專利名稱：一種多重歸一化基因擴(kuò)增方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因擴(kuò)增方法，尤其涉及一種多重基因的歸一化基因擴(kuò)增方法。
基因擴(kuò)增技術(shù)或稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymol/Lerase Chain Reaction.PCR)是八十年代發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)分子生物技術(shù)，其原理類似體內(nèi)天然DNA復(fù)制，主要是利用DNA聚合酶依賴DNA模板的特性，模仿體內(nèi)DNA復(fù)制過(guò)程，在附加的一對(duì)引物之間誘發(fā)聚合反應(yīng)。PCR全過(guò)程是基于一套“三步曲”的若干次的循環(huán)組合而成，其中每一步的轉(zhuǎn)換則是通過(guò)溫度的改變來(lái)控制，三步過(guò)程分別為1、DNA熱變性加熱使靶DNA雙鏈解離；2、引物退火，體系溫度降低，使兩個(gè)引物分別結(jié)合到靶DNA的兩條鏈的3′末端；3、引物延伸，在DNA聚合酶的催化下，引物沿著靶DNA鏈的3′末端向5′末端延伸，至此完成一個(gè)循環(huán)，整個(gè)PCR過(guò)程一般需要30～50循環(huán)，可將DNA擴(kuò)增百萬(wàn)倍以上(《PCR技術(shù)指南》C.W迪芬巴赫和G.S德維克斯勒者、黃培堂等譯，科學(xué)出版社1999年)，這種基軒擴(kuò)增技術(shù)廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)研究、遺傳工程、疾病診斷、法醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、考古學(xué)等領(lǐng)域的基因分析，基因克隆等，但這種擴(kuò)增方法對(duì)多基因分析有缺陷，即僅對(duì)單一基因，且最多僅能同時(shí)擴(kuò)增10個(gè)左右的基因，不能同時(shí)擴(kuò)增更多的基因，這給大量基因的分析工作帶來(lái)了局限性。
本發(fā)明的目的是提供一套多重基因擴(kuò)增方法，此法利用巧妙的PCR引物設(shè)計(jì)，可有效解決多基因的同時(shí)擴(kuò)增。
本發(fā)明的目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的首先在擴(kuò)增引物的5′端增加長(zhǎng)度為17～25核苷酸的共有引物片段，進(jìn)行初始擴(kuò)增，然后用共有引物引發(fā)擴(kuò)增，形成歸一化擴(kuò)增。
如附圖
所示。
初始化擴(kuò)增是指由特異性引物引發(fā)的特異基因片段的擴(kuò)增。
歸一化擴(kuò)增是指由共有引物引發(fā)的擴(kuò)增。
優(yōu)選方法可采用1、三次擴(kuò)增①逆轉(zhuǎn)錄和初始化擴(kuò)增；②第二次擴(kuò)增；③第三次擴(kuò)增；2、二次循環(huán)法；3、一次擴(kuò)增。
第二次擴(kuò)增是取初始擴(kuò)增產(chǎn)物1～2μmol/L，加入反應(yīng)體系，另加特異引物進(jìn)行的擴(kuò)增；第三次擴(kuò)增是取第二次擴(kuò)增產(chǎn)物1～2μmol/L，加入反應(yīng)體系及共有引物進(jìn)行的擴(kuò)增；二次循環(huán)法中第一循環(huán)引物為各0.001～0.01μmol/L，N和RT引物，擴(kuò)增25循環(huán)，第二循環(huán)引物為0.1～0.3μmol/L，T引物，擴(kuò)增25～40循環(huán)；一次擴(kuò)增是取引物N和RT 0.001～0.01μmol/L，T為0.1～0.3μmol/L，擴(kuò)增35～45循環(huán)。
第二次擴(kuò)增中，另加的特異引物是R和N引物，含0.005～0.05μmol/L的T引物的RT引物。
本發(fā)明基于巧妙的PCR引物設(shè)計(jì)，可大量分析多重基因的歸一化PCR方法，這種方法理論上可同時(shí)擴(kuò)增無(wú)數(shù)個(gè)基因，實(shí)際工作中可同時(shí)擴(kuò)增30個(gè)以上的基因，大大提高了基因分析的工作效率。
附圖為本發(fā)明技術(shù)方案示意圖。其中，R針對(duì)目的基因的常規(guī)特異性引物RT帶有共有序列的常規(guī)特異性引物N位于R和RT之間帶有共有序列的常規(guī)特異性引物T共有引物下面結(jié)合擴(kuò)增精液cDNA為例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
1.樣品制備1.1裂解液220mmol/L KOH加入500mmol/L DTT，混合比例9∶11.2中和緩沖液200mmol/L HCl 900mmol/L Tris-HCl(PH＝8.3)1.3步驟①20μl(精液)加入100μl裂解液60℃10分鐘。
②加100μl中和緩沖液。
③乙醇沉淀，沉淀樣做PCR。
注①不同的樣品可用不同的裂解液，或用其他樣品制備方法。
②若用裂解液直接用做PCR，注意K+離子濃度影響擴(kuò)增。
2.擴(kuò)增2.1溶液①10×PCR緩沖液100mmol/L Tris-HCl(PH8.3)500mmol/L KCl20mmol/L MgCl2100μg/ml②900mmol/L Tris-HCl(PH8.3)2.2三步擴(kuò)增法2.2.1逆轉(zhuǎn)錄和初始擴(kuò)增①樣品中加入反應(yīng)體系1×PCR緩沖液90mmol/L Tris-HCl(PH8.3)100mmol/L dNTP0.005μmol/L R和RT引物。
Rnasin和逆轉(zhuǎn)錄酶(視具體情況確定用量)②PCR循環(huán)前43℃溫育40分鐘(逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程)，95℃變性2分鐘，然后PCR循環(huán)30周期，條件為95℃30秒，55℃30秒，72℃1分鐘。
2.2.2第二次擴(kuò)增取第一次擴(kuò)增產(chǎn)物1.5μl，加入反應(yīng)體系(不含逆轉(zhuǎn)錄酶，R、RT引物)①中，另加入等濃度的T和N引物，含0.025μmol/L的T引物的RT引物，擴(kuò)增條件同②，循環(huán)10周期。
2.2.3第三次擴(kuò)增取第二次擴(kuò)增產(chǎn)物1.5μl，加入反應(yīng)體系(不含逆轉(zhuǎn)錄酶和PCR引物)及0.2μl的T引物，擴(kuò)增條件同②，擴(kuò)增32循環(huán)。
2.3二次循環(huán)法反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件同2.2，第一循環(huán)引物為各0.005μmol/L，N和RT引物，擴(kuò)增25循環(huán)，第二循環(huán)引物為0.1～0.3μmol/L，T引物，擴(kuò)增32循環(huán)。
2.4一次擴(kuò)增反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件同2.3，引物N和RT各為0.005μmol/L，T為0.1～0.3μmol/L，擴(kuò)增35～45循環(huán)。
反應(yīng)體系、擴(kuò)增條件可根據(jù)不同樣品作相應(yīng)改變。
權(quán)利要求
1.一種多重歸一化基因擴(kuò)增方法，其特征是，在擴(kuò)增引物的5′端增加長(zhǎng)度為17～25核苷酸的共有引物片段，進(jìn)行初始擴(kuò)增，然后用共有引物引發(fā)擴(kuò)增，形成歸一化擴(kuò)增。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多重歸一化基因擴(kuò)增方法，其特征是，所說(shuō)的初始擴(kuò)增是指由特異性引物引發(fā)的特異基因片段的擴(kuò)增。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的多重歸一化基因擴(kuò)增方法，其特征是，所說(shuō)的歸一化擴(kuò)增是指由共有引物引發(fā)的擴(kuò)增。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的多重歸一化基因擴(kuò)增方法，其特征是，優(yōu)選方法可采用(1)三次擴(kuò)增①逆轉(zhuǎn)錄和初始化擴(kuò)增；②第二次擴(kuò)增；③第三次擴(kuò)增；(2)二次循環(huán)法；(3)一次擴(kuò)增。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的多重歸一化基因擴(kuò)增方法，其特征是，第二次擴(kuò)增是取初始擴(kuò)增產(chǎn)物1～2μmol/L，加入反應(yīng)體系，另加特異引物進(jìn)行的擴(kuò)增；第三次擴(kuò)增是取第二次擴(kuò)增產(chǎn)物1～2μmol/L，加入反應(yīng)體系及共有引物進(jìn)行的擴(kuò)增；二次循環(huán)法中第一循環(huán)引物為各0.001～0.01μmol/L，N和RT引物，擴(kuò)增22～29循環(huán)，第二循環(huán)引物為0.1～0.3μmol/L，T引物，擴(kuò)增25～40循環(huán)，一次擴(kuò)增是取引物N和RT 0.001～0.01μmol/L，T為0.1～0.3μmol/L，擴(kuò)增35～45循環(huán)；R為針對(duì)目的基因的常規(guī)特異性引物，RT為帶有共有序列的常規(guī)特異性引物，N為位于R和RT之間帶有共有序列的常規(guī)特異性引物，T為共有引物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的多重歸一化基因擴(kuò)增方法，其特征是，第二次擴(kuò)增中，另加的特異引物是R和N引物，含0.005～0.05μmol/L的T引物的RT引物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種多重歸一化基因擴(kuò)增方法,它采用在擴(kuò)增物的5′端增加長(zhǎng)度為17～25核苷酸的共有引物片段,經(jīng)初始特異擴(kuò)增后,然后用共有引物引發(fā)擴(kuò)增,最后歸一化為共引物的擴(kuò)增。本發(fā)明所提供的方法,理論上可同時(shí)擴(kuò)增無(wú)數(shù)個(gè)基因,實(shí)際工作中可同時(shí)擴(kuò)增30個(gè)以上的基因,大大提高了基因分析的工作效率。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1266104SQ0011081
公開(kāi)日2000年9月13日 申請(qǐng)日期2000年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月10日
發(fā)明者韓金祥 申請(qǐng)人:山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心