一種石斛超低溫保存脫毒的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物病毒防治技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種石斛超低溫保存脫毒的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]石斛(Dendrobium nobile Lindl)，又名萬丈須、吊蘭、林蘭等，是蘭科中的大屬，有1500-1600個原生種，主要分布于亞洲的熱帶、亞熱帶地區(qū)和大洋洲，我國有76種，主要分布于西南和華南地區(qū)。莖直立，肉質(zhì)狀肥厚，稍扁的圓柱形，長10-60厘米，粗達(dá)1.3厘米。石斛是著名的中藥材，性味甘淡微咸，寒，歸胃、腎，肺經(jīng)。益胃生津，滋陰清熱。用于陰傷津虧，口干煩渴，食少干嘔，病后虛熱，目暗不明。石斛花姿優(yōu)雅，玲瓏可愛，花色鮮艷，氣味芳香，被喻為“四大觀賞洋花”之一。
[0003]由于石解屬植物生長緩慢，種子極其微小，且胚具有生理后熟現(xiàn)象，自然繁殖條件下種子萌發(fā)率小于5%，加之長期非法采挖，致使多種石解原生種已瀕臨滅絕。自1987年開始，石解先后被列為《中華人民共和國珍稀瀕危植物錄》、《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》中級保護(hù)植物，2001年石解屬全部被列入《國家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄(第2批戶)》。
[0004]國內(nèi)外利用石斛的莖節(jié)、花梗、幼葉尖為外植體快繁組培苗，在移栽技術(shù)方面已做了大量的研究工作，但市場上石斛商品藥材仍然短缺。就其原因在于組培苗移栽成活率低，易受外界氣候影響，而且易帶病毒，致使植株形態(tài)畸變，產(chǎn)生皺縮、花葉、雜斑、條斑、植株矮小、品質(zhì)變劣、品種退化等多種癥狀，嚴(yán)重時還會導(dǎo)致植株死亡，產(chǎn)量下降。
[0005]至今，蘭科植物的病毒病已發(fā)現(xiàn)30多種。常見的感染石斛的病毒有建蘭花葉病毒(CyMV)和齒蘭環(huán)斑病毒(ORSV)。感染CyMV病毒的石解植株葉片正反面出現(xiàn)黑色壞死小圓斑，葉脈間生褐色的條斑，后呈條紋狀花葉，花葉癥狀在新葉上明顯，成熟的葉上花葉癥色淡，使得植株葉片發(fā)育不良或開花不正常，病患傳播迅速，目前尚無有效的救治方法，一旦發(fā)現(xiàn)可疑植株只能立即隔離或燒毀。感染ORSV病毒的石斛，葉的壞死組織為同心圓圈或間有綠色區(qū)。圈可聯(lián)合成各種形狀，可使葉脫落。
[0006]種苗是規(guī)?；a(chǎn)的起點(diǎn)，是保護(hù)資源和有效利用資源的關(guān)鍵點(diǎn)，種苗的質(zhì)量得到保證才能提高石斛種植和產(chǎn)品質(zhì)量。因此，種苗脫毒具有重要的價值和意義。常用的脫毒方法有熱處理脫毒法、莖尖脫毒法、熱處理莖尖脫毒法等。傳統(tǒng)的脫毒方法脫毒率低，脫毒率受莖尖大小的影響，取材困難。因此如何克服現(xiàn)有技術(shù)的不足是目前植物病毒防治技術(shù)領(lǐng)域亟需解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為了更有效的保護(hù)即將瀕危的石斛，提高種苗質(zhì)量，生產(chǎn)無病毒種苗，本發(fā)明提供了一種新型的石斛超低溫保存脫毒方法，能有效提高種苗脫毒率。該方法周期短，操作簡便，無需復(fù)雜的設(shè)備、儀器和昂貴的藥品試劑，易于推廣應(yīng)用。
[0008]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
一種石斛超低溫保存脫毒的方法，包括如下步驟: 步驟(I)，選擇I月苗齡的帶有CyMV和ORSV病毒的石斛組培苗，取石斛組培苗帶有單芽的莖段1.0-1.5cm，接種到基本培養(yǎng)基上，在4°C黑暗條件下煉苗3-5周;所述I月苗齡是繼代培養(yǎng)I月的石斛組培苗，苗高度為2-3cm;
所述基本培養(yǎng)基為:l/2MS+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8;
步驟(2)，從步驟(I)所煉的苗上剝?nèi)-3mm長的莖尖，然后將莖尖在4°C黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)l-3d;接著在超凈工作臺上，采用高糖加載液對莖尖加載20-40min后，將莖尖轉(zhuǎn)移到玻璃化溶液PVS2中脫水30-60min，再將莖尖投入液氮中保存30min-lh，之后將莖尖在室溫下迅速轉(zhuǎn)入卸載液中解凍并卸載20-30min，或是將莖尖在37°C水浴中解凍3-4min再轉(zhuǎn)入卸載液中卸載20-30min，卸載后的莖尖接種到成活培養(yǎng)基上，先暗培養(yǎng)l-3d，后轉(zhuǎn)入正常光照下繼續(xù)培養(yǎng)，獲得石斛脫毒苗；
所述預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基為:1/2MS+0.3-0.6mol/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8;
所述加載和脫水過程都在冰上進(jìn)行；
所述高糖加載液為:l/2MS+2mol/L甘油+0.3-0.7mol/L鹿糖，pH5.8 ；
所述玻璃化液PVS2: 1/2MS+0.4mol/L蔗糖+30%w/v甘油+15%w/vDMS0 pH5.8 ；
所述卸載液為:1/2MS+1.2mol/L鹿糖，pH5.8;
所述成活培養(yǎng)基為:1/2MS+0.1-0.2ml/L NAA+0.1-2.0ml/L 6_BA+50g/L馬鈴薯+25g/L香蕉+7g/L瓊脂，pH5.8 ；
所述正常光照培養(yǎng)是在溫度25土 1°C、光照強(qiáng)度1000-20001x、光照12h/d的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
[0009]進(jìn)一步，優(yōu)選的是步驟(2)中在體視顯微鏡下剝?nèi)-3mm長的莖尖。
[0010]進(jìn)一步，優(yōu)選的是將莖尖投入液氮中保存時采用小滴玻璃化法或玻璃化法。
[0011]進(jìn)一步，優(yōu)選的是所述的小滴玻璃化法是將鋁箔紙剪成(0.8-l)cm*(2-2.2)cm長條形的鋁箔條，將經(jīng)PVS2脫水處理后的莖尖放到鋁箔條光滑的一面上，向莖尖上滴加PVS2，使莖尖完全包裹于PVS2溶液小滴中，然后將鋁箔條直接浸入液氮中進(jìn)行冷凍，冷凍后將鋁箔條裝入凍存管中，擰緊蓋子，最后投入液氮中保存。
[0012]進(jìn)一步，優(yōu)選的是所述的玻璃化法是將將經(jīng)PVS2脫水處理后的莖尖放入冷凍管中，向冷凍管加入PVS2使莖尖浸泡在PVS2中，蓋緊蓋子后直接將冷凍管投入液氮中保存。
[0013]進(jìn)一步，優(yōu)選的是將4°C黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)l-3d得到的莖尖先進(jìn)行包埋，然后再加載、脫水和液氮保存；
所述的包埋的具體步驟為:向莖尖上滴加海藻酸鈉包埋液，使得莖尖完全包裹于海藻酸鈉包埋液中，然后將含有莖尖的海藻酸鈉包埋液液滴加入至鈣離子包埋液中，置于室溫下，使其充分凝固成包埋珠；
所述的海藻酸鈉包埋液為:1/2MS+0.4mol/L蔗糖+2-3.5%w/v海藻酸鈉；
所述的鈣離子包埋液為:1/2MS+0.4mol/L蔗糖+0.lmol/1氯化鈣；
經(jīng)過包埋后的莖尖加載時間為1.5-2h，脫水時間為4-5h，液氮保存時間為0.9-1.1h。
[0014]進(jìn)一步，優(yōu)選的是，所述的包埋珠的直徑為4-5_。
[0015]進(jìn)一步，優(yōu)選的是，所述的石斛超低溫保存脫毒的方法，包括如下步驟:
步驟(I)，取I月苗齡的帶有CyMV和ORSV病毒的石斛組培苗，取帶有單芽的莖段1.2cm,接種到基本培養(yǎng)基上，在4°C黑暗條件下煉苗4周;所述I月苗齡是繼代培養(yǎng)I月的石斛組培苗，苗高度為2-3cm;
所述基本培養(yǎng)基為:l/2MS+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8;
步驟(2)，在體視顯微鏡下，從步驟(I)所煉的苗上剝?nèi)?mm長的莖尖，然后將莖尖在4°C黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)2d;接著在超凈工作臺上，采用高糖加載液對莖尖加載30min后，將莖尖轉(zhuǎn)移到玻璃化溶液PVS2中脫水50min，再將莖尖放到0.9cm*2.1cm的鋁箔條光滑的一面上，向莖尖上滴加PVS2，使莖尖完全包裹于PVS2溶液小滴中，之后將鋁箔條直接浸入液氮中進(jìn)行冷凍，冷凍后將鋁箔條裝入凍存管中，擰緊蓋子后投入液氮中保存45min，之后將莖尖在室溫下轉(zhuǎn)入卸載液中解凍并卸載25min，卸載后的莖尖接種到成活培養(yǎng)基上，先暗培養(yǎng)2d，后轉(zhuǎn)入正常光照下繼續(xù)培養(yǎng)，獲得石斛脫毒苗；
所述預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基為:1/2MS+0.5mol/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8;
所述加載和脫水過程都在冰上進(jìn)行；
所述高糖加載液為:l/2MS+2mol/I/y^^+0.6mol/L鹿糖，pH5.8;
所述玻璃化液PVS2: 1/2MS+0.4mol/L蔗糖+30%w/v甘油+15%w/vDMS0 pH5.8 ；
所述卸載液為:1/2MS+1.2mol/L鹿糖，pH5.8;
所述成活培養(yǎng)基為:l/2MS+0.17ml/L NAA+1.5m I/L 6_BA+50g/L 馬鈴薯+25g/L 香蕉+7g/L 瓊脂，pH5.8;
所述正常光照培養(yǎng)是在溫度25土 1°C、光照強(qiáng)度1000-20001x、光照12h/d的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
[0016]進(jìn)一步，優(yōu)選的是，所述的石斛超低溫保存脫毒的方法，包括如下步驟:
步驟(I)，取I月苗齡的帶有CyMV和ORSV病毒的石斛組培苗，取帶有單芽的莖段1.3cm，接種到基本培養(yǎng)基上，在4°C黑暗條件下煉苗3.5周;所述I月苗齡是繼代培養(yǎng)I月的石斛組培苗，苗高度為2-3cm;
所述基本培養(yǎng)基為:l/2MS+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8;
步驟(2)，在體視顯微鏡下，從步驟(I)所煉的苗上剝?nèi)?mm長的莖尖，然后將莖尖在4°C黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)1.8d;接著在超凈工作臺上，采用高糖加載液對莖尖加載25min后，將莖尖轉(zhuǎn)移到玻璃化溶液PVS2中脫水52min，再將莖尖放入冷凍管中，向冷凍管加入PVS2使莖尖浸泡在PVS2中，蓋緊蓋子后直接將冷凍管投入液氮中保存43mi