽和度，使分泌的重組水蛭素沉淀下來(lái)，將沉淀離心后溶于50mM PB，經(jīng)S-200分子篩柱層析和DEAE-Sepharose離子交換層析二步層析純化，即得到純度＞99％，比活性高于6800ATU/mg的重組水蛭素純品。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明提供了一種用酵母分泌表達(dá)具天然結(jié)構(gòu)和生物活性的重組水蛭素的新型工藝方法。它與傳統(tǒng)的大腸桿菌表達(dá)體系相比具有以下優(yōu)點(diǎn)①表達(dá)產(chǎn)率高②熱源性物質(zhì)減少③培養(yǎng)基簡(jiǎn)單、價(jià)廉④產(chǎn)物具天然結(jié)構(gòu)和生物活性，無(wú)需破菌或裂解。上述優(yōu)勢(shì)使本發(fā)明具有明顯的技術(shù)創(chuàng)新性與工藝先進(jìn)性，產(chǎn)率提高，成本降低，較適合于工業(yè)化生產(chǎn)重組水蛭素。
權(quán)利要求
1.用酵母分泌表達(dá)重組水蛭素。其特征在于表達(dá)用酵母為甲醇營(yíng)養(yǎng)酵母Pichia methanolica。
2.如權(quán)利要求1所述的重組水蛭素表達(dá)工程酵母的構(gòu)建。其特征在于水蛭素基因插入酵母表達(dá)載體如pMETA，B，C，將此表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化甲醇營(yíng)養(yǎng)酵母，即構(gòu)建成重組水蛭素表達(dá)工程酵母。
3.如權(quán)利要求1所述的重組水蛭素的分泌表達(dá)。其特征在于重組水蛭素在酵母中表達(dá)后可以有效地分泌至培養(yǎng)基中。
4.重組水蛭素的分離和純化。其特征在于經(jīng)過(guò)培養(yǎng)液分離、硫酸銨沉淀、分子篩層析、陰離子交換層析等步驟，獲得高純度、高比活的重組水蛭素。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用甲醇營(yíng)養(yǎng)酵母分泌表達(dá)重組水蛭素的新型工藝方法。將合成的水蛭素基因放入酵母的表達(dá)質(zhì)粒中,轉(zhuǎn)化酵母后經(jīng)分泌表達(dá)和一系列純化步驟,可以制備得到高純度、高比活性的重組水蛭素。
文檔編號(hào)C12P21/02GK1371994SQ0110780
公開日2002年10月2日 申請(qǐng)日期2001年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月20日
發(fā)明者王革 申請(qǐng)人:王革