專利名稱：IgG Fab－BPI融合蛋白質(zhì)及其DNA序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于用在抗人體細(xì)菌感染的融合蛋白質(zhì)，即IgG Fab-BPI融合蛋白質(zhì)，及編碼這種融合蛋白質(zhì)的DNA序列。
抗體LPS mAb一般都具有一定的中和LPS作用(Zigler，J infect Disl988；158(2)286-290)，但是，由于細(xì)菌LPS的種屬差異和內(nèi)源異質(zhì)性，多數(shù)mAb只能中和免疫用LPS和/或與其相近種屬細(xì)菌的LPS，而且少有保護(hù)作用(Mine，Km，Infect Immun 1996；52(1)56-62；Mutharia LM，Ingect Immun1984；45631-636；Brade L，Infect Immun 1987；55462-486)。
對(duì)于本發(fā)明特別有意義的報(bào)道之一是用LPS-HDL(脂多糖-高密度脂蛋白)復(fù)合物鑒定多株抗LPS mAb的交叉反應(yīng)性(Heumann D，J Infect Dis.1991；163762-768)，該研究表明大多數(shù)抗LPS mAb缺乏與之的交叉反應(yīng)性，經(jīng)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，LPS-HDL是不同細(xì)菌LPS在人體內(nèi)代謝的共同產(chǎn)物，純化的LPS約90％形成LPS-HDL復(fù)合物，細(xì)菌外膜碎片中50％以上的LPS形成LPS-HDL復(fù)合物，完整的細(xì)菌外膜和完整的細(xì)菌則分別有20％和10％的LPS形成LPS-HDL(焦炳華，《分子內(nèi)毒素學(xué)》，上?？茖W(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社1995)。而LPS-HDL依然有完整的LPS致休克和DIC的生物學(xué)活性，可見LPS-HDL是內(nèi)毒素致病的關(guān)鍵因素之一。目前未發(fā)現(xiàn)用LPS-HDL制備內(nèi)毒素抗體的研究。
殺菌/通透性增強(qiáng)蛋白(BPI)是人多形核粒細(xì)胞嗜天青顆粒中的一種陽(yáng)離子蛋白質(zhì)，具有與細(xì)菌LPS結(jié)合從而增強(qiáng)革蘭氏陰性菌通透性的作用，是十分有效的內(nèi)源性殺菌物質(zhì)(Ooi J Biol Chem 1987；26214891-94)。BPI結(jié)合LPS也具有中和游離LPS的作用(Weiss，Blood 1987；69(2)652-659)。BPI結(jié)合LPS的部位在其N-端，精確地說(shuō)是在第65-99位氨基酸。但其與LPS的結(jié)合能力是有限的，即對(duì)粗糙型LPS有較好的結(jié)合作用，對(duì)光滑型的LPS的結(jié)合能力則隨著LPS特異性多糖鏈的加長(zhǎng)而降低(Elasbach P et al.Basic Principlesand clinical corelates.1992；2603-636)。
BPI N端因表達(dá)產(chǎn)物的分子量約25Kba，半衰期短，需粘附于大分子物質(zhì)才能較好地發(fā)揮作用(Dahlberg PS，et al.J Surg Ras 1996，63(1)44-48)。
與BPI具有高度同源性的LPS結(jié)合人體內(nèi)存在的蛋白(LBP)是一種可溶性的血液內(nèi)成分，但其作用是加強(qiáng)LPS的解聚，增強(qiáng)其毒性(Marra M etal.Gritical care Medicine，1994；22(4)553-564)。從而致使BPI在應(yīng)用中出現(xiàn)以下情況LPS攻擊小鼠同時(shí)注入BPL，保護(hù)效率達(dá)90-95％；LPS攻擊小鼠1小時(shí)后注入BPI，保護(hù)效率僅50％，2小時(shí)后注入，則為0?？梢妼PI用于臨床實(shí)踐，尚需克服LBP對(duì)BPI的競(jìng)爭(zhēng)抑制作用，單純應(yīng)用BPI不能很好抑制體內(nèi)毒素對(duì)人體侵害。
對(duì)于本發(fā)明特別有意義的報(bào)道之二是重組合成包括抗腫瘤IgG抗原結(jié)合部分為融合的第一成分，和以白細(xì)胞介素(粘附分子)為第二融合成分的雜交融合蛋白質(zhì)。Fell HP et al.J Lmmun 1991；146(7)2446-2452中敘述了IL-2/IgG融合蛋白的合成，其主要目的是以IgG Fab段結(jié)合于抗原成份，通過(guò)IL-2吸引粘附于單核巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)單核巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的吞噬和殺傷。
對(duì)于本發(fā)明有特別意義的報(bào)道之三，是重組合成包含BPI結(jié)合LPS為第一融合成份，和以IgG Fc段為第二融合成分的雜交融合蛋白(專利號(hào)NO93109046；Dahberg PS，et al.Arch Surg；1996；1311173-1177).首先其選用IgG的成份為恒定區(qū)，目的是增強(qiáng)單核巨噬細(xì)胞等對(duì)BPI結(jié)合LPS抗原的吞噬作用而不是起中和LPS抗原作用；其次，該IgG雖是一種mAb，其制備不是用LPS-HDL篩選出。所以，其融合蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物不具有廣譜、強(qiáng)的中和內(nèi)毒素和殺菌作用。
本發(fā)明的目的是提供一種IgG Fab-BPI融合蛋白質(zhì)及其DNA序列，它是在制備了廣譜抗內(nèi)毒素(LPS)的單克隆抗體(mAb)的基礎(chǔ)上，將該抗體(免疫球蛋白IgG1)的Fab段(VH、Chl、VL、CkHinge)基因與白細(xì)胞中分離得到的殺菌通透性增強(qiáng)蛋白(BPI)N端1-629，或205-225位的基因融合，表達(dá)于真核細(xì)胞，所得融合蛋白表達(dá)產(chǎn)物具有廣譜、強(qiáng)大的中和內(nèi)毒素和殺菌作用，可用于人體革蘭氏陰性菌感染疾病的治療。
本目的以下列技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)該IgG Fab-BPI融合蛋白質(zhì)，是由抗體IgG1與增強(qiáng)蛋白BPI(N)端的基因融合而成，在其氨基(N)端有抗體IgG1的重鏈和輕鏈；在其羧基(C)端有BPI蛋白質(zhì)或BPI蛋白質(zhì)生物學(xué)活性片段，所述的抗體IgG1是一種廣譜抗內(nèi)毒素LPS的單克隆抗體(mAb)。其中所述的抗體IgG1的重鏈包括有重鏈可變區(qū)和重鏈恒定區(qū)；抗體IgG1的輕鏈包括有輕鏈可變區(qū)和輕鏈恒定區(qū)。IgG1的重鏈恒定區(qū)是CH1；輕鏈恒定區(qū)是CK。其中所述融合的BPI N端基因主要指1～629，或205～225位。在BPI蛋白質(zhì)與IgC1之間還包括有IgG1的絞鏈區(qū)和一個(gè)15個(gè)氨基酸的連接片段。所述BPI蛋白質(zhì)是由208個(gè)氨基酸或55個(gè)氨基酸組成。
IgG Fab-BPI融合蛋白質(zhì)的DNA序列，該DNA序列包括抗體IgG1的重鏈序列和輕鏈序列；DNA序列還包括有蛋白質(zhì)BPI的1～208個(gè)氨基酸殘基的編碼序列和BPI的68～122個(gè)氨基酸殘基的編碼序列。
IgG Fab-BPI融合蛋白是兩種抗LPS物質(zhì)的組合，相互彌補(bǔ)了各自的缺點(diǎn)，而有益于各自抗LPS作用優(yōu)點(diǎn)的充分發(fā)揮。顯而易見，本發(fā)明的IgG1選擇的是Fab段，目的是增加融合蛋白對(duì)各種革蘭氏陽(yáng)性菌LPS的中和，所以具有廣譜的抗LPS的作用，彌補(bǔ)了BPI的交叉反應(yīng)局限性，且提高了融合蛋白對(duì)LBP的競(jìng)爭(zhēng)抑制作用，延長(zhǎng)了半衰期BPI則由于其強(qiáng)大的中和LPS作用，而提高了融合蛋白的抗LPS和殺菌能力?？偟膩?lái)說(shuō)，該融合蛋白將不受發(fā)病時(shí)間、條件的限制，成為能廣泛應(yīng)用的有積極效果的抗革蘭氏陰性菌感染的新型藥物。
本發(fā)明在按照該融合蛋白質(zhì)的組成結(jié)構(gòu)在制備過(guò)程編碼了這種蛋白質(zhì)的DNA序列，即IgG的重鏈序列、輕鏈序列、蛋白質(zhì)BPI 1-208氨基酸序列、BPI55個(gè)氨基酸序列。
本發(fā)明所得的抗LPS mAb屬免疫球蛋白IgG1型，F(xiàn)ab段(VH、CH1、VL、Cr)包含完整抗體的抗原結(jié)合部位和部分恒定區(qū)，是具有良好的抗原結(jié)合能力的小分子抗體，一方面具有較長(zhǎng)的半衰期，且易于穿過(guò)胎盤，另一方面不易由于鼠源性而致使人體對(duì)其產(chǎn)生免疫排斥。IgG1是用LPS-HDL篩選出的廣譜抗LPS免疫球蛋白，在實(shí)驗(yàn)方案中選擇包含VH、CH1、V1、CK、Hinge基因，以及自行合成的16個(gè)氨基酸的Linker基因，作為融合蛋白的第一融合成份。
殺菌、通透性增強(qiáng)蛋白(BPI)是人多形核粒細(xì)胞嗜天青顆粒中的一種陽(yáng)離子蛋白質(zhì)，具有與細(xì)菌LPS結(jié)合從而增強(qiáng)革蘭氏陰性菌透性的作用，是十分有效的內(nèi)源性殺菌物質(zhì)。同時(shí)，BPI也具有中和游離LPS的作用。在本發(fā)明中BPI結(jié)合LPS的部位在其N端。在它的一個(gè)優(yōu)選方案中，BPI基因?yàn)榈?-629個(gè)堿基，其中包含了BPI的3個(gè)功能區(qū)，即第一結(jié)構(gòu)域(第17-45位氨基酸)；第二結(jié)構(gòu)域(第65-99位氨基酸)；第三結(jié)構(gòu)域(第142-169位氨基酸)。在另一優(yōu)選方案中，BPI基因?yàn)?05-225堿基，即包含BPI的第二個(gè)功能區(qū)(第65-99位氨基酸)。
本發(fā)明還提供克隆各個(gè)基因成份和表達(dá)該融合基因的合適載體以及宿主細(xì)胞，IgG的輕鏈基因可插入到含重鏈BPI融合基因的表達(dá)載體中，并在宿主細(xì)胞中表達(dá)，自行完成與重鏈氨基酸的組合折疊，形成完整的融合蛋白質(zhì)。
下面結(jié)合本發(fā)明的第一個(gè)優(yōu)選方案、第二個(gè)優(yōu)選方案分別詳細(xì)列舉出該IgGFab-BPI融合蛋白質(zhì)制備的具體實(shí)施例，及構(gòu)建表達(dá)本發(fā)明各種IgG Fab-BPI融合蛋白質(zhì)的DNA序列。
實(shí)施例11、內(nèi)毒素-高密度脂蛋白復(fù)合物(LPS-HDL)的制備取新鮮血漿(含20mMEDTA)3ml，加入100ug LPS，37℃I溫育1h，加入3ml KBr(d=1.06)，65000rpm離心2.5小時(shí)，取上清2ml，裝入透析袋，于1000ml透析液(75Mm Tris，150Mm NaCL，0.1EDTA)中浸泡24小時(shí)，經(jīng)透析去掉KBr后備用。
2、抗LPS McAb的制備:
分別以熱殺死的E.coli J5菌體2×108和LPS 30ug、福氏完全佐劑750ul混合，8周齡BALB/c鼠背部皮下多點(diǎn)注射；第二周起，每周皮下注射E.coli J5熱殺死菌體2×108和LPS 30ug、福氏不完全佐劑750ul混合，共4次。處死小鼠，取脾細(xì)胞1×108，與1×107骨髓瘤細(xì)胞(S/P20)混合，加入PEG40001ml融合，加入1％HAT培養(yǎng)液40ml，鋪于96孔板培養(yǎng)，每孔100ml，37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
取LPS-HDL，以PBS稀釋50倍，和LPS(10ug/ml)，分別包被酶聯(lián)板，用ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞陽(yáng)性孔上清，ABTS顯色，測(cè)定410nm OD值。選擇OD值＞2×OD對(duì)照孔細(xì)胞的細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)。獲得雜交瘤細(xì)胞株C3A2。
3、C3A2單克隆抗體Fab段基因的克隆取雜交瘤細(xì)胞株C3A2細(xì)胞1×107，用TriZol試劑(GIBCO公司)裂解細(xì)胞，提取RNA。經(jīng)RT-PCR方法分別擴(kuò)增出IgG重鏈和輕鏈基因片斷。
擴(kuò)增重鏈的引物是back-AT GGA TCC ATG GCC(GC)AG GT(GC)(AC)A(AG)CTC CAG(GC)AG TC(AT)GG，for-TGC TCDT AGA TCA AGG CTT ACTAGT ACA ATC CCT GGG CAC AAT，擴(kuò)增片斷690bp，擴(kuò)增條件為97℃10分鐘，94℃1分鐘，58℃1分鐘，72℃1分鐘，32次循環(huán)后，72℃延伸5分鐘。
擴(kuò)增輕鏈的引物是back-CG AAT TCC ATG GCA GAC ATT(GC)(AT)TG AC(GC)CAG TCT CCA，for-C TCG CTC GAG TTA ACA CTC ATT CCT GTT GAA GC，擴(kuò)增片斷為720bp，擴(kuò)增條件為97℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，32次循環(huán)后，72℃延伸5分鐘。
分別將重鏈和輕鏈基因擴(kuò)增產(chǎn)物與PGEM-T easy載體(Promeg Corporation)連接，轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌，經(jīng)IPTG和X-ga1篩選，挑取白色克隆，提取質(zhì)粒，分別以BamH Ⅰ+Xba Ⅰ和EcoR Ⅰ+Xho Ⅰ進(jìn)行酶切鑒定，確認(rèn)重組正確后，用T7和SSP6測(cè)序引物分別從5’和3’端進(jìn)行自動(dòng)測(cè)序，測(cè)序反應(yīng)由ABI377自動(dòng)測(cè)序儀完成。分別命名為PGEM-Fd和PGEM-L。
4、人殺菌/通透性增強(qiáng)蛋白(BPI)N端基因的克隆分離人外周血多形核粒細(xì)胞，用Trizol提取總RNA，以oligo(dt)15為引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以套式PCR方法擴(kuò)增BPI第25到749個(gè)堿基的DNA片段。第一輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)液組成；10×PCR緩沖液5ul，25mmol/L MGCL24ul。10mmol/L dNTP 2ul，50pmol/L外引物各1ul，3UTaq酶，5ulcDNA，加水至50ul。擴(kuò)增條件為94℃1min，58℃1min，72℃1min，32個(gè)循環(huán)，然后72℃延伸10min。第二輪PCR以第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物5ul為模板，換以內(nèi)引物擴(kuò)增，基它反應(yīng)物組成和反應(yīng)條件同第一輪。(外引物)back-TTG AGG TTT TGG CAG CTC TGG，for-AAA GGG AGG TGG ATT GTG G；內(nèi)引物back-AT GGA TCC TGG AGG ATG AGA GAGAAG ATG CT，for-AT TCT AGA CCA TAG TTA GAT TCC AGC CAC)。
PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收后，連接到PGEM-Teasy載體，轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌，挑取陽(yáng)性克隆，用Wizard plusDNA純化試劑盒提取重組質(zhì)粒，用Bam HI和Xbal酶切鑒定。確認(rèn)重組正確后，用T7 SP6測(cè)序引物分從5’和3’端進(jìn)行自動(dòng)測(cè)序，測(cè)序反應(yīng)由ABI377自動(dòng)測(cè)序儀完成。命名為PGEM-BPI。
5、BPI-IgG真核表達(dá)載體的構(gòu)建以EcoR Ⅰ分別消化PGEM-FD和pcDNA3，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，分離純化Fd和pcDNA3片斷，分別取2ulFd和pcDNA3，加入T4連接酶，于16℃過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，隨機(jī)挑選出4個(gè)抗氨芐青霉素克隆，小量培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ分別消化鑒定，將能切出690hp的細(xì)菌克隆命名為pcDNA3-Fd。
以Pgem-BPI為模板，PCR擴(kuò)增BPI 180bp片段。PCR引物為for-CGT CTA GAGTCA GTT ACT GCC CAG CTT CAG ATC-3’，back-G ACT AGT GGA AGA GTA GTA GGCGGT CGA GCC CTA CTG CGA GCC GTC AAC ATA AGC ATG GTG CCC AAT GTG-3’。擴(kuò)增條件為97℃變性5分鐘，94℃1分鐘，58℃1分鐘，72℃1分鐘，32次循環(huán)后，72℃延伸5分鐘。經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳，分離純化180bp DNA片段。
以Spe Ⅰ和XbaⅠ消化上述PCR產(chǎn)物，與同樣處理的pcDNA3-Fd連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。隨機(jī)挑選出4個(gè)抗氨芐青霉素克隆，小量培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用Spe Ⅰ和xba Ⅰ分別消化鑒定，將能切出180bp的細(xì)菌克隆命名為pcFd-BPI180。
以EcoR和Xho Ⅰ分別消化PGEM-L和pcDNA3質(zhì)粒，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，分離純化L和pcDNA3片斷，分別取2ul L和pcDNA3，加入T4連接酶，于16℃過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，隨機(jī)挑選出4個(gè)抗氨芐青霉素克隆，小量培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ分別消化鑒定，將能切出670bp的細(xì)菌克隆命名為pcDNA3-L。
PCR擴(kuò)增pcDNA3-L 1.7kb片段(包括CMN啟動(dòng)子，L鏈，BGH多聚A信號(hào))。擴(kuò)增引物為back-GAA CGT TTA GAT CTG CTT CGC G-3和for-GAG CCC CAA TTG GTTCTT TCC GC-3’，擴(kuò)增條件為97℃變性分鐘，94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃2分鐘，32次循環(huán)后，72℃延伸10分鐘。經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，分離純化1.7kbDNA片斷，以Bg1Ⅱ和Mun Ⅰ分別酶切上述PCR產(chǎn)物和pcFd-BPI180，將1.7kbDNA片斷插入到pcFd-BPI180中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，隨機(jī)挑選出4個(gè)抗氨芐青霉素克隆，小量培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用Bg1Ⅱ和Mun Ⅰ分別消化鑒定，將能切出1.7kp的細(xì)菌克隆命名為pcFBPI180。
6、pcFBPI轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞取6孔培養(yǎng)板，每孔加入1×105細(xì)胞/2ml完全培養(yǎng)基，置CO2孵箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞相互融合。
取一12×75mm無(wú)菌管，加入10ml無(wú)血清培養(yǎng)基，溶解2ug pcFBPI180質(zhì)粒DNA，標(biāo)為D管；取另一無(wú)菌管，加入100ul無(wú)血清培養(yǎng)基，溶角25ul指質(zhì)體，標(biāo)為L(zhǎng)管。將兩管溶液混合，室溫置40min，以形成DNA-Liposome復(fù)合物，記為D-L管。
用2ml無(wú)血清培養(yǎng)基沖洗一下細(xì)胞。在D-L管中加入800ul無(wú)血清培養(yǎng)基，輕輕混勻，鋪至細(xì)胞層上，置CO2孵箱24小時(shí)，加入1ml培養(yǎng)基；24小時(shí)后，更換新鮮完全培養(yǎng)基；72小時(shí)后，將細(xì)胞10倍稀釋，置選擇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
實(shí)施例2以Hinc Ⅱ和Xba Ⅰ消化和PGEM-BPI切下的645bp的DNA片斷插入到pcDNA3-Fd，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。隨機(jī)挑選出4個(gè)抗氨芐青霉素克隆，小量培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用HincⅡ和Xba Ⅰ分別消化鑒定，將能切出645bp的細(xì)菌克隆命名為pcFd-bpiI645。
PCR擴(kuò)增pcDNA3-L 1.7kb片斷(包括CMV啟動(dòng)子，L鏈，BGH多聚A信號(hào))。擴(kuò)增引物為5-agg cg tta gat ctg ctt cgc g-3和5-gag ccc caa ttg gtt ctt tccgc-3’，擴(kuò)增條件為97℃變性5分鐘，94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃2分鐘，32次循環(huán)后72℃延伸10分鐘。經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，分離純化1.7kb DNA片斷，以Bg1Ⅱ和Mun Ⅰ分別酶切上述PCR產(chǎn)物和pcFd-BPI645，將1.7KB片段插入到psFd-BPI645中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，隨機(jī)挑選出4個(gè)抗氨芐青霉素克隆，小量培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用Bg1Ⅱ和Mun Ⅰ分別消化鑒定，將能切出1.7kp的細(xì)菌克隆命名為pcFBPI645。
其余方法及步驟同實(shí)施例1。
DNA序列序列1(IgG1重鏈序列)TAT GGA TCC ATG GCC CAG GTG AAG CTC CAG CAG TCT GGA CCT GAGCTG GAG AAG CCT GGC GCT TCA GTG AAG ATA TCC TGC AAG GCT TCTGGT TAC TCA TTC ACT GGC TAC AAC ATG AAC TGG GTG AAG CAG AGCAAT GGA AAG AGC CTT GAG TGG ATT GGA AAT ATT GAT CCT TAC TATGGT GGT ACT AGC TAC AAC CAG AAG TTC AAG GGC AAG GCC ACA TTGACT GTA GAC AAA TCC TCC AGC ACA GCC TAC ATG CAG CTC AAG AGCCTG ACA TCT GAG GAC TCT GCA GTC TAT TAC TGT GCA AGA TCC GGG GGTAAC TAC GGG GGA GCC TGG TTT GCT TAC TGG GGC CAA GGG ACC ACGGTC ACC GCC AAA ACG ACA CCC CCA TCT GTC TAT CCA CTG GCC CCT GGATCT GCT GCC CAA ACT AAC TCC ATG GTG ACT CTG GGA TGC CTG GTC AAGGGC TAT TTC CCT GAG CCA GTG ACA GTG ACC TGG AAC TCT GGA TCC CTGTCC AGC GGT GTG CAC ACC TTC CCA GCT GTC CTG CAG TCT GAC CTC TACACT CTG AGC AGC TCA GTG ACT GTC CCC TCC AGC ACC TGG CCC AGCGAG ACC GTC ACC TGC AAC GTT GCC CAC CCG GCC AGC AGC ACC AAGGTG GAC AAG AAA ATT GTG CCC AGG GAT TGT ACT AGT AAG CCT TGATCT AGA GCA
序列2(IgG1輕鏈序列)TCG AAT TCC ATG GCA GAC ATT CTG TTG ACG CAG TCT CCA CTC ACTTTG TCG GTT ACC ATT GGA CAA CCA GCC TCC ATC TCT TGC AAG TCAAGT CAG AGC CTC TTA GAT AGT GAT GGA AAG ACA TAT TTG AAT TGGTTG TTA CAG AGG CCA GGC CAG TCT CCA AAG CGC CTA ATC TAT CTGGTG TCT AAA CTG GAC TCT GGA GTC CCT GAC AGG TTC ACT GGC AGTGGA TCA GGG ACA GAT TTC ACA CTG AAA ATC AGC AGA GTG GAG GCTGAG GAT TTG GGA GTT TAT TAT TGC TGG CAA GGT ACA CAT TTT CCATTC ACG TTC GGC TCG GGG ACA AAG TTG GAA ATA AAA CGG GCT GATGCT GCA CCA ACT GTA TCC ATC TTC CCA CCA TCC AGT GAG CAG TTAACA TCT GGA GGT GCC TCA GTC GTG TGC TTC TTG AAC AAC TTC TACCCC AAA GAC ATC AAT GTC AAG TGG AAG ATT GAT GGC AGT GAA CGACAA AAT GGC GTC CTG AAC AGT TGG ACT GAT CAG GAC AGC AAA GACAGC ACC TAC AGC ATG AGC AGC ACC CTC ACG TTG ACC AAG GAC GAGTAT GAA CGA CAT AAC AGC TAT ACC TGT GAG GCC ACT CAC AAG ACATCA ACT TCA CCC ATT GTC AAG AGC TTC AAC AGG AAT GAG TGT TAACTC GAG CGA G序列3(BPⅠ1～208個(gè)中國(guó)漢族人的氨基酸序列)GGC ACC GCC GTG ACA GCG GCC GTC AAC CCT GGC GTC GTG GTC AGGATC TCC CAG AAG GGC CTG GAC TAC GTC AGC CAG CAG GGG ACG GCCGCT CTG CAG AAG GAG CTG AAG AGG ATC AAG ATT CCT GAC TAC TCAGAC AGC TTT AAG ATC AAG CAT CTT GGG AAG GGG CAT TAT AGC TTCTAC AGC ATG GAC ATC CGT GAA TTC CAG CTT CCC AGT TCC CAG ATAAGC ATG GTG CCC AAT GTG GGC CTT AAG TTC TCC ATC AGC AAC GCCAAT ATC AAG ATC AGC GGG AAA TGG AAG GCA CAA AAG AGA TTC TTAAAA ATG AGC GGC AAT TTT GAC CTG AGC ATA GAA GGC ATG TCC ATTTCG GCT GAT CTG AAG CTG GGC AGT AAC CCC ACG TCA GGC AAG CCCACC ATC ACC TGC TCC AGC TGC AGC AGC CAC ATC AAC AGT GTC CACGTG CAC ATC TCA AAG AGC AAA GTG GGG TGG CTG ATC CAA CTC TTCCAC AAA AAA ATT GAG TCT GTG CTT CGA AAC AAG ATG AAC AGC CAGGTC TGC GAG AAA GTG ACC AAT TCT GTA TCC TCC GAG CTG CAA CCTTAT TTC CAG ACT CTG CCA GTA ATG ACC AAA ATA GAT TCT GTG GCT GGAATC AAC TAT GAG GTA序列4(BPⅠ55個(gè)中國(guó)漢族人的氨基酸序列)CTC GAG ATA AGC ATG GTG CCC AAT GTG GGC CTT AAG TTC TCC ATC AGCAAC GCC AAT ATC AAG ATC AGC GGG AAA TGG AAG GCA CAA AAG AGATTC TTA AAA ATG AGC GGC AAT TTT GAC CTG AGC ATA GAA GGC ATGTCC ATT TCG GCT GAT CTG AAG CTG GGC AGT AACTCT AGA
權(quán)利要求
1.一種IgG Fab-BPI融合蛋白質(zhì)，其特征它是由抗體IgG1與殺菌/通透性增強(qiáng)蛋白BPI(N)端的基因融合而成，在其氨基(N)端有抗體IgG1的重鏈和輕鏈；在其羧基(C)端有BPI蛋白質(zhì)或BPI蛋白質(zhì)生物學(xué)活性片段，所述的抗體IgG1是一種廣譜抗內(nèi)毒素LPS的單克隆抗體(mAb)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的IgG Fab-BPI融合蛋白質(zhì)，其特征是所述的抗體IgG1的重鏈包括有重鏈可變區(qū)和重鏈恒定區(qū)；所述的抗體IgG1的輕鏈包括有輕鏈可變區(qū)和輕鏈恒定區(qū)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的IgG Fab-BPI融合蛋白質(zhì)，其特征是蛋白質(zhì)BPI(N)端基因主要指1～629位，或205～225位。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的IgG Fab-BPI融合蛋白質(zhì)，其特征是所述的IgG1重鏈恒定區(qū)是CH1；所述的IgG1輕鏈恒定區(qū)是Ck。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的IgG Fab-BPI融合蛋白質(zhì)，其特征是在蛋白質(zhì)BPI與抗體IgG1之間還包括有IgG1的絞鏈區(qū)和一個(gè)15個(gè)氨基酸的連接片段。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的IgG Fab-BPI融合蛋白質(zhì)，其特征是蛋白質(zhì)BPI是由208個(gè)氨基酸或55個(gè)氨基酸組成。
7.一種IgG Fab-BPI融合蛋白質(zhì)的DNA序列，其特征是該DNA序列包括抗體IgG1的重鏈序列和輕鏈序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的IgG Fab-BPI融合蛋白質(zhì)的DNA序列，其特征是該DNA序列還包括有蛋白質(zhì)BPI的1～208個(gè)氨基酸殘基的編碼序列和蛋白質(zhì)BPI的68～122個(gè)氨基酸殘基的編碼序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了IgG Fab-BPI融合蛋白質(zhì),是由抗體IgG1與殺菌/通透性蛋白質(zhì)BPI融合而成,在它的氨基(N)端有IgG
文檔編號(hào)C12N15/11GK1296015SQ00113868
公開日2001年5月23日 申請(qǐng)日期2000年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月10日
發(fā)明者馬越云, 于文彬, 丁振若, 蘇明權(quán) 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院