加載和脫水過(guò)程都在冰上進(jìn)行；
所述高糖加載液為:l/2MS+2mol/I/y^^+0.55mol/L鹿糖，pH5.8;
所述玻璃化液PVS2: 1/2MS+0.4mol/L蔗糖+30%w/v甘油+15%w/vDMS0 pH5.8 ；
所述卸載液為:1/2MS+1.2mol/L鹿糖，pH5.8;
所述成活培養(yǎng)基為:l/2MS+0.15ml/L NAA+1.3m I/L 6_BA+50g/L 馬鈴薯+25g/L 香蕉+7g/L 瓊脂，pH5.8;
所述正常光照培養(yǎng)是在溫度25土 1°C、光照強(qiáng)度1000-20001x、光照12h/d的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
[0048]實(shí)施例7
一種石斛超低溫保存脫毒的方法，包括如下步驟:
步驟(I)，取I月苗齡的帶有CyMV和ORSV病毒的石斛組培苗，取帶有單芽的莖段1.0cm，接種到基本培養(yǎng)基上，在4°C黑暗條件下煉苗3周;所述I月苗齡是繼代培養(yǎng)I月的石斛組培苗，苗高度為2-3cm;
所述基本培養(yǎng)基為:l/2MS+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8;
步驟(2)，從步驟(I)所煉的苗上剝?nèi)mm長(zhǎng)的莖尖，然后將莖尖在4 °C黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)ld，之后將莖尖先進(jìn)行包埋，包埋后采用高糖加載液對(duì)莖尖加載1.5h后，將莖尖轉(zhuǎn)移到玻璃化溶液PVS2中脫水4h，再將莖尖投入液氮中保存0.9h，之后將莖尖在37 V水浴中解凍3min，之后將莖尖在室溫下轉(zhuǎn)入卸載液中解凍，并卸載20min，卸載后的莖尖接種到成活培養(yǎng)基上，先暗培養(yǎng)Id，后轉(zhuǎn)入正常光照下繼續(xù)培養(yǎng)，獲得石斛脫毒苗;60d后RT-PCR檢測(cè)CyMV和ORSV，脫毒率為89.5%。
[0049]所述預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基為:1/2MS+0.3mol/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8;
所述的包埋的具體步驟為:向莖尖上滴加海藻酸鈉包埋液，使得莖尖完全包裹于海藻酸鈉包埋液中，然后將含有莖尖的海藻酸鈉包埋液液滴加入至鈣離子包埋液中，置于室溫下15min，形成包埋珠;所述的包埋珠的直徑為4_。
[0050]所述的海藻酸鈉包埋液為:1/2MS+0.4mol/L蔗糖+2%w/v海藻酸鈉；
所述的鈣離子包埋液為:1/2MS+0.4mol/L蔗糖+0.lmol/1氯化鈣。
[0051 ]所述加載和脫水過(guò)程都在冰上進(jìn)行，搖床振蕩；
所述高糖加載液為:l/2MS+2mol/I/y^^+0.3mol/L鹿糖，pH5.8;
所述玻璃化液PVS2: 1/2MS+0.4mol/L蔗糖+30%w/v甘油+15%w/vDMS0 pH5.8 ；
所述卸載液為:1/2MS+1.2mol/L鹿糖，pH5.8;
所述成活培養(yǎng)基為:1/2MS+0.lml/L NAA+0.lml/L 6_BA+50g/L馬鈴薯+25g/L香蕉+7g/L 瓊脂，pH5.8;
所述正常光照培養(yǎng)是在溫度25土 1°C、光照強(qiáng)度1000-20001x、光照12h/d的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
[0052] 實(shí)施例8
一種石斛超低溫保存脫毒的方法，包括如下步驟:
步驟(I)，取I月苗齡的帶有CyMV和ORSV病毒的石斛組培苗，取帶有單芽的莖段1.5cm，接種到基本培養(yǎng)基上，在4°C黑暗條件下煉苗5周;所述I月苗齡是繼代培養(yǎng)I月的石斛組培苗，苗高度為2-3cm; 所述基本培養(yǎng)基為:l/2MS+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8;
步驟(2)，從步驟(I)所煉的苗上剝?nèi)?mm長(zhǎng)的莖尖，然后將莖尖在4 °C黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)3d，之后將莖尖先進(jìn)行包埋，包埋后采用高糖加載液對(duì)莖尖加載2h后，將莖尖轉(zhuǎn)移到玻璃化溶液PVS2中脫水5h，再將莖尖投入液氮中保存l.lh，之后將莖尖在37°C水浴中解凍4min，之后將莖尖在室溫下轉(zhuǎn)入卸載液中解凍，并卸載30min，卸載后的莖尖接種到成活培養(yǎng)基上，先暗培養(yǎng)3d，后轉(zhuǎn)入正常光照下繼續(xù)培養(yǎng)，獲得石斛脫毒苗；60d后RT-PCR檢測(cè)CyMV和ORSV，脫毒率為89.3%。
[0053]所述預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基為:1/2MS+0.6mol/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8;
所述的包埋的具體步驟為:向莖尖上滴加海藻酸鈉包埋液，使得莖尖完全包裹于海藻酸鈉包埋液中，然后將含有莖尖的海藻酸鈉包埋液液滴加入至鈣離子包埋液中，置于室溫下20min，形成包埋珠;所述的包埋珠的直徑為5_。
[0054]所述的海藻酸鈉包埋液為:1/2MS+0.4mol/L蔗糖+3.5%w/v海藻酸鈉；
所述的鈣離子包埋液為:1/2MS+0.4mol/L蔗糖+0.lmol/1氯化鈣。
[0055]所述加載和脫水過(guò)程都在冰上進(jìn)行，搖床振蕩；
所述高糖加載液為:l/2MS+2mol/I/y^^+0.7mol/L鹿糖，pH5.8;
所述玻璃化液PVS2: 1/2MS+0.4mol/L蔗糖+30%w/v甘油+15%w/vDMS0 pH5.8 ；
所述卸載液為:1/2MS+1.2mol/L鹿糖，pH5.8;
所述成活培養(yǎng)基為:l/2MS+0.2ml/L NAA+2.0ml/L 6_BA+50g/L馬鈴薯+25g/L香蕉+7g/L 瓊脂，pH5.8;
所述正常光照培養(yǎng)是在溫度25土 1°C、光照強(qiáng)度1000-20001x、光照12h/d的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
[0056]實(shí)施例9
一種石斛超低溫保存脫毒的方法，包括如下步驟:
步驟(I)，取I月苗齡的帶有CyMV和ORSV病毒的石斛組培苗，取帶有單芽的莖段1.4cm，接種到基本培養(yǎng)基上，在4°C黑暗條件下煉苗4.5周;所述I月苗齡是繼代培養(yǎng)I月的石斛組培苗，苗高度為2-3cm;
所述基本培養(yǎng)基為:l/2MS+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8;
步驟(2)，從步驟(I)所煉的苗上剝?nèi)?.8mm長(zhǎng)的莖尖，然后將莖尖在4°C黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)2d，之后將莖尖先進(jìn)行包埋，包埋后采用高糖加載液對(duì)莖尖加載1.7h后，將莖尖轉(zhuǎn)移到玻璃化溶液PVS2中脫水4.5h，再將莖尖投入液氮中保存Ih，之后將莖尖在37 °C水浴中解凍
3.6min，之后將莖尖在室溫下轉(zhuǎn)入卸載液中解凍，并卸載24min，卸載后的莖尖接種到成活培養(yǎng)基上，先暗培養(yǎng)2d，后轉(zhuǎn)入正常光照下繼續(xù)培養(yǎng)，獲得石斛脫毒苗；60d后RT-PCR檢測(cè)CyMV和ORSV，脫毒率為89.4%。
[0057]所述預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基為:1/2MS+0.5mol/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8;
所述的包埋的具體步驟為:向莖尖上滴加海藻酸鈉包埋液，使得莖尖完全包裹于海藻酸鈉包埋液中，然后將含有莖尖的海藻酸鈉包埋液液滴加入至鈣離子包埋液中，置于室溫下18min，形成包埋珠;所述的包埋珠的直徑為4.5mm。
[0058]所述的海藻酸鈉包埋液為:1/2MS+0.4mol/L蔗糖+3%w/v海藻酸鈉；
所述的鈣離子包埋液為:1/2MS+0.4mol/L蔗糖+0.lmol/1氯化鈣。
[0059]所述加載和脫水過(guò)程都在冰上進(jìn)行，搖床振蕩；
所述高糖加載液為:l/2MS+2mol/I/y^^+0.4mol/L鹿糖，pH5.8;
所述玻璃化液PVS2: 1/2MS+0.4mol/L蔗糖+30%w/v甘油+15%w/vDMS0 pH5.8 ；
所述卸載液為:1/2MS+1.2mol/L鹿糖，pH5.8;
所述成活培養(yǎng)基為:1/2MS+0.15ml/L NAA+lml/L 6_BA+50g/L馬鈴薯+25g/L香蕉+7g/L瓊脂，PH5.8;
所述正常光照培養(yǎng)是在溫度25土 1°C、光照強(qiáng)度1000-20001x、光照12h/d的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
[0060]以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書(shū)中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書(shū)及其等效物界定。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種石斛超低溫保存脫毒的方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟(1)，選擇I月苗齡的帶有CyMV和ORSV病毒的石斛組培苗，取石斛組培苗帶有單芽的莖段1.0-1.5cm，接種到基本培養(yǎng)基上，在4°C黑暗條件下煉苗3-5周;所述I月苗齡是繼代培養(yǎng)1月的石斛組培苗，苗高度為2-3cm; 所述基本培養(yǎng)基為:l/2MS+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8; 步驟(2)，從步驟(I)所煉的苗上剝?nèi)-3mm長(zhǎng)的莖尖，然后將莖尖在4 °C黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)l-3d;接著在超凈工作臺(tái)上，采用高糖加載液對(duì)莖尖加載20-40min后，將莖尖轉(zhuǎn)移到玻璃化溶液PVS2中脫水30-60min，再將莖尖投入液氮中保存30min-lh，之后將莖尖在室溫下迅速轉(zhuǎn)入卸載液中解凍并卸載20-30min，或是將莖尖在37°C水浴中解凍3-4min再轉(zhuǎn)入卸載液中卸載20-30min，卸載后